CN113897385A - 一种利用rna干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的dna*** - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA***,所述细胞杀伤***包括以下几个部分:1.表达核酸酶缺陷型CRISPR‑Cas9蛋白的质粒;2.表达前体单链引导RNA(pre‑sgRNA)的质粒,所述前体合成引导RNA的含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA(sgRNA)的序列;3.外源毒素基因;所述杀伤***用于利用细胞特异性表达的miRNA或siRNA驱动外源毒素基因表达,从而实现细胞的靶向杀伤。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,具体而言涉及一种利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA***。
背景技术
RNA干扰机制
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由单链或双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi具有如下特征:1)RNAi是转录后水平的基因沉默机制;2)RNAi具有很高的特异性,只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA;3)RNAi抑制基因表达具有很高的效率,表型可以达到缺失突变体表型的程度,而且相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达,是以催化放大的方式进行的;4)RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点;5)dsRNA不得短于21个碱基,并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21bp左右的siRNA,并由siRNA或者miRNA来介导mRNA切割。而且大于30bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰,而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡;6)ATP依赖性:在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。
小干扰RNA(siRNA)
病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内,并利用宿主细胞进行转录时,常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应,其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约21~23bp),即siRNA(小干扰RNA,small interfering RNA)。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链,继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合,RISC具有核酸酶的功能,在结合部位切割mRNA,切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解,从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA,而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA,从而使RNAi的作用进一步放大,最终将靶mRNA完全降解。
siRNA通常作为RNAi的工具被人工合成,但是后来发现很多生物包括线虫还有人类一些特殊的细胞也会合成内源性siRNA,以用于基因表达的调控。
微小RNA(microRNA,miRNA)
miRNA是一类长度约22个碱基的非编码小RNA,广泛存在于动物、植物和病毒中。miRNA主要通过与AGO2等蛋白形成RNA沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)在转录后水平调控基因的表达。由miRNA和AGO蛋白形成的RISC复合物通过碱基配对的方式识别目标序列,依赖于miRNA与靶标序列碱基互补的程度可以直接切割靶标RNA或者通过促进RNA降解以及抑制翻译的方式调控基因表达。
miRNA与靶标序列的识别主要依赖于种子序列(第2-8位碱基),但是其他部分的碱基也参与靶标序列的识别过程。当miRNA与靶标序列完全互补配对或者接近完全互补(除种子序列以外只有极少的错配),可以诱导AGO2蛋白直接切割靶标序列。如果miRNA的种子序列可以完全匹配靶标序列,而其余部分的匹配程度不足以诱导AGO2切割,则会利用复杂的机制促进RNA降解以及抑制翻译过程。
目前人体细胞内发现的miRNA种类已经超过2000余种。细胞中miRNA的表达根据细胞类型和细胞状态的不同呈现高度的特异性,这种表达特异性已越来越广泛被用作细胞的特征标签,用于区别不同的细胞类型和细胞状态。以人体细胞为例,研究表明人体组织内不同类型的细胞有明显差异的miRNA表达谱,许多细胞具有高度特异性的miRNA表达,例如肝细胞中的miR-122,肌肉细胞中的miR-1,神经元细胞中的miR-124等。研究表明,细胞内miRNA的表达组成在个体发育以及疾病发生和发展过程中均呈现高度的表达变化。
miRNA在细胞的增殖分化、新陈代谢、细胞凋亡和个体生长发育、组织器官功能以及疾病的发生发展等多种生物学过程中发挥重要的调控作用。例如,在癌症研究方面,迄今已经发现多种可以促进癌细胞生长或转移的miRNA,比如miR-17/92、miR-222/221、miR-21、miR-155等。
除了参与调控各项生命活动外,近年来miRNA在临床应用方面也受到了越来越多的关注。在治疗疾病方面,一方面通过降低病变细胞中高表达的具有促进疾病作用的miRNA的表达水平或者调控活性,可以起到抑制缓解疾病的目的。另一方面,通过向病变细胞靶向递送功能性miRNA,可以降低疾病相关基因的表达水平或者抑制免疫逃逸相关的基因,促进免疫细胞的杀伤效果。虽然利用miRNA在疾病治疗方面的应用已经取得了不少进展,但是这些研究大多处在初步研究阶段,对于其治疗效果和安全性等方面的研究还很不充分。目前对于miRNA的应用仍然是基于miRNA和靶基因之间的调控关系来实现的。但是由于每种miRNA平均可以调控数百个靶基因的表达,而每种靶基因又往往处在多种miRNA的调控之下,因而呈现出非常复杂的冗余性和关联性。因此通过降低或者递送单个或少量几个miRNA来调控致病基因的表达水平,一方面可能没有明显调控效果,另一方面可能会带来严重的副作用。突破基于miRNA和靶基因之间的调控关系的思路和方法有望避免以上缺陷,拓展miRNA的应用,并有望推动miRNA在临床治疗领域的实际应用。
发明内容
本发明人利用miRNA或siRNA介导的sgRNA释放策略创建了CRISPR-Cas9平台,该平台可以被细胞内特定的miRNA或siRNA打开从而激活外源毒素基因的表达,从而靶向杀伤病变细胞。
据此,本发明提供了一种利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA***,所述细胞杀伤***包括以下几个部分:
1.表达核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白的质粒;
2.表达前体单链引导RNA(pre-sgRNA)的质粒,所述前体合成引导RNA的含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA(sgRNA)的序列;
3.外源毒素基因;
所述细胞杀伤***用于靶向杀伤表达特定miRNA或siRNA的细胞。
在本发明的一个具体实施方案中,所述核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白与转录激活因子VP64、p65以及RTA融合表达,命名为dCas9-VPR蛋白。
在本发明的另一个具体实施方案中,所述前体合成引导RNA在合成引导RNA(sgRNA)的序列两端均含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列。
在本发明的另一个具体实施方案中,所述前体合成引导RNA在合成引导RNA(sgRNA)的序列两端含有的与目标miRNA或siRNA完全互补的序列是相同的序列。
在本发明的另一个具体实施方案中,所述合成引导RNA(sgRNA)的序列与所述外源毒素基因的启动子序列互补,以使得所述sgRNA可以将dCas9-VPR蛋白引导至所述报告基因的启动子处。
本发明提供的DNA靶向杀伤***通过利用RNA干扰机制和CRISPR-Cas9***相结合,将原本对基因表达起抑制作用的miRNA或siRNA转变为激活基因表达的信号,从而有效地实现了外源毒素基因的激活表达,可以用于靶向杀伤表达目标miRNA或siRNA的细胞。
附图说明
参考随附的附图,本发明更多的目的、功能和优点将通过本发明实施方式的如下描述得以阐明,其中:
图1为MICR-TK***设计原理。(a)pre-sgRNA的设计原理。分别在由II型启动子表达产生的sgRNA的5’端和3’端***与目标miRNA完全互补配对的靶标序列。当细胞中有目标miRNA表达时,可以通过RISC复合物对靶标序列产生切割,从而去掉pre-sgRNA两端的修饰,产生具有功能活性的sgRNA。(b)MICR-TK***的组成和作用原理。MICR-TK***利用细胞内miRNA或siRNA切割活化pre-sgRNA,与dCas9-VPR组成效应复合物,激活毒素蛋白hsvTK的表达。(c)hsvTK可以将GCV小分子催化成为GCV-TP形式,通过抑制DNA延伸过程,从而引起细胞死亡。
图2为利用MICR-TK***特异性杀死Hela细胞。(a)不同转染条件下Hela细胞的存活情况。向转染NC或者miR-294的Hela细胞中分别转染不同的pre-sgRNA、dCas9-VPR以及TRE-hsvTK表达质粒,并进行GCV处理。Mock对照组转染NC和dCas9-VPR、TRE-hsvTK以及不表达pre-sgRNA的空质粒。3次独立重复实验。比例尺为200μm。(b)不同转染条件下Hela细胞的相对数目。每组数据归一化到Mock对照组。图中所示数据为平均值±标准差。3次独立重复实验。统计方法:Two-tailed unpaired Student’s t-test。
图3为利用MICR-TK***特异性杀死小鼠胚胎干细胞。(a)不同转染条件下小鼠胚胎干细胞的存活情况。3次独立重复实验。比例尺为200μm。(b)不同转染条件下小鼠胚胎干细胞的相对数目。图中所示数据为平均值±标准差。3次独立重复实验。统计方法:Two-tailed unpaired Student’s t-test。
图4为利用MICR-TK***选择性杀死分化体系中未分化的胚胎干细胞。294T-TK小鼠胚胎干细胞在-LIF条件下分化5天后,分别在含有1μM或者不含GCV的胚胎干细胞完全培养基中培养3天后,将3x105个GCV处理或者未处理的细胞重新在12孔板中贴壁生长2-3天后,进行碱性磷酸酶染色。3次独立重复实验。比例尺为200μm。
图5为利用MICR-TK***可以显著降低移植细胞的成瘤性。(a)GCV处理或未处理的294T-TK分化细胞在免疫缺陷鼠体内的成瘤情况。294T-TK小鼠胚胎干细胞在-LIF条件下分化5天后,分别在含有1μM或者不含GCV的胚胎干细胞完全培养基中培养3天;然后将1x106个GCV处理或者未处理的分化细胞分别注射到同一只NOD/SCID免疫缺陷小鼠腹部的左右两侧皮下;细胞注射4-6周后,解剖小鼠并取出两侧的肿瘤组织。(b)GCV处理或者未处理的分化细胞在免疫缺陷鼠体内产生的肿瘤大小统计。3批独立重复实验,共15只小鼠接受实验。统计方法:Two-tailed unpaired Student’s t-test。(c)荷瘤小鼠。小鼠左侧腹部注射GCV处理后的分化细胞,右侧腹部注射未经GCV处理的分化细胞。绿色箭头指示为细胞注射位置。
具体实施方式
CRISPR-Cas9***
CRISPR全称是clustered regularly interspaced short palindromicrepeats,中文译作周期间隔短回文重复序列簇,是一类发现于细菌和古细菌中的基因组序列。Cas9全称是CRISPR-associated protein 9,属于一类核酸酶,Cas蛋白最初于2005-2006年左右被鉴定发现。此后几年(2007-2011)的一系列研究逐渐揭示CRISPR/Cas***作为细菌和古细菌免疫***对抗病毒侵染的机制:研究发现CRISPR序列实际上来源于侵入细菌的质粒或者病毒DNA,并且CRISPR序列可以被转录并加工产生短的RNA,这些RNA片段与Cas蛋白结合起到对抗病毒的作用,因此这些RNA被称为cas related RNA,简称crRNA。后来又发现细菌需要同时表达另外一种RNA来激活Cas蛋白的活性,即tracrRNA(trans-activation Cas related RNA,反式激活crRNA)。最终在2012年的研究中证明Cas9可以和tracrRNA、crRNA结合,切割质粒DNA;研究同时发现tracrRNA和crRNA可以被串联成一条RNA,即sgRNA。至此,CRISPR/Cas9***作为基因编辑工具的条件已经具备,并在2013年被成功应用在哺乳动物的基因编辑上,CRISPR-Cas9时代正式开始。
CRISPR-Cas9***是目前应用最为广泛的基因编辑***。如下图所示,这个***主要由两部分构成:Cas9和sgRNA。Cas9为核酸酶,可以切割DNA,造成双链断裂(doublestrand break,DSB);sgRNA全称为合成引导RNA(synthetic guide RNA),当Cas9和sgRNA结合以后,sgRNA可以激活并引导Cas9蛋白定位到基因组特定位点,由此启动Cas9的基因编辑或调控活性。
由于Cas9包含两个相对独立的功能区域,结合DNA的结构域和切割DNA的结构域。将Cas9的切割DNA活性的结构域突变使其失活后并不会影响Cas9结合DNA的能力,这种Cas9称之为dead Cas9,简写为dCas9。而将其他具有基因调控功能的蛋白与dCas9融合表达后可以赋予dCas9相应的基因调控功能。例如,将VP64、p65和Rta(简称VPR)3种转录激活因子采用串联的形式与dCas9融合表达后(即dCas9-VP64-P65-Rta,简写为dCas9-VPR),可以用与激活与dCas9结合的目的基因的表达水平,而不会造成基因突变。
sgRNA:合成引导RNA(sgRNA)通常为一段长度约110个核苷酸的序列。该序列主要由两部分构成:前端部分为长度约40个核苷酸的crRNA,其5’端包含有人为自主设计的和目标基因的DNA碱基互补配对的约20个核苷酸的序列,具有引导Cas9:sgRNA复合物定位到基因组目标区域的功能;后端部分为约70个核苷酸的tracrRNA序列,该部分与crRNA部分互补配对,形成特定结构,具有招募Cas9蛋白,促进Cas9:sgRNA复合物与目标序列结合的功能。crRNA与traRNA之间一般包含4个核苷酸连接序列。本发明使用sgRNA序列由UCSF的BoHuang于2013年发表,源于酿脓链球菌(S.pyogenes)。
在通常的应用中,一般使用U6启动子来表达sgRNA。这种启动子通过III型RNA聚合酶转录产生有活性的sgRNA。而本发明中使用II型RNA聚合酶的启动子进行转录,那么转录出来的sgRNA由于含有5’帽子和3’多聚核苷酸尾巴(PolyA),不能够发挥功能,因此被称为无活性sgRNA)。需要通过设计去掉5’帽子和3’PolyA才能够将其转变为有活性的sgRNA。
MICR-TK平台
本发明人建立了一种可被miRNA或siRNA诱导的CRISPR-Cas9激活外源毒素基因表达,从而靶向杀伤细胞的实验平台***。本***包含3个部分:由CAGGS启动子驱动表达的dCas9-VPR融合蛋白;由CAGGS启动子驱动表达的pre-sgRNA;由TRE驱动表达的hsvTK毒素蛋白。hsvTK全称为人单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase),是目前肿瘤基因治疗研究中常用的***基因。hsvTK可以将前药更昔洛韦(ganciclovir,GCV)代谢成为GCV-TP,后者可以掺入复制的DNA中,阻止DNA的延伸,最终导致细胞死亡。我们将这套***称之为MICR-TK(MICR toxin killer system)。
在本发明的一个具体实施方案中,所使用的报告基因是hsvTK毒素蛋白,该毒素基因被该基因上游的启动子控制表达。因此可设计与该上游启动子序列互补的sgRNA序列,并在该sgRNA序列的两端连接与目标miRNA或siRNA序列完全互补的RNA序列,这个就是所述的前体单链引导RNA(pre-sgRNA,在本发明中也表示为miRT-sgRNA-miRT,miRT表示与目标miRNA完全互补的序列),在pre-sgRNA的两端分别有5’帽子和3’PolyA,使得该pre-sgRNA处于无活性的状态。同时,将dCas9蛋白与转录激活因子相连接以增强其转录活性。
将该平台导入靶细胞后,如果该靶细胞中没有目标miRNA或siRNA的表达,则整个***处于未被激活的状态,外源毒素基因也不会表达,无法将前体药物GCV催化成为对细胞有毒性的小分子。如果该靶细胞中表达目标miRNA或siRNA,则该目标miRNA或siRNA就会与pre-sgRNA两端的与其完全互补的RNA序列相结合,从而启动miRNA或siRNA介导的RNA切割机制而导致该完全互补RNA序列被切割。而该完全互补RNA序列的切割则导致sgRNA与其两端的5’帽子和3’PolyA相脱离从而具有引导活性。有活性的sgRNA就会将dCas9蛋白引导至外源毒素基因上游的启动子位置,使得dCas9蛋白与该启动子相结合。在结合之后,dCas9蛋白上携带的转录激活因子就驱动了外源毒素基因的表达,将前体药物GCV催化成为对细胞有毒性的小分子,从而杀死细胞。以上过程就是本发明的主要原理。
在本发明的具体实施方案中,所述外源毒素基因可以是hsvTK毒素蛋白、DTA毒素蛋白等各种可以用于杀伤哺乳动物细胞的毒素基因。
在本发明的具体实施方案中,所述外源毒素基因的启动子可以是能够驱动外源毒素基因表达的各种诱导型启动子。
在本发明的具体实施方案中,dCas9蛋白所携带的转录激活因子可以是各种本领域技术人员已知的转录激活因子。
在本发明的具体实施方案中,与目标miRNA或siRNA完全互补的RNA序列存在所述sgRNA的两端。
在本发明的具体实施方案中,存在于所述sgRNA两端的与目标miRNA或siRNA完全互补的RNA序列是相同序列。
本发明提供的DNA靶向杀伤***通过利用RNA干扰机制和CRISPR-Cas9***相结合,将原本对基因表达起抑制作用的miRNA或siRNA转变为激活基因表达的信号,从而有效地实现了外源毒素基因的激活表达,可以用于靶向杀伤表达目标miRNA或siRNA的细胞。因此具有重大的实际意义和广泛的应用前景。
术语和缩写
在本说明书中使用了一些术语和缩写,其含义如下所述,未特别说明的术语和缩写具有本领域技术人员公知的含义。
RNAi:RNA干扰(RNA interference);
siRNA:小干扰RNA(small interfering RNA);
miRNA:微小RNA(microRNA)
miR:各种miRNA的缩写,通常后面跟有数字及字母编号以表示其命名,各种miR的编号及其序列在本领域中都是公知的。
miRT:表示与目标miRNA或siRNA完全互补的序列
sgRNA:合成引导RNA(synthetic guide RNA);
pre-sgRNA:前体合成引导RNA,含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及sgRNA的序列,亦可表示为miRT-sgRNA或者miRT-sgRNA-miRT;
CRISPR:周期间隔短回文重复序列簇(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats);
Cas9:周期间隔短回文重复序列簇相关蛋白9(CRISPR-associated protein9);
dCas9:核酸酶缺陷型Cas9,由于其核酸酶活性区域被突变,从而丧失了DNA切割活性而仅保留了DNA结合活性;
hsvTK:人单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase)。
MICR-TK:可被miRNA或siRNA诱导的CRISPR-Cas9激活外源毒素基因表达,从而靶向杀伤细胞的实验平台***(MICR toxin killer system);
dCas9-VPR:将VP64、p65和Rta(简称VPR)3种转录激活因子采用串联的形式与dCas9连接的产物。
通过下面的参考示范性实施例,本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而,本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例;可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。
在下文中,将参考附图描述本发明的实施例。在附图中,相同的附图标记代表相同或类似的部件,或者相同或类似的步骤。
实施例1
材料和方法
质粒和载体的构建
将dCas9-VPR连接于含有由PGK启动子驱动的潮霉素抗性基因的piggyBac载体中,所述dCas9-VPR由CAGGS启动子驱动。将pre-sgRNA(两端含有与目标miRNA或siRNA完全互补的RNA序列的sgRNA序列,简称为miRT-sgRNA-miRT)连接于含有由PGK启动子驱动的博来霉素(zeocin)抗性基因的piggyBac载体中,所述pre-sgRNA也由CAGGS启动子驱动。将由具有TRE3G元件的上游CMV小启动子控制的毒素蛋白hsvTK连接于无抗性基因的piggyBac载体中。为了制备对目标miRNA或siRNA敏感的miRT-sgRNA-miRT构建体,使用Fastpfu聚合酶(Transgene公司),以含有sgRNA的质粒为模板(所述sgRNA的序列与TRE3G元件的序列互补),用与miRT相对应的引物进行PCR。PCR产物与EcoRI-HF(20U,NEB公司)和BamHI-HF(20U,NEB公司)在37℃下孵育2h,用旋转柱(Magen公司)纯化,并用T4连接酶(Life Technology公司)连接到经过EcoRI和BamHI消化的piggyBac载体上。
细胞培养,质粒转染和小RNA转染
1)细胞培养
小鼠V6.5胚胎干细胞正常培养在ES完全培养基中。小鼠胚胎干细胞正常培养时,所使用的培养皿需事先经过0.1%明胶包被处理(室温5-10分钟)。在细胞生长到70%-80%汇合度时进行传代培养。传代时,将旧培养基吸除,用1×PBS清洗一遍后,加入0.1%Trypsin,于37℃消化3-5分钟;加入适量新鲜培养基终止消化后,用1ml无菌枪头轻轻吹打10-15次后,进行细胞计数;将小鼠V6.5胚胎干细胞按照2.5x104/cm2进行接种到含有适量新鲜培养基的培养皿中(以12孔板为例,加入1ml新鲜培养基即可),轻轻摇匀后置于37℃,5%CO2条件下进行培养。一般2-3天传代1次。
Hela细胞培养在高糖培养基中(DMEM+10%FBS+P/S)。培养皿不需要特殊处理。在细胞生长到70%-80%汇合度时进行传代培养。细胞消化完成后(操作方法与小鼠胚胎干细胞相同),按照1:3比例进行接种,轻轻摇匀后置于37℃,5%CO2条件下进行培养。一般2天传代1次。
小鼠胚胎干细胞的分化方法:分化前一天,将细胞按照2,500/cm2密度接种到0.1%明胶包被处理、含有适量ES完全培养基的培养皿中。16-20小时后,将ES完全培养基吸除,并用1xPBS清洗一遍后,加入适量ES分化培养基。将细胞置于37℃,5%CO2条件下进行分化,期间每天更换新鲜的ES分化培养基。
2)细胞转染和细胞系构建
294T-TK和122T-TK小鼠胚胎干细胞构建方法:在转染前16-20小时,将1.0x105个V6.5小鼠胚胎干细胞接种到12孔板中(0.1%明胶包被处理);转染时,按照Lipofectamine3000试剂使用说明,将0.45μg dCas9-VPR、0.45μg miR-294T pre-sgRNA、0.1μg TRE-hsvTK和0.5μg pBase表达质粒转染到细胞中;转染24小时后,将培养基换成含有150μg/mlhygromycin B和100μg/ml Zeocin的ES完全培养基;筛选培养1-2周后挑选克隆进行后续实验。
利用MICR-TK***杀伤Hela细胞:在转染前16-20小时,将3.0x104个Hela细胞接种到48孔板中;使用DharmaFECT分别转染NC和miR-294mimics,终浓度为20nM;转染后6小时使用试剂进行质粒转染,每孔转染145ng dCas9-VPR、100ng pre-sgRNA和5ngTRE-hsvTK表达质粒;转染后24小时,将细胞按照1:3比例重新接种到24孔板中(每组2个孔);16-20小时后,分别加入含有1μM或不含有GCV的培养基进行细胞培养;培养3天后,将细胞按照1:3比例重新接种到不含GCV的新的24孔板中继续培养2天,进行成像和细胞计数。
统计学分析
除非另有说明,数据以平均值±SD表示。我们进行双尾不成对Student’s t检验以确定统计学显著性。P值<0.05被认为是具有统计学显著性。
实施例2
利用MICR-TK***特异性杀死Hela细胞
本实施例的MICR-TK平台包含以下三个组分:表达dCas9-VPR的质粒,表达pre-sgRNA(miRT-sgRNA-miRT)的质粒,和含有被四环素诱导型启动子控制的hsvTK毒素基因的质粒。我们首先在Hela细胞中测试了该MICR-TK***对细胞的杀伤效果。我们分别构建了表达pre-sgRNA(miR294T-sgRNA-miR-294T,简称miR-294T)和pre-sgRNA(miR21T-sgRNA-miR-21T,简称miR-21T)的质粒,它们产生的pre-sgRNA的两端均含有与目标miRNA即miR-294-3p(也被称为miR-294)和miR-21-5p(也被称为miR-21)完全互补的序列,miR-21是一种在Hela细胞中高表达的miRNA,而miR-294在Hela细胞中并不存在。
实验结果见图2,在转染dCas9-VPR、miR-21T和TRE-hsvTK并加入GCV处理后,Hela细胞数目显著减少;而转染dCas9-VPR、miR-294T和TRE-hsvTK(+GCV)组并没有明显的细胞减少,只有当外源转染miR-294后才会导致Hela细胞数目显著减少。该结果说明MICR-TK***可以通过miRNA诱导的方式有效且特异性地杀伤细胞。
实施例3
利用MICR-TK***特异性杀死小鼠胚胎干细胞
我们接着在小鼠胚胎干细胞中测试了该MICR-TK***对细胞的杀伤效果。我们分别构建了表达pre-sgRNA(miR294T-sgRNA-miR-294T,简称miR-294T)和pre-sgRNA(miR122T-sgRNA-miR-122T,简称miR-122T)的质粒,它们产生的pre-sgRNA的两端均含有与miR-294和miR-122-5p(也被称为miR-122)完全互补的序列,miR-294是一种在小鼠胚胎干细胞中高表达的miRNA,而miR-122在小鼠胚胎干细胞中基本不表达。
实验结果见图3,在转染dCas9-VPR、miR-294T和TRE-hsvTK并加入GCV处理后,小鼠胚胎干细胞中数目显著减少;而转染dCas9-VPR、miR-122T和TRE-hsvTK(+GCV)组并没有明显的细胞减少,只有当外源转染miR-122后才会导致小鼠胚胎干细胞中数目显著减少。该结果说明MICR-TK***可以通过miRNA诱导的方式有效且特异性地杀伤小鼠胚胎干细胞。
实施例4
利用MICR-TK***选择性杀死分化体系中的胚胎干细胞
在本实施例中,我们证明了MICR-TK***可以用于去除分化体系中残留的小鼠胚胎干细胞。由于胚胎干细胞和诱导型多能干细胞具有自我更新和分化成为所有成体细胞的潜能,因而在当前生物医学的基础研究和转化研究中颇受青睐;通过将胚胎干细胞或者诱导型多能干细胞分化成为具有特定临床应用功能的细胞类型是当前细胞治疗和再生医学的主要方向之一。该领域面临的主要技术难题之一是如何有效获得高纯度的功能细胞,去除未分化的细胞类型,以消除移植后未分化细胞引起的成瘤性带来的安全风险。
为了确定是否可以利用MICR-TK***消除未分化的胚胎干细胞引起的成瘤性,本研究首先选择小鼠胚胎干细胞中特异性表达的miR-294,构建了dCas9-VPR、miR-294T和TRE-hsvTK的细胞系(简称为294T-TK小鼠胚胎干细胞),检测了GCV小分子处理是否可以有效杀死294T-TK小鼠胚胎干细胞。
我们将294T-TK小鼠胚胎干细胞在-LIF条件下分化5天后,分别在含有1μM或者不含GCV的胚胎干细胞完全培养基中培养3天后,将3x105个GCV处理或者未处理的细胞重新在12孔板中贴壁生长2-3天后,进行碱性磷酸酶染色。只有保持多能性、尚未分化的细胞可以被碱性磷酸酶染色,而已分化的细胞则不能被染色。实验结果见图4,表明加入GCV处理的确可以有效杀死294T-TK小鼠胚胎干细胞,只留下已分化的细胞。
实施例5
利用MICR-TK***可以显著降低移植细胞的成瘤性本实施例中我们探究了MICR-TK***是否可以有效降低移植细胞产生的成瘤性。本研究将294T-TK小鼠胚胎干细胞在不加LIF的培养基中分化5天后,将细胞在完全培养基中继续培养3天,并对细胞进行+/-GCV处理;3天后将相同数目的GCV处理或未处理的细胞注射到免疫缺陷型小鼠体内进行成瘤性检测。实验结果见图5,表明GCV处理组的细胞在免疫缺陷型小鼠体内形成的肿瘤尺寸和重量的确显著小于GCV未处理组的细胞。该结果说明MICR-TK***的预处理可以有效降低移植细胞的成瘤性。
通过公开的上述实施例,本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明书中的具体描述仅被认为是示例性的,本发明的真正范围和主旨均由本发明的权利要求书所限定。
Claims (7)
1.一种利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA***,所述细胞杀伤***包括以下几个部分:
1)表达核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白的质粒;
2)表达前体单链引导RNA的质粒,所述前体合成引导RNA的含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA(sgRNA)的序列;
3)外源毒素基因;
所述杀伤***用于利用细胞特异性表达的miRNA或siRNA驱动外源毒素基因表达,从而实现细胞的靶向杀伤。
2.根据权利要求1所述的利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA***,其中所述核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白与转录激活因子相连接。
3.根据权利要求2所述的利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA***,其中所述转录激活因子为VP64、p65和Rta中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA***,其中所述前体合成引导RNA在合成引导RNA的序列两端均含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列。
5.根据权利要求5所述的利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA***,其中所述前体合成引导RNA在合成引导RNA的序列两端含有的与目标miRNA或siRNA完全互补的序列是相同的序列。
6.根据权利要求1所述的利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA***,其中所述合成引导RNA的序列与所述外源毒素基因的启动子序列互补,以使得所述sgRNA可以将所述核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白引导至所述外源毒素基因的启动子处。
7.根据权利要求1所述的利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA***,其中所述外源毒素基因为hsvTK毒素基因,全称为人单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase)。
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