CN113897363B - 敲除ace2基因的胚胎干细胞细胞亚系、构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种敲除多能干细胞中ACE2基因的方法,包括采用一对核苷酸序列如SEQ ID No.5~8所示的sgRNA,分别克隆到质粒载体上后,与Cas9质粒共转染多能干细胞。本发明还公开了该敲除方法所采用的一对sgRNA、质粒与成套质粒,一种敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系的构建方法,以及一种敲除ACE2基因的人源分化细胞模型的建立方法。本发明在多能干细胞上的双gRNA敲除方法具有敲除效率高、容易操作的优点。基于该敲除方法所构建的胚胎干细胞细胞亚系可发展为任意免于新冠病毒侵染的人源性细胞/组织/类器官模型,在研究治疗新冠病毒的药物和疫苗研发等方面具有极为重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑和干细胞分化技术领域,尤其涉及一种敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系、构建方法及其在制备、筛选、评价抗新冠病毒疫苗、药物中的应用。
背景技术
COVID-19的全球大爆发,给世界经济和公共卫生带来了巨大挑战。SARS-CoV-2是新冠病人的主要致病病原,刺突蛋白(S蛋白)是介导病毒入侵宿主细胞的关键蛋白。研究发现新型冠状病毒与ACE2受体结合后进入宿主细胞。单细胞测序数据发现ACE2蛋白在肺泡细胞中显著表达。也有研究发现ACE2蛋白在鼻腔上皮细胞中具有高度聚集性。因此,ACE2在新冠病毒感染中发挥了主要的作用。
在现有的新冠病毒的疫苗、药物的研究过程中,一般采用动物模型进行验证。但动物与人体差异仍较大,动物体内上的各种机制研究或者药物实验结果未能真实地反应人体情况,导致现在利用动物产生的疫苗还是存在较多的不良反应。也有研究者采用器官芯片技术,建立了基于组织水平的新冠病毒感染模型,模拟了新冠病毒感染导致的肺组织屏障损伤,免疫细胞粘附,炎症因子释放和肺微血管内皮细胞损伤等一系列病理生理改变。此外,还有学者运用有源于胚胎干细胞或诱导多能干细胞的类器官模型研究新冠病毒。这些模型已经较动物模型更为贴近人体状态,但建立起来还是需要相当的难度。如何建立建模时间短、消耗低和人源性等特点,快速开展病毒致病机理、病毒传播和快速药物测试等方面的人源人源分化细胞模型是攻克病毒的重要路径。另外,目前研究新冠病毒感染的很多实验模型常常使用过表达ACE2基因的方法,但这并不能体现ACE2的真实功能,因为过表达的基因功能与细胞实际表达水平下所产生的功能不尽相同。因此,有必要构建ACE2基因敲除的细胞系进行验证。
扩展潜能干细胞(EPSC)是一种新型的胚胎干细胞,可发展成任何类型的组织细胞,在疾病的研究、治疗方面具有极其重要的前景。文献检索发现,迄今尚未有在胚胎干细胞敲除ACE2基因,从而建立ACE2基因敲除的干胚胎干细胞细胞亚系的方法,且也未有敲除胚胎干细胞后对分化能力的相关报道。
申请人通过实验发现,人源EPSC细胞(hEPSC)不表达ACE2,对新冠病毒不易感;而在其胚外分化的细胞上ACE2表达并对新冠病毒易感,这不仅仅提示ACE2在EPSC胚外分化细胞感染新冠病毒中发挥主要作用,也预示着EPSC在其后续分化中可能表达ACE2并对新冠病毒易感,因此,如果后续要使由EPSC分化的各类人源分化细胞模型或类器官模型等免受新冠病毒感染的风险,或利用从分化的EPSC或基因编辑的EPSC制备得到的各种细胞产品(包括外泌体等)时,皆需要先建立敲除ACE2基因的ESPC胚胎干细胞细胞亚系。鉴于上述原因,在EPSC构建敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系具有重要的应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,提供一种敲除多能干细胞中ACE2基因的方法,其敲除效率高,控制难度低。
本发明还要解决的技术问题在于,提供一种敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系的构建方法。
本发明还要解决的技术问题在于,提供一种敲除ACE2基因的人源分化细胞模型的建立方法。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种敲除多能干细胞中ACE2基因的方法,其包括:采用一对核苷酸序列如SEQ ID No.5~8所示的sgRNA,分别克隆到gRNA质粒载体上后,与Cas9质粒共转染多能干细胞。
作为上述技术方案的改进,所述多能干细胞为EPSC细胞或iPSC细胞。
作为上述技术方案的改进,所述多能干细胞为人源扩展潜能干细胞。
相应的,本发明还提供了一种敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系的构建方法,其包括:采用CRISPR/Cas9技术构建敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系,所述构建方法包括:采用一对核苷酸序列如SEQ ID No.5~8所示的sgRNA,分别克隆到gRNA质粒载体上后,与Cas9质粒共转染人源扩展潜能干细胞,得到重组细胞,将所述重组细胞培养后得到敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系。
相应的,本发明还提供了一种敲除ACE2基因的人源分化细胞模型的建立方法,其包括:采用一对核苷酸序列如SEQ ID No.5~8所示的sgRNA,分别克隆到质粒载体上后,与Cas9质粒共转染人源扩展潜能干细胞,得到重组细胞,将所述重组细胞扩增后在TGF-β抑制剂作用下诱导分化为胚外分化细胞,即得敲除ACE2基因的胚外分化人源分化细胞模型。
作为上述技术方案的改进,所述gRNA质粒载体为pKLV2-U6sgRNA。
作为上述技术方案的改进,所述Cas9质粒为pKLV2-EF1α-BsdCas9-W质粒。
作为上述技术方案的改进,所述sgRNA与所述gRNA质粒载体通过BbsⅠ酶切连接。
作为上述技术方案的改进,所述转染为电转染。
作为上述技术方案的改进,采用核苷酸序列如SEQ ID No.5~8所述的一对sgRNA,分别克隆到经BbsI酶切后线性化的pKLV2-U6sgRNA质粒载体上,得到pKLV2-U6sgRNA1质粒和pKLV2-U6sgRNA2质粒,并将pKLV2-U6sgRNA1质粒、pKLV2-U6sgRNA2质粒和pKLV2-EF1α-BsdCas9-W质粒按照预设比例混合均匀,得到混合质粒,采用所述混合质粒转染人源扩展潜能干细胞。
作为上述技术方案的改进,所述pKLV2-EF1α-BsdCas9-W质粒、pKLV2-U6sgRNA1质粒和pKLV2-U6sgRNA2质粒的重量比为:(4~10):(2~5):(2~5)。
作为上述技术方案的改进,采用TGF-β抑制剂SB431542诱导所述重组细胞分化为胚外分化细胞。
相应的,本发明还公开了一种用于敲除多能干细胞中ACE2基因的sgRNA,其核苷酸序列如SEQ ID No.5~8所示。
相应的,本发明还公开了一种质粒,其为上述的pKLV2-U6sgRNA1质粒或pKLV2-U6sgRNA2质粒。
相应的,本发明还公开了一种成套质粒,其包括上述的pKLV2-U6sgRNA1质粒、pKLV2-U6sgRNA2质粒和pKLV2-EF1α-BsdCas9-W质粒。
相应的,本发明还公开了上述的sgRNA在(1)或(2)中的应用:
(1)在构建敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系中的应用;或
(2)在建立敲除ACE2基因的人源分化细胞模型中的应用。
相应的,本发明还公开了上述的质粒在(1)或(2)中的应用:
(1)在构建敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系中的应用;或
(2)在建立敲除ACE2基因的人源分化细胞模型中的应用。
相应的,本发明还公开了上述的成套质粒在(1)或(2)中的应用:
(1)在构建敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系中的应用;或
(2)在建立敲除ACE2基因的人源分化细胞模型中的应用。
相应的,本发明还公开了一种敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系,其由上述的方法构建。
相应的,本发明还公开了一种敲除ACE2基因的人源分化细胞模型,其由上述的方法建立。
相应的,本发明还公开了上述的敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系在制备、筛选、评价抗COVID-19的疫苗中的应用。
相应的,本发明还公开了上述的敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系在制备、筛选、评价抗COVID-19的药物中的应用。
相应的,本发明还公开了上述的敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系在下述(1)~(3)任一项中的应用:
(1)在建立敲除ACE2基因的人源分化细胞模型中的应用;
(2)在建立干细胞诱导的抗COVID-19的类器官中的应用;
(3)在制备敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系的外泌体的应用。
相应的,本发明还公开了上述的敲除ACE2基因的人源分化细胞模型在下述(1)~(3)任一项中的应用:
(1)在建立干细胞诱导的抗COVID-19的类器官中的应用;
(2)在制备敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系的外泌体的应用
(3)在制备、筛选、评价抗COVID-19的疫苗、药物中的应用。
实施本发明,具有如下有益效果:
本发明通过特定的一对sgRNA,采用CRISPR/Cas9技术高效地敲除了人源扩展潜能干细胞中的ACE2基因,其敲除彻底,且操作方法简单。敲除得到的胚胎干细胞细胞亚系具有胚外发育能力,可继续诱导为不被新冠病毒感染的人源分化细胞模型。且该敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系可发展为任意免于新冠病毒侵染的人源性细胞/组织/类器官模型,在研究新冠病毒的药物、疫苗等方面具有极为重要的意义。
附图说明
图1是PCR检测ACE2敲除的基因组表型图;
图2是Western blot验证分析ACE2敲除效果的分析图;
图3是正常人源EPSC细胞(EPSCs)及ACE2基因敲除后人源EPSC细胞(ACE2-KO)的RT-qPCR分析结果图;
图4是正常人源EPSC细胞(EPSCs)及ACE2基因敲除后人源EPSC细胞(ACE2-KO)的流式细胞检测结果图;
图5是正常人源EPSC细胞(hEPSC)干性和多潜能标志的免疫荧光检测图;
图6是正常人源EPSC细胞(hEPSC)多能性标记的RT-qPCR检测图;
图7是正常人源EPSC细胞(hEPSC)中ACE2、TMPRSS2、CD147的表达检测图(RT-qPCR);
图8是SARS-CoV-2感染正常人源EPSC细胞(hEPSC)后用RT-qPCR分析细胞内病毒基因表达拷贝数的检测结果图;
图9是SARS-CoV-2感染正常人源EPSC细胞(hEPSC)后用RT-qPCR检测多能性基因表达的检测结果图;
图10是SARS-CoV-2感染正常人源EPSC细胞(hEPSC)后用免疫荧光检测多潜能标志和病毒蛋白表达的检测结果图;
图11是SB43诱导正常人源EPSC细胞(EPSCs)向胚外分化细胞分化第9天(SB43_9)的细胞相关因子和标志物分析结果图(RT-qPCR);
图12是SB43诱导正常人源EPSC细胞(hEPSCs)向胚外分化细胞第4天、第9天(SB43_Day4、SB43_Day9)中ACE2、TMPRSS2、CD147的表达检测图(RT-qPCR);
图13是SARS-CoV-2感染SB43诱导正常人源EPSC细胞向胚外分化细胞分化第4天、第9天(SB43_D4、SB43_D9)后细胞上清液中的病毒载量检测图;
图14是0.1 MOI的SARS-CoV-2感染SB43诱导正常人源EPSC细胞向胚外分化细胞分化第4天(SB43 Day4)后细胞上清液中病毒载量与Caco2细胞和Vero E6细胞的病毒载量比较图;
图15是SARS-CoV-2感染SB43诱导正常人源EPSC细胞向胚外分化细胞分化第4天、第9天(SB43_D4、SB43_D9)细胞内病毒复制情况的RT-qPCR分析结果图;
图16是SARS-CoV-2感染SB43诱导正常人源EPSC细胞向胚外分化细胞分化第4天(SB43_Day4)的免疫荧光共聚焦检测图;
图17是正常人源EPSC细胞(EPSCs)和ACE2敲除的亚细胞(ACE-KO-EPSCs)在SARS-CoV-2感染后病毒基因拷贝数的分析结果图(RT-qPCR);
图18是正常人源EPSC细胞(WT)及ACE2敲除的胚胎干细胞细胞亚系(ACE-KO)经SB43诱导后(day4)ACE2、TMPRSS2、CD147的表达检测图(RT-qPCR);
图19是正常人源EPSC细胞(WT)及ACE2敲除的胚胎干细胞细胞亚系(ACE-KO)经SB43诱导后(day4)感染0.1 MOI的SARS-CoV-2后细胞上清液中的病毒载量比较图;
图20是正常人源EPSC细胞(WT)及ACE2敲除的亚细胞(ACE-KO)经SB43诱导后(day4)在感染SARS-CoV-2病毒48hr后免疫荧光共聚焦检测结果图;
图21是正常人源EPSC细胞(WT)及ACE2敲除的胚胎干细胞细胞亚系(KO)经SB43诱导后(day4)细胞分化功能标志的检测图(RT-qPCR);
图22是gRNA质粒(pKLV2-U6sgRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFB-W)的结构图谱;
图23是Cas9 质粒(pKLV2-EF1α-BsdCas9-W)的结构图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
一、敲除人源扩展潜能干细胞(hEPSC细胞)中ACE2基因的方法
作为本发明的第一个方面,本发明提供了一种敲除hEPSC细胞中ACE2基因的方法,其具体包括:
(一)选用人源EPSC细胞,并对其进行培养;
具体的,取M1-hEPSC细胞,
将M1-hEPSC细胞置于SNL饲养层细胞上,每3-5天传代一次,即用PBS冲洗后,加入EDTA-0.25%胰蛋白酶处理3-5分钟,用含10%胎牛血清的DMEM培养基(M10)终止消化,并收集细胞液离心(300g,离心3分钟)。去除上清液后,重悬hEPSC。将hEPSC细胞接种于添加5 µMY27632(Tocris, cat. no.1254)的hEPSCM中(这里采用的hEPSCM是基于N2B27的培养基)。
需要说明的是,本发明中对人源EPSC细胞进行培养的方法不限于于此,本领域亦可根据具体情况选择其他前处理方法、其他培养基对各类人源EPSC细胞进行培养。
(二)sgRNA设计、合成;
具体的,在Ensemble(https://asia.ensembl.org/index.html)中搜索ACE2基因(Transcript: ACE2-202ENST00000427411.2);根据待编辑的靶序列(一般位于比较靠前的外显子),将上述序列输入在线设计工具(http://crispr.mit.edu/),选择20bp、PAM序列为“NGG”的设计原则,软件自动设计gRNA的序列并排序。可以获得多个可供选择的gRNA序列。如:
gRNA1
hACE2-gRNA1-F:GAATAATGCTGGGGACAAA(SEQ ID No.1)
hACE2-gRNA1-R:TTTGTCCCCAGCATTATTC(SEQ ID No.2)
gRNA2
hACE2-gRNA2-F:CTCAGAAGACAAGAGCAAA(SEQ ID No.3)
hACE2-gRNA2-R:TTTGCTCTTGTCTTCTGAG (SEQ ID No.4)
gRNA3
hACE2-gRNA3-F: TGAGCACCATCTACAGTAC
hACE2-gRNA3-R: GTACTGTAGATGGTGCTCA
gRNA4
hACE2-gRNA4-F:CAGTTTAGACTACAATGAG
hACE2-gRNA4-R:CTCATTGTAGTCTAAACTG
gRNA5
hACE2-gRNA5-F:GTGGTCTTGAAAAATGAGA
hACE2-gRNA5-R:TCTCATTTTTCAAGACCAC
gRNA6
hACE2-gRNA6-F:ATGTGCACAAAGGTGACAA
hACE2-gRNA6-R:TTGTCACCTTTGTGCACAT
gRNA7
hACE2-gRNA7-F:CTAAGCATTTAAAATCCAT
hACE2-gRNA7-R:ATGGATTTTAAATGCTTAG
结果发现,gRNA1与gRNA2脱靶效应较少,容易进行片段敲除,且容易进行基因型鉴定(两个序列之间至少有100bp以上大小的差异间距,这样在敲除该片段后在凝胶电泳时会出现两条不同的条带,因而比较容易进行基因型鉴定),故选择这两个gRNA序列。
进一步的,在上述gRNA的5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸序列,在其互补链的5'端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列、最末端添加一个C得到sgRNA引物序列如下:
sgRNA1
hACE2-sgRNA1-F:CACCGGAATAATGCTGGGGACAAA(SEQ ID No.5)
hACE2-sgRNA1-R:AAACTTTGTCCCCAGCATTATTCC(SEQ ID No.6)
sgRNA2
hACE2-sgRNA2-F:CACCGCTCAGAAGACAAGAGCAAA(SEQ ID No.7)
hACE2-sgRNA2-R:AAACTTTGCTCTTGTCTTCTGAGC(SEQ ID No.8)
通过上海生工公司分别合成正向和反向寡核苷酸序列引物,用其摩尔浓度10倍的去离子水稀释成100uM,4℃储存备用。
(三)质粒RNA构建
1、sgRNA引物退火,形成双链体系
取正向寡核苷酸序列引物(hACE2-sgRNA1-F或hACE2-sgRNA2-F)以及其相对应的反向寡核苷酸序列引物((hACE2-sgRNA1-R或hACE2-sgRNA2-R)组成两对体系,并在PCR仪上变性、退火,得到双链寡核苷酸链,退火后的双链寡核苷酸链含有BbsI的粘性末端。
具体的,变性、退火体系总体积为20μL,其中,正向寡核苷酸链(100μM) 1μL,反向寡核苷酸链(100μM) 1μL,H2O 18μL。
PCR仪的运行程序如下:95℃,10min;
在本发明的另一实施例之中,PCR仪的运行程序如下:95℃,10min;70℃,10min;37℃,20min;25℃,20min。
2、酶切gRNA通用质粒进行线性化
其中,选用带有U6启动子和BbsI酶切位点的通用型gRNA载体进行BbsI酶切。优选的,选用pKLV2-U6sgRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFB-W(简称pKLV2-U6sgRNA)作为载体,在PCR仪上酶切,酶切后的质粒用1%琼脂糖凝胶进行电泳,切取目的条带的凝胶后用Takara胶回收试剂盒回收DNA产物。
具体的,酶切总体系的体积为100μL,其中,10×SmartCut buffer 10μL,BbsI酶 3μL,pKLV2-U6sgRNA 10μg,ddH2O余量。
具体的,PCR运行程序为:37℃ 酶切6-8hr(或过夜)。
3、sgRNA与酶切线性化的gRNA载体进行连接
两对退火后的双链寡核苷酸链与被BbsI酶切过的pKLV2-U6sgRNA载体在PCR仪进行连接,可以分别得到pKLV2-U6sgRNA1和pKLV2-U6sgRNA2重组sgRNA质粒。
具体的,连接总体系的体积为10μL,其中,退火后得到的双链寡核苷酸链 4.5μL,线性化的pKLV2-U6sgRNA质粒0.5μL(>50ng/uL),Takara连接混合物 5μL。
具体的,PCR仪的运行程序为16℃ 1-2 hr,取出放4℃储存。
4、质粒转化与鉴定
将上述步骤得到的连接产物1uL加入置于冰上的DH5a感受态细胞,转化30min后,将细菌涂布于氨苄青霉素阳性的(Amp+)的琼脂糖凝胶(LB)平板。生长过夜后,挑取阳性克隆菌,放入氨苄青霉素阳性的LB溶液中37℃摇床摇菌过夜,Takara质粒抽提试剂盒提取质粒并进行测序鉴定,鉴定后得到测序正确的pKLV2-U6sgRNA质粒(图22)。具体的,sgRNA1对应的质粒命名为pKLV2-U6sgRNA1质粒,sgRNA2对应的质粒命名为pKLV2-U6sgRNA2质粒。
其中,测序总体系为15μL,其中,退火后得到的双链寡核苷酸链 1μL,U6引物 1μL,ddH2O 13μL。其中,
U6引物序列如下:
5’-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3’
同理,采用Cas9 质粒(pKLV2-EF1α-BsdCas9-W)进行上述转化和扩增,-20℃ 储存待用。
(四)采用混合质粒转染人源EPSC细胞;
具体的,可选用脂质体转染、核转染或电穿孔转染,但不限于此。
优选的,在本发明中,采用电穿孔工艺转染,其具体方法如下:
当hEPSC细胞密度达到70-80%,翌日可进行电穿孔。在处理hEPSC前5-10分钟制备混合质粒【将pKLV2-EF1α-BsdCas9-W质粒(图23):pKLV2-U6sgRNA1质粒:pKLV2-U6sgRNA2质粒以2:1:1的比例放入200uL转染专用MEM,用量范围可在4ug:2ug:2ug 或10ug:5ug:5ug区间】,然后将hEPSC细胞经PBS洗涤2次和EDTA-0.05%胰酶处理10分钟后,加入M10培养基中和胰酶。收集消化的细胞离心(300g×3min)后,弃上清。将1×106个细胞在含有混合质粒的200uL MEM培养基中重悬,再转移到0.4cm的电转杯中,随后立即进行电穿孔(BioRADGenePulser,230V 500uF)。然后加入人EPSC培养基(500uL)和10uM的 Rock inhibitor(Y27632),将细胞轻轻吹打成单细胞后接种于6孔板的2-3孔中。24小时后,换成正常EPSC培养基继续培养,加入杀稻瘟菌素(BSD,10ug),第三天加入嘌呤霉素(Puromycin)药物筛选,持续3-4天后停药。7-10天后挑取阳性克隆。
(五)DNA PCR检测ACE2敲除的基因组表型
挑取24个克隆,以未编辑的EPSC细胞作为对照,对每个克隆的基因组进行PCR扩增。扩增引物、扩增体系、扩增程序如下:
(1)扩增引物:在sgRNA序列外200bp~1000bp以内设计引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
具体的,设计得到的基因型鉴定引物如下:
ACE2-g1-geno-F:GTGGCCTGGTCACTCTTAAC(SEQ ID No.9)
ACE2-g1-geno-R:CAAATAAAGGCAGCTGCTGTG(SEQ ID No.10)
(2)扩增体系:总20μL,其中,Takara混合缓冲液 10uL,ACE2-g1-geno-F(10μM)0.8μL,ACE2-g1-geno-R(10μM) 0.8μL,亲本细胞或转染细胞(ACE2-KO)的基因组DNA 0.4μL,ddH2O 8uL。
(3)扩增程序:95°C 30s;64°C 30s,从第五个循环后每个循环降低0.4°C;72°C1min)35个循环;72°C 3min;4°C储存。
检测结果如表1及图1所示;由表中可以看出:Sanger测序鉴定PCR胶回收片段显示148bp的敲除在ACE2基因的第二编码外显子的两个gRNAs之间,且筛选的24个克隆中4个为杂合敲除,5个为纯合敲除,表明hEPSC中ACE2基因编辑的效率高。其中,在图1中,只有418bp左右条带的为非编辑细胞(WT),只有270bp条带的为双等位基因编辑细胞(DKO),既有418bp左右条带也有270bp条带的为单等位基因编辑细胞。
其中,截取测序结果图中WT细胞的基因组序列为:
GTCATTTCAGAATAATGCTGGGGACAAATGGTCTGCCTTTTTAAAGGAACAGTCCACACTTGCCCAAATGTATCCACTACAAGAAATTCAGAATCTCACAGTCAAGCTTCAGCTGCAGGCTCTTCAGCAAAATGGGTCTTCAGTGCTCTCAGAAGACAAGAGCAAACGGGTACGTTTGTGAACATTTTAGCATTGATC
截取测序结果图中敲除ACE2后的序列为:
GTCATTTCAGAATAATGCTGGGGAC GTTTGTGAACATTTTAGCATTGATC
对比上述序列,可确定被敲除的序列为148bp,其序列为:
AAATGGTCTGCCTTTTTAAAGGAACAGTCCACACTTGCCCAAATGTATCCACTACAAGAAATTCAGAATCTCACAGTCAAGCTTCAGCTGCAGGCTCTTCAGCAAAATGGGTCTTCAGTGCTCTCAGAAGACAAGAGCAAACGGGTAC
可见,其中gRNA1序列(GAATAATGCTGGGGACAAA)从最后三个AAA碱基到gRNA2(CTCAGAAGACAAGAGCAAA)以及其后的7个bp (CGGGTAC)被Cas9诱导的一对gRNA 剪辑掉了。
表1 Sanger测序ACE2基因敲除后PCR胶回收片段表
(六)蛋白质免疫印迹Western Blot鉴定
细胞样本用4%多聚甲醛(Sigma, Cat.No. P6148)室温固定15分钟,0.1% Triton-100(Sigma,Cat.no.T8787)透膜30分钟后用10% 驴血清 (Sigma,Cat.No.D9663)和1% BSA(Sigma, Cat.no.A2153),孵育阻断1hr然后与一抗孵育4℃过夜。荧光二抗室温孵育1hr之后用10µg/mL DAPI(Thermo Fisher Scientific, Cat.No.62248)染细胞核10mins而后荧光显微镜下观察。
检测结果如图2所示,从图中可以看出,ACE2基因敲除效果显著。
(七)荧光定量PCR (RT-qPCR)
RNeasy Mini Kit(Qiagen, Cat.No. 74104)提取总RNA,使用试剂盒 FastkinggDNA Dispelling RT SuperMix(Tiangen, Cat.No.KR118)在PCR仪器上逆转录为cDNA.PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix(Applied Biosystems)用来检测细胞内的SARS-CoV-2和其他标志基因的表达。
具体的,本发明中所涉及PCR检测的引物序列如下表所示:
表2 PCR检测引物序列表
结果如图3所示,从图中可以看出,敲除ACE2基因后的ACE2-KO细胞与正常的人源EPSC细胞(hEPSCs)中,CDX2、ELF5、MIX1、FOXA2、SOX17、GATA4、PAX6、NES、SOX1呈阴性表达;OCT4、NANOG呈阳性表达,两者不存在差异。提示ACE2敲除并不影响EPSC的多能性。
(八)流式细胞检测
待检测细胞用0.25%胰酶/EDTA在37°C消化2-3分钟,消化的细胞用a40µm的尼龙网过滤(Corning,Cat.No.352235)去除碎片。离心细胞用固定液(BD Cytofix,Cat.No.554655)固定,PBS洗脱后的细胞可置于4°C,用PBS+0.1%NaN3 (Sigma, Cat.No.199931)+5%FBS(Gibco, Cat.No.10270)保存至上机检测。使用ACEA NovoCyteQuanteon分析。488nm(530/30 bandpass filter)和561nm(610/20 bandpass filter)通道用以检测FITC并去除自发荧光。405nm(445/45 bandpass filter)通道用以检测DAPI阳性细胞。采用Flowjo分析FACS数据。抗体为Alexa Fluor® 488 anti-human/mouse SSEA-3抗体(Biolegend,Cat.No. 330305)和Alexa Fluor® 488 anti-human/mouse TRA-1-60抗体(Biolegend,Cat.No. 330613)。
检测结果如图4所示,从图中可以看出正常的人源EPSC细胞(EPSCs)及敲除ACE2基因后的ACE2-KO细胞中SSEA3和TRA-1-60均呈阳性表达。提示敲除ACE2基因后的细胞与敲除基因前两者的多能性及分化基因表达并无显著差异。
综上,本发明提供的敲除人源EPSC细胞中ACE2的方法,可有效敲除hEPSC细胞中ACE2的基因,并且敲除后对于其他基因的表达并无影响,与亲本hEPSC细胞无显著差异。
需要说明的是,本发明中敲除ACE2基因的方法的应用不限于人源扩展潜能干细胞(hEPSC细胞),亦可应用在其他多能干细胞中,如EPSC细胞、iPSC细胞等。
二、敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系的构建及人源分化细胞模型的建立
(一)敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系的构建
取电转完成的细胞种植到经过明胶包被并且添加了2mL EPSC培养基和10μM Y-27632的六孔培养板中于37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养。24hr后换正常EPSC培养基,添加杀稻瘟菌素(BSD)和嘌呤霉素进行药物筛选,48-96小时后停止药物筛选。电转后8-10天在物镜下可以看到克隆形成。在超净台中通过显微镜进行观察,将P200移液器调节至45μL使用带有滤芯的枪头挑取单个克隆,转移到96孔板的小孔中,0.05%的胰酶消化成单细胞,继续培养即得胚胎干细胞细胞亚系。
(二)敲除ACE2基因的人源分化细胞模型的建立
用EDTA-0.25%胰蛋白酶分离敲除ACE2后的人源EPSC细胞(ACE2-KO-hEPSCs),并将0.1×106个/孔细胞接种于六孔板中。细胞采用添加5µM Y27632的20%KSR培养基,培养1天。从第2天开始,在20% KSR培养基中加入10µM SB431542,以促使胚外细胞的分化,即获得胚外分化人源分化细胞模型。并在特定的时间点(第4天和第9天)收集细胞进行分析。
(三)SARS-Cov-2的扩增和感染
SARS-Cov-2菌株(SARS-Cov-2 HKU-001a;GenBank登录号MT230940)是从香港一名COVID-19患者的鼻咽抽吸标本中分离出来的,利用VeroE6细胞进行扩增繁殖。通过VeroE6细胞培养上清的菌斑试验进行病毒滴度测定。所有涉及活SARS-CoV-2的实验均按照香港大学玛丽医院生物安全三级设施的核准标准操作程序进行。
将hEPSCs、ACE2-KO-hEPSCs在感染前1天接种,其他类型的分化细胞依据其合适的时间点进行接种。感染当天,细胞经PBS洗涤后,感染不同滴度(MOI)的SARS-CoV-2。病毒感染1小时后,更换细胞基本培养基为完全培养基。每天用光镜观察细胞病理变化,并在适宜时间点收集细胞上清和细胞裂解物进行定量RT-PCR以评估病毒载量。
(四)病毒载量检测
在指定时间点收集上清液和裂解感染细胞,用QIAamp viral RNA mini试剂盒(QIAGEN)或QIARneasy mini试剂盒(QIAGEN)进行病毒RNA的提取。取560μL AVL缓冲液裂解培养上清后,随后用QIAamp病毒RNA mini试剂盒(QIAGEN)提取总RNA。对于病毒复制动力学的分析,利用提取的RNA经一步法QuantiNova探针RT-PCR试剂盒(QIAGEN)进行量化,即配制20μL混合物反应液(包含2×QuantiNova探针RT-PCR Master Mix 10μL,QuantiNova探针RT-PCR Master Mix 0.2μL,10μM的正引物和反向引物各1.6μL,10μM的探针0.4μL,5μLRNA,无RNase水1.2μL),再在45℃孵育10分钟进行逆转录,95℃孵育5分钟进行变性,95℃孵育5秒,55℃孵育30秒,45个循环,然后在40℃冷却30秒。对SARS-CoV-2的RNA依赖RNA聚合酶/解旋酶(RdRP/Hel)基因区域的引物如表2所示,其所采用的探针序列如下:
5’-FAM TTAAGATGTGGTGCTTGCATACGTAGAC-IABkFQ-3’。
(五)各种细胞基因表达、病毒感染研究
(1)人源EPSC细胞(hEPSC/EPSCs)
培养扩增人源EPSC细胞(M1-hEPSC),采用RT-qPCR(KLF4,NANOG,SOX2和OCT4)和免疫荧光(OCT4,SSEA3,SSEA4)鉴定其干性和多能性标记(图5、图6)。而后RT-qPCR检测人源EPSC细胞中ACE2、TMPRSS2和CD147的表达,发现:ACE2在hEPSC细胞上几乎检测不到,而TMPRSS2和CD147的表达量较高(图7)。
进一步的,针对人源EPSC细胞进行了病毒感染实验,SARS-CoV-2感染hEPSCs后用RT-qPCR分析细胞内病毒基因表达拷贝数(图8),免疫荧光检测多潜能标志和病毒蛋白表达(图9),RT-qPCR检测多能性基因表达(图10);发现:hEPSC对于SARS-CoV-2不易感,病毒孵育48hr后多潜能基因表达不变。这提示:可能与其ACE2几乎不表达有关,而人源EPSC细胞表达的TMPRSS2和CD147似乎对病毒的入侵并未起到介导的作用。
(2)由人源EPSC细胞制备得到的胚外分化细胞(SB43-hEPSC)
持续使用TGF-β抑制剂(SB431542)10-12天,可诱导EPSCs向胚外分化细胞分化(SB43-hEPSC);RT-PCR鉴定其胚外分化细胞相关标记(如SDC1、ERVW、GATA3、KRT7、CGB)的表达(图11),证实上述标志高表达。RT-qCR检测结果表明hEPSC经SB43处理后,在逐步分化为胚外分化细胞的过程中,ACE2表达逐步增加,而TMPRSS2和CD147则一直较ACE2高并处于比较稳定的水平(图12)。
进一步的,对SB43分化的细胞进行病毒感染实验,检测了SB43分化模型细胞上清液中的病毒载量(图13);当0.1 MOI的SARS-CoV-2 感染经SB43分化4天后的hEPSC(SB43Day4),将上清液中的病毒载量与 Caco2和VeroE6细胞株的病毒载量对比(图14)发现其低于VeroE6细胞但高于结肠腺瘤细胞Caco2的病毒载量。RT-qPCR分析SARS-CoV-2感染SB43分化模型(分化的第4天和第9天)细胞内病毒复制情况(图15)和病毒感染细胞的免疫荧光共聚焦结果(图16)也证实了上述结果。
从亲本的hEPSCs/EPSCs和SB43-hEPSC的实验可以看出:不表达ACE2的hEPSCs对病毒不感染;而表达ACE2的SB43-hEPSC则对病毒易感。这初步从表达水平层面提示了:较TMPRSS2和CD147而言,ACE2在SB43-hEPSC病毒感染中发挥主要作用。
(3)敲除ACE2基因的hEPSC亚细胞(ACE2-KO-hEPSCs)
培养人源hEPSC细胞和ACE2-KO-hEPSCs,并进行SARS-CoV-2病毒感染实验(0.1MOI),RT-qPCR分析SARS-CoV-2病毒基因拷贝数,结果显示ACE2-KO-hEPSCs细胞与人源扩展潜能干细胞(EPSCs)相似,依然对病毒不敏感(图17)。
(4)ACE2-KO-hEPSCs的SB43诱导分化人源分化细胞模型(SB43-ACE2-KO- hEPSCs)
通过SB43分化正常hEPSC和ACE2-KO-hEPSC细胞向胚外分化细胞分化(day 4),RT-qPCR分析 SARS-CoV-2病毒以及ACE2、TMPRSS2和BSG/CD147表达(图18),发现ACE2-KO组未检测到病毒表达,而该组细胞依然表达TMPRSS2和BSG/CD147。
在感染病毒细胞的上清液中(2hr、24hr、48hr、72hr)不同时间检测病毒载量,发现ACE2-KO细胞分化的胚外分化细胞病毒载量显著降低(图19),几乎不感染病毒。
感染后48hr免疫荧光共聚焦检测发现,SB43-分化的EPSC细胞(day 4)表达ACE2,胚外分化细胞标记以及SARS-CoV-2 N蛋白,而在ACE2-KO细胞分化的胚外分化细胞表达胚外分化细胞标记但不表达病毒N蛋白和ACE2(图20),提示缺失了ACE2是造成ACE2-KO-hEPSC细胞分化的胚外分化人源分化细胞模型不易感的重要原因。
hEPSC及ACE2-KO-hEPSC经SB43-诱导分化(第4天)后,RT-qPCR分析胚外分化细胞标记表达。发现敲除后的ACE2-KO细胞分化潜能也未发生改变;但在病毒感染之后,胚外分化细胞各个标记表达水平变化不一。CGB表达升高、ERVW1显著升高、SDC1显著升高、KRT7显著升高、TP63变化不显著、TEAD4下降显著(图21)。
通过上述实验说明,敲除ACE2基因的人源EPSC胚胎干细胞细胞亚系仍然具有胚外发育能力,与常规人源扩展潜能干细胞无显著差异。而该胚胎干细胞细胞亚系可继续诱导发展为不被新冠病毒感染的胚外分化人源分化细胞模型。
同时,由于ACE2-KO-hEPSCs与亲本细胞的全能性并无显著差异,因此提示,当该胚胎干细胞细胞亚系发展为其他胚内人源性细胞/组织/类器官模型时,同样可能免于受新冠病毒侵染。因此,使得敲除ACE2的胚胎干细胞细胞亚系无论是在制备各类分化的细胞产品或是筛选药物、评价抗COVID-19的疫苗等方面具有极为广阔的应用前景。
以上所述的仅为本发明一种较佳实施例而已,当然不能以此来限定本发明之权利范围,因此依本发明权利要求所作的等同变化,仍属本发明所涵盖的范围。
序列表
<110> 干细胞转换研究中心有限公司
<120> 敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系、构建方法及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaataatgct ggggacaaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttgtcccca gcattattc 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcagaagac aagagcaaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttgctcttg tcttctgag 19
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccggaata atgctgggga caaa 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaactttgtc cccagcatta ttcc 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caccgctcag aagacaagag caaa 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaactttgct cttgtcttct gagc 24
Claims (11)
1.一种敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系的构建方法,其特征在于,采用CRISPR/Cas9技术构建敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系,所述构建方法包括:采用一对核苷酸序列如SEQ ID No.5~8所示的sgRNA,分别克隆到gRNA质粒载体上后,与Cas9质粒共转染人源扩展潜能干细胞,得到重组细胞,将所述重组细胞培养后得到敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系;
所述敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系用于下述(1)~(4)任一项中的应用:
(1)在建立敲除ACE2基因的人源分化细胞模型中的应用;
(2)在建立干细胞诱导的抗COVID-19的类器官中的应用;
(3)在制备敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系的外泌体的应用;
(4)制备、筛选、评价抗COVID-19的药物中的应用。
2.一种敲除ACE2基因的人源分化细胞模型的建立方法,其特征在于,采用一对核苷酸序列如SEQ ID No.5~8所示的sgRNA,分别克隆到质粒载体上后,与Cas9质粒共转染人源扩展潜能干细胞,得到重组细胞,将所述重组细胞扩增后在TGF-β抑制剂作用下诱导分化为胚外分化细胞,即得敲除ACE2基因的人源分化细胞模型;
所述敲除ACE2基因的人源分化细胞模型用于下述(1)~(3)任一项中的应用:
(1)在建立干细胞诱导的抗COVID-19的类器官中的应用;
(2)在制备敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系的外泌体的应用;
(3)在制备、筛选、评价抗COVID-19的药物中的应用。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述gRNA质粒载体为pKLV2-U6sgRNA。
4.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述Cas9质粒为pKLV2-EF1α-BsdCas9-W质粒。
5.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述sgRNA与所述gRNA质粒载体通过BbsⅠ酶切连接。
6.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述转染为电转染。
7.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,采用核苷酸序列如SEQ ID No.5~8所述的两对sgRNA,分别克隆到经BbsI酶切后线性化的pKLV2-U6sgRNA质粒载体上,得到pKLV2-U6sgRNA1质粒和pKLV2-U6sgRNA2质粒,并将pKLV2-U6sgRNA1质粒、pKLV2-U6sgRNA2质粒和pKLV2-EF1α-BsdCas9-W质粒按照预设比例混合均匀,得到混合质粒,采用所述混合质粒转染人源扩展潜能干细胞。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述pKLV2-EF1α-BsdCas9-W质粒、pKLV2-U6sgRNA1质粒和pKLV2-U6sgRNA2质粒的重量比为:(4~10):(2~5):(2~5)。
9.如权利要求2所述的方法,其特征在于,采用TGF-β抑制剂SB431542诱导所述重组细胞分化为胚外分化细胞。
10.一种敲除ACE2基因的胚胎干细胞细胞亚系,其由如权利要求1、3、4、5、6、7或8所述的方法构建。
11.一种敲除ACE2基因的人源分化细胞模型,其由如权利要求2~9任一项所述的方法建立。
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