CN113897343A - 一种黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法 - Google Patents

一种黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物发酵工程领域，具体公开了一种黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法。本发明通过从不同土壤中筛选出产果胶酶性能较好的菌株黑曲霉，再设置培养基组分固体基质、金属离子及其浓度、含水量，培养温度、pH、装料量，建立单因素试验和正交试验从而得到菌株产酶最高的培养基组分和培养条件。本发明提供的黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法，大大提高了菌株产酶能力，达到理想目标。

Description

一种黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法
技术领域
本发明属于生物发酵工程领域，具体涉及一种黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法。
背景技术
果胶酶是一类能够把果胶降解的复合酶的总称，包括聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶酯酶(PE)和果胶酸裂解酶(PL)。根据果胶酶的最适作用pH来划分，果胶酶可分为酸性果胶酶和碱性果胶酶两大类。
杜国军等采用复合诱变方法处理黑曲霉HY-D3，获得突变株HY-LL3，之后对突变株进行固态发酵产果胶酶优化，果胶酶酶活高达到3124U/g；张佰清等通过脉冲方法诱变黑曲霉，与原始菌株相比，其果胶酶活力提高182.22％±0.18％，可达192.67U/mL；DIVYAS等以农业废弃物为底物，获得碱性果胶酶活力为109.10±8.80IU/mL。
由于微生物分布广泛、适应能力强、繁殖快等优势，微生物发酵产果胶酶应用的最为广泛。但是，目前黑曲霉固态发酵所获得的酶活普遍偏低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法，从江苏省武进区草莓园、桃园、葡萄园、紫叶李、杨梅树、油菜花田及小麦田等不同土壤中依据刚果红方法筛选出有透明圈的菌株，并通过分子生物学鉴定，确认所筛选菌株为黑曲霉；然后将黑曲霉接种于PDA液体种子培养基中，在恒温摇床中28℃培养2d，得到黑曲霉菌球，取菌球于固态发酵培养基中发酵培养，得到果胶酶。
黑曲霉发酵产果胶酶的方法，具体步骤如下：
(1)菌株筛选
1)分别称取草莓园、桃园、葡萄园、紫叶李、杨梅树、油菜花田及小麦田的土壤放于蒸馏水中，置于28℃，160r/min恒温摇床20min，再取出静置10min，采用稀释涂布法涂布于果胶培养基平板上，28℃恒温培养箱倒置培养，待菌株长出后，用平板划线法分离纯化菌株；采用单点法将纯种菌株接种在果胶培养基平板上，待菌株长出后，用刚果红溶液对菌株进行染色，再用氯化钠溶液进行洗脱，观察菌株是否产生透明圈，测量产生透明圈的菌株直径(DC)和透明圈直径(DP)，计算DP/DC的比值，选择产生透明圈的菌株用来进行复筛；
其中，果胶培养基的成分为：果胶8g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，K2HPO41g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L、琼脂20g/L。
2)将初筛的菌株接种到果胶液体培养基中进行发酵培养，测定各个菌株的果胶酶酶活力，选取果胶酶酶活力最高的菌株作为实验出发菌株，并鉴定为黑曲霉(Aspergillusniger)。
其中，果胶液体培养基成分为：果胶8g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，K2HPO41g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
筛选出的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株CM3保藏号为：CGMCC No，23060，保藏日为2021年8月23日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。
(2)菌种活化
将黑曲霉(Aspergillus niger)划线至PDA琼脂培养基上，28℃培养3d，得到长满黑曲霉孢子的平板。
(3)菌球制备
将步骤(2)平板上的孢子于无菌超净工作台挑取一环接种至PDA液体培养基中，在恒温摇床中28℃，160rpm培养2天，得到黑曲霉菌球。
(4)固态发酵。
取菌球于固态发酵培养基中发酵产果胶酶。
固态发酵培养基成分为：以麸皮、豆粕、菜籽饼粉、棉籽饼粉、黄豆粉为单一基质，又以麸皮与豆粕混合作为固体基质，且麸皮与豆粕的比例为93：2-13：82，以K+、Na+、Ca2+、Mg2 +、Fe2+为金属离子，金属离子浓度为0.4％-1.2％，含水量为培养基总质量的45％-65％。
固态发酵培养条件为：培养温度为22℃-34℃，培养pH为5.0-9.0，接种量0.5％-4.5％，装料量20g-70g，培养时间6d。
最优固态发酵培养基成分：麸皮与豆粕比例为73：22、Mg2+添加量为0.6％，含水量为60％。
发酵培养的最优生长条件为：发酵温度28℃、发酵pH6.0、接种量4.5％、装料量40g，培养时间为6d。
本发明的有益效果：从不同土壤中依据刚果红染色法筛选出产果胶酶酶活较高的黑曲霉，采用固态发酵培养菌株，产生的果胶酶系较全，酶活较高，且使得在操作过程中具有操作简便、能耗低、对无菌要求相对较低、不易发生大面积污染等优点。
附图说明：
图1不同土壤所筛部分菌株对产果胶酶的影响(CM3是从草莓园土壤中筛选出的菌株，YCH3、YCH4是从油菜花地土壤中筛选出的菌株，YM2是从杨梅地土壤中筛选出的菌株)；
图2经过刚果红染色产生透明圈的所筛菌株CM3示意图及出发菌株***发育树；
图3为不同固态基质对黑曲霉产果胶酶影响；在图3中，横坐标为不同的固态基质，纵坐标为果胶酶相对酶活；
图4为麸皮与豆粕比例对黑曲霉产果胶酶影响；在图4中，横坐标为麸皮与豆粕的比例，纵坐标为果胶酶相对酶活；
图5为金属离子对黑曲霉产果胶酶影响；在图5中，横坐标为不同的金属离子，纵坐标为果胶酶相对酶活；
图6为金属离子浓度(Mg2+)对黑曲霉产果胶酶影响；在图6中，横坐标为金属离子浓度(Mg2+)，纵坐标为果胶酶相对酶活；
图7为含水量对黑曲霉产果胶酶影响；在图7中，横坐标为含水量，纵坐标为果胶酶相对酶活；
图8为温度对黑曲霉产果胶酶影响；在图8中，横坐标为温度，纵坐标为果胶酶相对酶活；
图9为pH对黑曲霉产果胶酶影响；在图9中，横坐标为pH，纵坐标为果胶酶相对酶活；
图10为接种量对黑曲霉产果胶酶影响；在图10中，横坐标为接种量，纵坐标为果胶酶相对酶活；
图11为装料量对黑曲霉产果胶酶影响；在图11中，横坐标为装料量，纵坐标为果胶酶相对酶活；
图12为黑曲霉固态发酵产果胶酶周期；在图12中，横坐标为发酵时长，纵坐标为果胶酶酶活U/g干基。
具体实施方式
为使本领域的技术人员能进一步了解本发明，下面列举本发明的具体实施例，并配合说明书附图，详细说明本发明的技术方案。
本发明中测定果胶酶活力的方法采用的是滴定法，具体方法见中华人民共和国国家标准法发布的GB 1886.174-2016。
需强调的是：实施例并非本发明技术方案所有实施方式的穷举，故不限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
(1)材料
菌种：从江苏省武进区草莓园、桃园、葡萄园、紫叶李、杨梅树、油菜花田及小麦田等不同土壤中筛选得到。
(2)培养基
初筛培养基：果胶8g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，K2HPO4 1g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L、琼脂20g/L。
PDA琼脂培养基：称取削皮切块的新鲜土豆200g，加入蒸馏水，煮成土豆泥，八层纱布过滤，定容至1000mL备用，1000mL滤液中添加20g葡萄糖，20g琼脂，121℃灭菌20min后取出，在超净工作台中倒入培养皿，待凝备用。
(3)主要试剂
10g/L柑橘果胶溶液：称取果胶粉1.0000g，加水溶解，煮沸，冷却，过滤。调整pH至3.5，用蒸馏水定容至100mL，冰箱储存备用。使用时间不超过3天。
注:果胶底物对试验的影响大。如使用不同来源或批号的果胶粉,应与旧批次进行对照试验。
硫代硫酸钠标准溶液：c(Na2S2O3)＝0.05mol/L。
碳酸钠标准溶液：2mol/L。
碘标准溶液：0.1mol/L。
2mol/L硫酸溶液：取浓硫酸5.6mL，缓慢加入适量水中，冷却后用水定容至100mL，摇匀，备用。
可溶性淀粉指示液(10g/L)。
0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH3.5)：称取柠檬酸(C6H8O7·H2O)14.71g，柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)8.82g，加950mL水溶解，调节pH至3.5，再用水定容至1000mL。
(4)试验方法
(1)菌株筛选：从江苏省武进区草莓园、桃园、葡萄园、紫叶李、杨梅树、油菜花田及小麦田等不同土壤中依据刚果红方法筛选出有透明圈的菌株，采用稀释涂布法、平板划线法分离纯化菌株。采用单点法将纯种菌株接种在果胶培养基平板(初筛培养基)上，待菌株长出后，用刚果红溶液对菌株进行染色，再用氯化钠溶液进行洗脱，观察菌株是否产生透明圈，测量产生透明圈的菌株直径(DC)和透明圈直径(DP)，计算DP/DC的比值。选择产生透明圈的菌株用来进行复筛。
将初筛的菌株接种到果胶液体培养基中进行发酵培养，测定各个菌株的果胶酶酶活力，选取果胶酶酶活力最高的菌株作为实验出发菌株，并鉴定为黑曲霉(Aspergillusniger)。
其中，果胶液体培养基成分为：果胶8g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，K2HPO41g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
(2)菌种活化
将黑曲霉(Aspergillus niger)划线至PDA琼脂培养基上，28℃培养3d，得到长满黑曲霉孢子的平板。
(3)菌球制备
挑取平板上长满黑曲霉的孢子一环，接于PDA液体培养基中，在恒温摇床中28℃，160rpm，培养2d，在超净工作台里取出，并放入无菌离心管内，冷冻离心弃上清，称量菌球质量(离心管已去皮)，调整合适质量。
(6)黑曲霉发酵生产果胶酶
固体发酵培养基配好后，121℃灭菌20min，冷却后在无菌条件下接种2.5％黑曲霉菌球，搅匀后至于28℃恒温培养箱中静置培养6d。
(7)粗酶液提取
取出恒温培养箱中已培养6d含果胶酶的基质，称取1g左右于三角瓶内，加入25mL缓冲液，并将其固体充分捣碎，静置浸提3h，将浸提液使用滤纸过滤，过滤液体在4℃，8000rpm下离心5min，上清液即为粗酶液。
(8)果胶酶活力的测定
于甲、乙两支比色管中，分别加入5mL柑橘果胶溶液，置于50℃±0.2℃恒温水浴中预热8min；向甲管(空白)加入5mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；向乙管(样品)中加入1mL稀释酶液和4mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，立即摇匀，计时，准确反应30min后，立即取出，加热煮沸5min终止反应，冷却；取上述甲、乙管反应液各5mL放入碘量瓶中，准确加入4mL碳酸钠标准溶液和5mL碘标准溶液，摇匀，于暗处放置20min；取出，加入2mL硫酸溶液，用硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色，加淀粉指示液3滴，继续滴定至蓝色刚好消失为其终点，记录甲管、乙管反应液消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积。同时做平行样品测定。
酶活单位定义为在50℃、pH3.5的反应条件下，1g固体酶粉(或1mL液体酶)，1h分解果胶产生1mg半乳糖醛酸，即为1个酶活力单位，以U/g或U/mL表示。
(9)果胶酶发酵工艺的单因素优化
初始固体发酵培养基成分：麸皮：20-30g，豆粕5g以内，(NH4)2SO4：0.5-1.5g，K2HPO4：0.5-1.5g，KCl：0.01-0.02g，MgSO4：0.01-0.02g，蒸馏水30-50mL。初始pH7.0，发酵温度28℃，接种量2.5％，装料量30g，静置发酵时长6d。
果胶酶发酵工艺单因素优化内容包括固体基质选择，麸皮与豆粕的比例优化，金属离子选择及其浓度优化，含水量优化，接种量优化，培养温度优化，培养pH优化，装料量优化。
实施例1菌株筛选
从江苏省武进区草莓园、桃园、葡萄园、紫叶李、杨梅树、油菜花田及小麦田等不同土壤中依据刚果红方法筛选出有透明圈的菌株，具体是分别称取不同土壤放于蒸馏水中，置于28℃，160r/min恒温摇床20min，再取出静置10min，采用稀释涂布法涂布于果胶培养基平板上，28℃恒温培养箱倒置培养，待菌株长出后，用平板划线法分离纯化菌株。采用单点法将纯种菌株接种在果胶培养基平板上，待菌株长出后，用刚果红溶液对菌株进行染色，再用氯化钠溶液进行洗脱，观察菌株是否产生透明圈，测量产生透明圈的菌株直径(DC)和透明圈直径(DP)，计算DP/DC的比值。选择产生透明圈的菌株用来进行复筛。将初筛的菌株接种到果胶液体培养基中进行发酵培养，测定各个菌株的果胶酶酶活力，选取果胶酶酶活力最高的菌株作为实验出发菌株，并鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)。
其中，果胶液体培养基成分为：果胶8g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，K2HPO41g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
(2)菌种活化
将所筛黑曲霉(Aspergillus niger)划线至PDA琼脂培养基上，28℃培养3d，得到长满黑曲霉孢子的平板。
(3)菌球制备
挑取平板上长满黑曲霉的孢子一环，接于PDA液体培养基中，28℃，160rpm/min，2d，在超净工作台里取出放入无菌离心管内，冷冻离心弃上清，称量菌球质量(离心管已去皮)，调整合适质量。
实施例2果胶酶发酵培养基的单因素优化。
(1)不同固态基质对黑曲霉产果胶酶影响
以麸皮、豆粕、菜籽饼粉、棉籽饼粉、黄豆粉、麸皮与豆粕混合作为固体基质，28℃，静置发酵6d，测定果胶酶活力，结果如图2所示。由图2可以看到，当豆粕单独或者麸皮与豆粕混合作为固体基质时，果胶酶活力有最大值。因此考虑到经济成本，麸皮与豆粕混合是最适果胶酶的固态基质。
(2)麸皮与豆粕比例对产酶的影响
以麸皮与豆粕的比例为93：2，73：22，53：42，47.5：47.5，33：62，13：82，28℃，静置发酵6d，测定果胶酶活力，结果如图3所示。由图3可以看到，当麸皮与豆粕比例为73：22时，果胶酶活力有最大值。因此，选择麸皮与豆粕比例为73：22。
(3)金属离子及其浓度对产酶的影响
以K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe2+为金属离子，28℃，静置发酵6d，测定果胶酶活力，结果如图4所示。由图4可以看到，当Mg2+作为金属离子时，果胶酶活力有最大值。因此，选择Mg2+作为金属离子。
为进一步确定金属离子浓度(Mg2+)对黑曲霉产果胶酶影响，选取浓度为0.4％，0.6％，0.8％，1.0％，1.2％五个水平进行试验，28℃，静置发酵6d，测定果胶酶活力，结果如图5所示。由图5可以看到，当Mg2+浓度为0.6％时，果胶酶活力有最大值。因此，选择Mg2+浓度为0.6％。
(4)含水量对黑曲霉产果胶酶影响
以含水量为45％，50％，55％，60％，65％，28℃，静置发酵6d，测定果胶酶活力，结果如图6所示。由图6可以看到，当含水量为60％时，果胶酶活力有最大值。因此，选择含水量60％。
(5)温度对黑曲霉产果胶酶影响
以温度为22℃，25℃，28℃，31℃，34℃，静置发酵6d，测定果胶酶活力，结果如图7所示。由图7可以看到，当温度为31℃时，果胶酶活力有最大值。因此，选择温度为31℃。
(6)pH对黑曲霉产果胶酶影响
以pH为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，28℃，静置发酵6d，测定果胶酶活力，结果如图8所示。由图8可以看到，当pH为6.0时，果胶酶活力有最大值。因此，选择pH 6.0。
(7)接种量对黑曲霉产果胶酶影响
以接种量为0.5％，1.5％，2.5％，3.5％，4.5％，静置发酵6d，测定果胶酶活力，结果如图9所示。由图9可以看到，当接种量为3.5％时，果胶酶活力有最大值。因此，选择接种量为3.5％。
(8)装料量对黑曲霉产果胶酶影响
以装料量为20g，30g，40g，50g，60g，70g，静置发酵6d，测定果胶酶活力，结果如图10所示。由图10可以看到，当装料量为40g时，果胶酶活力有最大值。因此，选择装料量为40g。
实施例3
通过实施例1中的单因素试验，为更好探究菌株产酶条件，我们选含水量，金属离子浓度，麸皮与豆粕比例三个因素，设计培养基成分的正交实验，又选取发酵温度，接种量，发酵pH三个因素，设计培养条件的正交试验。正交试验的具体因素水平见表1，2。根据正交设计软件设计正交表进行试验，实验结果见表3，4。
表1培养基成分正交试验因素水平表
Figure BDA0003256932470000111
表2培养条件正交试验因素水平表
Figure BDA0003256932470000112
表3培养基成分正交试验结果表
Figure BDA0003256932470000113
三因素方差分析结果
Figure BDA0003256932470000114
Figure BDA0003256932470000121
表4培养条件正交试验结果表
Figure BDA0003256932470000122
三因素方差分析结果
Figure BDA0003256932470000123
本实施例说明影响果胶酶酶活的培养基成分由主到次分别为：含水量，金属离子浓度，麸皮与豆粕比例，培养条件由主到次为温度，pH，接种量。菌株黑曲霉最优产酶工艺为：麸皮与豆粕比例为73：22，Mg2+添加量为0.6％，含水量为60％，发酵温度28℃，发酵pH6.0，接种量4.5％，装料量40g，培养时间为6d。以上述条件发酵菌株，6d后测定果胶酶酶活达到11648U/g干基，相比原始工艺提高了29.42％，大大发掘了此菌株产酶潜力，达到理想目标。
对照实施例
发酵条件：
麸皮：20-30g，豆粕5g以内，(NH4)2SO4：0.5-1.5g，K2HPO4：0.5-1.5g，KCl：0.01-0.02g，MgSO4：0.01-0.02g，蒸馏水30-50mL。
发酵温度28℃，接种量2.5％，装料量30g，静置发酵时长6d。
以上述条件发酵菌株，6d后测定果胶酶酶活达到9000U/g干基。
以上实施例是对本发明的具体描述，仅用于说明本发明的技术方案，并非本发明技术方案的穷举，故不限制用于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法，其特征在于：所述方法为：从草莓园、桃园、葡萄园、紫叶李、杨梅树、油菜花田及小麦田土壤中依据刚果红方法筛选出有透明圈的菌株，并通过分子生物学鉴定，确认所筛选菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)；然后将黑曲霉接种于PDA液体种子培养基中，在恒温摇床中28℃培养2d，得到黑曲霉菌球，取菌球于固态发酵培养基中发酵培养，得到果胶酶。
2.根据权利要求1所述的黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
(1)菌株筛选
依据刚果红方法筛选出有透明圈的菌株，并通过分子生物学鉴定，确认所筛选菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)；
(2)菌种活化
将黑曲霉划线至PDA琼脂培养基上，在恒温培养箱28℃培养3d，得到长满黑曲霉孢子的平板；
(3)菌球制备
将平板上的孢子于无菌超净工作台挑取一环接种至PDA液体培养基中，在恒温摇床中28℃培养2d，得到黑曲霉菌球；
(4)固态发酵
取黑曲霉菌球于固态发酵培养基中发酵培养。
3.根据权利要求2所述的黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法，其特征在于：步骤(1)所述菌株筛选具体步骤如下：
1)分别称取取自草莓园、桃园、葡萄园、紫叶李、杨梅树、油菜花田及小麦田土壤放于蒸馏水中，置于28℃，160r/min恒温摇床20min，再取出静置10min，采用稀释涂布法涂布于果胶培养基平板上，28℃恒温培养箱倒置培养，待菌株长出后，用平板划线法分离纯化菌株；采用单点法将纯种菌株接种在果胶培养基平板上，待菌株长出后，用刚果红溶液对菌株进行染色，再用氯化钠溶液进行洗脱，观察菌株是否产生透明圈，测量产生透明圈的菌株直径(DC)和透明圈直径(DP)，计算DP/DC的比值，选择产生透明圈的菌株用来进行复筛；
2)将初筛的菌株接种到果胶液体培养基中进行发酵培养，测定各个菌株的果胶酶酶活力，选取果胶酶酶活力最高的菌株作为实验出发菌株，并鉴定为黑曲霉(Aspergillusniger)。
4.根据权利要求3所述的黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法，其特征在于：步骤1)所述果胶培养基的成分为：果胶8g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，K2HPO4 1g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L、琼脂20g/L。
5.根据权利要求3所述的黑曲霉固态固态发酵产果胶酶的方法，其特征在于：步骤2)所述果胶液体培养基成分为：果胶8g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，K2HPO4 1g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
6.根据权利要求3所述的黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法，其特征在于：步骤2)所述筛选出的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株CM3保藏号为：CGMCC No，23060，保藏日为2021年8月23日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
7.根据权利要求2所述的黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法，其特征在于：步骤(4)所述固态发酵培养基成分如下：以麸皮、豆粕、菜籽饼粉、棉籽饼粉、黄豆粉或麸皮与豆粕混合作为固体基质，其中，麸皮与豆粕混合的比例为93：2-13：82，以K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe2+为金属离子，金属离子浓度为0.4％-1.6％，含水量为培养基总质量的45％-65％。
8.根据权利要求2所述的黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法，其特征在于：步骤(4)所述固态发酵培养的条件为：培养温度为22℃-34℃，培养pH为5.0-9.0，接种量0.5％-4.5％，装料量20g-70g，发酵时长6d。
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