CN113896762B - 一种生物素三肽-1的液相合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物素三肽‑1的液相合成方法，涉及多肽合成技术领域，包括：由功能化离子液体作为载体，通过缩合反应键合Boc‑Lys‑OH，再通过脱水缩合与Trt‑His‑OH连接，之后再碱液环境下切割除去功能化离子液体得到His(Trt)‑Lys(Boc)‑OH；然后与生物素‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯通过化学反应键连甘氨酸得到Biotin‑Gly‑OH通过脱水缩合反应、再脱保护得到生物素三肽‑1。该液相合成方法制得的生物素三肽‑1的纯度和收率均明显增加；且中间产物分离提纯简单，成本降低，污染减少，可扩大化生产。

Description

一种生物素三肽-1的液相合成方法
技术领域
本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种生物素三肽-1的液相合成方法。
背景技术
现有技术，生物素三肽-1是采用固相合成方法，主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离，最终通过制备液相来纯化，放大会导致产品更加杂不易纯化，且存在成本高、对环境的污染大，单批次生产量小的问题。
离子液体作为近年来新兴的一种绿色溶剂和催化剂，在许多种重要的有机合成反应中体现出了明显的优势：反应的选择性、速度和收率得到了显著的提高，反应后处理方便，离子液体可回收使用等。以功能化的离子液体为载体的液相平行合成法综合了液相合成的优点和固相合成的优点，因而在小分子液相平行合成方面的优势越来越明显。离子液体被作为载体负载有机单元反应以及小分子化合物的合成，并建立了合成杂环化合物、多肽、寡糖等化合物的方法；但采用该方法制备生物素三肽-1的方法却几乎未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物素三肽-1的液相合成方法，该液相合成方法制得的生物素三肽-1的纯度和收率均明显增加；且中间产物分离提纯简单，成本降低，污染减少，可扩大化生产。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种生物素三肽-1的液相合成方法，包括：
His(Trt)-Lys(Boc)-OH的制备：
-由功能化离子液体作为载体，通过缩合反应键合Boc-Lys-OH得到离子载体A；
-取离子载体A通过脱水缩合与Trt-His-OH连接得到离子载体B；
-取离子载体B在碱液环境下切割除去功能化离子液体得到His(Trt)-Lys(Boc)-OH；
Biotin-Gly-OH的制备：
-由生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯通过化学反应键连甘氨酸得到Biotin-Gly-OH；
生物素三肽-1的制备：
-由His(Trt)-Lys(Boc)-OH与Biotin-Gly-OH通过脱水缩合反应、再脱保护得到生物素三肽-1；
其中，所述功能化离子液体结构中至少包含羟基活性基团；上述功能化离子液体原料组成至少包括2-氯-6,7-二甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮或4-氯-1-丁醇。本发明建立了一种以功能化离子液体为载体，温和条件下用碱性溶液进行切割反应，液相合成生物素三肽-1的方法。其中，采用功能化离子液体应用于液相合成，其单位负载量高，中间产物分离纯化简便；反应过程用到的有机挥发性溶剂、过量试剂、催化剂等的用量减少，降低了对环境的污染；且合成的目标产物产率与纯度高，无需进一步的色谱纯化。本发明加入2-氯-6,7-二甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮制备得到的功能化离子液体，作为可溶性载体用于生物素三肽-1的液相合成中，能够进一步提高生物素三肽-1产品的纯度，且收率也有明显的增加。
在一些实施方式中，功能化离子液体原料组成还包括1-甲基咪唑。
进一步地，一种生物素三肽-1的液相合成方法，步骤具体包括：
His(Trt)-Lys(Boc)-OH的制备：
取功能化离子液体、Boc-Lys-OH、DMAP和乙腈，混合搅拌溶解后，加入0.8~1 M浓度的DCC/二氯甲烷溶液，室温、氮气保护的条件下搅拌反应24~28 h，用铺有两层滤纸和硅藻土的布氏漏斗抽滤，减压蒸馏、***洗涤，然后溶于二氯甲烷中，1.8~2 M浓度盐酸洗涤，有机相加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏浓缩、40~50 ℃真空干燥24~30 h得到离子载体A；
取离子载体A、PyBOP、Trt-His-OH、DIPEA和乙腈混合，氮气保护下搅拌溶解，35~40℃恒温水浴条件下搅拌反应8~10 h，50~55 ℃下减压蒸馏除溶剂，依次用***、去离子水分别洗涤3~4次，加入无水硫酸钠干燥、真空干燥24~30 h得到离子载体B；
取0.8~1 M浓度氢氧化钠、THF/水（v/v，1:1.5~2.5）和离子载体B，氮气保护条件下室温搅拌，TLC监测反应，结束后在50~55℃下减压蒸馏，加入1.8~2 M浓度盐酸酸化至pH为5~6，过滤、沉淀用去离子水洗涤2~3次，70~80℃真空干燥24~30 h得到His(Trt)-Lys(Boc)-OH；
Biotin-Gly-OH的制备：
取生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯、甘氨酸混合，加入四氢呋喃/水混合溶液（v/v，1:0.8~1.4）溶解，加入25~30 wt%浓度的氢氧化钠溶液调节pH至8~9，室温反应，TLC监测反应，结束后调节pH至2.0~2.5，析出固体，过滤、水淋洗、真空干燥得到Biotin-Gly-OH；
生物素三肽-1的制备：
取Biotin-Gly-OH、四氢呋喃，冰浴降温条件下加入N,N’-羰基咪唑，反应液不再冒泡时，将其滴加至含有8~10 wt%浓度的His(Trt)-Lys(Boc)-OH和三乙胺的四氢呋喃溶液中，滴完后室温反应，TLC监测反应，结束后减压浓缩，加入水和乙酸乙酯，用1.8~2 M浓度盐酸调节pH至2~2.5，有机相用盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、减压浓缩得到产物M；接着去保护，即:取上述产物M在氮气保护条件下加入二氯甲烷溶解，浓度为0.08~0.15 g/mL，加入等体积TFA，室温下搅拌0.5~1 h，TLC监测反应，结束后50~55 ℃减压蒸干溶剂，***洗涤2~4次，40~50 ℃真空干燥24~30 h得到产物N，即为生物素三肽-1。
在一些实施方式中，His(Trt)-Lys(Boc)-OH的制备过程中，功能化离子液体、Boc-Lys-OH的摩尔比为1:1.8~2.5；功能化离子液体、DMAP的摩尔比为1:0.3~0.5；功能化离子液体、乙腈的固液比为1 g:24~28 mL；功能化离子液体、DCC的摩尔比为1:2~2.4。
在一些实施方式中，His(Trt)-Lys(Boc)-OH的制备过程中，离子载体A、Trt-His-OH的摩尔比为1:1.4~1.6；离子载体A、PyBOP的摩尔比为1:1.4~1.6；离子载体A、DIPEA摩尔比为1:2.5~3.5；离子载体A、乙腈的固液比为1 g:22~26 mL。
在一些实施方式中，His(Trt)-Lys(Boc)-OH的制备过程中，氢氧化钠、THF/水的体积比为1:14~16；离子载体B与氢氧化钠的固液比为1 g:0.8~1 mL。
在一些实施方式中，Biotin-Gly-OH的制备过程中，生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯、甘氨酸的摩尔比为1:1.1~1.3；生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯与四氢呋喃/水混合溶液的固液比为1 g:12~15 mL。
在一些实施方式中，生物素三肽-1的制备过程中，Biotin-Gly-OH、四氢呋喃固液比为1 g:8~12 mL；Biotin-Gly-OH、N,N’-羰基咪唑的质量比为1:0.5~0.6；His(Trt)-Lys(Boc)-OH与Biotin-Gly-OH的质量比为1:1.5~2；三乙胺与Biotin-Gly-OH的质量比为1:0.35~0.45。
在一些实施方式中，生物素三肽-1的纯度≥96%，收率＞90%；优选地，生物素三肽-1的纯度≥97%，收率＞94%；更优选地，生物素三肽-1的纯度＞99%。
上述功能化离子液体的制备方法，包括：
取1-甲基咪唑、4-氯-1-丁醇或2-氯-6,7-二甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮混合，升温至80~90 ℃，氮气气氛下反应即得。
具体的，功能化离子液体的制备方法，步骤为：
取1-甲基咪唑和4-氯-1-丁醇混合，升温至80~90 ℃，氮气气氛下反应48~54 h；之后加入等体积***洗涤4~6次，剧烈搅拌，50~60 ℃真空干燥过夜得到功能化离子液体；
或，
取1-甲基咪唑和2-氯-6,7-二甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮混合，升温至80~90 ℃，氮气气氛下反应48~54 h；之后加入等体积***洗涤4~6次，剧烈搅拌，50~60 ℃真空干燥过夜得到功能化离子液体。
在一些实施方式中，1-甲基咪唑、4-氯-1-丁醇的摩尔比为1:1.2~1.6；或，1-甲基咪唑、2-氯-6,7-二甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮的摩尔比为1:1.2~1.6。
优选地，在His(Trt)-Lys(Boc)-OH的制备过程中，和/或，在生物素三肽-1的制备过程中，采用功能化大孔树脂进行进一步纯化；其中，功能化大孔树脂原料组成包括聚（GMA-co-EDMA）基质的大孔吸附树脂、4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸、间苯二胺、间苯二甲醛。本发明采用4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸对聚（GMA-co-EDMA）基质的大孔吸附树脂进行修饰改性，得到功能化大孔树脂，显著改善了树脂的吸附性能，其吸附当量和解吸率有效增加；且大孔树脂的使用稳定性也得到增强，多次循环使用后，依然保持较高的吸附-脱吸附性能，具有优良的再生与循环使用性能，有效延长了其使用寿命；同时，改性后的大孔树脂对生物素三肽-1具有优异的选择性吸附。将其应用于生物素三肽-1液相合成中，制得的产品的纯度和收率均得到明显提升；且在液相合成不同阶段使用，均产生优异的影响；对中间阶段产物进行分离纯化，可以进一步提升生物素三肽-1产品的纯度和收率；对最后产物进行分离纯化，可以进一步提升产品的纯度。
进一步地，His(Trt)-Lys(Boc)-OH的制备过程中，将得到的离子载体B溶于50~60%乙醇溶液中，浓度为0.02~0.05 g/mL；加入功能化大孔树脂进行吸附-脱吸附、分离纯化、减压蒸馏、真空干燥，然后再进行离子液体载体切割步骤。
进一步地，在生物素三肽-1的制备过程中，得到产物N溶于50~60 %乙醇溶液中，浓度为0.02~0.05 g/mL；加入功能化大孔树脂进行吸附-脱吸附、分离纯化、减压蒸馏、真空干燥得到生物素三肽-1。
在一些实施方式中，功能化大孔树脂与乙醇溶液的固液比为1 g:50~60 mL。
进一步地，上述功能化大孔树脂由各原料组份混合，采用“一锅法”，通过物理化学反应对聚（GMA-co-EDMA）基质的大孔吸附树脂进行改性得到。
具体的，上述功能化大孔树脂的制备方法，包括：
取聚（GMA-co-EDMA）基质的大孔吸附树脂、4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸、间苯二胺、间苯二甲醛混合分散于二氧六环中，加入2~4 M浓度的醋酸水溶液，体系置于80~90℃油浴条件下，氮气气氛中搅拌反应24 h；离心收集沉淀，依次用THF、甲醇洗涤3~5次，110~120℃真空干燥过夜得到功能化大孔树脂。
在一些实施方式中，聚（GMA-co-EDMA）基质的大孔吸附树脂、4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸、间苯二胺、间苯二甲醛的质量比为1:0.15~0.3:0.1~0.2:0.1~0.25；聚（GMA-co-EDMA）基质的大孔吸附树脂与二氧六环的固液比为14~18 mg/mL；醋酸水溶液的加入体积为二氧六环的2~4 %。
本发明还公开了上述功能化离子液体作为载体材料、催化剂的应用。
本发明又公开了上述功能化离子液体在多肽液相合成领域的应用。
在一些实施方式中，功能化离子液体在提高多肽产品纯度和收率中的用途。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明加入2-氯-6,7-二甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮制备得到的功能化离子液体，作为可溶性载体用于生物素三肽-1的液相合成中，能够进一步提高生物素三肽-1产品的纯度，且收率也有明显的增加。同时，本发明采用4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸对聚（GMA-co-EDMA）基质的大孔吸附树脂进行修饰改性，得到功能化大孔树脂，其吸附当量和解吸率有效增加；且具有优良的再生与循环使用性能；对生物素三肽-1具有优异的选择性吸附；将其应用于生物素三肽-1液相合成中，制得产品的纯度和收率均进一步提升。
因此，本发明提供了一种生物素三肽-1的液相合成方法，该液相合成方法制得的生物素三肽-1的纯度和收率均明显增加；且中间产物分离提纯简单，成本降低，污染减少，可扩大化生产。
附图说明
图1为本发明试验例1中功能化离子液体的红外光谱测试结果；
图2为本发明试验例1中功能化大孔树脂的红外光谱测试结果。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
本发明实施例用聚（GMA-co-EDMA）基质的大孔吸附树脂的制备为现有技术，基本制备过程如下：
取苯乙烯、PVP（两者质量比为1:0.2）和AIBN（加入量为苯乙烯的1 wt%）共同加入无水乙醇（苯乙烯与无水乙醇的质量比为1:8）中，超声分散30 min；接着80 ℃油浴条件下，充入氮气15 min，密封回流反应24 h；冷却至室温后离心，去掉上层，加入水/工业酒精混合溶剂（w/w，1:1），超声分散、离心沉淀5次，真空干燥24 h得到聚苯乙烯微球种子；
取聚苯乙烯微球种子分散至含有1 wt% PVA和0.25 wt% SDS的水溶液中，浓度为20 mg/mL，得到溶液A；取GMA、EDMA（两者的摩尔比为1:1）和AIBN（加入量为GMA和EDMA总量的1.1 wt%）溶于丙酮溶液（GMA与丙酮的质量比为1:8）中得到溶液B；溶液A和溶液B（质量比为1.5:1）混合后进行超声乳化，30 ℃下溶胀12 h，然后体系置于70℃下恒温反应24 h；得到产物依次用THF和甲醇洗涤4次，60 ℃下真空干燥24 h得到聚（GMA-co-EDMA）基质的大孔吸附树脂。
实施例1：
功能化离子液体的制备：
按摩尔比1:1.45的比例取1-甲基咪唑和2-氯-6,7-二甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮混合，升温至86 ℃，氮气气氛下反应50 h；之后加入等体积***洗涤5次，剧烈搅拌，55 ℃真空干燥过夜得到功能化离子液体。
一种生物素三肽-1的液相合成方法：
His(Trt)-Lys(Boc)-OH的制备：
取功能化离子液体、Boc-Lys-OH、DMAP和乙腈，混合搅拌溶解后，加入1 M浓度的DCC/二氯甲烷溶液，室温、氮气保护的条件下搅拌反应25 h，用铺有两层滤纸和硅藻土的布氏漏斗抽滤，减压蒸馏、***洗涤，然后溶于二氯甲烷中，2 M浓度盐酸洗涤，有机相加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏浓缩、45 ℃真空干燥24 h得到离子载体A；其中，功能化离子液体、Boc-Lys-OH的摩尔比为1:2.2；功能化离子液体、DMAP的摩尔比为1:0.42；功能化离子液体、乙腈的固液比为1 g:26.2 mL；功能化离子液体、DCC的摩尔比为1:2.2；
取离子载体A、PyBOP、Trt-His-OH、DIPEA和乙腈混合，氮气保护下搅拌溶解，38℃恒温水浴条件下搅拌反应10 h，55 ℃下减压蒸馏除溶剂，依次用***、去离子水分别洗涤4次，加入无水硫酸钠干燥、真空干燥24 h得到离子载体B；其中，离子载体A、Trt-His-OH的摩尔比为1:1.52；离子载体A、PyBOP的摩尔比为1:1.51；离子载体A、DIPEA摩尔比为1:3.05；离子载体A、乙腈的固液比为1 g:24 mL；
取1M浓度氢氧化钠、THF/水（v/v，1:2.1）和离子载体B，氮气保护条件下室温搅拌，TLC监测反应，结束后在55 ℃下减压蒸馏，加入2 M浓度盐酸酸化至pH为5.6，过滤、沉淀用去离子水洗涤3次，76 ℃真空干燥30 h得到His(Trt)-Lys(Boc)-OH；其中，氢氧化钠、THF/水的体积比为1:15.5；离子载体B与氢氧化钠的固液比为1 g:0.92 mL；
Biotin-Gly-OH的制备：
取生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯、甘氨酸混合，加入四氢呋喃/水混合溶液（v/v，1:1.15）溶解，加入27.8 wt%浓度的氢氧化钠溶液调节pH至8.5，室温反应，TLC监测反应，结束后调节pH至2.0，析出固体，过滤、水淋洗、真空干燥得到Biotin-Gly-OH；其中，生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯、甘氨酸的摩尔比为1:1.22；生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯与四氢呋喃/水混合溶液的固液比为1 g:13.5 mL；
生物素三肽-1的制备：
取Biotin-Gly-OH、四氢呋喃，冰浴降温条件下加入N,N’-羰基咪唑，反应液不再冒泡时，将其滴加至含有9.2 wt%浓度的His(Trt)-Lys(Boc)-OH和三乙胺的四氢呋喃溶液中，滴完后室温反应，TLC监测反应，结束后减压浓缩，加入水和乙酸乙酯，用2 M浓度盐酸调节pH至2，有机相用盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、减压浓缩得到产物M；接着去保护，即:取上述产物M在氮气保护条件下加入二氯甲烷溶解，浓度为0.12 g/mL，加入等体积TFA，室温下搅拌1 h，TLC监测反应，结束后55℃减压蒸干溶剂，***洗涤4次，50 ℃真空干燥24 h得到产物N，即为生物素三肽-1；其中，Biotin-Gly-OH、四氢呋喃固液比为1 g:10.5 mL；Biotin-Gly-OH、N,N’-羰基咪唑的质量比为1:0.54；His(Trt)-Lys(Boc)-OH与Biotin-Gly-OH的质量比为1:1.8；三乙胺与Biotin-Gly-OH的质量比为1:0.41。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δppm: 8.84 (s, 1H, IMI-H), 7.72 (s, 1H, IMI-H), 5.08、4.62~4.70、4.61 (4H, -CH),3.44 (1H, S-CH), 3.25、3.02 (2H, IMI-CH2), 3.19、2.90 (2H, S-CH2), 4.15、2.71、2.23~1.40 (18H, -CH2)。HRMS (ESI): Calcd for C24H38N8O6S, m/z [M+H]+, 566.32。
实施例2：
功能化离子液体的制备与实施例1相同。
一种生物素三肽-1的液相合成方法与实施例1的区别在于：
His(Trt)-Lys(Boc)-OH的制备过程中，功能化离子液体、Boc-Lys-OH的摩尔比为1:1.9；离子载体A、Trt-His-OH的摩尔比为1:1.42；离子载体B与氢氧化钠的固液比为1 g:0.84 mL。
Biotin-Gly-OH的制备过程中，生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯、甘氨酸的摩尔比为1:1.12。
生物素三肽-1的制备过程中，His(Trt)-Lys(Boc)-OH与Biotin-Gly-OH的质量比为1:1.6。
实施例3：
功能化离子液体的制备与实施例1相同。
一种生物素三肽-1的液相合成方法与实施例1的区别在于：
His(Trt)-Lys(Boc)-OH的制备过程中，功能化离子液体、Boc-Lys-OH的摩尔比为1:2.35；离子载体A、Trt-His-OH的摩尔比为1:1.55；离子载体B与氢氧化钠的固液比为1 g:0.94 mL。
Biotin-Gly-OH的制备过程中，生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯、甘氨酸的摩尔比为1:1.26。
生物素三肽-1的制备过程中，His(Trt)-Lys(Boc)-OH与Biotin-Gly-OH的质量比为1:1.85。
实施例4：
功能化离子液体的制备与实施例1相同。
一种生物素三肽-1的液相合成方法与实施例1的区别在于：
His(Trt)-Lys(Boc)-OH的制备过程中，功能化离子液体、Boc-Lys-OH的摩尔比为1:2.4；离子载体A、Trt-His-OH的摩尔比为1:1.6；离子载体B与氢氧化钠的固液比为1 g:1mL。
Biotin-Gly-OH的制备过程中，生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯、甘氨酸的摩尔比为1:1.28。
生物素三肽-1的制备过程中，His(Trt)-Lys(Boc)-OH与Biotin-Gly-OH的质量比为1:1.96。
实施例5：
功能化离子液体的制备与实施例1相同。
一种生物素三肽-1的液相合成方法与实施例1的区别在于：在His(Trt)-Lys(Boc)-OH的制备过程中，采用功能化大孔树脂进行进一步纯化。
具体为：His(Trt)-Lys(Boc)-OH的制备过程中，将得到的离子载体B溶于60 %乙醇溶液中，浓度为0.04 g/mL；加入功能化大孔树脂（与乙醇溶液的固液比为1 g:55 mL）进行吸附3 h，然后脱吸附，即取吸附后的树脂放入30 %浓度的乙醇溶液中，振荡30 min，过滤、减压蒸馏、真空干燥，然后再进行离子液体载体切割步骤。
其中，功能化大孔树脂的制备：
按质量比1:0.22:0.16:0.18的比例取聚（GMA-co-EDMA）基质的大孔吸附树脂、4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸、间苯二胺、间苯二甲醛混合分散于二氧六环中，加入3 M浓度的醋酸水溶液，体系置于90 ℃油浴条件下，氮气气氛中搅拌反应24 h；离心收集沉淀，依次用THF、甲醇洗涤5次，120 ℃真空干燥过夜得到功能化大孔树脂；其中，聚（GMA-co-EDMA）基质的大孔吸附树脂与二氧六环的固液比为16 mg/mL；醋酸水溶液的加入体积为二氧六环的3.2 %。
实施例6：
功能化离子液体的制备与实施例1相同。
一种生物素三肽-1的液相合成方法与实施例1的区别在于：在生物素三肽-1的制备过程中，采用功能化大孔树脂进行进一步纯化。
具体为：在生物素三肽-1的制备过程中，将得到的产物N溶于60 %乙醇溶液中，浓度为0.04 g/mL；加入功能化大孔树脂（与乙醇溶液的固液比为1 g:55 mL）进行吸附3 h，然后脱吸附，即取吸附后的树脂放入30 %浓度的乙醇溶液中，振荡30 min，过滤、减压蒸馏、真空干燥，得到生物素三肽-1。
其中，功能化大孔树脂的制备与实施例5相同。
实施例7：
功能化离子液体的制备与实施例1相同。
一种生物素三肽-1的液相合成方法与实施例1的区别在于：在His(Trt)-Lys(Boc)-OH的制备过程中和在生物素三肽-1的制备过程中，采用功能化大孔树脂进行进一步纯化。其纯化过程分别与实施例5和实施例6相同；功能化大孔树脂的制备与实施例5相同。
实施例8：
功能化离子液体的制备与实施例5的区别在于：采用4-氯-1-丁醇替代2-氯-6,7-二甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮。
一种生物素三肽-1的液相合成方法与实施例5的区别在于：采用本实施例制备的功能化离子液体。
实施例9：
功能化离子液体的制备与实施例6的区别在于：采用4-氯-1-丁醇替代2-氯-6,7-二甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮。
一种生物素三肽-1的液相合成方法与实施例6的区别在于：采用本实施例制备的功能化离子液体。
实施例10：
功能化离子液体的制备与实施例7的区别在于：采用4-氯-1-丁醇替代2-氯-6,7-二甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮。
一种生物素三肽-1的液相合成方法与实施例7的区别在于：采用本实施例制备的功能化离子液体。
实施例11：
功能化离子液体的制备与实施例10相同。
一种生物素三肽-1的液相合成方法与实施例10的区别在于：功能化大孔树脂的制备过程中，采用间苯二胺替代4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸。
对比例1：
功能化离子液体的制备与实施例1的区别在于：采用4-氯-1-丁醇替代2-氯-6,7-二甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮。
一种生物素三肽-1的液相合成方法与实施例1的区别在于:采用本对比例制备的功能化离子液体。
试验例1：
1、红外表征
测试采用德国BRUKER公司生产的VERTEX 70型傅里叶变换红外光谱，通过溴化钾压片法进行测试，离子液体样品利用点样毛细管将样品均匀涂抹在压片上。测试波长为4000~500 cm-1，分辨率为4 cm-1，次数16。
对对比例1、实施例1制备得到的功能化离子液体进行上述测试，结果如图1所示。从图中分析可知，相比于对比例1制备的功能化离子液体的红外测试结果，实施例1制得的功能化离子液体的红外光谱中，在1600~1500 cm-1范围内出现苯环骨架振动的特征吸收峰，表明实施例1中功能化离子液体成功制备。
对实施例5和实施例11制备得到的功能化大孔树脂进行上述测试，结果如图2所示。从图中分析可知，相比于实施例11制备的功能化大孔树脂的红外测试结果，实施例5制得的功能化大孔树脂的红外光谱中，在1675 cm-1附近出现羧基中C=O键的特征吸收峰，在1625 cm-1附近的峰信号明显增强，是由缩醛亚胺键的特征吸收峰引起的，说明4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸、间苯二甲醛已发生逐步聚合反应，其它基团峰信号覆盖在聚（GMA-co-EDMA）基质的大孔吸附树脂峰信号中；以上结果表明实施例5中功能化大孔树脂成功制备。
2、纯度和收率的测定
测试采用高效液相色谱法进行。取生物素三肽-1样品溶于水中，浓度为0.5 mg/mL；测试条件具体包括：C18色谱柱（4.6×250 mm）；流动相，A相为体积比0.2 %三氟乙酸/水，B相为体积比0.1 %三氟乙酸/乙腈；流速，1.0 mL/min；进样量，10 μL；洗脱梯度，B相浓度从20~70 %；洗脱时间，30 min。
对对比例1、实施例1~11合成的生物素三肽-1进行上述测试，结果如表1所示：
表1 纯度和收率测试结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
从表1中数据可以看出，实施例1合成的生物素三肽的纯度和收率明显高于对比例1，表明采用2-氯-6,7-二甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮改性制得的功能化离子液体，作为多肽液体合成的载体，能够有效提升生物素三肽-1产品的纯度和收率，且各阶段物分离纯化操作简单，无需进一步的色谱纯化，降低生产成本。实施例5合成的生物素三肽-1的纯度和收率明显高于实施例1，实施例6合成的生物素三肽-1的纯度高于实施例1，而其收率则与实施例1的相当，表明在生物素三肽-1的液相合成过程中加入4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸修饰改性的功能化大孔树脂对中间产物进一步分离提纯，能够进一步增加合成的生物素三肽-1产品的纯度和收率；而在最后得到的产物后进一步进行功能化大孔树脂的分离、纯化，可进一步提升合成产品的纯度，对其收率不产生明显的影响；同样的实施例8和实施例9相比于对比例1的变化趋势与上述一致。此外，实施例10的效果要好于实施例11，表明4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸修饰改性的功能化大孔树脂的分离提纯效果更佳。
试验例2：
功能化大孔树脂表征
1、吸附-脱吸附性能测定
静态吸附试验
预处理，功能化大孔树脂先用无水乙醇浸泡24 h，充分溶胀后装柱，用5倍床层体积的无水乙醇以3 BV/h的流速通过树脂，至流出液在样品出峰位置处无吸收峰，再用去离子水以4 BV/h的流速冲洗至无乙醇味备用；
取50 g预先处理过的树脂样品，加入100 mL浓度为0.2 g/mL的生物素三肽-1醇溶液（乙醇浓度为60 %），封口后放入20℃的恒温摇床中140 次/min的频率振荡3 h，之后取出静置3 h。每隔半小时搅拌一次，使吸附完全。然后将溶剂进行抽滤并用50 mL去离子水洗涤，滤液进行浓缩、冷冻干燥、称重，并按下列式子计算吸附当量：
吸附当量（mg/g）=吸附量/干树脂质量
静态解吸试验
取静态吸附后得到的干燥固体树脂样品，加入40 %浓度的乙醇，封口后置于20℃的恒温摇床上140 次/min频率下振荡3 h。之后取出，溶剂抽滤，滤液进行浓缩，冷冻干燥，称重，并按下列式子计算解吸率：
解吸率%=解吸量/吸附量×100%
对实施例5和实施例11制备的功能化大孔树脂进行上述测试，结果如表2所示：
表2吸附-脱吸附性能测试结果
Figure 890255DEST_PATH_IMAGE002
从表2中数据可以看出，实施例5制备的功能化大孔树脂的吸附当量和解吸率明显高于实施例11的，表明采用4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸修饰改性的功能化大孔树脂，能够显著增强大孔树脂的吸附性能，其吸附当量明显增加；且解吸附性能也得到显著增强，其解吸率明显增加。
2、稳定性测定
试验取50 g预先处理过的树脂样品进行10次吸附-解吸附操作，具体操作方法同上述吸附-解吸附性能测定，结果以吸附当量的减少率来表征。
对实施例5和实施例11制备的功能化大孔树脂进行上述测试，结果如表3所示：
表3 稳定性测试结果
Figure DEST_PATH_IMAGE003
从表3中数据可以看出，实施例5制备的功能化大孔树脂的吸附当量的减少率明显低于实施例11的，表明采用4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸修饰改性的功能化大孔树脂，能够有效提升大孔树脂的稳定性，能够多次从复使用，有效延长其使用寿命。
3、选择性吸附测定
分别配制浓度为0.02 g/mL的生物素三肽-1（实施例1制备）醇溶液、离子载体B（实施例1制备）醇溶液、功能化离子液体（实施例1制备）醇溶液、His(Trt)-Lys(Boc)-OH（实施例1制备）醇溶液、Biotin-Gly-OH（实施例1制备）醇溶液，并分别加入5 g功能化大孔树脂，进行吸附-脱吸附实验，操作同上。
对实施例5和实施例11制备的功能化大孔树脂进行上述测试，结果如表4所示：
表4 吸附-脱吸附性能测试结果
Figure DEST_PATH_IMAGE005
从表4中数据可以看出，实施例5制备的功能化大孔树脂对生物素三肽-1和离子载体B的吸附当量显著高于对其它物质的吸附量，具有良好的选择吸附性；且对功能化离子液体、His(Trt)-Lys(Boc)-OH、Biotin-Gly-OH的吸附量明显少于实施例11制备的；表明采用4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸修饰改性的功能化大孔树脂，能够有效提升大孔树脂对生物素三肽-1和离子载体B的选择性吸附能力，达到更佳的分离提纯效果。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种生物素三肽-1的液相合成方法，包括：
His(Trt)-Lys(Boc)-OH的制备：
取功能化离子液体、Boc-Lys-OH、DMAP和乙腈，混合搅拌溶解后，加入0.8~1 M浓度的DCC/二氯甲烷溶液，室温、氮气保护的条件下搅拌反应24~28 h，用铺有两层滤纸和硅藻土的布氏漏斗抽滤，减压蒸馏、***洗涤，然后溶于二氯甲烷中，1.8~2 M浓度盐酸洗涤，有机相加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏浓缩、40~50 ℃真空干燥24~30 h得到离子载体A；
取离子载体A、PyBOP、Trt-His-OH、DIPEA和乙腈混合，氮气保护下搅拌溶解，35~40℃恒温水浴条件下搅拌反应8~10 h，50~55 ℃下减压蒸馏除溶剂，依次用***、去离子水分别洗涤3~4次，加入无水硫酸钠干燥、真空干燥24~30 h得到离子载体B；
取0.8~1 M浓度氢氧化钠、THF/水（v/v，1:1.5~2.5）和离子载体B，氮气保护条件下室温搅拌，TLC监测反应，结束后在50~55℃下减压蒸馏，加入1.8~2 M浓度盐酸酸化至pH为5~6，过滤、沉淀用去离子水洗涤2~3次，70~80℃真空干燥24~30 h得到His(Trt)-Lys(Boc)-OH；
Biotin-Gly-OH的制备：
-由生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯通过化学反应键连甘氨酸得到Biotin-Gly-OH；
生物素三肽-1的制备：
-由His(Trt)-Lys(Boc)-OH与Biotin-Gly-OH通过脱水缩合反应、再脱保护得到生物素三肽-1；
其中，所述功能化离子液体结构中至少包含羟基活性基团；所述功能化离子液体原料组成至少包括2-氯-6,7-二甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮、1-甲基咪唑；
所述功能化离子液体的制备方法，包括：
取1-甲基咪唑、2-氯-6,7-二甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮混合，升温至80~90℃，氮气气氛下反应即得。
2.根据权利要求1所述的一种生物素三肽-1的液相合成方法，其特征在于：所述生物素三肽-1的纯度≥96%，收率＞90%。
3.根据权利要求1所述的一种生物素三肽-1的液相合成方法，其特征在于：所述His(Trt)-Lys(Boc)-OH的制备过程中，和/或，生物素三肽-1的制备过程中，采用功能化大孔树脂进行进一步纯化；其中，功能化大孔树脂原料组成包括聚（GMA-co-EDMA）基质的大孔吸附树脂、4-氨基-4-脱氧-10-甲基蝶酸、间苯二胺、间苯二甲醛。
4.根据权利要求1所述的一种生物素三肽-1的液相合成方法，其特征在于：所述1-甲基咪唑、2-氯-6,7-二甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮的摩尔比为1:1.2~1.6。
5.权利要求1中所述功能化离子液体作为载体材料、催化剂的应用。
6.权利要求1中所述功能化离子液体在多肽液相合成领域的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述功能化离子液体在提高多肽产品纯度和收率中的用途。
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