CN113855617A - 一种蜂胶黄酮精制物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种蜂胶黄酮精制物及其制备方法与应用，本发明提供的技术方案是由碳酸氢钠、氢氧化钠分步提取、分离纯化、酸化处理、大孔吸附树脂过滤的方法制备得到蜂胶黄酮精制物，该蜂胶黄酮精制物中总黄酮的重量百分含量以芦丁计为90％以上，其中含量最高的9种黄酮单体依次为：槲皮素、3,4‑二甲氧基肉桂酸、短叶松素、柚皮素、松属素、山奈酚、芹菜素、白杨素、高良姜素；本发明采用常见的碱和酸处理，减少乙醇用量，对环境无污染，且制备的蜂胶黄酮精制物化学成分明确，总黄酮含量高，无粘性，颜色金黄色，对皮肤抗光老化具有明显的作用，极大拓展了蜂胶黄酮精制物在化妆品领域的应用，具有较高的适用性。

Description

一种蜂胶黄酮精制物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及天然产物中活性成分的研究领域，特别是涉及一种蜂胶黄酮精制物及其制备方法与应用。

背景技术

蜂胶是工蜂采集植物树脂等分泌物与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的胶粘性物质。研究表明，蜂胶中的黄酮类、萜烯类物质对于多种细菌都有抑制和杀灭作用、还具有局部麻醉、促进组织再生等广泛的生物学作用。

蜂胶原料不能直接食用，现有技术中大多采用乙醇提取浓缩得到块状的蜂胶乙醇提取物，用于生产溶液剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂和化妆品等。然而这种蜂胶乙醇提取物中黄酮类化合物含量大约在24％左右，其中还含有很多杂质，粘性强，颜色呈黑褐色，在化妆品中应用时其产品颜色很深、黏度高、稳定性差、易沉淀，导致开发的护肤品颜色深和肤感差，严重限制了蜂胶在化妆品等领域的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蜂胶黄酮精制物及其制备方法与应用，以解决现有现在蜂胶黄酮提取含量低、杂质多，应用到化妆品中导致颜色深、黏度高、稳定性差、易沉淀等缺陷。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种蜂胶黄酮精制物的制备方法，包括以下步骤：

(1)：将粉碎后的毛胶用纱布包裹，将毛胶放入碳酸氢钠水溶液中煮沸，保温搅拌提取得到滤渣和滤液；将上述滤渣放入氢氧化钠水溶液中煮沸，提取滤液后与上述的滤液合并得到滤液L1；

(2)：将步骤(1)中得到的滤液L1加入盐酸，至滤液R1的PH值为4.8～5.2，静置离心，得到沉淀物S1和上清液L2；将上清液L2加入盐酸，至上清液L2的PH值为3.8～4.2，静置离心，得到沉淀物S2和上清液L3；将上清液L3加入盐酸，至上清液L3的PH值为2.8～3.2，静置离心，得到沉淀物S3；将沉淀物S1、沉淀物S2和沉淀物S3合并，得到蜂胶黄酮粗提物；

(3)：将步骤(2)中得到的蜂胶黄酮粗提物加入乙醇中溶解稀释，得到稀释液，调节稀释液的PH至4.8～5.2后逐滴加入至大孔吸附树脂，静置；

(4)：将步骤(3)中得到的大孔吸附树脂加入去离子水中，置于摇床上洗脱，再将大孔吸附树脂置于无水乙醇中，置于摇床上洗脱，收集洗脱液，洗脱三次，将洗脱液合并，减压干燥后得到蜂胶黄酮精制物。

优选地，所述步骤(1)中，碳酸氢钠的质量分数为5％，以克计蜂胶与以毫升计5％碳酸氢钠水溶液的比为1：(8～20)。

优选地，所述步骤(1)中，氢氧化钠的质量分数为2％，以克计蜂胶与2％氢氧化钠的质量比为1：(5～10)。

优选地，所述步骤(1)中，蜂胶在碳酸氢钠水溶液中煮沸时间为25～35分钟，保温温度为80～90℃，保温搅拌时间为50～70min。

优选地，所述步骤(2)中，盐酸的质量分数为10％，静置时间均为20～30小时。

优选地，所述步骤(3)中，乙醇的质量分数为40％～60％，稀释液密度为0.1～0.5g/ml。

优选地，稀释液与大孔吸附树脂的上样量为0.5～1.0mL/g，静置时间为1～2小时。

优选地，步骤(4)中，无水乙醇的质量分数为75％～95％。

一种蜂胶黄酮精制物，由上述的蜂胶黄酮精制物的制备方法所制备，蜂胶黄酮精制物中总黄酮的重量百分含量以芦丁计为90％以上，该蜂胶黄酮精制物含量最高的9种黄酮单体依次为：槲皮素、3,4-二甲氧基肉桂酸、短叶松素、柚皮素、松属素、山奈酚、芹菜素、白杨素、高良姜素。

一种上述的蜂胶黄酮精制物在化妆品中的应用。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

上述技术方案提供一种蜂胶黄酮精制物及其制备方法与应用，该制备方法采用碱提酸沉、大孔吸附树脂过滤的方法，减少乙醇用量，对环境友好，提取精制效率高，对蜂胶中的黄酮提取基本完全，黄酮类含量和纯度高，种类丰富，适用于工厂化批量生产，由该方法制备得到的蜂胶黄酮精制物中总黄酮含量高，重量百分含量以芦丁计为90％以上，呈黄金色，无粘性，干燥后呈粉末状，为蜂胶在化妆品领域的使用提供一种基础的原料，极大拓展了蜂胶黄酮精制物在化妆品领域的应用，具有较高的适用性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例六提供的液相色谱检测结果图。

图2为本发明实施例七提供的ROS抑制率检测图。

图3为本发明实施例七提供的MMP-1基因表达检测及含量检测图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种蜂胶黄酮精制物的制备方法，由该方法制备得到的蜂胶黄酮精制物中总黄酮的重量百分含量以芦丁计，为90％以上，且该蜂胶黄酮精制物含量最高的9种黄酮单体依次为：槲皮素、3,4-二甲氧基肉桂酸、短叶松素、柚皮素、松属素、山奈酚、芹菜素、白杨素、高良姜素。

该蜂胶黄酮精制物的制备方法包括以下步骤：

(1)：将粉碎后的毛胶用尼龙纱布包裹，放入质量分数为5％的碳酸氢钠水溶液中煮沸25～35分钟，在85℃以上保温搅拌提取50～70min，得到滤渣和滤液；将上述滤渣放入质量分数为2％的氢氧化钠水溶液中煮沸25～35分钟，在85℃以上保温搅拌提取50～70min，得到滤渣和滤液，将上述两次滤液合并得到滤液L1；

其中，毛胶以克计，碳酸氢钠水溶液以毫升计，二者比例为1：(8～20)；毛胶以克计，氢氧化钠水溶液以毫升计，二者比例为1：(5～10)；

(2)：将步骤(1)中得到的滤液L1中逐滴加入质量分数为10％的盐酸，边滴加边搅拌，至滤液L1的PH为4.8～5.2，静置20～30小时，离心得到沉淀物S1和上清液L2；上清液L2中逐滴加入质量分数为10％的盐酸，边滴加边搅拌，至上清液L2的PH为3.8～4.2，静置20～30小时，离心得到沉淀物S2和上清液L3；上清液L3中逐滴加入质量分数为10％的盐酸，边滴加边搅拌，至上清液L3的PH为2.8～3.2，静置20～30小时，离心得到沉淀物S3；将沉淀物S1、沉淀物S2和沉淀物S3合并，得到蜂胶黄酮粗提物；

(3)：将步骤(2)中得到的蜂胶黄酮粗提物加入质量分数为40％～60％的乙醇中溶解稀释，至稀释液的密度为0.1～0.5g/mL，调节稀释液PH值为4.8～5.2，取稀释液逐滴加入至大孔吸附树脂上，静置1～2小时；

其中，稀释液与大孔树脂之间的上样量为0.5～1.0mL/g(生药量/树脂量)；

(4)：将步骤(3)中上样后的大孔树脂加入去离子水中，置于摇床上洗脱，除去水溶性杂质，在将大孔树脂置于质量分数为75％～95％的无水乙醇中，置于摇床上洗脱，洗脱三次，分别收集洗脱液，将洗脱液合并，减压干燥后得到蜂胶黄酮精制物。

由上述方法制备得到的蜂胶黄酮精制物的总黄酮含量从蜂胶中的9.62％提高到90％以上。

下面将结合具体实施例进一步说明

实施例一

(1)：取毛胶50g，将粉碎后的毛胶用尼龙纱布包裹，放入质量分数为5％的碳酸氢钠水溶液中煮沸25分钟，在85℃保温搅拌提取50min，得到滤渣和滤液；将上述滤渣放入质量分数为2％的氢氧化钠水溶液中煮沸25min，在85℃保温搅拌提取50min，得到滤渣和滤液，将上述两次滤液合并得到滤液L1；

其中，毛胶以克计，碳酸氢钠水溶液以毫升计，二者比例为1：10；毛胶以克计，氢氧化钠水溶液以毫升计，二者比例为1：8；

(2)：将步骤(1)中得到的滤液L1中逐滴加入质量分数为10％的盐酸，边滴加边搅拌，至滤液L1的PH为4.8，静置20小时，离心得到沉淀物S1和上清液L2；上清液L2中逐滴加入质量分数为10％的盐酸，边滴加边搅拌，至上清液L2的PH为3.8，静置20小时，离心得到沉淀物S2和上清液L3；上清液L3中逐滴加入质量分数为10％的盐酸，边滴加边搅拌，至上清液L3的PH为2.8，静置20小时，离心得到沉淀物S3；将沉淀物S1、沉淀物S2和沉淀物S3合并，得到蜂胶黄酮粗提物；

(3)：将步骤(2)中得到的蜂胶黄酮粗提物加入质量分数为50％的乙醇中溶解稀释，至稀释液的密度为0.2g/mL，调节稀释液PH值为4.8，取稀释液逐滴加入至大孔吸附树脂上，静置1小时；

其中，稀释液与大孔树脂之间的上样量为0.6mL/g(生药量/树脂量)；

(4)：将步骤(3)中上样后的大孔树脂加入去离子水中，置于摇床上洗脱，除去水溶性杂质，在将大孔树脂置于质量分数为75％的无水乙醇中，置于摇床上洗脱，洗脱三次，分别收集洗脱液，将洗脱液合并，减压干燥后得到蜂胶黄酮精制物3.58g。

实施例二

(1)：取毛胶50g，将粉碎后的毛胶用尼龙纱布包裹，放入质量分数为5％的碳酸氢钠水溶液中煮沸30min，在85℃以上保温搅拌提取60min，得到滤渣和滤液；将上述滤渣放入质量分数为2％的氢氧化钠水溶液中煮沸30min，在90℃保温搅拌提取60min，得到滤渣和滤液，将上述两次滤液合并得到滤液L1；

其中，毛胶以克计，碳酸氢钠水溶液以毫升计，二者比例为1：20；毛胶以克计，氢氧化钠水溶液以毫升计，二者比例为1：5；

(2)：将步骤(1)中得到的滤液L1中逐滴加入质量分数为10％的盐酸，边滴加边搅拌，至滤液L1的PH为5，静置24小时，离心得到沉淀物S1和上清液L2；上清液L2中逐滴加入质量分数为10％的盐酸，边滴加边搅拌，至上清液L2的PH为4，静置24小时，离心得到沉淀物S2和上清液L3；上清液L3中逐滴加入质量分数为10％的盐酸，边滴加边搅拌，至上清液L3的PH为3，静置24小时，离心得到沉淀物S3；将沉淀物S1、沉淀物S2和沉淀物S3合并，得到蜂胶黄酮粗提物；

(3)：将步骤(2)中得到的蜂胶黄酮粗提物加入质量分数为60％的乙醇中溶解稀释，至稀释液的密度为0.5g/mL，调节稀释液PH值为5，取稀释液逐滴加入至大孔吸附树脂上，静置1.5小时；

其中，稀释液与大孔树脂之间的上样量为0.8mL/g(生药量/树脂量)；

(4)：将步骤(3)中上样后的大孔树脂加入去离子水中，置于摇床上洗脱，除去水溶性杂质，在将大孔树脂置于质量分数为95％的无水乙醇中，置于摇床上洗脱，洗脱三次，分别收集洗脱液，将洗脱液合并，减压干燥后得到蜂胶黄酮精制物3.75g。

实施例三

(1)：取毛胶50g，将粉碎后的毛胶用尼龙纱布包裹，放入质量分数为5％的碳酸氢钠水溶液中煮沸35min，在95℃保温搅拌提取70min，得到滤渣和滤液；将上述滤渣放入质量分数为2％的氢氧化钠水溶液中煮沸35min，在95℃保温搅拌提取70min，得到滤渣和滤液，将上述两次滤液合并得到滤液L1；

其中，毛胶以克计，碳酸氢钠水溶液以毫升计，二者比例为1：15；毛胶以克计，氢氧化钠水溶液以毫升计，二者比例为1：10；

(2)：将步骤(1)中得到的滤液L1中逐滴加入质量分数为10％的盐酸，边滴加边搅拌，至滤液L1的PH为5.2，静置30小时，离心得到沉淀物S1和上清液L2；上清液L2中逐滴加入质量分数为10％的盐酸，边滴加边搅拌，至上清液L2的PH为4.2，静置30小时，离心得到沉淀物S2和上清液L3；上清液L3中逐滴加入质量分数为10％的盐酸，边滴加边搅拌，至上清液L3的PH为3.2，静置30小时，离心得到沉淀物S3；将沉淀物S1、沉淀物S2和沉淀物S3合并，得到蜂胶黄酮粗提物；

(3)：将步骤(2)中得到的蜂胶黄酮粗提物加入质量分数为50％的乙醇中溶解稀释，至稀释液的密度为0.3g/mL，调节稀释液PH值为5.2，取稀释液逐滴加入至大孔吸附树脂上，静置2小时；

其中，稀释液与大孔树脂之间的上样量为1mL/g(生药量/树脂量)；

(4)：将步骤(3)中上样后的大孔树脂加入去离子水中，置于摇床上洗脱，除去水溶性杂质，在将大孔树脂置于质量分数为85％的无水乙醇中，置于摇床上洗脱，洗脱三次，分别收集洗脱液，将洗脱液合并，减压干燥后得到蜂胶黄酮精制物3.69g。

实施例四

蜂胶黄酮精制物的制备方法包括以下步骤：

(1)：取毛胶50g，将粉碎后的毛胶用尼龙纱布包裹，放入质量分数为5％的碳酸氢钠水溶液中煮沸30min，在85℃以上保温搅拌提取1小时，得到滤渣和滤液；将上述滤渣放入质量分数为2％的氢氧化钠水溶液中煮沸30min，在85℃以上保温搅拌提取1小时，得到滤渣和滤液，将上述两次滤液合并得到滤液L1；

其中，毛胶以克计，碳酸氢钠水溶液以毫升计，二者比例为1：8；毛胶以克计，氢氧化钠水溶液以毫升计，二者比例为1：7；

(2)：将步骤(1)中得到的滤液L1中逐滴加入质量分数为10％的盐酸，边滴加边搅拌，至滤液L1的PH为5，静置24小时，离心得到沉淀物S1和上清液L2；上清液L2中逐滴加入质量分数为10％的盐酸，边滴加边搅拌，至上清液L2的PH为4，静置24小时，离心得到沉淀物S2和上清液L3；上清液L3中逐滴加入质量分数为10％的盐酸，边滴加边搅拌，至上清液L3的PH为3，静置24小时，离心得到沉淀物S3；将沉淀物S1、沉淀物S2和沉淀物S3合并，得到蜂胶黄酮粗提物；

(3)：将步骤(2)中得到的蜂胶黄酮粗提物加入质量分数为40％的乙醇中溶解稀释，至稀释液的密度为0.1g/mL，调节稀释液PH值为5，取稀释液逐滴加入至大孔吸附树脂上，静置1小时；

其中，稀释液与大孔树脂之间的上样量为0.5mL/g(生药量/树脂量)；

(4)：将步骤(3)中上样后的大孔树脂加入去离子水中，置于摇床上洗脱，除去水溶性杂质，在将大孔树脂置于质量分数为80％的无水乙醇中，置于摇床上洗脱，洗脱三次，分别收集洗脱液，将洗脱液合并，减压干燥后得到蜂胶黄酮精制物3.55g。

实施例五、蜂胶黄酮精制物的总黄酮含量测定实验

(1)、芦丁标准曲线的绘制

精密吸取密度为0.2g/L芦丁对照品使用溶液1mL，2mL，3mL，4mL，5mL，6mL，分别置于50mL容量瓶中；加无水乙醇至总体积为15mL，依次加入密度为100g/L的硝酸铝溶液1ml，密度为9.8g/L的醋酸钾溶液1mL，摇匀，加水至刻度，摇匀，静置1h。

用1cm比色杯于415nm处，以30％乙醇溶液为空白，测定吸光度。以50mL中芦丁质量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线或按直线回归方程计算，可知线性工作范围0mg-1.2mg(50mL)。

(2)空白试验

精密称待测蜂胶精制物样品0.1g，置于50mL容量瓶中，加无水乙醇至总体积为15mL，加水稀释至刻度，摇匀。

(3)测定总黄酮含量

精密称实施例一至实施例四中蜂胶精制物样品各0.1g，毛胶0.5克，分别置于50mL容量瓶中，加无水乙醇至总体积为15mL，依次加入密度为100g/L的硝酸铝溶液1ml，密度为9.8g/L的醋酸钾溶液1mL，摇匀，加水至刻度，摇匀。静置1h。

以空白试液作参比，用1cm比色杯，在波长415nm处测定试料溶液的吸光度。测得实施例一总黄酮为92.4％，实施例二总黄酮为94.6％，实施例三总黄酮为95.8％，实施例四总黄酮为91.9％，毛胶总黄酮为9.86％。

表1

实施例六、蜂胶黄酮精制物化学组成测定实验

液相色谱检测条件：

色谱柱：Sepax HP-C18(150mm*4.6mm,5μm)或性能相当的色谱柱

流动相：甲醇，质量分数为1％的乙酸

流速：1ml/min

检测波长：280nm

柱温：33℃

进样量：5μl

停止时间：135min

后运行时间：20min

梯度洗脱：洗脱程序见表2

表2 高效液相色谱法梯度洗脱程序

检测结构如附图1所示，实施例一、实施例二、实施例三得到的蜂胶黄酮精制物与毛胶中黄酮种类基本一致，具体为：

峰1：槲皮素；

峰2：3,4-二甲氧基肉桂酸；

峰3：短叶松素；

峰4：柚皮素；

峰5：松属素；

峰6：山奈酚；

峰7：芹菜素；

峰8：白杨素；

峰9：高良姜素。

实施例七、基于人成纤维细胞的抗光老化功效检测实验

抗老化效果测试是基于UVA辐照成纤维细胞的氧化损伤模型，通过分析ROS抑制率、氧化相关基因MMP-1表达情况以及MMP-1含量来评价待测活性物的功效。将实施例二得到的蜂胶黄酮精制物分别溶于无水乙醇和聚乙二醇制成浓度为0.01％的试样，进行抗光老化功效测试。

(1)ROS抑制率检测

取对数生长期细胞消化后接种至6孔板，在温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中培养24h；待6孔板中细胞铺板率达到40％左右时，进行分组给药，每组设3个复孔。在温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中孵育培养24h。

空白对照组直接进行ROS活性检测；其余组采用剂量为10J/cm²的UVA进行辐照，辐照结束后，直接进行ROS活性检测；PBS清洗细胞后，每孔加入1mL浓度为25μM DCFH-DA探针，37℃细胞培养箱孵育45min；弃掉含DCFH-DA的培养液，用PBS清洗多次，胰酶消化细胞后，PBS清洗细胞1次，加入一定量新鲜PBS，流式检测。

(2)MMP-1基因表达检测

基于细胞毒性检测的结果，选择安全浓度进行MMP-1基因表达检测。待给药24h后收集细胞，通过qRT-PCR检测样品对细胞内MMP-1基因表达的影响。具体操作步骤如下：

取对数生长期细胞消化后接种至6孔板，在温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中培养24h。培养结束后，收集细胞培养液用于下一步ELISA检测。用PBS轻柔清洗细胞三次，使用RNA isoPlus裂解细胞，每孔加入1mL裂解液。室温放置5min，使其充***解，转移至1.5mLRNase-free Eppendorf管中，提取RNA，合成cDNA，进行Elastin基因表达检测。

(3)MMP-1含量检测

收集细胞培养液于1.5mL EP管中，用于MMP-1 ELISA检测。收集的培养液1000g离心后吸取上清液-20℃保存，进行MMP-1蛋白ELISA检测。

实验结果如附图2好附图3所示，与未辐照BC组相比，UVA辐照后ROS含量极显著增加(p<0.01)，表明氧化损伤模型造模成功；与UVA辐照组相比，PC组VE极显著降低了ROS含量(p<0.01)，蜂胶黄酮精制物乙醇溶解组和聚乙二醇溶解组均极显著降低了ROS含量(p<0.01)，抑制MMP-1的合成，说明蜂胶黄酮精制物可以通过抑制MMP-1的表达而达到抑制胞外基质ECM的降解，从而起到抗光老化功效。

实施例八、眼部刺激实验

制备试验受试液：

取实施例2蜂胶黄酮精制物0.01克，加入50mL丙二醇充分溶解，再加入50mL纯净水混匀，配成0.01％的受试液。

动物和饲养环境如下：

试验方法：

检测依据：消毒技术规范(2002年版)2.3.4

实验动物数量：3只

实验动物预检检查：在试验开始前24小时对试验动物两只眼睛进行检查，排除有眼睛刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤的动物。

操作程序：

首先，轻轻拉开家兔一侧眼睛下眼睑，往受试物结膜囊中滴入0.1mL受试液，另一侧眼睛滴入生理盐水作为正常对照。

然后，在滴入受试液后，使上、下眼睑被动闭合4秒，在30秒后用生理盐水冲洗。

临床检查和评分：

在滴入受试液后1h、24h、48h、72h、7d、14d和21d对动物眼睛进行检查，肉眼观察家兔眼结膜、虹膜和角膜的损伤与恢复情况。如果72h未出现刺激反应，或第7d或第14d眼睛刺激反应完全恢复，提前终止试验。

结果评价方法：

按照眼损害评分标准对家兔眼角膜、虹膜和结膜急性刺激反应进行评分，并分别计算每只动物在三个不同观察时间(24h、48h和72h)角膜损害、虹膜损害、结膜充血和结膜水肿四方面的“平均评分”(即每只动物的24h、48h和72h评份之和除以观察数3)。

试验结果：

染毒后动物中毒表现情况：无。

眼刺激反应评分情况见表3。

表3 家兔眼刺激(3天内)反应评分

结论:

根据眼刺激反应判定标准，受试物对家兔急性眼刺激反应强度为无刺激性。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种蜂胶黄酮精制物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)：将粉碎后的毛胶用纱布包裹，将毛胶放入碳酸氢钠水溶液中煮沸，保温搅拌提取得到滤渣和滤液；将上述滤渣放入氢氧化钠水溶液中煮沸，提取滤液后与上述的滤液合并得到滤液L1；

(2)：将步骤(1)中得到的滤液L1加入盐酸，至滤液R1的PH值为4.8～5.2，静置离心，得到沉淀物S1和上清液L2；将上清液L2加入盐酸，至上清液L2的PH值为3.8～4.2，静置离心，得到沉淀物S2和上清液L3；将上清液L3加入盐酸，至上清液L3的PH值为2.8～3.2，静置离心，得到沉淀物S3；将沉淀物S1、沉淀物S2和沉淀物S3合并，得到蜂胶黄酮粗提物；

(3)：将步骤(2)中得到的蜂胶黄酮粗提物加入乙醇中溶解稀释，得到稀释液，调节稀释液的PH至4.8～5.2后逐滴加入至大孔吸附树脂，静置；

(4)：将步骤(3)中得到的大孔吸附树脂加入去离子水中，置于摇床上洗脱，再将大孔吸附树脂置于无水乙醇中，置于摇床上洗脱，收集洗脱液，洗脱三次，将洗脱液合并，减压干燥后得到蜂胶黄酮精制物。

2.根据权利要求1所述的蜂胶黄酮精制物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，碳酸氢钠的质量分数为5％，以克计蜂胶与以毫升计5％碳酸氢钠水溶液的比为1：(8～20)。

3.根据权利要求1所述的蜂胶黄酮精制物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，氢氧化钠的质量分数为2％，以克计蜂胶与2％氢氧化钠的质量比为1：(5～10)。

4.根据权利要求1所述的蜂胶黄酮精制物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，蜂胶在碳酸氢钠水溶液中煮沸时间为25～35分钟，保温温度为80～90℃，保温搅拌时间为50～70min。

5.根据权利要求1所述的蜂胶黄酮精制物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，盐酸的质量分数为10％，静置时间均为20～30小时。

6.根据权利要求1所述的蜂胶黄酮精制物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，乙醇的质量分数为40％～60％，稀释液密度为0.1～0.5g/mL。

7.根据权利要求1所述的蜂胶黄酮精制物的制备方法，其特征在于，稀释液与大孔吸附树脂的上样量为0.5～1.0mL/g，静置时间为1～2小时。

8.根据权利要求1所述蜂胶黄酮精制物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，无水乙醇的质量分数为75％～95％。

9.一种蜂胶黄酮精制物，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述的蜂胶黄酮精制物的制备方法所制备，蜂胶黄酮精制物中总黄酮的重量百分含量以芦丁计为90％以上，该蜂胶黄酮精制物含量最高的9种黄酮单体依次为：槲皮素、3,4-二甲氧基肉桂酸、短叶松素、柚皮素、松属素、山奈酚、芹菜素、白杨素、高良姜素。

10.一种如权利要求9所述的蜂胶黄酮精制物在化妆品中的应用。

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