CN113842494B - 一种促进组织再生的可注射止血晶胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进组织再生的可注射止血晶胶及其制备方法和应用，制备方法为：将聚多巴胺，壳聚糖和胶原蛋白超声分散于去离子水中，加入冰醋酸搅拌直至溶解；将氧化葡聚糖溶解于去离子水中，在剧烈搅拌下将氧化葡聚糖溶液加入混合溶液中，转移至冰箱反应，室温下融化，得到促进组织再生的可注射止血晶胶。本发明的晶胶孔径为50μm～200μm，具有相互连接的大孔结构和稳定的机械强度，经过压缩固定可以通过注射器输送至窄而深的伤口处，在吸血后快速恢复形状以阻塞伤口并形成物理屏障，并通过浓缩血液激活凝血过程达到止血的效果。本发明制备的晶胶具有快速形状恢复能力，可注射性，并具有良好的止血能力等。

Description

一种促进组织再生的可注射止血晶胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种促进组织再生的可注射止血晶胶及其制备方法和应用。
背景技术
外伤，手术，先天性疾病或药物引起的血液疾病造成的出血并发症导致了极高的重大发病率和死亡率。据报道，出血导致了超过30％的外伤死亡率。因此，在战场，手术，车祸等紧急情况下及时止血具有极其重要的意义。在这些紧急情况下，仅靠身体的止血机制无法实现快速止血。因此需要合适的止血剂来促进、增强、补偿或者模拟止血的自然机制。在出血导致的死亡中，非压迫性出血占了其中的50％。在战场中的子弹、炸弹、***造成的伤口形状不规则不可按压，常规的止血方法只有向伤口填充纱布，但需要二次手术来清除纱布，这样会对患者造成二次伤害。应用于伤口表面的止血剂已经能达到很好的止血效果，但是应对不可按压，深，窄的出血伤口也无能为力，此外，传统的加压辅助止血方法不适用于穿刺伤口和腋窝或腹股沟区域的伤口。此外大面积的伤口往往难以修复，严重影响了健康。因此制备出一种能够快速处理深窄的非压迫性出血，能够在体内降解，并具有促进伤口修复的能力的止血材料具有极为重要的临床意义。
具有相互连接的大孔结构和稳定的机械强度的晶胶可以压缩固定，然后通过注射器输送到狭窄而深的伤口，固定的晶胶在吸血后迅速恢复形状阻塞出血伤口并形成物理屏障来止血。制备晶胶的常规交联方式为自由基聚合，EDC/NHS交联的蛋白质，或者是迈克尔加成等，不仅需要对天然聚合物如明胶，海藻酸钠，壳聚糖等进行繁琐的乙烯基官能化，而且残留的APS/TEMED等交联剂具有明显的细胞毒性。壳聚糖晶胶可以由二醛交联剂如戊二醛和乙二醛形成。然而，它们的高反应性和毒性限制了它们作为生物医学***交联剂的应用。因此需要一种安全的交联剂来制备所需要的晶胶。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种促进组织再生的可注射止血晶胶及其制备方法和应用。本发明的晶胶能够快速处理深窄的、深层致命性出血量大的非压迫性出血。能够在体内降解，可以促进组织再生。原材料价格低廉，工艺简单，而且生物相容性良好，并具有良好的形状记忆能力，在接触血液会形成物理屏障堵塞出血伤口。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种促进组织再生的可注射止血晶胶的制备方法，其特征在于，制备方法包括：
步骤一、将胶原蛋白和壳聚糖加入到去离子水中，分散均匀，得到混合溶液；或者将胶原蛋白、壳聚糖和聚多巴胺加入到去离子水中，分散均匀，得到混合溶液；
步骤二、向步骤一中所述混合溶液中加入冰醋酸，搅拌使壳聚糖全部溶解；然后加入氧化葡聚糖溶液，混合均匀；将混合均匀后的溶液置于冰箱中反应，反应结束后常温下解冻，得到促进组织再生的可注射止血晶胶。
上述的一种促进组织再生的可注射止血晶胶的制备方法，其特征在于，步骤一中所述混合溶液中壳聚糖的质量百分含量为0.5％～1％，混合溶液中聚多巴胺的含量不大于2mg/mL；胶原蛋白与壳聚糖的质量比为1:(0.5～2)；步骤二中氧化葡聚糖与步骤一中壳聚糖的质量比为(0.1～1):1。
上述的一种促进组织再生的可注射止血晶胶的制备方法，其特征在于，步骤二中所述反应的温度为-8℃～-20℃，反应的时间为8h～36h。
上述的一种促进组织再生的可注射止血晶胶的制备方法，其特征在于，步骤一中聚多巴胺的制备方法包括：将氨水、无水乙醇和去离子水混合均匀，室温下反应10min～30min，然后加入多巴胺盐酸盐溶液，室温下反应12h～24h，离心得到聚多巴胺。
上述的一种促进组织再生的可注射止血晶胶的制备方法，其特征在于，所述聚多巴胺的形态为直径200nm～300nm的球形。
上述的一种促进组织再生的可注射止血晶胶的制备方法，其特征在于，氨水、无水乙醇和去离子水的体积比为(0.5～1.5):20:(30～45)，多巴胺盐酸盐溶液的浓度为20mg/mL～50mg/mL，多巴胺盐酸盐溶液与水的体积比为1:(5～10)。
上述的一种促进组织再生的可注射止血晶胶的制备方法，其特征在于，步骤二中氧化葡聚糖的制备方法包括：将葡聚糖溶于去离子水中，加入高碘酸钠，室温下避光反应18h～24h；然后加入乙二醇以终止葡聚糖的进一步氧化，并持续搅拌1h～2h，然后将溶液在透析袋中用水透析，直至无色后进行冷冻干燥，得到氧化葡聚糖。
上述的一种促进组织再生的可注射止血晶胶的制备方法，其特征在于，葡聚糖与高碘酸钠的摩尔比为1:(0.5～1)，高碘酸钠与乙二醇的摩尔比为1:(0.5～1)；透析袋的分子量为8000～12000。
进一步地，本发明还提供了一种按照上述方法制备的促进组织再生的可注射止血晶胶。
进一步地，本发明还提供了一种按照上述方法制备的促进组织再生的可注射止血晶胶在止血材料中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明采用胶原蛋白、壳聚糖、聚多巴胺和氧化葡聚糖，壳聚糖的止血活性主要来源于其表面的正电荷，这一特性不依赖于自身的凝血机制，因此可以适用于患有凝血障碍的患者。胶原蛋白，壳聚糖和氧化葡聚糖可以模拟细胞外基质，促进伤口愈合。聚多巴胺所携带的邻苯二酚基团提供了组织粘附性，并且可以提高体内凝血效率。
2、本发明中的原材料均具有良好的生物相容性，且均可以在体内降解，同时成胶中未再加入新的交联剂，进一步保障了材料的无毒副性。
3、本发明的制备方法原料廉价易得，成本低，合成步骤简单，接触到血液可以快速膨胀形成物理屏障以阻止出血，并且具有很高的吸血能力以及膨胀系数。
4、本发明制备的晶胶相比于别的形状记忆止血材料具有更快的恢复速度和更高的溶胀率，将本发明制备的晶胶溶胀平衡后压缩至其体积的80％，在去离子水中恢复的时间为1.8s～9.7s，在去离子水中溶胀平衡后，溶胀率为4500％～6000％。快速的形状恢复可以更快的堵塞出血伤口，给伤口周围施加压力进而物理堵塞止血。高的溶胀率可以更好的浓缩凝血因子，进而迅速止血。
5、本发明的晶胶孔径为50μm～200μm，具有相互连接的大孔结构和稳定的机械强度，经过压缩固定可以通过注射器输送至窄而深的伤口处，在吸血后快速恢复形状以阻塞伤口并形成物理屏障，并通过浓缩血液激活凝血过程达到止血的效果，可用作止血材料。
下面结合具体实施方式和附图，对本发明的技术方案做进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的聚多巴胺的SEM图。
图2为本发明实施例4制备的氧化葡聚糖的FTIR图。
图3为本发明实施例4制备的氧化葡聚糖的1HNMR图。
图4为本发明实施例10-14制备的晶胶的溶胀率。
图5为本发明实施例10-14制备的晶胶的压缩应变图。
图6为本发明实施例10-14制备的晶胶全血凝结图。
图7为本发明实施例10-14制备的晶胶的溶血率。
图8为本发明实施例10-14制备的晶胶的细胞毒性MTT分析结果示意图。
图9为采用不同止血材料体内止血时的创面照片。
图10为采用不同止血材料体内止血的出血量。
图11为本发明实施例11和实施例13制备的晶胶对于大鼠全皮层缺损伤口的修复效果图。
图12为本发明实施例11和实施例13制备的晶胶在溶菌酶中的降解图。
具体实施方式
聚多巴胺的制备
实施例1
将1mL氨水溶液、20mL无水乙醇和45mL去离子水室温搅拌20分钟。然后，将5mL浓度为50mg/mL的多巴胺盐酸盐溶液快速加入上述混合溶液中。1分钟后，溶液颜色变为淡黄色。室温下剧烈搅拌20小时后，所得溶液变成深棕色。最后离心得到聚多巴胺纳米颗粒，用去离子水洗涤3次。通过扫描电镜检测产物为粒径约200nm～300nm的纳米球，如图1所示。
实施例2
将1.5mL氨水溶液、20mL无水乙醇和40mL去离子水室温搅拌30分钟。然后，将4mL浓度为40mg/mL的多巴胺盐酸盐溶液快速加入上述混合溶液中。1分钟后，溶液颜色变为淡黄色。室温下剧烈搅拌12小时后，所得溶液变成深棕色。最后离心得到聚多巴胺纳米颗粒，用去离子水洗涤3次。其理化性质与实施例1相似。
实施例3
将0.5mL氨水溶液、20mL无水乙醇和30mL去离子水室温搅拌10分钟。然后，将6mL浓度为20mg/mL的多巴胺盐酸盐溶液快速加入上述混合溶液中。1分钟后，溶液颜色变为淡黄色。室温下剧烈搅拌24小时后，所得溶液变成深棕色。最后离心得到聚多巴胺纳米颗粒，用去离子水洗涤3次。其理化性质与实施例1相似。
氧化葡聚糖的制备
实施例4
将4g分子量为70000的葡聚糖和3.4g高碘酸钠在磁力搅拌下溶于50mL去离子水中。室温下将混合物处于避光条件下反应24h，溶液为浅黄色。然后加入1g乙二醇与混合物反应2h以终止葡聚糖的进一步氧化。将产物用去离子水连续透析3天(透析袋截留分子量为8000～12000)，每天更换5次透析水，然后将透析袋内的溶液冷冻干燥，得到氧化葡聚糖。
对本实施例制备的氧化葡聚糖进行傅立叶变换红外吸收光谱分析，氧化葡聚糖在1732cm-1处有一个羰基伸缩峰(证实对葡聚糖成功氧化改性)，如图2和图3所示。通过1H-NMR分析定性证实葡聚糖的氧化，氧化葡聚糖在9.6ppm处生成的弱共振，这属于醛质子，并且葡聚糖谱上没有这些峰，这证实了葡聚糖的氧化。
实施例5
将4g分子量为70000的葡聚糖和2.6g高碘酸钠在磁力搅拌下溶于50mL去离子水中。室温下将混合物处于避光条件下反应18h，溶液为浅黄色。然后加入0.6g乙二醇与混合物反应1h以终止葡聚糖的进一步氧化。将产物用去离子水连续透析3天(透析袋截留分子量为8000～12000)，每天更换5次透析水，然后将透析袋内的溶液冷冻干燥，得到氧化葡聚糖。
对本实施例制备的氧化葡聚糖进行傅立叶变换红外吸收光谱分析，氧化葡聚糖在1732cm-1处有一个羰基伸缩峰(证实对葡聚糖成功氧化改性)。通过1H-NMR分析定性证实葡聚糖的氧化，氧化葡聚糖在9.6ppm处生成的弱共振，这属于醛质子，并且葡聚糖谱上没有这些峰，这证实了葡聚糖的氧化。
实施例6
将4g分子量为70000的葡聚糖和5.3g高碘酸钠在磁力搅拌下溶于50mL去离子水中。室温下将混合物处于避光条件下反应20h，溶液为浅黄色。然后加入0.8g乙二醇与混合物反应1.5h以终止葡聚糖的进一步氧化。将产物用去离子水连续透析3天(透析袋截留分子量为8000～12000)，每天更换5次透析水，然后将透析袋内的溶液冷冻干燥，得到氧化葡聚糖。
对本实施例制备的氧化葡聚糖进行傅立叶变换红外吸收光谱分析，氧化葡聚糖在1732cm-1处有一个羰基伸缩峰(证实对葡聚糖成功氧化改性)。通过1H-NMR分析定性证实葡聚糖的氧化，氧化葡聚糖在9.6ppm处生成的弱共振，这属于醛质子，并且葡聚糖谱上没有这些峰，这证实了葡聚糖的氧化。
晶胶的制备
实施例7
步骤一、将0.05g胶原蛋白，0.1g壳聚糖加入去离子水中，搅拌直至胶原蛋白全部溶解，得到10mL混合溶液；
步骤二、向混合溶液中加入50μL冰醋酸，直至壳聚糖均匀溶解，将1g实施例4制备的氧化葡聚糖溶于10mL去离子水，在剧烈搅拌下将100μL氧化葡聚糖溶液加入壳聚糖混合溶液中，之后将其在-8℃下反应8h，常温下解冻，得到促进组织再生的可注射止血晶胶。
实施例8
步骤一、将0.1g胶原蛋白，0.1g壳聚糖加入去离子水中，搅拌直至胶原蛋白全部溶解，得到10mL混合溶液；
步骤二、向混合溶液中加入50μL冰醋酸，直至壳聚糖均匀溶解，将1g实施例4制备的氧化葡聚糖溶于10mL去离子水，在剧烈搅拌下将200μL氧化葡聚糖溶液加入壳聚糖混合溶液中，之后将其在-12℃下反应16h，常温下解冻，得到促进组织再生的可注射止血晶胶。
实施例9
步骤一、将0.1g胶原蛋白，0.05g壳聚糖加入去离子水中，搅拌直至胶原蛋白全部溶解，得到10mL混合溶液；
步骤二、向混合溶液中加入50μL冰醋酸，直至壳聚糖均匀溶解，将1g实施例4制备的氧化葡聚糖溶于10mL去离子水，在剧烈搅拌下将500μL氧化葡聚糖溶液加入壳聚糖混合溶液中，之后将其在-18℃下反应24h，常温下解冻，得到促进组织再生的可注射止血晶胶。
实施例10
步骤一、将0.05g胶原蛋白，0.1g壳聚糖和2.5mg聚多巴胺加入去离子水中，超声并搅拌直至胶原蛋白和聚多巴胺溶解，得到10mL混合溶液；
步骤二、向混合溶液中加入50μL冰醋酸，直至壳聚糖均匀溶解，将1g实施例4制备的氧化葡聚糖溶于10mL去离子水，在剧烈搅拌下将100μL氧化葡聚糖溶液加入壳聚糖混合溶液中，之后将其在-20℃下反应36h，常温下解冻，得到促进组织再生的可注射止血晶胶。命名为CS/HLC/PDA0.25。
本实施例所用聚多巴胺可以采用实施例1-3中任一实施例制备的聚多巴胺，也可采用市售粒径约200nm～300nm的聚多巴胺。
实施例11
将步骤一混合溶液中PDA(聚多巴胺)最终浓度控制在0mg/mL，其它条件同实施例10，获得CS/HLC晶胶。
实施例12
将步骤一混合溶液中PDA最终浓度控制在0.5mg/mL，其它条件同实施例10，获得CS/HLC/PDA0.5晶胶。
实施例13
将步骤一混合溶液中PDA最终浓度控制在1.0mg/mL，其它条件同实施例10，获得CS/HLC/PDA1.0晶胶。
实施例14
将步骤一混合溶液中PDA最终浓度控制在2.0mg/mL，其它条件同实施例10，获得CS/HLC/PDA2.0晶胶。
对本发明实施例7-10制备的晶胶测量其在去离子水中平衡时的溶胀率，如图4所示，高的溶胀率可以快速吸收伤口渗出液和血液，减少细菌感染，还有助于浓缩凝血因子，从而提高止血率。如表1所示，随着聚多巴胺含量的不断增高，晶胶在去离子水中恢复的时间越快，在应对出血的紧急情况下可以迅速膨胀，将伤口完全填满，形成物理屏障，阻止血液流出。
表1本发明实施例7-10制备的晶胶在水中恢复时间
Figure BDA0003256944950000091
将实施例10-14制备的晶胶通过万能试验机测量其抗压强度，结果如图5所示。由于聚多巴胺携带的反应性醌基可以与壳聚糖和胶原蛋白上的氨基形成希夫碱键，加入聚多巴胺会增加其交联密度，随着聚多巴胺含量的不断增高，晶胶的机械性能逐渐增加。
图6为晶胶体外凝血性能测试。通过测试晶胶的动态全血凝血指数来衡量凝血性能，凝血指数越高凝血性能越差。从图6结果可以看出，空白组，明胶海绵组和纱布组在150秒后依然呈现出较高的凝血指数，然而所有晶胶组在相同的时间点的凝血指数均比明胶海绵和纱布组更低。
将红细胞用浓度为0.5mg/mL至4mg/mL的晶胶悬浮液处理后，溶血率均低于5％，表明所制备的晶胶血液相容性良好。如图7所示。
图8为实施例10-14所制备的晶胶的细胞相容性实验，培养24，48和72小时后细胞存活率均在95％以上，证明所制备的晶胶具有良好的生物相容性。
通过注射1mL 10％水合氯醛给大鼠麻醉。用打孔器在大鼠肝脏上制成(5×3mm2)的圆柱形伤口，用作非压迫性出血的伤口模型。将实施例11制备的晶胶立即***圆柱形伤口，并记录失血量。商业纱布、明胶海绵和壳聚糖止血粉用作对照。图9为止血时的创面照片，图10为大鼠的出血量，表明本发明所制备的晶胶具有良好的止血能力。
图11为晶胶对于大鼠全皮层缺损伤口的修复效果研究。从图11结果可以看出，处理3天后，CS/HLC、CS/HLC/PDA1.0晶胶与空白相比伤口愈合出现了显著差异。处理7天后，CS/HLC和CS/HLC/PDA1.0晶胶均表现出比空白更高的伤口愈合率，且CS/HLC/PDA1.0晶胶组的伤口愈合率显著高于CS/HLC组。处理13天后，CS/HLC和CS/HLC/PDA1.0晶胶都表现出100％的愈合率，而空白组还没完全愈合。晶胶具有相互连接的大孔结构有助于通过促进血管化加速伤口修复，加入聚多巴胺的晶胶具有抗氧化活性，可消除炎症反应过程中过量产生的活性氧，加快伤口愈合。
图12为晶胶在5mg/mL的溶菌酶中的降解图，表明晶胶可以被溶菌酶降解，加入聚多巴胺增加了其交联密度，导致其降解速度减慢。所以晶胶可以被体液中的溶菌酶降解。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (5)

1.一种促进组织再生的可注射止血晶胶的制备方法，其特征在于，制备方法包括：
步骤一、将胶原蛋白和壳聚糖加入到去离子水中，分散均匀，得到混合溶液；或者将胶原蛋白、壳聚糖和聚多巴胺加入到去离子水中，分散均匀，得到混合溶液；所述混合溶液中壳聚糖的质量百分含量为0.5%~1%，混合溶液中聚多巴胺的含量不大于2mg/mL；胶原蛋白与壳聚糖的质量比为1:（0.5~2）；所述聚多巴胺的形态为直径200nm~300nm的球形；
步骤二、向步骤一中所述混合溶液中加入冰醋酸，搅拌使壳聚糖全部溶解；然后加入氧化葡聚糖溶液，混合均匀；将混合均匀后的溶液置于冰箱中反应，反应的温度为-8℃~-20℃，反应的时间为8h~36h，反应结束后常温下解冻，得到促进组织再生的可注射止血晶胶；氧化葡聚糖与步骤一中壳聚糖的质量比为（0.1~1）:1；
所述氧化葡聚糖的制备方法包括：将葡聚糖溶于去离子水中，加入高碘酸钠，室温下避光反应18h~24h；然后加入乙二醇以终止葡聚糖的进一步氧化，并持续搅拌1h~2h，然后将溶液在透析袋中用水透析，直至无色后进行冷冻干燥，得到氧化葡聚糖；所述葡聚糖与高碘酸钠的摩尔比为1:（0.5~1），高碘酸钠与乙二醇的摩尔比为1:（0.5~1）；透析袋的分子量为8000~12000。
2.根据权利要求1所述的一种促进组织再生的可注射止血晶胶的制备方法，其特征在于，步骤一中聚多巴胺的制备方法包括：将氨水、无水乙醇和去离子水混合均匀，室温下反应10min~30min，然后加入多巴胺盐酸盐溶液，室温下反应12h~24h，离心得到聚多巴胺。
3.根据权利要求2所述的一种促进组织再生的可注射止血晶胶的制备方法，其特征在于，氨水、无水乙醇和去离子水的体积比为（0.5~1.5）:20:（30~45），多巴胺盐酸盐溶液的浓度为20mg/mL~50mg/mL，多巴胺盐酸盐溶液与水的体积比为1:（5~10）。
4.一种按照权利要求1至3中任一权利要求所述方法制备的促进组织再生的可注射止血晶胶。
5.一种按照权利要求1至3中任一权利要求所述方法制备的促进组织再生的可注射止血晶胶在止血材料中的应用。
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