CN113842398A - 一种用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶、给药方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶，制备步骤如下：通过对复苏的脐带间充质干细胞传代培养，并进行富集浓缩的方法，获得高浓度的具有生物活性的脐带间充质干细胞；配合海藻酸钠凝胶联合制备，获得具有高度稳定性、渗透性的脐带间充质干细胞凝胶。本发明凝胶通过体外对局部伤处进行涂抹的方式，促进伤处细胞生长，同时避免了细菌侵入，降低感染的可能性，为伤处提供有利于组织生长的微环境，从而促进外伤愈合、缩短治疗时间，减少伤者痛苦。使用操作简单、成品便于保存，降低伤者治疗成本，提高治疗效果。

Description

一种用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶、给药 方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是一种用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶、给药方法和应用。
背景技术
外伤是正常皮肤或组织在外界致伤因子如外科手术、外力、热、电流、化学物质、低温及机体内在因素如局部血液供应障碍等作用下所导致的损害。常伴有皮肤完整性的破坏以及一定量正常组织的缺失及皮肤正常功能受损。外伤愈合是一个动态、复杂有序的过程，包括①凝血期：外伤形成瞬间开始的机体首先出现的止血反应；②炎症期：由于局部血管收缩导致的的组织缺血，引起血管活性物质的释放，以及一些可能的致病微生物的存在引起的机体防御反应；③修复期：基底细胞增殖，刺激毛细血管和***的反应性增生，巨噬细胞释放生长因子如血小板衍生生长因子(PDGF)、β转型生长因子(β-TGF)、也α转型生长因子(α-TGF)加速肉芽组织形成。外伤愈合过程中，若某一阶段失控，则会导致组织损伤无法得到正常的修复，形成难愈性创面，而难愈性创面的形成，常伴随基础性疾病的存在。
1988年，第一例胚胎干细胞临床应用取得效果，但其细胞来源困难，不易于获得；1995年，第一例脐带间充质干细胞疗法进入临床应用。20多年的发展历程，脐带间充质干细胞因其多向分化潜能、免疫调节功能、旁分泌效应，成为干细胞治疗的首选。其来源广泛，取材方便，通过建立高效分离、培养、扩增的方法，可获得大量种子细胞，-196℃液氮罐中可长期保存且无免疫原性。
研究发现，创伤的刺激及局部创面的微环境中含有的各种不同的细胞因子可能具有促进脐带间充质干细胞趋化及诱导其向所需要的组织和细胞分化来参与组织的修复；同时，局部创伤的微环境刺激脐带间充质干细胞分泌产生血管内皮生长因子、表皮生长因子等来促进伤处血管形成，皮损修复，以行使其功能。海藻酸钠凝胶的存在，促进有效成分渗透吸收，维持局部环境稳定性，降低伤处感染风险。
目前针对外伤的外用药其药效较为固定，不能够针对不同类型、不同程度的外伤进行针对性的治疗，间充质干细胞作为活细胞，其最大的优势在于能够根据外伤部位的局部微环境有针对性的分泌各种活性物质，达到降低局部炎性反应、促进伤口愈合及血管新生等。而海藻酸钠及丙二醇的加入为间充质干细胞提供了一个能够长期在伤口处附着并存活的环境，并促进干细胞分泌因子的透皮吸收，从而提升治疗效果。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶、给药方法和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶，制备步骤如下：
(1)将体外分离获得的间充质干细胞以原代培养基进行细胞培养，37℃、5％CO2培养，3-4小时后翻面，使培养基浸润细胞，继续培养P0代细胞7-10天；
(2)细胞融合度达到50％-70％，质量浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入胰酶消化液使细胞从培养瓶底部脱落；300-500g离心5-8分钟，去上清，细胞沉淀用培养基重悬，过滤，计数，根据计数结果按照4-6×103/cm2接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，补加完全培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养P1代细胞；
(3)细胞培养3-6天，细胞融合度达到50-80％，质量浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入胰酶消化液使细胞从培养瓶底部脱落；300-500g离心5-8分钟，去上清，细胞沉淀用培养基重悬，过滤，计数，根据计数结果按照1-2×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养P2代细胞；
(4)细胞培养2-4天后，细胞融合度达到80-90％，质量浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入胰酶消化液使细胞从培养瓶底部脱落；300-500g离心5-8分钟，去上清，细胞沉淀用培养基重悬后过滤，计数，根据计数结果，进行种子库细胞冻存，冻存规格3-4×106/ml/管；放入医用低温冰箱冷冻，24h后转入液氮罐长期保存；
(5)观察P2代种子细胞生长状态，筛选出细胞生长状态良好的P2代种子细胞，良好即为满足如下的观察指标：①细胞形态呈长梭形；②流式细胞仪测定CD29+＞95％、CD44+＞95％、CD73+＞95％、CD90+＞95％、CD105+＞95％、CD34+＜2％、CD45+＜2％、HLA-DR+＜2％；③脐带间充质干细胞体外能够向成脂、成骨、成软骨细胞诱导分化；
(6)微生物检测即需厌氧菌、真菌、支原体检测均为阴性后，复苏种子库细胞，按照2-3×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养P3代细胞；
(7)培养3-4天，融合度达到80-90％，0.9氯化钠注射液清洗细胞一次，加入胰酶消化液使细胞从培养瓶底部脱落，300-500g离心5-8分钟，去上清，培养基重悬细胞沉淀，过滤，计数，根据计数结果，按照2-3×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基，放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养P4代细胞；
(8)按照步骤(7)的方法将P4代细胞传代培养至P5代后，按照步骤(4)的方法进行工作库细胞冻存，冻存规格为1.2×107/3ml/管；放入医用低温冰箱冷冻，24h后转入液氮罐长期保存；
(9)海藻酸钠凝胶配制：溶胶：在生物安全柜中，将灭菌后的海藻酸钠粉末加入含转子的蓝盖瓶中，再向其中依次加入丙二醇、DMSO、复方电解质注射液，边加边摇匀，盖紧瓶盖，室温避光放置48h使其充分溶胀；溶胀48h后将蓝盖瓶放在磁力搅拌器搅拌，使海藻酸钠粉末充分溶解，室温避光保存，得海藻酸钠凝胶；
其中，海藻酸钠：丙二醇：DMSO：复方电解质注射液的比例g：ml：ml：ml为1.5-2.5：10-15：10：75-80；
(10)微生物检测即需厌氧菌、真菌、支原体检测均为阴性后，复苏工作库细胞，按照2-3×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中培养P6代细胞；
(11)细胞培养3天后，融合度达到80-90％，质量浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞两次后，加入胰酶消化液消化回收细胞，300-500g离心5-8分钟，去上清，使用预先配制好的洗液清洗细胞三次，去上清，以20％人血白蛋白重悬细胞沉淀，过滤，计数，根据计数结果，调整细胞悬液浓度至4.5-9×106/ml；
其中，洗液成分为：每500ml质量浓度0.9％氯化钠注射液中加入1ml质量浓度20％人血白蛋白；
(12)分别将步骤(11)制得的细胞悬液与步骤(9)的海藻酸钠凝胶按体积比1:2灌装至预充式注射器中，颠倒混匀后放入医用低温冰箱冷冻保存，即得用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶。
进一步地，所述步骤(9)中在溶胶处理前还经过如下灭菌处理：
电子精密天平称取海藻酸钠粉末，以铝箔纸包起，取一个250ml蓝盖瓶，向其中加入一个磁力搅拌器转子，另取一个蓝盖瓶，向其中加入丙二醇，将包裹海藻酸钠粉末的铝箔纸和两个蓝盖瓶共同121℃高压灭菌30分钟。
进一步地，所述胰酶消化液为重组胰酶消化液Gibco/12569-029；
或者，所述步骤(12)中预充式注射器为5ml预充式注射器。
进一步地，所述步骤(1)中间充质干细胞来源于脐带。
进一步地，所述间充质干细胞的具体制备步骤如下：
经授权获取捐献脐带，取检测合格的优质脐带，合格指标为：采集液需/厌氧菌、真菌、支原体检测阴性、脐带长度不低于20厘米、母血HIV、HBV、HCV及梅毒检测阴性，脐带组织用脐带清洗液洗净后剪成2-3mm3组织块均匀平铺于培养瓶或培养皿底部，每瓶不少于180块，补加原代培养基后倒放入37℃、5％CO2培养箱中，3-4小时后翻面，继续培养P0代细胞7-10天；
其中，脐带清洗液成分为：硫酸庆大霉素终浓度为80IU/ml的质量浓度0.9％的氯化钠注射液。
进一步地，所述步骤(2)中细胞沉淀用完全培养基重悬，完全培养基为含质量浓度10％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子的DF-12培养基；或者，所述步骤(3)中细胞沉淀用完全培养基重悬，完全培养基为含质量浓度10％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子的DF-12培养基；或者，所述步骤(4)中细胞沉淀用DF-12培养基重悬；或者，所述步骤(7)中用完全培养基培养基重悬细胞沉淀，完全培养基为含质量浓度10％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子的DF-12培养基。
进一步地，所述原代培养基为：DMEM/F12培养基中含有体积分数20-25％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子、10IU/ml硫酸庆大霉素注射液；
所述完全培养基为DMEM/F12培养基中含有体积分数10-15％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子。
如上所述的用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶的给药方法，步骤如下：
室温融化后使用，适用于体外，直接涂抹于伤处即可。
如上所述的用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶在制备促进外伤愈合药物方面中的应用。
如上所述的用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶在作为促进外伤愈合药物方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明通过对复苏的脐带间充质干细胞传代培养，并进行富集浓缩的方法，获得高浓度的具有生物活性的脐带间充质干细胞；配合海藻酸钠凝胶联合制备，获得具有高度稳定性、渗透性的脐带间充质干细胞凝胶。通过体外直接涂抹于伤处的方式促进外伤愈合。
2、本发明通过对复苏的脐带间充质干细胞传代培养，并进行富集浓缩的方法，获得高浓度的具有生物活性的脐带间充质干细胞。脐带间充质干细胞是来源于新生儿脐带组织的一种成体干细胞，具有多向分化潜能，免疫原性低，用于外伤创口处可通过定向分化、分泌细胞因子、外泌体等多种途径发挥良好的促进损伤修复及抗炎作用；海藻酸钠，又名褐藻酸钠、海带胶，是一种以海带、海藻为原料经各种离子交换提取制成的天然链锁状高分子多糖聚合物，由于其特殊的理化性质，在温和条件下可形成凝胶，具有一定的稳定性，延长有效作用时间。同时，因其用于体外具有止血作用，常用作外用医疗敷料。二者联合制备(海藻酸钠凝胶能够为干细胞提供一个持续附着于患处的支撑，且在此凝胶环境中24小时后，间充质干细胞的活率仍能达到80％以上，二者具有协同作用)，获得同时具有细胞活性和稳定性的脐带间充质干细胞外用凝胶，通过体外对局部伤处进行涂抹的方式，促进伤处细胞生长，同时避免了细菌侵入，降低感染的可能性，为伤处提供有利于组织生长的微环境，从而促进外伤愈合、缩短治疗时间，减少伤者痛苦。使用操作简单、成品便于保存，降低伤者治疗成本，提高治疗效果。
3、脐带间充质干细胞在体外增殖稳定，同时配合海藻酸钠凝胶共同制备，具有稳定性与较高粘度，有利于维持伤处微环境稳定、促进渗透、降低伤处感染风险。
随着人们对外伤愈合标准的不断提高，伤处的组织重建与功能恢复乃至“完美愈合”成为当前外伤愈合要解决的重要问题，具有重要理论意义和巨大临床价值。目前用于构建组织工程化全层皮肤的种子细胞多来源于伤者自身或异体的表皮细胞和成纤维细胞，这些高度分化的细胞本身不具有再生能力，因而缺乏持续分泌各种促进外伤愈合的细胞因子的生物活性物质的功能，且异体异体细胞存在免疫排斥，临床应用受到限制。而脐带间充质干细胞的多向分化潜能和低免疫原性使其能够通过诱导分化来重建伤处皮肤的解剖结构和生理功能。且给药方式简单、治疗效果明显。
4、本发明中包括脐带间充质干细胞的培养及通过对复苏的脐带间充质干细胞传代培养，并进行富集浓缩的方法，获得高浓度的具有生物活性的脐带间充质干细胞，联合海藻酸钠凝胶共同制备，获得具有较高稳定性与渗透性的脐带间充质干细胞凝胶，大大延长了有效作用时间，提高了作用效果与愈后状态，便于保存且给药方式简单。
5、本发明中脐带间充质干细胞在作用过程中会大量分泌多种细胞因子，能够促进皮肤组织分化、血管新生以及肉芽组织的生长，可调节局部组织微环境，促进血管新生，改善局部供血，促进组织修复及功能恢复，达到促进外伤愈合的效果。
附图说明
图1为本发明中细胞倍增曲线图；
图2为本发明中P5代流式图；
图3为本发明中P10代流式图；
图4为本发明中P20代流式图；
图5为本发明中三系分化-成脂(20×)图；
图6为本发明中三系分化-成骨(20×)图；
图7为本发明中三系分化-成软骨(4×)图；
图8为本发明中P6代流式图；
图9为本发明中大体观察图；其中，N1至N3表示三个对照组，A1至A3表示三个凝胶治疗组。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶，制备步骤如下：
(1)将体外分离获得的间充质干细胞以原代培养基进行细胞培养，37℃、5％CO2培养，3-4小时后翻面，使培养基浸润细胞，继续培养P0代细胞7-10天；
(4)细胞融合度达到50％-70％，质量浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入胰酶消化液使细胞从培养瓶底部脱落；300-500g离心5-8分钟，去上清，细胞沉淀用培养基重悬，过滤，计数，根据计数结果按照4-6×103/cm2接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，补加完全培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养P1代细胞；
(5)细胞培养3-6天，细胞融合度达到50-80％，质量浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入胰酶消化液使细胞从培养瓶底部脱落；300-500g离心5-8分钟，去上清，细胞沉淀用培养基重悬，过滤，计数，根据计数结果按照1-2×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养P2代细胞；
(4)细胞培养2-4天后，细胞融合度达到80-90％，质量浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入胰酶消化液使细胞从培养瓶底部脱落；300-500g离心5-8分钟，去上清，细胞沉淀用培养基重悬后过滤，计数，根据计数结果，进行种子库细胞冻存，冻存规格3-4×106/ml/管(P2)；放入医用低温冰箱冷冻，24h后转入液氮罐长期保存；
(5)观察P2代种子细胞生长状态，筛选出细胞生长状态良好的P2代种子细胞，良好即为满足如下的观察指标：①细胞形态呈长梭形；②流式细胞仪测定CD29+＞95％、CD44+＞95％、CD73+＞95％、CD90+＞95％、CD105+＞95％、CD34+＜2％、CD45+＜2％、HLA-DR+＜2％；③脐带间充质干细胞体外能够向成脂、成骨、成软骨细胞诱导分化；
(6)微生物检测即需厌氧菌、真菌、支原体检测均为阴性后，复苏种子库细胞，按照2-3×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养P3代细胞；
(7)培养3-4天，融合度达到80-90％，0.9氯化钠注射液清洗细胞一次，加入胰酶消化液使细胞从培养瓶底部脱落，300-500g离心5-8分钟，去上清，培养基重悬细胞沉淀，过滤，计数，根据计数结果，按照2-3×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基，放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养P4代细胞；
(8)按照步骤(7)的方法将P4代细胞传代培养至P5代后，按照步骤(4)的方法进行工作库细胞冻存，冻存规格为1.2×107/3ml/管；放入医用低温冰箱冷冻，24h后转入液氮罐长期保存；
(9)海藻酸钠凝胶配制：溶胶：在生物安全柜中，将灭菌后的海藻酸钠粉末加入含转子的蓝盖瓶中，再向其中依次加入丙二醇、DMSO、复方电解质注射液，边加边摇匀，盖紧瓶盖，室温避光放置48h使其充分溶胀；溶胀48h后将蓝盖瓶放在磁力搅拌器搅拌，使海藻酸钠粉末充分溶解，室温避光保存，得海藻酸钠凝胶；
其中，海藻酸钠：丙二醇：DMSO：复方电解质注射液的比例g：ml：ml：ml为1.5-2.5：10-15：10：75-80；
(10)微生物检测即需厌氧菌、真菌、支原体检测均为阴性后，复苏工作库细胞，按照2-3×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中培养P6代细胞；
(11)细胞培养3天后，融合度达到80-90％，质量浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞两次后，加入胰酶消化液消化回收细胞，300-500g离心5-8分钟，去上清，使用预先配制好的洗液清洗细胞三次，去上清，以20％人血白蛋白重悬细胞沉淀，过滤，计数，根据计数结果，调整细胞悬液浓度至4.5-9×106/ml；
其中，洗液成分为：每500ml质量浓度0.9％氯化钠注射液中加入1ml质量浓度20％人血白蛋白；
(12)分别将步骤(11)制得的细胞悬液与步骤(9)的海藻酸钠凝胶按体积比1:2灌装至预充式注射器中，颠倒混匀后放入医用低温冰箱冷冻保存，即得用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶。
较优地，所述步骤(9)中在溶胶处理前还经过如下灭菌处理：
电子精密天平称取海藻酸钠粉末，以铝箔纸包起，取一个250ml蓝盖瓶，向其中加入一个磁力搅拌器转子，另取一个蓝盖瓶，向其中加入丙二醇，将包裹海藻酸钠粉末的铝箔纸和两个蓝盖瓶共同121℃高压灭菌30分钟。
较优地，所述胰酶消化液为重组胰酶消化液Gibco/12569-029；
或者，所述步骤(12)中预充式注射器为5ml预充式注射器。
较优地，所述步骤(1)中间充质干细胞来源于脐带。
较优地，所述间充质干细胞的具体制备步骤如下：
经授权获取捐献脐带，取检测合格的优质脐带，合格指标为：采集液需/厌氧菌、真菌、支原体检测阴性、脐带长度不低于20厘米、母血HIV、HBV、HCV及梅毒检测阴性，脐带组织用脐带清洗液洗净后剪成2-3mm3组织块均匀平铺于培养瓶或培养皿底部，每瓶不少于180块，补加原代培养基后倒放入37℃、5％CO2培养箱中，3-4小时后翻面，继续培养P0代细胞7-10天；
其中，脐带清洗液成分为：硫酸庆大霉素终浓度为80IU/ml的质量浓度0.9％的氯化钠注射液。
较优地，所述步骤(2)中细胞沉淀用完全培养基重悬，完全培养基为含质量浓度10％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子的DF-12培养基；或者，所述步骤(3)中细胞沉淀用完全培养基重悬，完全培养基为含质量浓度10％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子的DF-12培养基；或者，所述步骤(4)中细胞沉淀用DF-12培养基重悬；或者，所述步骤(7)中用完全培养基培养基重悬细胞沉淀，完全培养基为含质量浓度10％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子的DF-12培养基。
较优地，所述原代培养基为：DMEM/F12培养基中含有体积分数20-25％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子、10IU/ml硫酸庆大霉素注射液；
所述完全培养基为DMEM/F12培养基中含有体积分数10-15％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子。
如上所述的用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶的给药方法，步骤如下：
室温融化后使用，适用于体外，直接涂抹于伤处即可。
如上所述的用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶在制备促进外伤愈合药物方面中的应用。
如上所述的用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶在作为促进外伤愈合药物方面中的应用。
具体地，相关制备及检测实施例如下：
一种用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶，包括以下步骤：
(1)将体外分离获得的间充质干细胞以原代培养基进行细胞培养，37℃、5％CO2培养，3-4小时后翻面，使培养基浸润细胞，继续培养P0代细胞7-10天；
其中，原代培养基为：DMEM/F12培养基中含有体积分数20-25％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子、10IU/ml硫酸庆大霉素注射液；
间充质干细胞来源于脐带，间充质干细胞的具体制备步骤如下：
经授权获取捐献脐带，取检测合格的优质脐带，脐带组织用脐带清洗液(脐带清洗液成分为硫酸庆大霉素终浓度为80IU/ml的0.9％氯化钠注射液)洗净后剪成2-3mm3组织块均匀平铺于培养瓶或培养皿底部，每瓶不少于180块，补加原代培养基后(基础培养基中含有体积分数20-25％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子、10IU/ml硫酸庆大霉素注射液)倒放入37℃、5％CO2培养箱中，3-4小时后翻面，继续培养7-10天(P0)。
(6)细胞融合度达到50％-70％，0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入Tryple消化液(Gibco/12569-029)使细胞从培养瓶底部脱落。300-500g离心5-8分钟，去上清，细胞沉淀用培养基重悬，过滤，计数，根据计数结果按照4-6×103/cm2接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中(P1)，补加完全培养基(基础培养基中含有体积分数10-15％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子)后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养(P1)。
(7)细胞培养3-6天，细胞融合度达到50-80％，0.9％氯化钠注射液清
洗细胞一次，加入Tryple消化液(Gibco/12569-029)使细胞从培养瓶底部脱落。300-500g离心5-8分钟，去上清，细胞沉淀用培养基重悬，过滤，计数，根据计数结果按照1-2×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基(基础培养基中含有体积分数10-15％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子)后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养(P2)。
(4)细胞培养2-4天后，细胞融合度达到80-90％，0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入Tryple消化液(Gibco/12569-029)使细胞从培养瓶底部脱落。300-500g离心5-8分钟，去上清，细胞沉淀用培养基重悬后过滤，计数，根据计数结果，进行种子库细胞冻存，冻存规格3-4×106/ml/管(P2)。放入医用低温冰箱冷冻，24h后转入液氮罐长期保存。
(5)观察P2代种子细胞生长状态，主要观察指标为：①细胞形态及生长特点②流式细胞仪测定CD90、CD105、CD34、CD45等表达情况③脐带间充质干细胞向成脂、成骨、成软骨细胞诱导分化鉴定。
(6)微生物检测合格后，复苏种子库细胞，按照2-3×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基(基础培养基中含有体积分数10-15％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子)后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养(P3)。
(7)培养3-4天，融合度达到80-90％，0.9氯化钠注射液清洗细胞一次，加入Tryple消化液(Gibco/12569-029)使细胞从培养瓶底部脱落，300-500g离心5-8分钟，去上清，培养基重悬细胞沉淀，过滤，计数，根据计数结果，按照2-3×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基(基础培养基中含有体积分数10-15％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子)，放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养(P4)。
(8)按照(7)方法将细胞传代培养至P5代后，按照(4)方法进行工作库细胞冻存，冻存规格为1.2×107/3ml/管(P5)。放入医用低温冰箱冷冻，24h后转入液氮罐长期保存。
(9)海藻酸钠凝胶配制：①灭菌：用电子精密天平称取1.5-2.3g粘度为400cps的海藻酸钠粉末，以铝箔纸包起，取一个250ml蓝盖瓶，向其中加入一个磁力搅拌器转子，另取一个蓝盖瓶，向其中加入适量丙二醇，将包裹海藻酸钠粉末的铝箔纸和两个蓝盖瓶共同121℃高压灭菌30分钟。②溶胶：在生物安全柜中，将灭菌后的海藻酸钠粉末加入含转子的蓝盖瓶中，再向其中依次加入复方电解质溶液、丙二醇、DMSO配制成100ml海藻酸钠凝胶(凝胶中海藻酸钠终浓度为1.5-2.3％、丙二醇体积分数为6-9％、DMSO体积分数为15％)，边加边摇匀，盖紧瓶盖，室温避光放置48h使其充分溶胀。溶胀48h后将蓝盖瓶放在磁力搅拌器搅拌，使海藻酸钠粉末充分溶解，室温避光保存。
(10)微生物检测合格后，复苏工作库细胞，按照2-3×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基(基础培养基中含有体积分数10-15％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子)后放入37℃，5％CO2培养箱中培养(P6)。
(11)细胞培养3天后，融合度达到80-90％，0.9％氯化钠注射液清洗细胞两次后，加入Tryple消化液(Gibco/12569-029)消化回收细胞，300-500g离心5-8分钟，去上清，使用预先配制好的洗液清洗细胞三次(洗液成分为500ml0.9％氯化钠注射液加入1ml20％人血白蛋白)，去上清，根据消化瓶数，按照1ml/瓶加入20％人血白蛋白重悬细胞，过滤至一个新的离心管，再按照1ml/瓶加入20％人血白蛋白冲洗原管后过滤至同一离心管中，计数，根据计数结果，调整细胞悬液浓度至4.5-9×106/ml。
(12)分别将1ml细胞悬液和2ml海藻酸钠凝胶(细胞悬液与海藻酸钠凝胶比例为1:2)灌装至5ml预充式注射器中(终产品含细胞数为4.5-9×106，海藻酸钠终浓度为1-1.5％，丙二醇体积分数为4-6％，DMSO体积分数为10％)，颠倒混匀后放入医用低温冰箱冷冻保存。上述用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶，通过体外直接涂抹于伤处的方式给药。
本发明中包括脐带间充质干细胞的培养及通过对复苏的脐带间充质干细胞传代培养，并进行富集浓缩的方法，获得高浓度的具有生物活性的脐带间充质干细胞，联合海藻酸钠凝胶共同制备，获得具有较高稳定性与渗透性的脐带间充质干细胞凝胶，大大延长了有效作用时间，提高了作用效果与愈后状态，便于保存且给药方式简单。
本发明中脐带间充质干细胞在作用过程中会大量分泌多种细胞因子，能够促进皮肤组织分化、血管新生以及肉芽组织的生长，可调节局部组织微环境，促进血管新生，改善局部供血，促进组织修复及功能恢复，达到促进外伤愈合的效果。
相关检测实施例：
动物实验一：
1、动物模型的制备：
戊巴比妥钠以30mg/kg剂量腹部麻醉注射大鼠，迅速在大鼠背部中线处制备面积约0.5-1cm2的皮肤外伤创口。实验组、对照组分别设3只大鼠，实验组分别为A1-3，使用干细胞凝胶涂抹于伤处，对照组N1-3，为空白对照，8天后观察创口处创面恢复情况。
每日观察创面有无感染、创面分泌物、愈合质量的等情况；测量创面愈合面积。
2、脐带间充质干细胞凝胶的制备：
(1)将体外分离获得的间充质干细胞以原代培养基进行细胞培养，37℃、5％CO2培养，3-4小时后翻面，使培养基浸润细胞，继续培养P0代细胞7-10天；
其中，原代培养基为：DMEM/F12培养基中含有体积分数20-25％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子、10IU/ml硫酸庆大霉素注射液；
间充质干细胞来源于脐带，间充质干细胞的具体制备步骤如下：
经授权获取捐献脐带，检测合格后观察脐带组织可见，颜色均匀，表面光滑无透明胶质，无褶皱或水肿，有弹性长度为28cm。脐带组织用脐带清洗液(脐带清洗液成分为含硫酸庆大霉素的0.9％氯化钠注射液，硫酸庆大霉素注射液终浓度为80IU/ml)洗净后剪成2-3mm3组织块均匀平铺于T-75培养瓶底部，每瓶不少于180块，补加15ml原代培养基后(原代培养基为DF-12培养基含20％胎牛血清、10IU/ml硫酸庆大霉素注射液、100IU/ml人表皮细胞生长因子)倒放入37℃、5％CO2培养箱中，共贴15瓶，3小时后翻面，培养7天后，吸弃培养基，每瓶加入15ml原代培养基，为P0代。
(2)细胞细胞培养4天后，融合度达到60％，以0.9％氯化钠注射液清
洗细胞两次，按照2ml/瓶加入Tryple消化液(Gibco/12569-029)使细胞从培养瓶底部脱落。300g离心8分钟，去上清，细胞沉淀用完全培养基重悬(完全培养基为DF-12培养基含10％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子)，过滤，根据计数结果，共回收7.65×106细胞，按照4.5×105/瓶的接种量接种于T-75培养瓶中，共17瓶，补加完全培养基至15ml后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养，为P1代。
(3)细胞培养4天，细胞融合度达到80％，0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，按照1ml/瓶加入Tryple消化液(Gibco/12569-029)使细胞从培养瓶底部脱落。300g离心8分钟，去上清，细胞沉淀用完全培养基重悬，过滤，根据计数结果，共回收8.50×107细胞，按照2×106/瓶接种量将细胞接种到T-175培养瓶中，共42瓶，补加完全培养基至40ml，放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养，为P2代。
(4)细胞培养4天后，细胞融合度达到90％，0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，按照3ml/瓶加入Tryple消化液(Gibco/12569-029)使细胞从培养瓶底部脱落。300g离心8分钟，去上清，细胞沉淀用DF-12培养基重悬，过滤，根据计数结果，共回收72.24×107细胞，配平，300g离心8分钟，离心结束后，去上清，使用NFD10重悬细胞，调整细胞浓度为4×106/ml，按照4×106/1ml/管分装至2ml离心管中，为P2代，共180管。放入医用低温冰箱冷冻，24h后转入液氮罐长期保存。
(5)观察种子库细胞生长状态，主要观察指标为：①细胞形态及细胞倍增时间(见图1)②流式细胞仪测定CD90、CD105、CD34、CD45等表达情况(见图2、图3、图4)③脐带间充质干细胞向成脂、成骨细胞诱导分化鉴定(见图5至图7)。
(6)微生物检测合格后，复苏5管种子库细胞，按照4×106/瓶接种量将细胞接种到T-175培养瓶中，共10瓶，补加完全培养基至40ml，放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养，为P3代。
(7)培养3天，融合度达到90％，0.9氯化钠注射液清洗细胞一次，按照3ml/瓶加入Tryple消化液(Gibco/12569-029)使细胞从培养瓶底部脱落，300g离心8分钟，去上清，完全培养基重悬细胞沉淀，过滤，根据计数结果，共回收8.40×107细胞，按照4×106/瓶接种量将细胞接种到T-175培养瓶中，共21瓶，补加完全培养基至40ml，放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养，为P4代。
(8)培养3天后按照(7)方法回收细胞，根据计数结果，共回收35.91×107细胞，按照6×106/瓶接种量将细胞接种到T-525培养瓶中，共60瓶，补加完全培养基至120ml，为P5代，培养3天后，按照10ml/瓶加入Tryple消化液(Gibco/12569-029)消化回收细胞，根据计数结果，共回收213.60×107细胞，配平，500g离心10分钟，离心结束后，去上清，使用NFD10重悬细胞，调整细胞浓度为4×106/ml，按照1.2×107/3ml/管分装至5ml离心管中，共177管。放入医用低温冰箱冷冻，24h后转入液氮罐长期保存，为P5代。
(9)海藻酸钠凝胶配制：①灭菌：用分析天平称取2g粘度为400cps的海藻酸钠粉末，以铝箔纸包起，取一个250ml蓝盖瓶，向其中加入一个磁力搅拌器转子，另取一个250ml蓝盖瓶，向其中加入适量丙二醇，将包裹海藻酸钠粉末的铝箔纸和两个蓝盖瓶共同121℃高压灭菌30分钟。②溶胶：在生物安全柜中，将灭菌后的海藻酸钠粉末加入含转子的蓝盖瓶中，再向其中依次加入80.0ml复方电解质溶液、10ml丙二醇、10.0mlDMSO配制成100ml海藻酸钠凝胶(海藻酸钠终浓度为2％)，边加边摇匀，盖紧瓶盖，室温避光放置48h使其充分溶胀。溶胀48h后将蓝盖瓶放在磁力搅拌器搅拌，使海藻酸钠粉末充分溶解，室温避光保存。
(10)微生物检测合格后，复苏7管工作库细胞，按照4×106/瓶接种量将细胞接种到T-175培养瓶中，共21瓶，补加完全培养基至40ml，放入37℃，5％CO2培养箱中培养，为P6代。
(11)细胞培养3天后，融合度达到90％，0.9％氯化钠注射液清洗细胞两次后，按照3ml/瓶加入Tryple消化液(Gibco/12569-029)消化回收细胞，300g离心8分钟，去上清，使用预先配制好的洗液清洗细胞三次(洗液成分为500ml0.9％氯化钠注射液加入1ml20％人血白蛋白)，配平，300g离心8分钟，离心结束后去上清，以10ml20％人血白蛋白重悬细胞沉淀，过滤至一个250ml离心管，再以10ml20％人血白蛋白冲洗原管后过滤至同一个250ml离心管中，计数，根据计数结果，共回收36.75×107细胞，补加20％人血白蛋白，调整细胞悬液浓度至6×106/ml。
(12)取5ml预充式注射器倒置于试管架上，将调整至6×106/ml的细胞悬液按照1ml/管灌装至5ml预充式注射器中，每管补加2ml海藻酸钠凝胶(海藻酸钠终浓度为1.3％)，连接预充式注射器推杆和胶塞，***预充注射器管体，正置管体，排出空气后拧紧，颠倒混匀后放入医用低温冰箱冷冻保存，共50支。
(13)融化一支脐带间充质干细胞凝胶，将全部凝胶打入一个50ml离心管中，补加0.9％氯化钠注射液至40ml，配平，500g离心8分钟，离心结束后，去上清，以5ml0.9％氯化钠注射液重悬底部沉淀，计数，体积：5.2ml、计数：218/6(未稀释)、活细胞总数：5.7×106、活率：97％，剩余细胞送检流式(见图8)。
3、使用方式：室温融化脐带间充质干细胞凝胶，实验组局部施用于创面处，每2天涂抹一次，共涂抹4次。
4、结果讨论：创面均无感染现象，实验大鼠全部存活，均可正常进食。涂抹后2天开始，施用处炎性分泌物减少，4天后创口面积逐渐减小，形成新生表皮，创口愈合趋势明显。
5、大体观察(见图9)。
动物实验二：
1、动物模型的制备：
盐酸***4mg/kg体重腹部麻醉注射大鼠，在其背部使用烧红的铁片以80-85℃的温度制备II°烧伤动物模型。实验组、对照组分别设3只大鼠，实验组分别为A1-3，对照组N1-3，烧伤后第4天，对大鼠进行清创切痂、消毒处理，实验组对创面涂抹干细胞凝胶，覆盖无菌纱布；对照组为空白对照，覆盖无菌纱布。每2天涂抹一次，共4次，8天后观察创口处创面愈合情况。
每日观察创面有无感染、创面分泌物、愈合质量的等情况；测量创面愈合面积。
2、脐带间充质干细胞凝胶的制备：
按照具体实施方式进行干细胞凝胶的制备，并进行凝胶融化后细胞计数、活率的检测。
3、使用方式：室温融化脐带间充质干细胞凝胶，实验组局部施用于烧伤创面处，每2天涂抹一次，共涂抹4次。
4、结果讨论：创面均无感染现象，实验大鼠全部存活，均可正常进食，行为及精神状态无异常。实验组涂抹后2天开始，施用处炎性分泌物减少，切痂处创面愈合率明显高于对照组(见图9)。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (10)

1.一种用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶，其特征在于：制备步骤如下：
(1)将体外分离获得的间充质干细胞以原代培养基进行细胞培养，37℃、5％CO2培养，3-4小时后翻面，使培养基浸润细胞，继续培养P0代细胞7-10天；
(2)细胞融合度达到50％-70％，质量浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入胰酶消化液使细胞从培养瓶底部脱落；300-500g离心5-8分钟，去上清，细胞沉淀用培养基重悬，过滤，计数，根据计数结果按照4-6×103/cm2接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，补加完全培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养P1代细胞；
(3)细胞培养3-6天，细胞融合度达到50-80％，质量浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入胰酶消化液使细胞从培养瓶底部脱落；300-500g离心5-8分钟，去上清，细胞沉淀用培养基重悬，过滤，计数，根据计数结果按照1-2×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养P2代细胞；
(4)细胞培养2-4天后，细胞融合度达到80-90％，质量浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入胰酶消化液使细胞从培养瓶底部脱落；300-500g离心5-8分钟，去上清，细胞沉淀用培养基重悬后过滤，计数，根据计数结果，进行种子库细胞冻存，冻存规格3-4×106/ml/管；放入医用低温冰箱冷冻，24h后转入液氮罐长期保存；
(5)观察P2代种子细胞生长状态，筛选出细胞生长状态良好的P2代种子细胞，良好即为满足如下的观察指标：①细胞形态呈长梭形；②流式细胞仪测定CD29+＞95％、CD44+＞95％、CD73+＞95％、CD90+＞95％、CD105+＞95％、CD34+＜2％、CD45+＜2％、HLA-DR+＜2％；③脐带间充质干细胞体外能够向成脂、成骨、成软骨细胞诱导分化；
(6)微生物检测即需厌氧菌、真菌、支原体检测均为阴性后，复苏种子库细胞，按照2-3×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养P3代细胞；
(7)培养3-4天，融合度达到80-90％，0.9氯化钠注射液清洗细胞一次，加入胰酶消化液使细胞从培养瓶底部脱落，300-500g离心5-8分钟，去上清，培养基重悬细胞沉淀，过滤，计数，根据计数结果，按照2-3×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基，放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养P4代细胞；
(8)按照步骤(7)的方法将P4代细胞传代培养至P5代后，按照步骤(4)的方法进行工作库细胞冻存，冻存规格为1.2×107/3ml/管；放入医用低温冰箱冷冻，24h后转入液氮罐长期保存；
(9)海藻酸钠凝胶配制：溶胶：在生物安全柜中，将灭菌后的海藻酸钠粉末加入含转子的蓝盖瓶中，再向其中依次加入丙二醇、DMSO、复方电解质注射液，边加边摇匀，盖紧瓶盖，室温避光放置48h使其充分溶胀；溶胀48h后将蓝盖瓶放在磁力搅拌器搅拌，使海藻酸钠粉末充分溶解，室温避光保存，得海藻酸钠凝胶；
其中，海藻酸钠：丙二醇：DMSO：复方电解质注射液的比例g：ml：ml：ml为1.5-2.5：10-15：10：75-80；
(10)微生物检测即需厌氧菌、真菌、支原体检测均为阴性后，复苏工作库细胞，按照2-3×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中培养P6代细胞；
(11)细胞培养3天后，融合度达到80-90％，质量浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞两次后，加入胰酶消化液消化回收细胞，300-500g离心5-8分钟，去上清，使用预先配制好的洗液清洗细胞三次，去上清，以20％人血白蛋白重悬细胞沉淀，过滤，计数，根据计数结果，调整细胞悬液浓度至4.5-9×106/ml；
其中，洗液成分为：每500ml质量浓度0.9％氯化钠注射液中加入1ml质量浓度20％人血白蛋白；
(12)分别将步骤(11)制得的细胞悬液与步骤(9)的海藻酸钠凝胶按体积比1:2灌装至预充式注射器中，颠倒混匀后放入医用低温冰箱冷冻保存，即得用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶。
2.根据权利要求1所述的用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶，其特征在于：所述步骤(9)中在溶胶处理前还经过如下灭菌处理：
电子精密天平称取海藻酸钠粉末，以铝箔纸包起，取一个250ml蓝盖瓶，向其中加入一个磁力搅拌器转子，另取一个蓝盖瓶，向其中加入丙二醇，将包裹海藻酸钠粉末的铝箔纸和两个蓝盖瓶共同121℃高压灭菌30分钟。
3.根据权利要求1所述的用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶，其特征在于：所述胰酶消化液为重组胰酶消化液Gibco/12569-029；
或者，所述步骤(12)中预充式注射器为5ml预充式注射器。
4.根据权利要求1所述的用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶，其特征在于：所述步骤(1)中间充质干细胞来源于脐带。
5.根据权利要求4所述的用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶，其特征在于：所述间充质干细胞的具体制备步骤如下：
经授权获取捐献脐带，取检测合格的优质脐带，合格指标为：采集液需/厌氧菌、真菌、支原体检测阴性、脐带长度不低于20厘米、母血HIV、HBV、HCV及梅毒检测阴性，脐带组织用脐带清洗液洗净后剪成2-3mm3组织块均匀平铺于培养瓶或培养皿底部，每瓶不少于180块，补加原代培养基后倒放入37℃、5％CO2培养箱中，3-4小时后翻面，继续培养P0代细胞7-10天；
其中，脐带清洗液成分为：硫酸庆大霉素终浓度为80IU/ml的质量浓度0.9％的氯化钠注射液。
6.根据权利要求1所述的用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶，其特征在于：所述步骤(2)中细胞沉淀用完全培养基重悬，完全培养基为含质量浓度10％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子的DF-12培养基；或者，所述步骤(3)中细胞沉淀用完全培养基重悬，完全培养基为含质量浓度10％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子的DF-12培养基；或者，所述步骤(4)中细胞沉淀用DF-12培养基重悬；或者，所述步骤(7)中用完全培养基培养基重悬细胞沉淀，完全培养基为含质量浓度10％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子的DF-12培养基。
7.根据权利要求1至6任一项所述的用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶，其特征在于：所述原代培养基为：DMEM/F12培养基中含有体积分数20-25％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子、10IU/ml硫酸庆大霉素注射液；
所述完全培养基为DMEM/F12培养基中含有体积分数10-15％胎牛血清、100IU/ml人表皮细胞生长因子。
8.如权利要求1至7任一项所述的用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶的给药方法，其特征在于：步骤如下：
室温融化后使用，适用于体外，直接涂抹于伤处即可。
9.如权利要求1至7任一项所述的用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶在制备促进外伤愈合药物方面中的应用。
10.如权利要求1至7任一项所述的用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶在作为促进外伤愈合药物方面中的应用。
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