CN113840915A

CN113840915A - 腺相关病毒及其用于内耳疗法的用途

Info

Publication number: CN113840915A
Application number: CN202180002375.XA
Authority: CN
Inventors: W.W.钱
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services; University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2020-01-24
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2021-12-24
Also published as: WO2021150850A1; US20220348957A1; IL285977A; EP3908593A1

Abstract

本文提供了腺相关病毒和使用其治疗或预防影响受试者内耳的病症的方法。

Description

腺相关病毒及其用于内耳疗法的用途

对相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年1月24日提交的美国临时申请第62/965,506号的优先权，该临时申请通过引用以其整体并入本文。

背景技术

听力损失是当今影响世界人口的最常见残疾之一。根据国家健康和营养检查调查(National Health and Nutritional Examination Survey)，接近三分之二的70岁及以上的美国成年人受到听力损失的影响。听力损失通常与耳蜗损伤相关。内耳基因疗法是一种有希望的治疗模式，其可以潜在地预防和逆转耳蜗损伤。尽管腺相关病毒载体(AAV)介导的内耳基因疗法已应用于遗传性听力损失的动物模型以改善听觉功能，但在一些耳蜗细胞类型中的感染率较低。为了使内耳基因疗法能有效地治疗听力损失，需要一种具有更高感染效率的病毒载体。

发明内容

本公开涉及用于治疗或预防影响受试者内耳的疾病或病症的组合物和方法。本文已经发现，包含经修饰的AAV衣壳蛋白的重组AAV可以感染耳蜗侧壁，以有效地将遗传物质递送至受试者的耳中。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法可以用于在受试者中治疗或预防听力损失和/或头晕。

在一些实施方案中，本公开提供了一种重组腺相关病毒(AAV)病毒体，其包含：a)经修饰的AAV衣壳蛋白，其中该经修饰的AAV衣壳蛋白包含相对于对应亲本AAV衣壳蛋白的突变，其中该经修饰的AAV衣壳蛋白中的突变位于AAV8-VP1的氨基酸587-595中；以及b)产生表达产物的异源核酸，其中该表达产物减少听力损失或头晕。

在一些实施方案中，表达产物是降低与听力损失和/或头晕相关的基因的表达的核酸，其中该与听力损失和/或头晕相关的基因选自下组，该组由以下各项组成：DIAPH1、KCNQ4、GJB3、IFNLR1、GJB2、GJB6、MYH1、CEACAM16、GSDME/DFNA5、WFS1、LMX1A、TECTA、COCH、EYA4、MYO7A、COL11A2、POU4F3、MYH9、ACTG1、MYO6、SIX1、SLC17A8、REST、GRHL2、NLRP3、TMC1、COL11A1、CRYM、P2RX2、CCDC50、MIRN96、TJP2、TNC、SMAC/DIABLO、TBC1D24、CD164、OSBPL2、HOMER2、KITLG、MCM2、PTPRQ、DMXL2、MYO3A和PDE1C。

在一些实施方案中，表达产物是减少听力损失和/或头晕的多肽，其中该多肽选自下组，该组由以下各项组成：GJB2、GJB6、MYO7A、MYO15A、SLC26A4、TMIE、TMC1、TMPRSS3、OTOF、CDH23、GIPC3、STRC、USH1C、OTOG、TECTA、OTOA、PCDH15、RDX、GRXCR1、TRIOBP、CLDN14、MYO3A、WHRN、CDC14A、ESRRB、ESPN、MYO6、HGF、ILDR1、ADCY1、CIB2、MARVELD2、BDP1、COL11A2、PDZD7、PJVK、SLC22A4、SLC26A5、LRTOMT/COMT2、DCDC2、LHFPL5、S1PR2、PNPT1、BSND、MSRB3、SYNE4、LOXHD1、TPRN、GPSM2、PTPRQ、OTOGL、TBC1D24、ELMOD3、KARS、SERPINB6、CABP2、NARS2、MET、TSPEAR、TMEM132E、PPIP5K2、GRXCR2、EPS8、CLIC5、FAM65B、DFNB32、EPS8L2、ROR1、WBP2、ESRP1、MPZL2、PRPS1、POU3F4、SMPX、AIFM1和COL4A。

在一些实施方案中，重组AAV病毒体选自下组，该组由以下各项组成：AAV2、AAV5、AAV8和AAV9。在一些实施方案中，重组AAV病毒体是包含经修饰的AAV8-VP1衣壳蛋白的AA8病毒体，例如，AAV8BP2病毒体。

在一些实施方案中，表达产物是降低与听力损失相关的基因的表达的核酸，并且是干扰RNA。在一些实施方案中，干扰RNA是反义分子、短干扰RNA或miRNA。

在一些实施方案中，AAV病毒体产生表达产物，该表达产物减少与年龄有关的听力损失、遗传性听力损失、噪声诱发性听力损失、由于施用耳毒性药物而导致的听力损失、疾病相关听力损失或由创伤造成的听力损失。

在另一个实施方案中，本公开提供了一种用于在受试者中治疗或预防耳蜗损伤的方法，该方法包含将有效量的本文描述的任何重组AAV病毒体施用于患有耳蜗损伤或处于形成内耳毛细胞损伤的风险中的受试者。

在一些实施方案中，受试者患有以下各项或处于形成以下各项的风险中：与年龄有关的听力损失、遗传性听力损失、噪声诱发性听力损失、由于施用耳毒性药物而导致的听力损失、疾病相关听力损失以及由创伤造成的听力损失。

在一些实施方案中，重组AAV病毒体感染受试者的耳蜗侧壁。在一些实施方案中，重组AAV病毒体感染耳蜗侧壁中的血管纹。在一些实施方案中，重组AAV病毒体感染血管纹的边缘细胞。

在一些实施方案中，重组AAV病毒体增加内耳毛细胞再生，例如，耳蜗毛细胞再生。

在另一个实施方案中，本公开还提供了一种用于在受试者中治疗或预防听力损失和/或头晕的方法，该方法包含将有效量的本文描述的任何重组AAV病毒体施用于患有听力损失和/或头晕或者处于形成听力损失和/或头晕的风险中的受试者。

在一些实施方案中，患有听力损失或处于形成听力损失的风险中的受试者是患有以下各项或处于形成以下各项的风险中的受试者：与年龄有关的听力损失、遗传性听力损失、噪声诱发性听力损失、由于施用耳毒性药物而导致的听力损失、疾病相关听力损失以及由创伤造成的听力损失。

在一些实施方案中，重组AAV病毒体感染受试者的耳蜗侧壁，该受试者患有听力损失或处于形成听力损失的风险中。在一些实施方案中，重组AAV病毒体感染受试者的耳蜗侧壁中的血管纹。在一些实施方案中，重组AAV病毒体感染受试者的血管纹中的边缘细胞。

在本文提供的任何方法中，可以静脉内、鞘内、鼓室内、通过圆窗施用、通过半规管递送或通过镫骨足板造孔术将重组AAV病毒体施用于受试者。在一些实施方案中，通过小管切开术(canalostomy)将重组AAV病毒体施用于受试者的后半规管中。

附图说明

本申请包括以下图。图旨在说明组合物和方法的某些实施方案和/或特征，并且补充对组合物和方法的任何描述。图不限制组合物和方法的范围，除非书面描述明确地指示情况确实如此。

图1a至1e示出了在通过PSCC的AAV-GFP注射之后的耳蜗的冰冻切片。(a)AAV2.7m8转导感觉上皮上，而非在侧壁中的多种细胞类型。(b)AAV8BP2转导侧壁中的细胞(白色箭头)。(c)Anc80转导螺旋隆凸中的细胞(白色箭头)。(d)AAV2不转导侧壁中的细胞。(e)AAV8转导侧壁中的细胞。

图2是提供AAV2.7m8、AAV2、Anc80L65、AAV8和AAV8BP2的边缘细胞感染效率的量化的图。与AAV2、AAV2.7m8和Anc80L65相比，AAV8BP2最高效地转导边缘细胞，并且示出了统计学上的显著差异(p<0.05)。

具体实施方式

以下描述叙述了本发明组合物和方法的各个方面和实施方案。无特定实施方案旨在定义组合物和方法的范围。更确切地说，实施方案仅提供至少包括在所公开组合物和方法的范围内的各种组合物和方法的非限制性实例。应当从本领域普通技术人员的角度来阅读描述；因此，不一定包括本领域技术人员众所周知的信息。

根据本公开，已经发现，包含经修饰的AAV衣壳蛋白的重组AAV可以感染耳蜗侧壁，以有效地将遗传物质递送至受试者的耳蜗侧壁中。本文提供了用于治疗或预防耳蜗损伤的组合物和方法。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法可以用于治疗或预防影响受试者内耳的疾病或病症。

在一些实施方案中，重组AAV病毒体包含：a)经修饰的AAV衣壳蛋白，其中该经修饰的AAV衣壳蛋白包含相对于对应亲本AAV衣壳蛋白的突变，其中该经修饰的AAV衣壳蛋白中的突变位于与AAV8-VP1的氨基酸587-595对应的位置中；以及b)产生表达产物的异源核酸，其中该表达产物减少听力损失或头晕。

经修饰的AAV衣壳可以包含AAV8-VP1的氨基酸587-595或另一种AAV血清型的衣壳亚单位的对应位置中的一个或多个突变。本领域技术人员可以容易地将AAV8-VP1的氨基酸序列与另一种AAV血清型的VP1氨基酸序列的氨基酸序列进行比对，以鉴定来自另一种AAV血清型的VP1，例如，来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9或AAV10的VP1中的与AAV8-VP1的氨基酸587-595对应的氨基酸。在本文中，AAV8VP1衣壳蛋白的氨基酸序列提供为SEQ ID NO:1:

在一些实施方案中，可以在与SEQ ID NO:1的587-595对应的氨基酸之间(包括与SEQ ID NO:1的位置587对应的氨基酸和与SEQ ID NO:1的氨基酸595对应的氨基酸)，或者与AAV8-VP1的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列进行一个或多个突变。

适合于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法是BLAST和BLAST2.0算法，它们分别描述在Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410以及Altschul et al.(1977)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中。通过国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)网站可公开获得用于进行BLAST分析的软件。该算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高得分序列对(HSP)，所述短字在与数据库序列中长度相同的字比对时匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul et al，同上)。这些初始邻域字命中作用为用于启动搜索的种子，以查找包含它们的更长HSP。然后沿着每个序列在两个方向上延伸字命中，直到累积比对得分可以增加为止。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；始终>0)和N(错配残基的惩罚得分；始终<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积得分。当出现以下情况时，停止这些字命中在每个方向上的延伸：累计比对得分从其最大实现值跌落数量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积得分变为零或以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用28的字长(W)；10的期望值(E)，M＝1，N＝-2；以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用3的字长(W)、10的期望值(E)、以及BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。

BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如，Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一个相似性度量是最小总和概率(P(N))，其指示两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小总和概率小于约0.01、更优选地小于约10^-5并且最优选地小于约10^-20，则认为核酸与参考序列相似。

在一些实施方案中，该重组AAV病毒体是AAV8BP2病毒体。参见，例如，Cronin etal.(Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolarcells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter,EMBOMol.Med.6(9):1175ㄱ1190(2014))以及美国专利申请公布第20150376240号，它们特此通过引用以它们的整体并入。在AAV8BP2病毒体中，VP1衣壳序列包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含SEQ ID NO:2(CCT GAG GGG ACG GCG ATG AGT CTT CCG)。SEQ ID NO:2编码AAV8BP2病毒体中AAV8VP1的氨基酸585-594。在一些实施方案中，与包含没有VP1衣壳蛋白中的一个或多个突变的对应亲本AAV衣壳蛋白的重组AAV病毒体对耳蜗侧壁的感染性相比，该重组AAV病毒体使得受试者耳的耳蜗侧壁(例如，在血管纹的边缘细胞中)的感染性增加。在一些实施方案中，与重组AAV2.7m8病毒体或重组AAV Anc80L65病毒体对边缘细胞的感染性相比，该重组AAV病毒体(例如，AAV8BP2)使得耳蜗侧壁(例如，在血管纹的边缘细胞中)的感染性增加。与对照相比，在施用本文描述的重组AAV病毒体(例如，AAV8BP2)之后，耳蜗侧壁的感染性的增加可以为至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％增加或更大。增加还可以为至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍增加或更大。

如本文所用，重组AAV病毒体是包含至少一种AAV衣壳蛋白以及包囊的重组AAV载体的病毒颗粒。如本文所用，“重组AAV载体”是指包含通常不存在于AAV中的核酸序列(即，与AAV异源的多核苷酸)，例如，用于细胞遗传转化的感兴趣的核酸序列的AAV载体。一般而言，异源核酸侧翼有至少一个，并且通常两个AAV反向末端重复序列(ITR)。术语重组AAV载体涵盖rAAV载体颗粒和重组AAV载体质粒二者。重组AAV载体可以是单链的(ssAAV)或自身互补的(scAAV)。

AAV的各种血清型的基因组序列以及天然末端重复(TR)、Rep蛋白和衣壳亚单位的序列是本领域已知的。此类序列可以在文献或公共数据库(如，GenBank)中找到。参见，例如，GenBank登录号NC_002077(AAV-1)、AF063497(AAV-1)、NC_001401(AAV-2)、AF043303(AAV-2)、NC_001729(AAV-3)、NC_001829(AAV-4)、U89790(AAV-4)、NC_006152(AAV-5)、AF513851(AAV-7)、AF513852(AAV-8)和NC_006261(AAV-8)；其公开内容通过引用并入本文，以用于教导AAV核酸和氨基酸序列。

“AAV病毒”、“AAV病毒体”、“AAV病毒颗粒”或“重组AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白以及包囊的多核苷酸重组AAV载体构成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源核酸序列(即，除野生型AAV基因组之外的核酸序列，如要被递送至哺乳动物细胞的转基因)，则其可以被称为重组AAV载体。因此，重组AAV颗粒或病毒体的产生必然包括重组AAV载体的产生，因为此种载体是含在重组AAV颗粒内的。用于产生AAV载体和病毒体的方法是本领域已知的。参见，例如，Shin et al.“Recombinant Adeno-Associated Viral VectorProduction and Purification,”Methods Mol.Biol.798:267-284(2012))。本文描述的任何AAV病毒体可以用于感染耳蜗侧壁中(例如，在血管纹中)的一种或多种细胞类型(例如血管纹的边缘细胞、中间细胞或基底细胞)。任选地，本文描述的任何病毒体可以感染一种或多种类型的内耳毛细胞，其包括但不限于耳蜗细胞、前庭细胞、耳蜗的内毛细胞、耳蜗的外毛细胞、耳蜗的神经胶质样支持细胞(例如，Hensen细胞、Deiters细胞、内柱和外柱细胞、Claudius细胞和内指状细胞)。在一些实施方案中，将感染血管纹(例如，血管纹的边缘细胞)的AAV病毒体与感染一种或多种类型的内耳毛细胞的AAV病毒体(例如，AAV2.7m8病毒体)组合施用于受试者，该一种或多种类型的内耳毛细胞包括但不限于耳蜗细胞、前庭细胞、耳蜗的内毛细胞、耳蜗的外毛细胞、耳蜗的神经胶质样支持细胞(例如，Hensen细胞、Deiters细胞、内柱和外柱细胞、Claudius细胞和内指状细胞)。

如通篇所用，“对应亲本AAV衣壳蛋白”是指相同AAV血清型，且不具有肽***的AAV衣壳蛋白。如本文所用，当描述重组AAV载体或病毒体时，短语“异源”是指非天然存在于野生型AAV中的核酸序列。例如，产生表达产物的异源核酸是通常不存在于野生型AAV中的核酸。在异源核酸编码多肽的实施方案中，所编码的多肽是通常不由天然存在的野生型AAV编码或表达的异源多肽。

如通篇所用，“表达产物”是在被AAV病毒体感染后在细胞(例如，内耳毛细胞)中表达或产生的核酸或多肽。表达产物可以通过体外、体内或离体感染细胞来表达。如在本说明书和所附的权利要求书中所用的，除非上下文另外清楚指明，单数形式“一个/种”和“所述”包括复数引用。因此，术语“病毒体”或“细胞”也是指多于一个的病毒体或细胞，例如，病毒体或细胞的群体。

表达产物包括但不限于多肽、适体、反义分子、干扰RNA或mRNA。在一些实施方案中，表达产物是选自下组的干扰RNA，该组由以下各项组成：短干扰RNA(siRNA)、短发夹(shRNA)和miRNA。

如通篇所用，术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，该术语包括含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，所述核苷酸类似物具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另外指明，具体的核酸序列还隐含包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同系物、SNP和互补序列以及清楚所示的序列。具体地，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个所选的(或全部)密码子的第三个位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；以及Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。

在一些实施方案中，编码感兴趣的表达产物的核酸可操作地连接至组成型启动子。在其它实施方案中，编码感兴趣的表达产物的核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，编码感兴趣的表达产物的核酸可操作地连接至组织特异性或细胞类型特异性调控元件。例如，在一些例子中，编码感兴趣的表达产物的核酸可操作地连接至内耳毛细胞特异性调控元件，例如，赋予内耳毛细胞中可操作地连接的核酸的选择性表达的调控元件。参见，例如，Boeda和Petit“A specific promoter of the sensory cells of theinner ear defined by transgenesis”Hum Mol.Genet.19(15):1581-9(2001)，其用于在内耳毛细胞中表达受MYO7A启动子控制的基因产物。如本文所用，特异性表达并不意味着表达产物仅在特异性组织或细胞类型中表达，而是指基本上限于特异性组织或细胞类型的表达。产生表达产物的任何异源核酸可以进一步包含编码可检测多肽，例如，荧光多肽(GFP、RFP等)或其活性片段的核酸。

当用本文描述的任何AAV病毒体感染耳蜗侧壁，例如，在血管纹的边缘细胞或者本文描述的任何其它细胞类型中时，在耳蜗侧壁中，例如，在血管纹的边缘细胞或者本文描述的任何其它细胞类型中产生的表达产物减少受试者听力损失和/或头晕。在一些实施方案中，表达产物是降低与受试者听力损失和/或头晕相关的基因的表达的核酸，例如，反义分子或干扰RNA。

在一些实施方案中，核酸(例如，反义分子或干扰RNA)降低受试者内耳毛细胞中的选自下组的一个或多个基因的表达，该组由以下各项组成：DIAPH1、KCNQ4、GJB3、IFNLR1、GJB2、GJB6、MYH1、CEACAM16、GSDME/DFNA5、WFS1、LMX1A、TECTA、COCH、EYA4、MYO7A、COL11A2、POU4F3、MYH9、ACTG1、MYO6、SIX1、SLC17A8、REST、GRHL2、NLRP3、TMC1、COL11A1、CRYM、P2RX2、CCDC50、MIRN96、TJP2、TNC、SMAC/DIABLO、TBC1D24、CD164、OSBPL2、HOMER2、KITLG、MCM2、PTPRQ、DMXL2、MYO3A和PDE1C。在一些实施方案中，表达的降低是mRNA的转录的降低和/或从mRNA翻译的多肽或其片段的翻译的降低。与对照相比，表达的降低或减少可以为约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或介于这些百分比之间的任何百分比的降低或减少。通过减少选自下组的一个或多个基因的表达，可以减少或改善听力损失，该组由以下各项组成：DIAPH1、KCNQ4、GJB3、IFNLR1、GJB2、GJB6、MYH1、CEACAM16、GSDME/DFNA5、WFS1、LMX1A、TECTA、COCH、EYA4、MYO7A、COL11A2、POU4F3、MYH9、ACTG1、MYO6、SIX1、SLC17A8、REST、GRHL2、NLRP3、TMC1、COL11A1、CRYM、P2RX2、CCDC50、MIRN96、TJP2、TNC、SMAC/DIABLO、TBC1D24、CD164、OSBPL2、HOMER2、KITLG、MCM2、PTPRQ、DMXL2、MYO3A和PDE1C。

在一些实施方案中，表达产物是减少或改善受试者听力损失和/或头晕的多肽。如通篇所用，“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换地使用，其是指氨基酸残基的聚合物。如本文所用，该术语包括任意长度的氨基酸链，包括全长蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。这些术语也涵盖本文描述的任何多肽的片段。

在一些实施方案中，选自下组的一种或多种多肽或其片段在受试者的内耳毛细胞中表达，该组由以下各项组成：GJB2、GJB6、MYO7A、MYO15A、SLC26A4、TMIE、TMC1、TMPRSS3、OTOF、CDH23、GIPC3、STRC、USH1C、OTOG、TECTA、OTOA、PCDH15、RDX、GRXCR1、TRIOBP、CLDN14、MYO3A、WHRN、CDC14A、ESRRB、ESPN、MYO6、HGF、ILDR1、ADCY1、CIB2、MARVELD2、BDP1、COL11A2、PDZD7、PJVK、SLC22A4、SLC26A5、LRTOMT/COMT2、DCDC2、LHFPL5、S1PR2、PNPT1、BSND、MSRB3、SYNE4、LOXHD1、TPRN、GPSM2、PTPRQ、OTOGL、TBC1D24、ELMOD3、KARS、SERPINB6、CABP2、NARS2、MET、TSPEAR、TMEM132E、PPIP5K2、GRXCR2、EPS8、CLIC5、FAM65B、DFNB32、EPS8L2、ROR1、WBP2、ESRP1、MPZL2、PRPS1、POU3F4、SMPX、AIFM1和COL4A。

在一些实施方案中，与对照相比，当通过本文描述的重组AAV病毒体感染耳蜗侧壁，例如，在血管纹的边缘细胞或者本文描述的任何其它细胞类型中时，受试者边缘细胞中的一种或多种多肽的水平增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、50倍或超过至少50倍，使得受试者听力损失和/或头晕得以减少。

表达产物可以与受试者的细胞异源。如本文所用，当短语“异源”当其涉及细胞，例如，受试者的内耳毛细胞中的表达产物时，是指非天然存在于受试者的细胞中的核酸或多肽。术语“异源序列”是指通常不存在于自然界的给定细胞中的序列。因此，异源核苷酸或蛋白质序列可以是：(a)对其宿主细胞是外来的(即，对该细胞是外源性的)；(b)天然存在于宿主细胞中的(即内源性的)，但以非天然数量存在于该细胞中的(即，比天然存在于宿主细胞中的数量大或小)；或(c)天然存在于宿主细胞中的，但定位在其天然基因座之外的。

方法

本文提供了用于将感兴趣的核酸递送至内耳的方法，其通过施用本文描述的任何AAV病毒体来进行。在一些实施方案中，AAV病毒体包含感兴趣的核酸。在一些实施方案中，仅将AAV病毒体递送至受试者。在一些实施方案中，将感兴趣的核酸递送至受试者的耳蜗侧壁，例如，递送至血管纹中的细胞。在一些实施方案中，将AAV病毒体或包含感兴趣的核酸的AAV病毒体递送至血管纹中的边缘细胞。在一些实施方案中，AAV病毒体是包含感兴趣的核酸的AAV8BP2病毒体。在一些实施方案中，感兴趣的核酸降低耳蜗损伤、内毛细胞损伤、听力损失和/或头晕。在一些实施方案中，感兴趣的核酸编码降低耳蜗损伤、内毛细胞损伤、听力损失和/或头晕的多肽。

听力损失通常是由耳蜗损伤引起的，例如，由对内耳毛细胞(如耳蜗毛细胞)的损伤引起。哺乳动物耳蜗含有两种类型的毛细胞，内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)，该两种类型的毛细胞对听觉信息的检测和处理都是重要的。这些毛细胞被支持细胞包围，该支持细胞是对耳蜗稳态而言重要的异质性细胞组。成熟的哺乳动物毛细胞不能再生。因此，一旦这些细胞发生损伤，变性过程通常是不可逆的。

本文提供了一种在受试者中治疗或预防耳蜗损伤的方法，该方法包含将有效量的本文描述的重组AAV病毒体施用于患有耳蜗损伤或处于形成内耳毛细胞损伤的风险中的受试者。在一些实施方案中，重组病毒体是重组AAV病毒体，例如，AAV8BP2病毒体，其包含降低与内耳毛细胞损伤相关的基因的表达的核酸。在一些实施方案中，该重组AAV病毒体是重组AAV病毒体，例如，AAV8BP2病毒体，其包含编码在受试者中治疗或预防内耳毛细胞损伤的多肽的核酸。在一些实施方案中，患有耳蜗损伤或处于形成耳蜗损伤的风险中的受试者患有听力损失或处于形成听力损失的风险中。在一些实施方案中，患有耳蜗损伤或处于形成耳蜗损伤的风险中的受试者经历头晕。

在另一个实施方案中，本文提供了一种在受试者中治疗或预防听力损失和/或头晕的方法，该方法包含将有效量的本文描述的重组AAV病毒体施用于患有听力损失或头晕或者处于形成听力损失或头晕的风险中的受试者。在一些实施方案中，重组AAV病毒体是重组AAV8病毒体，例如，AAV8BP2病毒体，其包含降低与内耳毛细胞损伤相关的基因的表达的核酸。在一些实施方案中，重组病毒体是重组AAV病毒体，例如，AAV8BP2病毒体，其包含编码在受试者中治疗或预防内耳毛细胞损伤的多肽的核酸。

在一些实施方案中，重组AAV病毒体增加内耳毛细胞再生，例如，耳蜗毛细胞再生。在一些实施方案中，重组AAV病毒体感染耳蜗侧壁。在一些实施方案中，重组AAV病毒体感染耳蜗侧壁中的血管纹。在一些实施方案中，重组AAV病毒体感染耳蜗侧壁的血管纹中的边缘细胞。在一些实施方案中，重组AAV病毒体增加耳蜗的内毛细胞、外毛细胞和/或神经胶质样支持细胞的再生。在一些实施方案中，重组AAV病毒体优先地感染血管纹中的边缘细胞。在一些实施方案中，受试者的血管纹中的边缘细胞中的重组AAV病毒体感染效率比受试者的其它耳蜗细胞中的重组AAV病毒体感染效率高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或至少100％。在一些实施方案中，与受试者的其它耳蜗细胞相比，在边缘细胞中，重组AAV病毒体在受试者的血管纹的边缘细胞中所产生的表达产物的水平高出至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或至少100％。

本文提供的方法和组合物可以用于治疗患有任何类型听力损失或处于形成任何类型听力损失的风险中的受试者。听力损失可以在传导性水平、感觉神经和/或中枢水平上。传导性听力损失是由涉及外耳或中耳的病变引起的，导致通过鼓膜和小骨放大至内耳液的正常空气传声通路被破坏。感觉神经性听力损失是由耳蜗或者第八颅神经的听觉部分的病变引起的。中枢性听力损失是由于中枢听觉通路的病变而导致的。在一些情况下，传导性听力损失与感觉神经性听力损失组合发生(混合性听力损失)。

本文提供的组合物和方法可以用于治疗患有以下各项或处于形成以下各项的风险中的受试者：与年龄有关的听力损失(老年性耳聋)、遗传性听力损失、噪声诱发性听力损失、疾病相关听力损失、暴露于有毒物质、由于施用耳毒性药物而导致的听力损失、以及由创伤造成的听力损失等等。

在一些实施方案中，遗传性听力损失可以是由涉及听力的一个或多个基因的突变引起的。一些突变引起非综合征性听力损失，这意味着受试者除听力损失之外没有任何其它症状。引起听力损失的其它突变是综合征的，这意味着患者除听力损失之外还具有其它症状(例如，瓦尔登布尔(Waardenburg)氏综合征、奥尔波特(Alport)氏综合征和尤希尔(Usher)氏综合征)。在一些实施方案中，遗传性听力损失是常染色体显性听力损失，例如，由GJB2突变引起的听力损失。

在一些实施方案中，将编码与听力损失相关的缺少或突变基因的非突变多肽的核酸递送至本文描述的任何内耳细胞，例如，受试者中血管纹的边缘细胞，以向边缘细胞提供涉及听力损失的缺少或突变基因的工作拷贝。在其它实施方案中，将降低涉及听力损失的基因的一个或多个突变型等位基因的表达的核酸递送至本文描述的任何内耳细胞，例如，受试者的血管纹中的边缘细胞。

本文提供的方法和组合物可以用于治疗患有头晕或处于形成头晕的风险中的受试者。在一些实施方案中，头晕与前庭病症相关。前庭病症的实例包括但不限于良性发作性位置性眩晕病(benign paroxysmal positional vertigo，BPPV)、迷路炎、前庭神经炎、Ménière病、继发性内淋巴积水(secondary endolymphatic hydrops)和外淋巴瘘(perilymphfistula)。前庭病症还包括上管裂开(superior canal dehiscence)、听神经瘤、耳毒性、前庭导水管扩大综合征(enlarged vestibular aqueduct syndrome)和mal de débarquement。

本文提供的治疗听力损失或头晕的任何方法可以与用于听力损失或头晕的其它治疗(例如，助听器、施用有效量的皮质类固醇、或用于治疗眩晕的练习等等)组合。

在全文中，治疗和处理是指减少或延迟听力损失(例如，理解语言困难、以高音量听电视或广播、耳鸣、要求别人复述)或头晕(例如，失去平衡、晕厥、复视、混淆、言语不清、臂或腿麻木)的一种或多种影响或症状的方法。受试者可以被诊断出患有听力损失或头晕。治疗还可以是指减少根本性病理而非症状的方法。对受试者施用的效果可以具有以下效果，但不限于以下的效果：减少疾病的一种或多种症状、减少疾病的严重程度、完全消融疾病、或延迟一种或多种症状的发作或恶化。例如，当与治疗前的受试者相比或者与对照受试者或对照值相比时，如果受试者中听力损失或头晕减少至少约10％，则公开的方法被认为是治疗。因此，减少可以为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100％或两者之间的任何减少量。听力损失的减少也可以是听力的百分比改善为至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100％或介于这些百分比之间的任何百分比。用于在受试者中测试听力的方法是本领域已知的，并且包括。

如本文所用，所谓预防(prevent)意指排除、延迟、避免、消除、预先阻止、停止或阻碍疾病或病症的发作、发生、严重程度或复发的方法。例如，与未接受治疗的易患听力损失或头晕的对照受试者相比，如果易患听力损失或头晕的受试者中听力损失或头晕或者听力损失(例如，理解语言困难、以高音量听电视或广播、耳鸣、要求别人复述)或头晕(例如，失去平衡、晕厥、复视、混淆、言语不清、臂或腿麻木)的一种或多种症状的发作、发生、严重程度或复发减少，则所公开的方法被认为是预防。听力损失或头晕的发作、发生、严重程度或复发的减少或延迟可以为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100％或其间的任何减少量。

如通篇所用，受试者意指个体。受试者可以是成年受试者或儿科受试者。儿科受试者包括年龄在出生至十八岁年龄范围内的受试者。因此，小于10岁龄、五岁龄、两岁龄、一岁龄、六个月龄、三个月龄、一个月龄、一周龄或一天龄的儿科受试者也作为受试者包括。优选地，受试者是哺乳动物，如灵长类动物，并且更优选地是人类。非人灵长类动物也是受试者。术语受试者包括家养动物(如猫、狗等)、牲畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)和实验动物(例如，雪貂、毛丝鼠(chinchilla)、小鼠、兔子、大鼠、沙鼠、豚鼠等)。因此，本文考虑了兽医用途和医学配制剂。

药物组合物

本文提供了一种药物组合物，其包含本文描述的任何重组AAV病毒体以及药物上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲液。在一些实施方案中，药物上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲液适用于受试者，例如，人。可以将药物组合物递送至受试者，从而允许在受试者的内耳细胞中产生表达产物。药物组合物包含足够的遗传物质，其允许受者产生有效量的减少或预防内毛细胞损伤的表达产物。在一些实施方案中，药物组合物包含足够的遗传物质，其允许受者产生有效量的治疗或预防受试者的听力损失和/或头晕的表达产物。

组合物可以单独施用或与至少一种其它试剂(如使化合物稳定)组合施用，所述其它试剂可以在任何无菌、生物相容性药物载体中施用，该载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖和水。在一些实施方案中，药物组合物还含有药物上可接受的赋形剂。此类赋形剂包括本身不会诱导对接受组合物的个体有害的免疫应答，并且可以在没有过度毒性的情况下施用的任何试剂。药物上可接受的赋形剂包括但不限于液体，如水、盐水、丙三醇、糖和乙醇。其中可以包括药物上可接受的盐，例如，无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，辅助物质(如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等)可以存在于此类载体中。含有这些材料的药物上可接受的载体、赋形剂和配制剂的制备描述在例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22nd edition,Loyd V.Allen et al编,Pharmaceutical Press(2012)中。

适合于胃肠外施用的药物配制剂可以在水性溶液中配制，优选地在生理相容性缓冲液(如汉克(Hanks)氏溶液、林格(Ringer)氏溶液或生理缓冲盐水)中。水性注射悬浮液可以含有增加该悬浮液的粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。另外，活性化合物的悬浮液可以制备为适当的油状注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(如芝麻油)、或合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)、或脂质体。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度以允许制备高度浓缩溶液的试剂。

递送方法

本公开提供了一种将表达产物递送至个体中的内耳细胞的方法，该方法包含将如上所述的重组AAV病毒体施用于个体。表达产物可以是多肽、反义分子、干扰RNA或适体等等。

如通篇所用，术语“有效量”定义为产生期望的生理应答(例如，减少或预防内耳毛细胞损伤)所必需的任何量。可以根据经验确定用于施用本文描述的重组AAV病毒体的有效量和时间表，并且进行此类确定在本领域的技术内。施用的剂量范围是足够大以产生期望的效果的那些，其中疾病或病症的一种或多种症状受到影响(例如，减轻或延迟)。剂量不应大到引起实质性的不良副作用，如不希望有的交叉反应、不希望有的细胞死亡等。通常，剂量将随受试者的物种、年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用的方式和时间；以及特定病况的严重程度而变化，并且可以由本领域技术人员确定。在任何禁忌症的情况下，个体医师可以调整剂量。剂量可以变化，并且可以以一剂或多剂剂量施用。

本文描述的任何重组AAV病毒体的有效量将变化，并且可以由本领域技术人员通过实验和/或临床试验来确定。例如，对于体内注射，例如直接注射至受试者的内耳中，有效剂量可能为约10⁶至约10¹⁵个重组rAAV病毒体，例如，约10⁸至10¹²个重组AAV病毒体。对于体外感染，要递送至细胞的重组病毒体的有效量可以为约10⁶至约10¹⁵个重组AAV病毒体。其它有效剂量可以由本领域普通技术人员通过建立剂量响应曲线的常规试验来容易地建立。

本文描述的组合物以多种方式施用，这取决于是否需要局部治疗或全身治疗。组合物通过若干施用途径(静脉内、鞘内、鼓室内、通过圆窗施用、通过半规管递送或通过镫骨足板造孔术)中的任一种施用。在一些实施方案中，通过小管切开术将组合物施用于受试者的后半规管中。可以从衍生自体外测试***或动物模型测试***的剂量响应曲线外推用于本文描述的任何施用方法的有效剂量。

公开了材料、组合物和组分，它们可以用于所公开的方法和组合物的产物、可以与所公开的方法和组合物的产物结合使用、可以用于制备所公开的方法和组合物的产物或是所公开的方法和组合物的产物。本文公开了这些和其它材料，并且应当理解，当公开了这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可以不明确地公开这些化合物的每种不同的单个和集体的组合和排列的具体引用，但在本文中每种组合和排列都得到了具体的考虑和描述。例如，如果公开和讨论了方法，并且讨论了可以对多个分子(包括在该方法中)进行的多个修饰，则除非具体有相反的指示，否则该方法的每一种组合和排列以及可能的修饰都得到了具体的考虑。同样地，这些的任何子集或组合也得到了具体的考虑和公开。这些构思适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以进行的多个额外步骤，则应当理解，这些额外步骤中的每一个可以与所公开方法的方法步骤的任何具体方法步骤或组合一起进行，并且每种此种组合或组合的子集都得到了具体的考虑并且应当认为是公开的。

本文引用的出版物及其引用的材料在此通过引用以它们的整体具体地并入。

实施例

提供以下实施例仅用作说明而非限制。本领域技术人员将容易地识别各种非关键参数，这些参数可以进行改变或修改以得到基本上相同或相似的结果。

实施例1

腺相关病毒(AAV)因其出色的生物安全概况而成为基因疗法研究中常用的病毒载体。其已成功用于若干内耳基因疗法研究，以改善突变小鼠的听觉和前庭功能。虽然大多数关于AAV内耳基因递送的研究都专注于转导机械感觉毛细胞和支持细胞，但很少的研究检查耳蜗侧壁中的AAV转导。

耳蜗侧壁中的血管纹负责维持耳蜗内电位，其对正常耳蜗功能至关重要。一些最常见的遗传性听力损失类型是由在耳蜗侧壁(例如，SLC26A4)7中表达的基因的变体引起的。在该实施例中，研究了两种常规AAV(AAV2和AAV8)和三种合成AAV(AAV2.7m8、AAV8BP2、Anc80L65)在新生小鼠内耳中的侧壁转导模式。

方法

AAV载体构建

AAV2.7m8-CAG-eGFP、AAV8BP2-CAG-eGFP和Anc80L65-CAG-eGFP是由Center forAdvanced Retinal and Ocular Therapeutics(University of Pennsylvania)的Research Vector Core产生的。用于这些病毒的产生方法描述在Ramachandran et al.(Evaluation of Dose and Safety of AAV7m8 and AAV8BP2 in the Non-Human PrimateRetina.Hum Gene Ther 28,154-167(2017))中。对于每种病毒，病毒储备溶液的浓度为每ml 1x10¹³个基因组拷贝(G.C.)。

动物手术

将P0-P5新生CBA/J小鼠用于研究。使用玻璃微量移液器将三种合成(AAV2.7m8、AAV8BP2和Anc80L65)和两种常规(AAV2和AAV8)AAV-GFP通过后半规管递送。每只小鼠左耳注射1ml。

听觉脑干响应

将听觉脑干响应(ABR)测试用于评价听力灵敏度。针对1月龄CBA/J小鼠，使用Tucker Davis Technologies***(RZ6 Multi I/O处理器，Tucker-Davies Technologies，Gainesville，FL，USA)记录ABR。使用***(ketamine)和dexdomitor来麻醉小鼠，并将其放置在设置为37℃的加热垫上，在4、8、16和32kHz下测量ABR阈值。在每个刺激水平上，对512-1024个响应取平均值。

免疫组织化学

获得耳蜗的整体装片(whole mount)，并且将其解剖成基底、中间和顶部转角。分别从基底和中间转角解剖出侧壁。将针对SLC12a2和Hoechst/鬼笔环肽的抗体应用于侧壁整体装片。将使用Zeiss LSM780的共聚焦显微镜用于拍摄边缘细胞的Z-堆叠图像，然后基于其边缘细胞标志物SLC12a2/鬼笔环肽和GFP表达对其进行量化。收集耳蜗的冷冻切片，并且使用Leica CM3050低温恒温器将其切片。

结果

检查了两种常规AAV(AAV2和AAV8)和三种合成AAV(AAV2.7m8、AAV8BP2、Anc80L65)在新生小鼠内耳中的侧壁转导模式。如图1a所示，AAV2.7m8转导感觉上皮上，而非耳蜗侧壁中的多种细胞类型。图1b示出，AAV8BP2转导侧壁中的细胞(白色箭头)。Anc80注射导致螺旋隆凸附近的一些感染(图1c中的白色箭头)。图1d示出，与AAV2.7m8相似，AAV2不转导侧壁中的细胞。AAV8注射导致侧壁中的一些感染(图1e)。

AAV8和AAV8BP2转导血管纹中的边缘细胞。AAV8BP2-GFP注射导致边缘细胞(MC)中高水平的GFP表达。注射AAV8-GFP的小鼠表达出相对更高的水平。比较而言，AAV2-GFP、AAV2.7m8和Anc80L65-GFP以较低的水平转导边缘细胞。

根据边缘细胞转导效率的量化，示出了AAV8BP2最有效地转导血管纹的边缘细胞(图2)。

为了利用基因疗法来维持或改善耳蜗功能，一个关键要素在于具有可以有效地靶向耳蜗侧壁的病毒载体。如本文所示，AAV8BP2有效地感染耳蜗侧壁。另外，其感染负责维持耳蜗内电位的血管纹的边缘细胞。这些结果表明，AAV8BP2是一种强大的病毒载体，其可以极大地扩展内耳基因疗法的应用。

实施例2

方法

AAV载体构建

AAV8BP2-CAG-eGFP(1.10×10¹³GC/mL)是由Center for Advanced Retinal andOcular Therapeutics(University of Pennsylvania)的Research Vector Core产生的。先前已经描述了用于这些病毒的产生方法(Ramachandran et al..Hum.Gene Ther.28,154–167(2017))。所有病毒均使用相同的转基因构建体来产生，该构建体由衍生自InvivoGen pDRIVE CAG质粒(InvivoGen，San Diego，CA，USA)的CAG启动子、编码增强型GFP(eGFP)蛋白的cDNA、以及牛生长激素聚腺苷酸化信号组成。

动物手术

将CBA/J小鼠用于该研究。对于新生小鼠(P0-P5)，使用低温来诱导和维持麻醉。仅在每只动物的左耳中进行手术。右耳充当对照。对于通过后半规管方案的内耳基因递送，进行耳廓后切口，并且解剖组织以暴露后半规管。在解剖期间，注意避开面神经。将Nanoliter显微注射***(Nanoliter2000；World Precision Instruments,Sarasota,FL,USA)与玻璃微量移液器结合使用，以将AAV-eGFP加载至玻璃微量移液器中。在约40秒内注射总计1μL的AAV-eGFP。切口用5-0Vicryl缝线缝合。

对于成年小鼠，使用异氟醚气体(Baxter,Deerfield,IL,USA)通过鼻锥以0.5L/min的流动速率来诱导麻醉。成年小鼠耳囊(otic capsule)完全骨化(与软骨质的新生小鼠耳囊形成对照)。因此，使用圆窗方案来完成成年小鼠内耳基因递送。使用小剪刀进行耳廓后切口。直接解剖软组织以暴露大疱。用25号针在大疱上开小孔，并且用镊子将其扩大以暴露圆窗(RW)膜。将Nanoliter显微注射***(Nanoliter2000；World PrecisionInstruments,Sarasota,FL,USA)与玻璃微量移液器结合使用，以将AAV-eGFP加载至玻璃微量移液器中。在约80秒内注射总计2μL的AAV2.7m8-eGFP(9.75x10¹²GC/mL)。切口用5-0Vicryl缝线缝合。

听觉脑干响应

将ABR测试用于评价约P30处的听力灵敏度。用***(100mg/kg)和赛拉嗪(xylazine)(10mg/kg)通过腹膜内注射来麻醉动物，并且将其放置在隔声室(ETS-LindgrenAcoustic Systems,Cedar Park,TX,USA)内的温热垫上。使用闭合反馈环来维持动物的体温，并且使用直肠探针(CWE Incorporated,TC-1000,Ardmore,PN,USA)进行监测。以顶点(+)和测试耳乳突(-)***皮下针电极，其中接地电极在对侧耳下面。使用Tucker DavisTechnologies硬件(RZ6 Multi I/O处理器；Tucker-Davis Technologies，Gainesville，FL，USA)和软件(BioSigRx，v.5.1)来完成刺激生成和ABR记录。在4、8、16和32kHz下，使用以29.9/秒呈现的具有交替刺激极性的3-ms Blackman门控短音来测量ABR阈值。在每个刺激水平上，对512-1024个响应取平均值。阈值通过对波形的目视检查来确定，并且定义为可以可靠地检测到任何波的最低刺激水平。在阈值水平上获得至少两个波形，以确保响应的可重复性。针对各个频率，对生理结果进行分析，然后针对4至32kHz的这些频率中的每个频率，对生理结果取平均值。

转圈行为

使用光学追踪和ANY迷宫追踪软件(4.96版；Stoelting Co.,Wood Dale,IL,USA)对经受内耳基因递送的小鼠的转圈行为进行量化。将38x58 cm盒附接至摄像机(FujinonYV5X2.7R4B-2 1/3英寸2.7–13.5mm F1.3日/夜非球面变焦镜头)。ANY迷宫视频追踪软件设置成追踪放置在盒内的小鼠的头部。将每只小鼠放置至盒中，并且允许其适应新环境2分钟。在接下来的2分钟内记录完整的旋转并对其进行量化，随后是1分钟的“冷却”期，其中不追踪旋转。每只小鼠评估三次，并且取平均值。

免疫组织化学和量化

在完成功能测试之后，通过CO₂窒息对小鼠实施安乐死，随后进行断头术。收获颞骨并且将其用4％多聚甲醛固定过夜，随后在120mM乙二胺四乙酸中脱钙4天。对前庭器官和耳蜗感觉上皮进行显微解剖，将其封闭，并且使用以下各项对其进行标记：标记毛细胞的小鼠抗肌球蛋白7a抗体(1:200，产品号25-6790；Proteus BioSciences,Ramona,CA,USA)、标记支持细胞的小鼠抗乙酰化微管蛋白抗体(1:100，产品号T9026；Sigma-Aldrich Corp.,St.Louis,MO,USA)、以及标记细胞核的鸡抗GFP抗体(1:1000，产品号ab13970；Abcam,Cambridge,MA,USA)和Hoechst染色剂(1:500，产品号62249；Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)。将一抗和二抗在磷酸盐缓冲盐水中稀释。使用z-堆叠，使用ZeissLSM780共聚焦显微镜来获得10倍和40倍的图像。

对于苏木精(hematoxylin)和曙红(eosin)染色，首先用蔗糖梯度(磷酸盐缓冲盐水中10-30％)处理组织，然后用蔗糖和包埋介质SCEM(Section-Lab Co Ltd,Japan)的混合物进行处理。在液氮中冷冻之后，然后将组织以10μm的厚度切片，并且按照制造商的说明(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA,USA)使用苏木精和曙红染色试剂盒进行苏木精和曙红染色。

为了量化耳蜗毛细胞和支持细胞感染效率，在耳蜗的顶点、中间转角和基部处拍摄两个40倍图像。在沿耳蜗的每个位置处对具有GFP表达的毛细胞和支持的数目进行计数并且取平均值。每个40倍图像含有约30个IHC和约90个OHC。通过对从整个耳蜗获得的感染率取平均值来计算总体感染率。为了量化椭圆囊毛细胞感染效率，每个椭圆囊样本拍摄两个40倍图像(每个含有约300个前庭毛细胞)，并且对具有GFP表达的毛细胞的数目进行计数并且取平均值。

统计

将Student t测试(双尾)用于评估感染效率的差异。已经示出，在耳蜗的不同区域中，不同的AAV血清型可以具有不同的感染效率。因此，在计算平均值、标准误差和统计显著性时，来自耳蜗的每个区域(顶点、中间转角和耳蜗基底)的感染效率作为单独的测量值处理。将ANOVA用于评估ABR阈值以及转圈行为的差异。使用Scheffe方法进行事后分析。p值<0.05指示统计显著性。

结果

检查了AAV8BP2在小鼠内耳中的感染模式。为了评估AAV8BP2在哺乳动物内耳中的感染效率，使用后半规管方法将AAV8BP2-GFP(1.10x1013GC/mL)递送至新生(P0-P5)小鼠内耳。后半规管基因递送允许病毒载体有效地感染新生耳蜗和前庭器官中的细胞。还使用相同的递送方法对AAV2-GFP(5.69x1012 GC/mL)和AAV8-GFP(1.66x1013 GC/mL)(分别递送AAV2.7m8和AAV8BP2的两种常用的常规AAV)以及合成AAV Anc80L65-GFP(1.89x1013GC/mL)的感染效率进行了检查，作为另外的对照。将1微升的AAV递送至每只动物中。通过对具有绿色荧光蛋白(GFP)表达的毛细胞(由抗Myo7a抗体鉴定)的百分比进行量化来评估毛细胞感染效率。注射有AAV8BP2-GFP的小鼠(n＝9只动物)在IHC和OHC中具有中等至高水平的GFP表达。IHC的总体感染效率为55.7±9.53％，并且OHC的总体感染效率为44.1±7.94％。

除了评估AAV8BP2在耳蜗中的毛细胞感染效率外，还检查了在前庭器官中的毛细胞感染效率。当将AAV8BP2-GFP递送至新生小鼠内耳时，GFP在前庭器官中表达。在椭圆囊中进行前庭毛细胞感染效率的量化。AAV8BP2-GFP的椭圆囊毛细胞感染效率为34.2±9.84％。

为了使内耳基因疗法成为听力损失和前庭功能障碍的可行治疗方法，所使用的病毒载体对正常的听觉和前庭功能的影响应最小。为了评估AAV8BP2的内耳递送是否对听力有任何影响，测量了听觉脑干响应(ABR)。在经受浓度为0.55x1010 GC的AAV8BP2-GFP注射的小鼠中，ABR阈值与对照小鼠的阈值相当。

患有前庭功能障碍的小鼠经常表现出转圈行为。为了评估合成AAV的内耳递送是否对前庭***有任何影响，检查了注射的小鼠的转圈行为。未经受内耳基因递送的对照小鼠每2分钟转圈5.11±0.32次(n＝6只动物)。与对照动物相比，注射浓度为0.55x1010 GC的AAV8BP2-GFP没有增加转圈行为(每2分钟5.47±0.77次，p＝0.66，n＝5只动物)。该结果指示，AAV8BP2-GFP的内耳递送是安全的，并且不会对听觉和前庭功能产生不利影响。

序列表

<110> ***合众国, 由健康及人类服务部部长代表

<120> 腺相关病毒及其用于内耳疗法的用途

<130> 196633.00420

<150> US 62/965,506

<151> 2020-01-24

<160> 2

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 738

<212> PRT

<213> 腺相关病毒8

<400> 1

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly

195 200 205

Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp

260 265 270

Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn

275 280 285

Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn

290 295 300

Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn

305 310 315 320

Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala

325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

340 345 350

Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe

355 360 365

Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn

370 375 380

Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr

405 410 415

Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu

435 440 445

Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly

450 455 460

Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp

465 470 475 480

Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly

485 490 495

Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His

500 505 510

Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr

515 520 525

His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile

530 535 540

Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val

545 550 555 560

Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala

580 585 590

Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val

595 600 605

Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile

610 615 620

Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val

645 650 655

Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe

660 665 670

Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu

675 680 685

Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr

690 695 700

Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu

705 710 715 720

Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

Asn Leu

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 腺相关病毒8

<400> 2

cctgagggga cggcgatgag tcttccg 27

Claims

1.一种重组腺相关病毒(AAV)病毒体，其包含：

a)经修饰的AAV衣壳蛋白，其中所述经修饰的AAV衣壳蛋白包含相对于对应亲本AAV衣壳蛋白的突变，其中所述经修饰的AAV衣壳蛋白中的所述突变位于与AAV8-VP1的氨基酸587-595对应的氨基酸中；以及

b)产生表达产物的异源核酸，其中所述表达产物减少听力损失或头晕。

2.根据权利要求1所述的重组AAV病毒体，其中所述表达产物是降低与听力损失相关的基因的表达的核酸，其中所述基因选自下组，所述组由以下各项组成：DIAPH1、KCNQ4、GJB3、IFNLR1、GJB2、GJB6、MYH1、CEACAM16、GSDME/DFNA5、WFS1、LMX1A、TECTA、COCH、EYA4、MYO7A、COL11A2、POU4F3、MYH9、ACTG1、MYO6、SIX1、SLC17A8、REST、GRHL2、NLRP3、TMC1、COL11A1、CRYM、P2RX2、CCDC50、MIRN96、TJP2、TNC、SMAC/DIABLO、TBC1D24、CD164、OSBPL2、HOMER2、KITLG、MCM2、PTPRQ、DMXL2、MYO3A和PDE1C。

3.根据权利要求1所述的重组AAV病毒体，其中所述表达产物是减少听力损失的多肽，其中所述多肽选自下组，所述组由以下各项组成：GJB2、GJB6、MYO7A、MYO15A、SLC26A4、TMIE、TMC1、TMPRSS3、OTOF、CDH23、GIPC3、STRC、USH1C、OTOG、TECTA、OTOA、PCDH15、RDX、GRXCR1、TRIOBP、CLDN14、MYO3A、WHRN、CDC14A、ESRRB、ESPN、MYO6、HGF、ILDR1、ADCY1、CIB2、MARVELD2、BDP1、COL11A2、PDZD7、PJVK、SLC22A4、SLC26A5、LRTOMT/COMT2、DCDC2、LHFPL5、S1PR2、PNPT1、BSND、MSRB3、SYNE4、LOXHD1、TPRN、GPSM2、PTPRQ、OTOGL、TBC1D24、ELMOD3、KARS、SERPINB6、CABP2、NARS2、MET、TSPEAR、TMEM132E、PPIP5K2、GRXCR2、EPS8、CLIC5、FAM65B、DFNB32、EPS8L2、ROR1、WBP2、ESRP1、MPZL2、PRPS1、POU3F4、SMPX、AIFM1和COL4A。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组AAV病毒体，其中所述AAV病毒体是AAV2病毒体、AAV5病毒体、AAV8病毒体或AAV9病毒体。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组AAV病毒体，其中所述AAV病毒体是AAV8BP2病毒体。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的重组AAV病毒体，其中所述降低与听力损失相关的基因的表达的核酸是干扰RNA。

7.根据权利要求6所述的重组AAV病毒体，其中所述干扰RNA是反义分子、短干扰RNA或miRNA。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组AAV病毒体，其中所述听力损失选自下组，所述组由以下各项组成：与年龄有关的听力损失、遗传性听力损失、噪声诱发性听力损失、由于施用耳毒性药物而导致的听力损失、疾病相关听力损失以及由创伤造成的听力损失。

9.一种用于在受试者中治疗或预防耳蜗损伤的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求1至8中任一项所述的重组AAV病毒体施用于患有耳蜗损伤或处于形成耳蜗损伤的风险中的受试者。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述受试者患有以下各项或处于形成以下各项的风险中：与年龄有关的听力损失、遗传性听力损失、噪声诱发性听力损失、由于施用耳毒性药物而导致的听力损失、疾病相关听力损失以及由创伤造成的听力损失。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述重组AAV病毒体感染所述受试者的耳蜗侧壁。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述重组AAV病毒体感染所述耳蜗侧壁中的血管纹。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述重组AAV病毒体感染所述血管纹的边缘细胞、中间细胞和/或基底细胞。

14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其中所述重组AAV病毒体增加内耳毛细胞再生。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述重组AAV病毒体增加耳蜗毛细胞再生。

16.一种用于在受试者中治疗或预防听力损失或头晕的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求1至8中任一项所述的重组AAV病毒体施用于患有听力损失或头晕或处于形成耳蜗损伤或头晕的风险中的受试者。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述受试者患有以下各项或处于形成以下各项的风险中：与年龄有关的听力损失、遗传性听力损失、噪声诱发性听力损失、由于施用耳毒性药物而导致的听力损失、疾病相关听力损失以及由创伤造成的听力损失。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述重组AAV病毒体感染所述受试者的耳蜗侧壁。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述重组AAV病毒体感染所述耳蜗侧壁中的血管纹。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述重组AAV病毒体感染边缘细胞、中间细胞和/或基底细胞。

21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中所述重组AAV病毒体增加内耳毛细胞再生。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述重组AAV病毒体增加耳蜗毛细胞再生。

23.根据权利要求9至22中任一项所述的方法，其中静脉内、鞘内、鼓室内、通过圆窗施用、通过半规管递送或通过镫骨足板造孔术施用所述重组AAV病毒体。

24.根据权利要求23所述的方法，其中通过小管切开术(canalostomy)将所述重组AAV病毒体施用于所述受试者的后半规管中。