CN113832079B

CN113832079B - 肠道微生物组合及其作为***性红斑狼疮标志物的应用

Info

Publication number: CN113832079B
Application number: CN202111303496.6A
Authority: CN
Inventors: 谢宝钊; 黄菁梅; 李水贤; 赖春桃; 林智明; 杨柳; 陆雪; 钟金河; 卢品伶
Original assignee: Wuzhou Gongren Hospital
Current assignee: Wuzhou Gongren Hospital
Priority date: 2021-11-05
Filing date: 2021-11-05
Publication date: 2023-07-28
Anticipated expiration: 2041-11-05
Also published as: CN113832079A

Abstract

本发明公开了肠道微生物组合及其作为***性红斑狼疮标志物的应用，具体的本发明通过分别对来自***性红斑狼疮个体和健康个体的肠微生物样品进行16s rRNA测序，确定SLE患者中存在的水平差异的孢子杆菌(Sporobacter)、丁酸弧菌(Butyricimonas)、和考拉杆菌(Phascolarctobacterium)，并明确了这些水平差异与***性红斑狼疮的关系。这些具有水平差异的肠道微生物能够作为***性红斑狼疮的标志物。

Description

肠道微生物组合及其作为***性红斑狼疮标志物的应用

技术领域

本发明涉及微生物学，具体地涉及肠道微生物组合及其作为***性红斑狼疮标志物的应用。

背景技术

***性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种多***受累的常见慢性自身免疫性***病。SLE患者主要以年轻女性为主，女性与男性比例为9:1，高峰发病年龄为20～40岁。目前普遍认为其发病原因与T淋巴细胞减少、T-reg功能降低、B细胞过度活化以及功能异常有关，同时产生了大量的自身抗体从而导致多器官和多***损害。目前***性红斑狼疮临床诊断主要采用临床症状以及血清学的实验室自身抗体等检查手段，缺乏特异性的辅助病情判断方法及相关检测试剂盒。

肠道微生态体系是人体最大的生态***，肠道中定植着超过10¹⁴数量级的细菌，肠道菌群基因组的基因数约为人类基因组基因总数的150倍。肠道菌群与人体相互依存，影响着包括肠道神经***、肠道内分泌***、免疫***、肠道通透性等功能，在对食物消化、维生素营养、抵御外来病原微生物入侵、刺激免疫等方面起着重要作用。肠道微生态***的平衡受到包括食物、药物等一系列外界因素的影响，抗生素、病原体等会打破肠道菌群的平衡，进而引起一系列相关病症，包括各种胃肠道疾病、肝脏性疾病、炎症性疾病、风湿性关节炎、多发性硬化症等免疫***疾病、糖尿病、代谢综合征、肥胖等代谢***疾病等。近年来研究表明，特定的肠道菌群可通过免疫***影响宿主的健康状态，具有调节免疫、提高防御功能、抑制肿瘤形成、促进正常的细胞代谢、促进骨质健康、抑制骨钙流失、延缓衰老等作用。随着“肠-肝轴”与“脑-肠轴”概念的提出，越来越多的研究开始集中在肠道菌群的种类与功能上。通过使用益生菌操纵肠细菌组成和局部代谢物已被探索为用于疾病治疗干预的有希望的途径。

针对***性红斑狼疮，目前临床尚未有十分有效的早期检查方法，因此亟需建立一种具有高灵敏性、和经济性的方法，以满足临床诊断、预防或治疗***性红斑狼疮疾病的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够作为***性红斑狼疮疾病标志物的肠道微生物组合。

本发明的第一方面，提供了一种肠道微生物组合，所述肠道微生物组合包括选自下组的一种或多种微生物：孢子杆菌(Sporobacter)、丁酸弧菌(Butyricimonas)、考拉杆菌(Phascolarctobacterium)。

在另一优选例中，所述肠道微生物组合至少包括：孢子杆菌(Sporobacter)、丁酸弧菌(Butyricimonas)、和考拉杆菌(Phascolarctobacterium)。

在另一优选例中，所述肠道微生物组合还包括选自下组的一种或多种微生物：理炎菌(Alistipes)、拟普雷沃菌(Alloprevotella)、臭气杆菌(Odoribacter)、和普雷沃氏菌(Prevotella)。

在另一优选例中，所述肠道微生物组合用于***性红斑狼疮的诊断(包括早期诊断和/或辅助诊断)和治疗(包括辅助治疗)；或用于制备一试剂盒或试剂，所述的试剂盒或试剂用于***性红斑狼疮的诊断(包括早期诊断和/或辅助诊断)和治疗(包括辅助治疗)。

在另一优选例中，通过PCR对各个微生物生物标志物进行检测；优选地，所述PCR包括QPCR、或RT－QPCR。

在另一优选例中，所述肠道微生物组合为基因组合，所述基因组合包含各微生物的特异性基因核酸片段。

本发明的第二方面，提供了一种用于诊断(包括早期诊断和/或辅助诊断)***性红斑狼疮的试剂组，所述试剂组包括用于检测如本发明第一方面所述的肠道微生物组合中各微生物的试剂。

在另一优选例中，各所述试剂为各微生物特异的引物、探针、反义寡核苷酸、适体或抗体。

在另一优选例中，所述试剂为PCR检测试剂；优选地包括特异性扩增各微生物基因的引物；更优选地，还包括特异性结合各微生物基因的探针。

在另一优选例中，所述PCR检测试剂包括多重PCR检测体系，所述多重PCR检测体系包括引物对组，所述引物对组包括：

第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:4所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:5所示的反向引物；

第二引物对，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.:8所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:9所示的反向引物；和

第三引物对，所述第三引物对包括如SEQ ID NO.:13所示的正向引物；和，如SEQID NO.:14所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对组包括：

第四引物对，所述第四引物对包括如SEQ ID NO.:10所示的正向引物；和，如SEQID NO.:11所示的反向引物。

在另一优选例中，所述多重PCR检测体系还包括探针组，所述探针组包括：

第一探针，所述第一探针序列如SEQ ID NO.:12所示；

第二探针，所述第二探针序列如SEQ ID NO.:15所示；

第三探针，所述第三探针序列如SEQ ID NO.:16所示；和/或

第四探针，所述第四探针序列如SEQ ID NO.:17所示。

本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括如本发明第一方面所述的肠道微生物组合，和/或如本发明第二方面所述的试剂组。

在另一优选例中，如本发明第一方面所述的肠道微生物组合中各微生物用作标准品。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、和/或PCR反应酶系。

本发明的第四方面，提供了肠道微生物组合或其检测试剂的用途，用于制备一试剂盒，所述的试剂盒用于诊断(包括早期诊断和/或辅助诊断)***性红斑狼疮，其中，所述肠道微生物组合包括选自下组的一种或多种微生物：孢子杆菌(Sporobacter)、丁酸弧菌(Butyricimonas)、考拉杆菌(Phascolarctobacterium)。

在另一优选例中，所述的诊断包括步骤：

(1)提供一来源于待测对象的样品，用PCR方法对样品中所述肠道微生物组合中各微生物的水平进行检测；

(2)将步骤(1)测得的水平与正常人群中的对应微生物水平进行比较。

在另一优选例中，步骤(1)中使用PCR方法对各微生物的16SrDNA进行检测。

在另一优选例中，所述的样品选自粪便。

本发明的第五方面，提供了一种用于治疗(包括辅助治疗)***性红斑狼疮的药物，所述药物具有调节患者肠道内本发明第一方面所述的肠道微生物组合的能力。

本发明的第六方面，提供了一种筛选用于治疗(包括辅助治疗)***性红斑狼疮的药物的方法，所述方法包括步骤：

(1)在测试组中，向待测对象施用测试化合物，检测测试组中来源于所述对象的样品中所述的肠道微生物组合中各微生物的水平L1；在对照组中，向待测对象施用空白对照(包括溶媒)，检测对照组中来源于所述对象的样品中所述肠道微生物组合中各微生物的水平L2；

(2)对上一步骤检测得到的水平L1和水平L2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是治疗***性红斑狼疮的候选化合物；

其中，所述肠道微生物组合包括选自下组的一种或多种：孢子杆菌(Sporobacter)、丁酸弧菌(Butyricimonas)、考拉杆菌(Phascolarctobacterium)。

应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了SLE患者和健康人群肠道菌群丰富度和多样性比较结果：

(a)采用Chao1指数评估α多样性；(b)采用Shannon指数评估α多样性；(***P<0.001，Kruskal-Wallis检验)。

图2显示评估了SLE患者和健康人群肠道菌群结构多样性的结果：

(a)基于Bray-Curtis距离的PCOA可视化图；(b)PCA分析图。

图3显示了Sporobacter菌的ROC曲线。

图4显示了Butyricimonas菌的ROC曲线。

图5显示了Phascolarctobacterium菌的ROC曲线。

具体实施方式

本发明的发明人进行了深入的研究，通过分别对来自***性红斑狼疮个体和健康个体的肠微生物样品进行16s rRNA测序，确定SLE患者中存在的多种肠道微生物水平差异，确定了这些水平差异与***性红斑狼疮的关系。这些具有水平差异的肠道微生物能够用于预防、诊断/治疗***性红斑狼疮疾病的组合物或试剂盒。

本发明确认了SLE患者在肠道菌物种分类上明显不同于健康人群，在多种微生物水平上存在差异(P<0.05)，患者的孢子杆菌(Sporobacter)、丁酸弧菌(Butyricimonas)、考拉杆菌(Phascolarctobacterium)表达量显著低于健康人群，差异具有显著的统计学意义，提示这些指标的表达量与***性红斑狼疮的发病密切相关。

“16s rRNA”指构成原核生物核糖体的30S小亚单位的rRNA，其一方面碱基序列的大部分被高度保留，另一方面部分区域显示出高的碱基序列多样性。特别是在同种之间几乎不存在多样性而异种间显示出多样性，因此通过比较16SrRNA的序列，能够有效鉴定原核生物。

在本发明优选地实施方式中，各菌株16SrRNA的靶基因的序列如下：

Sporobacter菌代表性序列(SEQ ID NO.:1)：

GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGAGACAATTGGTTCGCTGATTGTCTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGCAATCTGCCCTTCGGAGGGGGACAACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCGCATAATGTATATTCAAGGCATCTTGGATATACCAAAGATTTATCGCCGAAGGATGAGCTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCTGCGATCAGTAGCCGGACTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGAACTGAGATACGGGCCAGACTCCTACGGGAGGGAGCAGTGGGGAATTTTGGNCAATGGGGGAAAGCCNTACCCAGCAACGCCGCGTGAAGGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACTTCTTTGACCAGGGACGAAACAAATGACGGTACCTGGAAAACAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTATTACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGTGTAAAGGGCGCGTAGGCGGGAGTACAAGTCAGATGTGAAATCTGGGGGCTTAACCCTCAAACTGCATTTGAAACTGTATTTCTTGAGTATCGGAGAGGCAGGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTTGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCCTGCTGGACGACAACTGACTCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAATACTAGGTGTGGGGGGACTGACCCCCTCCGTGCCGGAGTTAACACAATAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGNCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGTGGATTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATCGTACTAACGAAGCAGAGATGCATTAGGTGCCCTTCCGGGGAAAGTATAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTNATTTGCTACNCGAGANCACTCTAGCGAGGCTGCCGATGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCCTGGGCTACACACGTAATACAATGTCTCTCACAGAGGGAAGCAAGACCGCGAGGTGGAGCAAATCCCTAAAATGCGTCTCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGCCGGGAACACCCGAAGTCCGTAGTCTAACCGCAAGGGGGACGCGGCCGAAGGTGGGTTTGGTAATTGGGGTG

Butyricimonas菌代表性序列如下(SEQ ID NO.:2)：

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTAGCGACAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGCAGCACGGTGTAGCAATACACTGGTGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACACGTGTGCAACCAACCCCGTACCGGGAGATAACCCGCGGAAACGTGGACTAACATCCCATGATACTCGAGAGCCGCATGGCTCTCGATTTAAAATTCCGGTGGTACGGGACGGGCACGCGCGACATTAGGTAGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGCCGACGATGTCTAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGAGAGCCTGAACCAGCCAAGTCGCGTGAGGGAAGAATGGTCTATGGCCTGTAAACCTCTTTTGTCAGGGAAGAATAAGGATGACGAGTCATTCGATGCCAGTACTTGACGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGATGCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGCGCGTAGGCGGGACGTCAAGTCAGCGGTAAAAGACTGCAGCTAAACTGTAGCACGCCGTTGAAACTGGCGCCCTGGAGACGAGACGAGGGAGGCGGAACAAGTGAAGTAGCGGTGAAATGCATAGATATCACTTGGAACCCCGATAGCGAAGGCAGCTTCCCAGGCTCGTTCTGACGCTGATGCGCGAGAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGCTCACTGGATCTTGGCGATACACTGCCAGGGTTCAAGCGAAAGTATTAAGTGAGCCACCTGGGGAGTACGTCGGCAACGATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGTTTAAATGTAGATTGCATGAGGTGGAAACGCTTCTTCCCTTCGGGGCTATTTACAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCGGGTTAAGTCCCATAACGAGCGCAACCCCTATCGCCAGTTGCCATCGGTTGAAGCCGGGCACTCTGTCGAGACTGCCACCGTAAGGTGCGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACACCCGGGGCGACACACGTGTTACAATGGCCGGTACAGAGGGCAGCCACGGGGTGACCCGGAGCGAATCTCTAAAGCCGGTCGTAGTTCGGACTGGAGTCTGCAACCCGACTCCACGAAGTTGGATTCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGCCGGGAGTACCTGAAGATCGTGACCGCGAGGAACGGGCTAGGGTAATACCGGTAACTGGGGCTAAGTCGTAACAAGGTAACC

Phascolarctobacterium代表性序列如下(SEQ ID NO.:3)：

GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGNACGGAGAATTTTATTTCGGTAGAATTCTTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGCAACCTACCCTTTAGACGGGGACAACATTCCGAAAGGAGTGCTAATACCGGATGTGATCATCGTGCCGCATGGCAGGATGAAGAAAGATGGCCTCTACAAGTAAGCTATCGCTAAAGGATGGGCCTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTAGTGTAACGGACTACCAAGGCGATGATCAGTAGCCGGTCTGAGAGGATGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGATTTCGGTCTGTAAAGCTCTGTTGTTTATGACGAACGTGCAGTGTGTGAACAATGCATTGCAATGACGGTAGTAAACGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCATGTAGGCGGCTTAATAAGTCGAGCGTGAAAATGCGGGGCTCAACCCCGTATGGCGCTGGAAACTGTTAGGCTTGAGTGCAGGAGAGGAAAGGGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTGGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGCCTTTCTGGACTGTGTCTGACGCTGAGATGCGAAAGCCAGGGTAGCGAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCTGGCCGTAAACGATGGGTACTAGGTGTAGGAGGTATCGACCCCTTCTGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATTGATTGAACGCTCTAGAGATAGAGATTTCCCTTCGGGGACAAGAAAACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTATGTTACCAGCAAGTAAAGTTGGGGACTCATGGGAGACTGCCAGGGACAACCTGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTACACACGTACTACAATGGTCGGAAACAGAGGGAAGCGAAGCCGCGAGGCAGAGCAAACCCCAGAAACCCGATCTCAGTTCGGATCGCAGGCTGCAACCCGCCTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTNCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGAGGTAACCTATTAGGAGCCAGCCGTCTAAGGTGGNGCCGATGATTGGGGTG

本发明提供肠道微生物组合用于制备或筛选***性红斑狼疮检测产品的用途，所述肠道微生物组合包括选自下组的一种或多种微生物：孢子杆菌(Sporobacter)、丁酸弧菌(Butyricimonas)、考拉杆菌(Phascolarctobacterium)。

本发明人研究发现，在***性红斑狼疮患者中，所述肠道微生物在患者粪便中水平显著降低。其中，与健康人群相比，孢子杆菌(Sporobacter)水平降低约55％，丁酸弧菌(Butyricimonas)水平降低约50％，考拉杆菌(Phascolarctobacterium)水平降低约10％。

因此，所述肠道微生物能够作为***性红斑狼疮诊断、检测的生物标志物。

在一种实施方式中，所述***性红斑狼疮检测产品包括所述肠道微生物的微生物丰度检测试剂；优选地如所述各微生物的特异性识别试剂。

在一种实施方式中，所述特异性识别试剂选自各所述微生物的特异性引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。

在一种实施方式中，所述特异性引物能够检测所述各微生物的包括16SrRNA及其他可识别所述特定微生物的基因序列的引物。

在本发明中，术语“引物”是能够形成与模板链互补的碱基对，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7～50bp的序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。

作为一个实施方式，在本发明中，上述引物可以用于扩增相应微生物的16SrRNA及其他可识别所述微生物的基因序列，扩增序列后，通过期望的产物的生成与否，能够检测出微生物的存在或测定微生物水平。

利用引物的序列扩增方法可以使用本领域已知的多种多样的方法。例如，可以使用聚合酶链式反应(PCR)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、多重PCR、巢式(nested)PCR、实时荧光定量PCR等。

本发明提供的肠道微生物的特异性识别试剂组合可用于制备***性红斑狼疮前期检测试剂盒。优选地，所述试剂盒为PCR检测试剂盒；所述试剂盒可以包含测试管或其他合适的容器、反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)、Taq-聚合酶逆转录酶等酶、SYBRGreen荧光染料、DEPC-水等。

本发明还提供了一种用于***性红斑狼疮检测的基因芯片，所述基因芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性识别所述肠道微生物组合中各微生物的基因序列。

在本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

所述探针具有与靶基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有90％以上、优选95％以上、更优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，也可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(lockednucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(2′-O,4′-C-Ethylene-bridgednucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1研究受试者和样品收集

在知情同意的情况下，在南方医科大学南方医院收集来自300名受试者的粪便样品，包括120个SLE患者和180个健康对照。

为了有资格纳入本研究，个人必须符合以下粪便样品收集标准：

1)没有服用抗生素或免疫调节剂治疗，没有特定饮食(糖尿病患者、素食者等)和正常生活方式(没有额外的压力)至少3个月；

2)任何医疗干预后至少3个月；

3)无怀孕、肿瘤、感染或自身免疫性疾病或风湿性疾病

为研究受试者派发粪便样本采集管，并告知具体的收集方法，受试者取10-15g新鲜粪便放于带有粪便基因组保护液的采集管内，常温快递到医院实验室，4℃冰箱保存直到使用。

实施例2 16S rRNA分析肠道微生物群落

2.1DNA提取

使用粪便微生物基因组提取试剂盒(广东南芯医疗科技有限公司)根据制造商的说明书进行DNA提取。

提取物用无DNA酶的RNA酶处理以消除RNA污染。使用NanoDrop分光光度计，Qubit荧光计测定DNA含量。

2.2DNA文库构建和测序

用细菌通用引物对纯化后的基因组DNA进行两轮16S rRNA基因PCR扩增，完成测序样本文库构建，使用2.0Fluorometer(Invitrogen，USA)检测浓度，Agilent2100(Agilent，USA)检测文库的大小；应用Illumina MiSeq(Illumina，San Diego，USA)测序仪对扩增的16S rRNA高变区序列进行测序，测序区域为V3-V4区。

2.3数据分析

使用Trimmomatic v.0.32软件对原始测序数据(FASTQ)进行修剪和过滤，将优质序列文件通过97％相似度的标准聚类，得到操作分类单元(OTU)。然后使用Qiime2V.2017.12软件和R软件进行α和β多样性分析。

使用Chao1、Shannon多样性指数评估肠道菌群α多样性，使用主坐标分析(PCoA)和PCA分析以评估肠道菌群的β多样性。使用基于线性判别分析效应量的分析方法(LEfSe)分析各组样本显著性差异的类群。

2.4结果

通过基于16S rRNA的分析获得了健康人群、SLE患者的肠道微生物群落信息，证实了，SLE患者的肠道菌群多样性和丰富度较健康人群明显降低(图1)。

PCoA分析以及PCA分析评估肠道菌群β多样性，结果，SLE患者和健康人群有明显的分离趋势，提示SLE患者的肠道菌群结构不同与HC组(图2)。

此外，确认了SLE患者在肠道菌物种分类上明显不同于健康人群，在多种肠道微生物水平上存在差异(P<0.05)，患者的Sporobacter菌、Butyricimonas菌、Phascolarctobacterium菌表达量显著低于健康人群，差异具有显著的统计学意义，提示这些指标的表达量与***性红斑狼疮的发病密切相关(表1)。

表1差异物种

实施例3 SLE患者肠道菌群的临床检测验证

上述研究表明，SLE患者在肠道菌物种分类上明显不同于健康人群，在多重肠道微生物水平上存在差异，患者的Sporobacter菌、Butyricimonas菌、Phascolarctobacterium菌表达量显著低于健康人群(P<0.05)。

根据相关菌群与SLE的相关性，可以通过检测患者样本中相关菌群的丰度对SLE进行诊断。

因此，本实施例收集了健康和SLE患者的粪便样本各100例，将样本编号后，进行测试。针对目标微生物的16S rRNA基因序列，设计特异性荧光定量PCR引物探针，并设置内标。

检测样本中Sporobacter菌、Butyricimonas菌、Phascolarctobacterium菌丰度的实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)特异性引物序列如表2所示。

表2

荧光定量PCR扩增检测体系：各菌株上下游引物各0.5μl，模板DNA 5μl，SYBRGreen 6μl。荧光定量PCR反应条件为：95℃10min，95℃15s，60℃2min，共40个循环。

每个样本分别检测9种细菌，设置一个内标基因和一个纯水对照样本。

在ABI7500荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，采用ΔΔCT法(CT值比较法)来计算样本中各目的基因的表达丰度。

使用logistics回归模型进行分析，并绘制ROC曲线来考量菌种的诊断性能。ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以真阳性率(灵敏度)为纵坐标，假阳性率(1-特异度)为横坐标绘制的曲线。ROC曲线越靠近左上角，标志物的诊断准确性就越高，最靠近左上角的ROC曲线的点是错误最少的最好阈值，其假阳性和假阴性的总数最少。计算各个潜在标志物的ROC曲线下的面积(AUC)可判断潜在标志物诊断价值，AUC越大其诊断价值就越大。

表3.诊断潜力分析

检测结果显示，相对于健康个体，SLE患者的肠道菌群中Sporobacter菌、Butyricimonas菌、Phascolarctobacterium菌呈现显著性差异(P<0.05)。该结果与16SrRNA文库测序结果一致。

图3至图5显示了各菌群的ROC曲线，结果表明检测的菌群均具有较高的灵敏度和特异性，因此能够用于SLE患者的辅助诊断。

因此，当受测人群的肠道菌群中Sporobacter菌、Butyricimonas菌、Phascolarctobacterium菌的其中一个或多个指标低于正常人时，则患***性红斑狼疮的几率较大，由此有助于协助疾病病情的判断，同时也是治疗***性红斑狼疮的潜在靶点。

实施例4检测试剂盒的制备

本实施例提供了一种基于检测样本中Sporobacter菌、Butyricimonas菌、和Phascolarctobacterium菌丰度的实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测试剂盒。

为了提高样本检测效率，本发明人在研究过程中，对上述各菌株的PCR扩增引物进行了多轮设计及实验验证，以获得能够对上述多个菌株进行多重检测的多重检测体系。经过人工设计多对引物和探针，再对其进行优化选择并验证，最后将筛选出的针对各菌群的不同引物、探针进行组合测试，最终很好地解决多重荧光PCR体系引物间互相干扰抑制的难题，获得了具有较佳特异性和灵敏度的多重检测体系，体系中各引物探针序列信息如下，其中，F为正向引物，R为反向引物，P为探针。

表4.多重检测体系

使用过程中PCR反应体系中各组分的含量如下：

5×PCR buffer	5μL
		各引物-F(50μmol/L)	0.3μL
各引物-R(50μmol/L)	0.3μL
		各探针-P(50μmol/L)	0.1μL
20mmol/L dNTPs(含dUTP)	0.3μL
		PCR反应酶系	3μL
模板核酸	5μL
		DEPC水	补足至25μL

在实时荧光PCR仪中进行扩增反应，荧光通道选择FAM、VIC、Texas red和Cy5,PCR扩增程序如下；

50℃，2min，95℃，15min；1个循环

94℃，15sec，55℃，45sec(搜集荧光)；40个循环。

PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值，采用ΔΔCT法(CT值比较法)来计算样本中各目的基因的表达丰度。

分别使用上述多重检测体系，对实施例3中的各100例健康和SLE患者样本进行检测。检测结果与实施例3中单重检测检测结果进行比对，判断临床符合率。结果表明，上述三个多重检测体系的检测结果与实施例3的单重检测结果能够完全对应，临床符合率达到100％。

对比例1

本发明人对目标菌的16sRNA基因序列，进行深入比对分析后，针对各目标序列设计了数对引物和探针，由于多重反应体系引物之间的竞争抑制、引物特异性差异、退火温度不一致、以及引物二聚体等原因，很难获得有效的多重PCR扩增引物以及探针序列。通过大量的实验，对设计的引物和探针进行优化选择并验证，最终确定了可以用于多重PCR扩增的引物和探针序列及其组合。

实验中发现，即使在已经基本确定针对各目标核酸的引物对和探针序列的情况下，不同引物对组合进行多重扩增的效果也存在显著地差异。

例如，在多重PCR步骤中，将上述多重反应体系中的Butyricimonas菌引物序列替换为对照引物对1：

F1：GGTCCAGACTCCTACGGGAG(SEQ ID NO.:6)

R1：GCAGCACCTTGTAAATAGCC(SEQ ID NO.:7)

其他组分不变。

上述对照引物对1在单重PCR检测中能够正常检测出Butyricimonas菌靶核酸序列。

在多重检测体系中，20例样本的检测结果表明，包含该对照引物对1的多重检测体系，仅在13例样本中检测出目标Butyricimonas菌，准确性较差，无法满足临床检测要求。

将上述多重反应体系中的Sporobacter菌引物序列替换为对照引物对2：

F2：GCGGCGTGCCTAACACATG(SEQ ID NO.:18)

R2：CATAATCCACTGCTTGTGCG(SEQ ID NO.:19)

其他组分不变。

上述对照引物对2在单重PCR检测中能够正常检测出Sporobacter菌靶核酸序列。

在多重检测体系中，20例样本的检测结果表明，包含该对照引物对2的多重检测体系，仅在16例样本中检测出目标Sporobacter菌，准确性无法满足临床检测要求。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 梧州市工人医院

<120> 肠道微生物组合及其作为***性红斑狼疮标志物的应用

<130> P210347

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1436

<212> DNA

<213> 孢子杆菌(Sporobacter)

<220>

<221> misc_feature

<222> (341)..(341)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (357)..(357)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (843)..(843)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1074)..(1074)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1084)..(1084)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1090)..(1090)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

gacgaacgct ggcggcgtgc ctaacacatg caagtcgaac ggagacaatt ggttcgctga 60

ttgtcttagt ggcggacggg tgagtaacgc gtgagcaatc tgcccttcgg agggggacaa 120

cagctggaaa cggctgctaa taccgcataa tgtatattca aggcatcttg gatataccaa 180

agatttatcg ccgaaggatg agctcgcgtc tgattagcta gttggtgagg taaaggctca 240

ccaaggctgc gatcagtagc cggactgaga ggttgaacgg ccacattgga actgagatac 300

gggccagact cctacgggag ggagcagtgg ggaattttgg ncaatggggg aaagccntac 360

ccagcaacgc cgcgtgaagg aagaaggcct tcgggttgta aacttctttg accagggacg 420

aaacaaatga cggtacctgg aaaacaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 480

ttacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt actgggtgta aagggcgcgt aggcgggagt 540

acaagtcaga tgtgaaatct gggggcttaa ccctcaaact gcatttgaaa ctgtatttct 600

tgagtatcgg agaggcaggc ggaattccta gtgtagcggt gaaatgcgtt gatattagga 660

ggaacaccag tggcgaaggc ggcctgctgg acgacaactg actctgaggc gcgaaagcgt 720

ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgctg taaacgatga atactaggtg 780

tggggggact gaccccctcc gtgccggagt taacacaata agtattccac ctggggagta 840

cgnccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcag tggattatgt 900

ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accagggctt gacatcgtac taacgaagca 960

gagatgcatt aggtgccctt ccggggaaag tatagacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020

ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccctat tgtnatttgc 1080

tacncgagan cactctagcg aggctgccga tgacaaaccg gaggaaggtg gggacgacgt 1140

caaatcatca tgccccttat gtcctgggct acacacgtaa tacaatgtct ctcacagagg 1200

gaagcaagac cgcgaggtgg agcaaatccc taaaatgcgt ctcagttcag attgcaggct 1260

gcaactcgcc tgcatgaagt cggaattgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa 1320

tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg agagccggga acacccgaag 1380

tccgtagtct aaccgcaagg gggacgcggc cgaaggtggg tttggtaatt ggggtg 1436

<210> 2

<211> 1486

<212> DNA

<213> 丁酸弧菌(Butyricimonas)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcgacaggc ttaacacatg caagtcgagg 60

ggcagcacgg tgtagcaata cactggtggc gaccggcgca cgggtgagta acacgtgtgc 120

aaccaacccc gtaccgggag ataacccgcg gaaacgtgga ctaacatccc atgatactcg 180

agagccgcat ggctctcgat ttaaaattcc ggtggtacgg gacgggcacg cgcgacatta 240

ggtagttggc ggggtaacgg cccaccaagc cgacgatgtc taggggttct gagaggaagg 300

tcccccacac tggaactgag acacggtcca gactcctacg ggaggcagca gtgaggaata 360

ttggtcaatg ggcgagagcc tgaaccagcc aagtcgcgtg agggaagaat ggtctatggc 420

ctgtaaacct cttttgtcag ggaagaataa ggatgacgag tcattcgatg ccagtacttg 480

acgaataagc atcggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggggg atgcgagcgt 540

tatccggatt tattgggttt aaagggcgcg taggcgggac gtcaagtcag cggtaaaaga 600

ctgcagctaa actgtagcac gccgttgaaa ctggcgccct ggagacgaga cgagggaggc 660

ggaacaagtg aagtagcggt gaaatgcata gatatcactt ggaaccccga tagcgaaggc 720

agcttcccag gctcgttctg acgctgatgc gcgagagcgt gggtagcgaa caggattaga 780

taccctggta gtccacgccg taaacgatgc tcactggatc ttggcgatac actgccaggg 840

ttcaagcgaa agtattaagt gagccacctg gggagtacgt cggcaacgat gaaactcaaa 900

ggaattgacg ggggcccgca caagcggagg aacatgtggt ttaattcgat gatacgcgag 960

gaaccttacc cgggtttaaa tgtagattgc atgaggtgga aacgcttctt cccttcgggg 1020

ctatttacaa ggtgctgcat ggttgtcgtc agctcgtgcc gtgaggtgtc gggttaagtc 1080

ccataacgag cgcaacccct atcgccagtt gccatcggtt gaagccgggc actctgtcga 1140

gactgccacc gtaaggtgcg aggaaggcgg ggatgacgtc aaatcagcac ggcccttaca 1200

cccggggcga cacacgtgtt acaatggccg gtacagaggg cagccacggg gtgacccgga 1260

gcgaatctct aaagccggtc gtagttcgga ctggagtctg caacccgact ccacgaagtt 1320

ggattcgcta gtaatcgcgc atcagccatg gcgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1380

acaccgcccg tcaagccatg gaagccggga gtacctgaag atcgtgaccg cgaggaacgg 1440

gctagggtaa taccggtaac tggggctaag tcgtaacaag gtaacc 1486

<210> 3

<211> 1481

<212> DNA

<213> 考拉杆菌(Phascolarctobacterium)

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)..(38)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1370)..(1370)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1465)..(1465)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

gacgaacgct ggcggcgtgc ctaacacatg caagtcgnac ggagaatttt atttcggtag 60

aattcttagt ggcgaacggg tgagtaacgc gtaggcaacc taccctttag acggggacaa 120

cattccgaaa ggagtgctaa taccggatgt gatcatcgtg ccgcatggca ggatgaagaa 180

agatggcctc tacaagtaag ctatcgctaa aggatgggcc tgcgtctgat tagctagttg 240

gtagtgtaac ggactaccaa ggcgatgatc agtagccggt ctgagaggat gaacggccac 300

attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtggggaa tcttccgcaa 360

tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggatttcgg tctgtaaagc 420

tctgttgttt atgacgaacg tgcagtgtgt gaacaatgca ttgcaatgac ggtagtaaac 480

gaggaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcgagcgttg 540

tccggaatta ttgggcgtaa agagcatgta ggcggcttaa taagtcgagc gtgaaaatgc 600

ggggctcaac cccgtatggc gctggaaact gttaggcttg agtgcaggag aggaaagggg 660

aattcccagt gtagcggtga aatgcgtaga tattgggagg aacaccagtg gcgaaggcgc 720

ctttctggac tgtgtctgac gctgagatgc gaaagccagg gtagcgaacg ggattagata 780

ccccggtagt cctggccgta aacgatgggt actaggtgta ggaggtatcg accccttctg 840

tgccggagtt aacgcaataa gtaccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttgaaactca 900

aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagtatgtg gtttaattcg acgcaacgcg 960

aagaacctta ccaaggcttg acattgattg aacgctctag agatagagat ttcccttcgg 1020

ggacaagaaa acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080

gtcccgcaac gagcgcaacc cctatcctat gttaccagca agtaaagttg gggactcatg 1140

ggagactgcc agggacaacc tggaggaagg cggggatgac gtcaagtcat catgcccctt 1200

atgtcttggg ctacacacgt actacaatgg tcggaaacag agggaagcga agccgcgagg 1260

cagagcaaac cccagaaacc cgatctcagt tcggatcgca ggctgcaacc cgcctgcgtg 1320

aagtcggaat cgctagtaat cgcaggtcag catactgcgg tgaatacgtn cccgggcctt 1380

gtacacaccg cccgtcacac cacgaaagtt ggtaacaccc gaagccggtg aggtaaccta 1440

ttaggagcca gccgtctaag gtggngccga tgattggggt g 1481

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

ggttcgctga ttgtcttagt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

accacataat ccactgcttg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

ggtccagact cctacgggag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

gcagcacctt gtaaatagcc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

ctttagacgg ggacaacatt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

cgaagggaaa tctctatctc 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

cccttcattg agaccaagt 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 11

gtacttgagc atgtaggcct 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 12

tgaaggaaga aggccttc 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 13

aactgagaca cggtccagac 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 14

cttcctccgt tttgtcaacg 20

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 15

acgtgccagc agccgcggt 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 16

aaagtctgac ggagcaacg 19

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 17

ccgggatctg gcattacg 18

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 18

gcggcgtgcc taacacatg 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 19

cataatccac tgcttgtgcg 20

Claims

1.肠道微生物组合或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备一试剂盒，所述的试剂盒用于诊断***性红斑狼疮，其中，所述肠道微生物组合由孢子杆菌(Sporobacter)、丁酸弧菌(Butyricimonas)和考拉杆菌(Phascolarctobacterium)组成。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂为PCR检测试剂。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述PCR检测试剂包括多重PCR检测体系，所述多重PCR检测体系包括引物对组，所述引物对组包括：

第三引物对，所述第三引物对包括如SEQ ID NO.:13所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:14所示的反向引物。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述引物对组还包括：

第四引物对，所述第四引物对包括如SEQ ID NO.:10所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:11所示的反向引物。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述多重PCR检测体系还包括探针组，所述探针组包括：

第一探针，所述第一探针序列如SEQ ID NO.:12所示；

第二探针，所述第二探针序列如SEQ ID NO.:15所示；

第三探针，所述第三探针序列如SEQ ID NO.:16所示；和

第四探针，所述第四探针序列如SEQ ID NO.:17所示。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断包括步骤：