CN113825502A - 治疗药物性诱发的牙龈增生的材料与方法 - Google Patents

Abstract

公开了一种含有微球的凝胶组合物，该微球包覆叶酸和可选的一种或多种药物、一种或多种肽类、一种或多种生长因子、一种或多种核酸或类似物，或其组合。组合物可以在设备中或应用于设备，例如，假牙。该组合物可用于治疗患有或怀疑患有药物诱导的牙龈过度生长(DIGO)的个体。该组合可以直接应用到个人或通过设备(例如，假牙)应用。还描述了制作该组合物的方法、制作该装置的方法和使用该组合物的方法。

Description

治疗药物性诱发的牙龈增生的材料与方法

相关应用的交叉引用

本申请于2019年5月7日提交，并拥有美国临时申请第62/844，202号的优先权，其全部公开内容并入本申请中做参考。

发明披露背景

口腔(口)的状况是反映受试者的局部和全身健康方面的重要指标。口腔有两部分，即前庭和口腔本身，由硬组织和软组织结构组成。软组织结构包括嘴唇、粘膜、软腭、口腔底部、舌头和牙龈。牙龈是覆盖牙齿颈部和颌骨牙槽突的粘膜组织。它是支撑牙齿的牙周组织的外部成分。在解剖学上，牙龈分为三个主要部分，即附着牙龈、边缘牙龈和牙间***状突起。健康的牙龈可以避免机械损伤和微生物感染。

以组织学的角度，牙龈由角化不全的分层鳞状上皮和***组成。上皮在针对微生物和各种外伤的免疫防御反应中起着重要作用。上皮中的主要细胞是角质细胞，它分泌角蛋白并形成物理屏障。另一方面，牙龈***主要由成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞组成，这些细胞构成牙龈***的基质、血管和执行免疫功能。

临床上，健康的牙龈呈淡粉色，可被描述为“鲑肉色”或“珊瑚粉”。正常牙龈具有坚硬的一致性并牢固地附着在牙齿和牙槽骨下。牙龈与身体中的任何其他结构一样，容易受到多种病理状况的影响，这些病理状况可能会改变其自然特征，例如颜色、大小、轮廓、形状、稠度或表面纹理。在临床上，覆盖牙冠的牙龈大小以及形状发生改变，导致美观上和功能上的问题被称为牙龈过度生长。

牙龈过度生长分为炎性牙龈过度生长、遗传性牙龈纤维瘤病、全身性牙龈过度生长和药物诱导牙龈过度生长(DIGO)。炎症性牙龈过度生长是由于由局部刺激物(例如牙菌斑、牙结石、微生物和外伤)引发的明显炎症反应。遗传性牙龈纤维瘤病(HGF)，也称为特发性增生，是一种罕见的良性疾病，其特征是附着牙龈的非出血性纤维过度生长。全身性牙龈过度生长可能导致局部或全身性的牙龈过度生长。最常见的全身性原因是怀孕、荷尔蒙失调、白血病和维生素缺乏。牙龈过度生长的其他原因包括溶酶体贮积症、血管疾病和与牙齿异常相关的牙龈过度生长。与遗传缺陷相关的牙龈过度生长，不仅可以作为一个单独的实体出现，也可以作为综合征的一部分出现。它通常与上颌和下颌第二和第三磨牙区域的牙齿萌出有关。很少会涉及与骨骼，但假性口袋的形成会导致牙周的问题。牙龈过度生长通常与不同的全身性疾病有关，例如白血病、韦格纳肉芽肿、克罗恩病、结节病和结核。牙龈过度生长也很少与淀粉形成不全、桥本氏甲状腺炎、I细胞病和多发性骨髓瘤相关。该项目的重点是药物引起的牙龈过度生长，并将在以下部分进一步阐述。

已知几类众所周知的药物可引起药物性牙龈过度生长DIGO，包括三大类，即抗惊厥药(例如苯妥英)、免疫调节剂(钙调磷酸酶抑制剂，例如环孢菌素)和抗高血压药(钙通道阻滞剂，例如硝苯地平)。一般来说，这些药物在接受治疗的患者中显示出牙龈过度生长的高发生率。据报道，使用抗惊厥药的发生率最高，其次是免疫抑制剂和抗高血压药物。1939年的第一份报告描述了DIGO与抗惊厥药和抗高血压药物的钙通道阻滞剂有关。1972年首次报道了DIGO是环孢素(CSA)的副作用，而在1980年代初则报道DIGO是硝苯地平的副作用。牙龈过度生长会导致多种并发症，并导致蛀牙、牙周病、咬合问题以及审美和言语障碍的风险增加。SEYMOUR等人在1992年报道中表示25-81％的环孢素CSA治疗患者出现牙龈过度生长。而后，KILPATRICK等人在1997年的研究表明接受环孢素CSA治疗的移植儿童受者中有97％出现牙龈过度生长。与环孢素和钙通道阻滞剂相关的牙龈过度生长的患病率分别为30％和20％。

披露概要

本披露公开了适用于治疗药物性牙龈过度生长DIGO的组合物(例如，包含多个封装叶酸的微球的凝胶)以及制备该组合物和使用该组合物的方法。还提供了装置(例如牙科装置，例如假牙)和使用该装置的方法。

在一方面，本发明提供了包含多个微球的聚合物凝胶的组合物。所述多个微球中的单个微球封装叶酸。

在一方面，本披露提供了制备本公开的组合物的方法。

在一方面，本披露提供了装置。其装置包括假体和本公开的组合物。组合物可以设置在假体中和/或假体的表面上。

在一方面，本披露提供制造此公开的装置的方法。

在一方面，本披露提供了一种用于治疗患有或怀疑患有DIGO个体的方法。该方法包括如何利用本披露的设备。

附图简述

为了更全面地理解本披露的本质和对象，应参考下列连同附图所作的详细说明。

图1显示了使用TGF-Β诱导胶原表达处理纤维细胞。

图2显示了叶酸减少TNF-Α口腔角质形成细胞。口腔角质形成细胞接种在以密度为2.5X 104/平方厘米的60毫米平板中。粘附后，用不同浓度的叶酸(2.5微克/毫升–40微克/毫升)处理细胞，并通过ELISA测量TNF-Α含量(P<0.05)，*与未经处理组有着显著的不同。

图3显示了叶酸在LPS刺激下减少口腔角质形成细胞中的TNF-Α。口腔角质形成细胞接种在以密度为2.5X 104/平方厘米的60毫米的平板中。粘附后，用LPS(10微克/毫升)、CSA(10微克/毫升)和FA(10微克/毫升)处理细胞24小时。通过ELISA测定分泌的TNF-Α的含量(P<0.05)，*与未处理组有显著不同，#与非叶酸组有显著不同。

图4显示了转染因子结合到人TNF-Α启动子和生成的荧光素酶缺失结构的示意图。

图5显示叶酸抑制口腔角质形成细胞中TNF-Α的启动子活性。口腔角质形成细胞用全长TNF-Α启动子和四个缺失构建体(Δ1-4)转染，并用CSA(10微克/毫升)&LPS(10微克/毫升)和CSA(10微克/毫升)、LPS(10微克/毫升)和叶酸(10微克/毫升)进行处理。测量TNF-Α荧光素酶报告基因活性。(P<0.05)，*与未处理组有显著不同，#与非叶酸组有显著不同

图6显示叶酸抑制CSA诱导的LITAF、P-P65和MYD88蛋白在口腔角质形成细胞中的表达。将口腔角质形成细胞接种在以密度为2.5X 104/平方厘米的60毫米平板中，并用LPS(10微克/毫升)、CSA(10微克/毫升)和FA(10微克/毫升)处理24小时，并测定LITAF、MYD88和P-P65蛋白水平。与未处理有显著不同，#与非叶酸组有显著不同。

图7显示叶酸抑制口腔角质形成细胞中CSA诱导的磷酸-P65活化。培养口腔角质形成细胞，并用单独或组合的CSA、LPS或FA处理并孵育24小时。拍摄免疫荧光图像以确定P-P65向细胞核的易位。细胞用鬼笔环肽(细胞骨架)和DAPI(细胞核)复染。P65为绿色，DAPI为蓝色，鬼笔环肽为红色。

图8显示了不同浓度叶酸对人口腔角质形成细胞中MYD88的抑制作用(A)和叶酸处理后不同时间点对口腔角质形成细胞中MYD88的抑制作用(B)。培养口腔角质形成细胞，并用不同浓度和不同时间点(B)的叶酸处理，浓度为10微克/毫升，并确定FA对MYD88的剂量依赖性影响(A)，并在24小时后进行蛋白质印迹分析评估。用蛋白质印迹评估叶酸处理后的MYD88动能下降(B)。

图9显示叶酸抑制口腔角质形成细胞中苯妥英诱导的TNF-Α。接种口腔角质形成细胞并用LPS(10微克/毫升)、PHE(10微克/毫升)和叶酸FA(10微克/毫升)处理24小时。通过ELISA测定分泌的TNF-Α的含量。(P<0.05)，*与未处理组有显著不同，#与非叶酸组有有显著不同。

图10显示MYD88的表达被叶酸处理降低。口腔角质形成细胞接种在60毫米的平板中。细胞用LPS(10微克/毫升)、PHE(10微克/毫升)和叶酸FA(10微克/毫升)处理24小时。MYD88蛋白的含量通过蛋白质印迹分析(A)确定。使用IMAGEJ软件对蛋白质条带进行定量分析(B)。

图11显示了LITAF表达在药物治疗后被叶酸降低。将口腔角质形成细胞接种在板中。细胞用LPS(10微克/毫升)、PHE(10微克/毫升)和叶酸FA(10微克/毫升)处理24小时。LITAF蛋白的量含通过蛋白质印迹分析(A)确定。使用IMAGEJ软件对蛋白质条带进行定量分析(B)。

图12显示了两种不同类型的LPS对LITAF表达的剂量依赖性作用和叶酸对LITAF表达的剂量依赖性作用。口腔角质形成细胞用不同血清型(026:B6和055:B5)和浓度(1微克/毫升和10微克/毫升)的LPS(A)和不同浓度的叶酸(2.5–40微克/毫升)处理24小时(C)，并通过蛋白质印迹分析测量LITAF蛋白的含量。使用IMAGEJ软件(B、D)对蛋白质条带进行定量分析。

图13显示叶酸降低NF-KB(P-P65)的磷酸化。将口腔角质形成细胞接种在板中。细胞用LPS(10微克/毫升)、PHE(10微克/毫升)和FA(10微克/毫升)处理24小时。磷酸-P65(P-P65)蛋白的含量通过蛋白质印迹分析(A)确定。使用IMAGEJ软件对蛋白质条带进行定量分析(B)。

图14显示了叶酸减少了P-P65的核易位。口腔角质形成细胞接种于24孔板中。细胞用LPS(10微克/毫升)、PHE(10微克/毫升)和叶酸FA(10微克/毫升)处理24小时。通过荧光显微镜，如绿色所示，确定磷酸-P65(P-P65)蛋白向细胞核的易位。细胞形态和细胞核位置分别由红色和蓝色显示的鬼笔环肽和DAPI染色确定。

图15显示CHIP-QPCR测定证明LITAF与TNF-Α促成因子结合。口腔角质形成细胞接种于24孔板中。将细胞经过LPS(10微克/毫升)、PHE(10微克/毫升)、LPS(10微克/毫升)和叶酸FA(10微克/毫升)处理24小时。并进行CHIP-QPCR测定以确定LITAF与人TNF-Α促成因子的结合。*P<0.05(治疗VS未治疗)，#P<0.05(有VS没有叶酸FA)。

图16显示叶酸处理不改变TLR2和TLR4表达。口腔角质形成细胞仅用LPS(10微克/毫升)处理24小时。FACS测定分析显示口腔角质形成细胞表面上TLR4受体的含量(A)。细胞用LPS(10微克/毫升)和PHE(10微克/毫升)处理24小时。FACS测定分析显示细胞表面上TLR2和TLR4受体的含量(B)。细胞用LPS(10微克/毫升)、PHE(10微克/毫升)和FA(5、10和10微克/毫升)处理24小时。FACS测定分析显示了口腔角质形成细胞(C)表面上TLR2和TLR4受体的含量。FACS分析显示经LPS、PHE和不同浓度叶酸处理后口腔角质形成细胞表面的TLR2和TLR4受体(D)。

图17显示叶酸处理通过抑制口腔角质形成细胞中的TNF-Α信号传导降低口腔成纤维细胞中的TGF-Β表达。培养人口腔成纤维细胞(HOF)，并用CSA、PHE、LPS、TGF-Β抑制剂(SB)、TNF-Α抑制剂、RHTNF-Α(TNF-Α蛋白)和从ORAL收集的条件培养基(CM)处理角质形成细胞。ELISA结果显示HOF细胞分泌的TGF-Β的含量。

图18显示叶酸通过TNF-Α激活的TGF-Β信号在人口腔成纤维细胞中降低胶原表达。将人口腔成纤维细胞(HOF)细胞接种在以密度为以2.5X 104/平方厘米的60毫米平板中，并用从含有LPS(10微克/毫升)、CSA(10微克/毫升)、CSA(10微克/毫升)、苯妥英(10微克/毫升)或叶酸(10微克/毫升)孵育并处理24小时。通过QPCR(A)确定I型胶原蛋白1(COL1A1)基因表达。HOF细胞用RTGF-Β、SB-431542(SB)、RTNF-Α或TNF-Α抑制剂(TNF-ΑINH)处理。定量实时PCR结果显示处理后HOF细胞中COL1A1的表达(B)。(P<0.05)，*与未处理组有显著不同，#与非叶酸、TGFΒ或TNF-α组有哦显著不同。

图19显示了(A)人口腔角质形成细胞和人口腔成纤维细胞之间的旁分泌信号传导的示意图，其负责分泌TNFA，TNFA刺激胶原蛋白产生，导致药物性牙龈过度生长DIGO。(B)说明了信号通路被叶酸处理而被阻止，并导致药物性牙龈过度生长DIGO。

图20显示了叶酸从聚合物微球中的持续释放。

图21显示了对于动物的药物性牙龈过度生长DIGO的引起原因和用叶酸预防或治疗的动物研究大纲。

图22显示了评估叶酸治疗疗效的体内DIGO模型。叶酸封装PLGA微球(左上)与甲基纤维素凝胶(左下)混合后应用于小鼠牙龈(右下)的扫描电镜图像。丝线缝合在门牙周围以促进斑块积聚并诱发炎症(右上图)。

图23显示了评估叶酸治疗疗效的体内DIGO模型。(A.)管理药物引起的牙龈过度生长的叶酸治疗方案。四个星期的雄性C57/B6小鼠接受结扎放置和环孢素(CSA)以诱导牙龈肿胀，顶部面板显示干预的时间过程，而下部面板显示放置和移除缝合线的临床图像。(B.)叶酸(FA)治疗组在药物性牙龈过度生长DIGO建立后1周开始，拆线并停止注射环孢素CSA。顶部面板显示干预的时间线，而下部面板显示放置和移除或缝合和放置叶酸FA凝胶的临床图像。

图24显示了治疗组牙龈肿胀的评估。牺牲后，使用立体显微镜对小鼠颌骨进行解剖和成像，并用数码相机对标本进行拍照。在这些研究中，小鼠被分为两组，两组均接受环孢素CSA和缝合1周，然后去除缝合线并停止注射环孢素CSA。然后一组每天接受叶酸应用(治疗组)，直到研究结束。

图25显示了预防组牙龈肿胀的评估。牺牲后，使用立体显微镜对小鼠下颌进行解剖和成像。用数码相机对标本的咬合面、颊面和舌面进行拍照。小鼠被分为三组，即未治疗组(对照)、疾病组(环孢素CSA和缝合线)和预防组(环孢素CSA、缝合线和叶酸)。

图26显示了在预防组和未处理的对照组(A)在一段时间内两组中C57BL/6小鼠牙龈的图像。对牙龈样品进行蛋白质印迹以评估参与药物性牙龈过度生长DIGO的信号通路(B)。

图27显示(A.)四个星期的雄性BALB/C小鼠在门牙之间具有缝合位置并且注射环孢菌素(CSA)单独或与叶酸(CSA&FA)组合以进行预防。数字图像是在一段时间内捕获的。(B.)在第8天，进行了数字3D平面测量以评估两组小鼠的牙龈肿大。

图28显示了预防组牙龈组织的评价。牺牲小鼠并从解剖的牙龈组织中分离总蛋白质。通过蛋白质印迹分析检查牙龈组织裂解物中LITAF、PHOSPHO-P65和MYD88的表达。将蛋白质印迹的条带强度标准化为Β-肌动蛋白并通过光密度测定法进行定量。*P<0.05

图29显示叶酸降低小鼠牙龈组织中TNF-Α的表达。使用ELISA评估小鼠牙龈组织裂解物的TNF-Α水平(N＝5，*P<0.05)。

图30显示了MYD88在DIGO中的验证作用。在野生型和MYD88-/-(基因敲除)小鼠的雄性和雌性小鼠中使其患上药物性牙龈过度生长DIGO，并捕获了它们的牙龈组织的图像。

图31显示与MYD88敲除小鼠相比，野生型小鼠具有更加显著的药物性牙龈过度生长DIGO的诱导性。用于评估切牙周围牙龈肿大的数字3D平面测量法(A)。两组牙龈肿大的量化(B)(N＝5*P<0.005)。

图32显示了两种性别的MYD88敲除小鼠的药物性牙龈过度生长DIGO减少。进行数字3D平面测量以评估两组小鼠的牙龈肿大(A)。对野生型和MYD88-/-(基因敲除)小鼠的牙龈增大做定量测量(B)。

图33显示了在两组小鼠的雌性牙龈组织中TNF-Α的含量为(N＝4/5*P<0.05)(A)。测定了两组小鼠雄性中的TNF-Α含量为(N＝3*P<0.05)(B)。

图34显示了TNF-Α和TGF-Β对人口腔成纤维细胞(HOF)细胞中胶原的诱导的影响的示意图。

图35显示了蛋白质印迹分析，其显示了叶酸对正常口腔角质形成细胞中MYD88(A)、LITAF(B)和NF-KB(C)下调的能力。

图36显示了用于叶酸治疗的控制释放***。叶酸封装在聚乳酸-COLYCOLIDE(PLG)微球中，使用扫描电子显微镜(SEM)(A)进行可视化。这些微球被嵌入甲基纤维素凝胶中以实现口腔应用并使用SEM(B)进行可视化。使用光谱学检查了长时间过程中叶酸的受控释放，并计算了累积释放(C)

图37显示了叶酸在管理DIGO中的作用。在一项初步研究中，小鼠被用于通过放置缝合线和环孢菌素(CSA)腹腔注射来开发DIGO的体内模型。为了检查叶酸(FA)作为治疗的功效，在饮用水中补充FA并每天使用FA凝胶。

图38显示了小鼠研究的临床图像。(A)四个星期的雄性BALB/C小鼠在门牙之间缝线，并单独注射了环孢菌素CSA或与叶酸(CSA+FA)结合注射，并在一段时间内捕获数字图像。(B)在第8天获取两组小鼠牙龈组织的高倍图像。

图39显示了在BALB/C小鼠的初步研究。在第一项研究中，动物在它们的门牙周围缝合并腹膜内注射环孢菌素CSA以诱导药物性牙龈过度生长DIGO。另一组同时用叶酸(FA)凝胶治疗以预防疾病。(A)显示了三只小鼠两组牙龈肿胀的立体显微镜图像。右图显示两组中一些小鼠的缝合线意外丢失，但继续注射环孢菌素CSA。(B)在第8天进行数字成像和3D体积重建以评估牙龈肿胀。(C)切除牙龈组织并染色以进行MYD88表达，虚线表示上皮基底膜。

图40显示了C57/B6小鼠中小鼠实验2的临床图像。(A)图像显示4周雄性小鼠的两个下中切牙周围牙龈中的缝合位置。(B)环孢菌CSA和环孢菌素CSA与叶酸FA组在一段时间内的临床图像。

图41显示了牙龈过度生长的3D形态计量分析。来自对照(灰色，无干预)、疾病(红色、缝合线和环孢菌CSA)和预防性治疗(蓝色、缝合线、环孢菌CSA和叶酸)的牙龈小鼠组织的数字图像。使用具有代表性的样本，以数字方式裁剪门牙并叠加图像以突出显示第14天在(A)对照和疾病、(B)对照和治疗、(C)疾病和治疗以及(D)所有的三个条件之间牙龈肿胀的变化。在疾病和治疗中进行3D体积分析，N＝5，统计显著性用*表示，其中P<0.005。

图42显示了牙龈组织的免疫染色分析。牺牲小鼠并处理牙龈组织进行免疫染色。在疾病和叶酸预防(A)和治疗(B)组中评估了介导牙龈过度生长的三个标志物，即MYD88、LITAF和NF-KB表达，并与对照(未处理)小鼠进行比较。

图43显示了分子标记的组织分析。牺牲后，常规处理小鼠牙龈组织进行免疫印迹，并检查MYD88(A)、LITAF(B)和磷酸P65(C)的表达。此处显示了来自三只小鼠的组织，用于标准化表达的条带的光密度定量如下所示。

图44显示了转基因小鼠的临床图像。缝合线被放置在雌性(A)和雄性小鼠(B)的门牙之间的牙龈中，同时每天注射环孢菌素CSA(I.P.)。在整个时间过程中用数码相机收集临床图像。

图45显示了通过3D形态测量法的牙龈组织分析。MYD88-/-(基因敲除)型小鼠接受缝合线放置和每日注射CSA持续2周，然后进行牺牲。使用3D数字形态测量法检查牙龈形态，并在雌性(A和B，N＝4/5)和雄性(C和D，N＝3)小鼠中重建和定量代表性体积。统计显著性表示为*，其中P<0.05。

图46显示了人类样品的组织学分析。***固定石蜡包埋切片用苏木精和伊红染色。对这些切片进行了显微评估，并证明了各个区域(A-F)的离散特征，可能代表了病因病理过程的范围。

图47显示牙龈组织的免疫染色分析。在IRB批准后，对DIGO患者的人牙龈组织进行MYD88表达的免疫染色，并使用光学显微镜和数码相机进行成像。

本披露的详细描述

尽管声称的主题内容将根据某些实施例进行描述，但其他实施例，包括不提供本文阐述的所有益处和特征的实施例，也在本公开的范围内。在不脱离本公开的范围的情况下，可以进行各种结构、逻辑和工艺步骤的改变。

本文公开了值的范围。该范围规定了下限值和上限值。除非另有说明，范围包括到最小值(下限值或上限值)的值的所有值以及所述范围的值之间的范围。

本文公开了适用于治疗DIGO的组合物(例如，包含多个封装叶酸的微球的凝胶)以及制备该组合物和使用该组合物的方法。还提供了装置(例如牙科装置，例如假牙)和使用该装置的方法。

如在本公开中使用的，单数形式包括复数参考，反之亦然，除非上下文另有明确规定。因此，例如，对“该方法”的引用包括本文所述类型的一种或多种方法和/或步骤。

如本文所用，术语“口腔”和“口腔”是指构成个体口腔和口咽的所有解剖结构，例如但不限于嘴唇、脸颊、舌头、舌骨、牙齿、牙龈、颌骨(下颌骨)、牙槽骨、唾液腺、扁桃体、腺样体、硬腭和软腭、悬雍垂、颞下颌关节、会厌以及所有***和上皮组织。

例如，本公开描述了体外药物性牙龈过度生长DIGO发病机制的检查，人类口腔成纤维细胞和角质形成细胞用环孢菌素(CSA)和脂多糖(LPS)处理以模拟疾病(图34)。两种处理都强烈诱导人口腔角质形成细胞中的MYD88表达(图35)。为了实现叶酸治疗，使用了含有聚乳酸乙醇酸(PLGA)和甲基纤维素凝胶的控释***(图36)。叶酸的释放动能随时间增加，并注意到一直持续到第21天。由于聚合物的整体劣化，第1天释放的叶酸含量约为400微克/毫升，第21天达到800微克/毫升。

在一方面，本公开提供包含聚合物凝胶的组合物，所述聚合物凝胶包含多个微球。多个微球中的单个微球封装叶酸。

各种不同的聚合物凝胶可以被使用。聚合物凝胶可由包含胶凝化合物的水溶液形成。可以使用各种胶凝化合物。胶凝化合物的实例包括但不限于甲基纤维素、壳聚糖、淀粉、聚乳酸乙醇酸等，以及它们的组合。在各种实例中，聚合物凝胶包含甲基纤维素(例如，5％甲基纤维素)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。水溶液可以是水或缓冲水溶液。

微球可以由(例如，包含)各种材料(例如，微球前体)形成。微球前体的非限制性实例包括聚乳酸乙醇酸、聚己内酯(PCL)、壳聚糖、淀粉、聚乳酸、藻酸盐等，以及它们的组合。在各种实例中，微球是聚乳酸乙醇酸微球、聚己内酯(PCL)微球、壳聚糖微球、淀粉微球、聚乳酸微球、聚(酯酰胺)微球、藻酸盐微球等，以及它们的组合。在各种实例中，微球是聚乳酸乙醇酸微球。微球具有生物相容性和生物可降解性。微球可能适用于在DIGO感染附近持续和控制释放叶酸。组合物中微球的浓度可为0.001至0.07毫克/微升，包括每0.01毫克/微升值及其之间的范围。在各种示例中，微球浓度约为0.06毫克/微升。微球可包含PVA。

多个微球中的单个微球封装叶酸。组合物中叶酸的浓度可为2.5至150微克/毫升，包括所有0.01微克/毫升值及其之间的范围(例如，2.5至40微克/毫升)。在各种示例中，叶酸的浓度为100微克/毫升。

在各种实例中，多个微球体中的单个微球体进一步包含(例如，封装)一种或多种药物、一种或多种肽、一种或多种生长因子、一种或多种核酸等，以及组合其中。一种或多种药物可以相同或不同(例如，结构相同或不同)。药物的非限制性实例包括抗生素、抗炎药(例如，NSAID、阿片样物质等及其组合)、抗体等及其组合

抗生素的实例包括但不限于青霉素类(例如，氟氯西林(氟氧苯唑青霉素，氟氯西林酸)、安莫西林+克拉维酸钾(安美汀，CLAMOXYM)、哌拉西林+他唑巴坦(達梭黴素))、头孢菌素类(例如，头孢氨苄(KEFLEX,IBILEX)、头孢唑啉(KEFZOL)、头孢曲松(罗氏芬)、大环内酯类(例如阿奇霉素(ZITHROMAX)、罗红霉素(RULIDE))、唑类(例如氟康唑(大扶康)、伏立康唑(威凡))和鸟嘌呤衍生物(例如，阿昔洛韦(ZOVIRAX)、伐昔洛韦(VALTREX))。

生长因子的非限制性因子包括PDGF,EGF,TGF-,TGF-KGF,FGF,IL-1,IGF-1,VEGF,SDF,BMPS,WNTS,IGF,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,LIF,IGF-2,MSP,MSF,TGF-Α,ANG,AM,GDF-8,NGF,SHH,NGF,PDGF,FGFR,TNF,等及其组合。

抗体的非限制性实例包括抗-BMP、抗-TGF-Β、抗-TNF-Α等，以及它们的组合。

在一方面，本公开提供了制备本公开的组合物的方法。

制备本公开的组合物的方法可包括(A)制造多个微球，其中单个微球封装叶酸；(B)将多个微球与包含胶凝化合物的水溶液混合。在各种实例中，胶凝化合物是甲基纤维素。

在各种示例中，制造多个微球包括双乳化溶剂蒸发方法。双乳化溶剂蒸发法可包括(A)将一定量的叶酸与微球先导溶液混合：(B)向微球先导溶液中加入聚醋酸乙烯酯(PVA)溶液；(C)混合微球先导和PVA溶液；(D)离心微球先导和PVA溶液，形成沉淀和上清液；(E)收集上清液；(F)浓缩(例如，冻干)上清液以形成固体，其中固体是多个微球。更具体地说，可以将溶解在分子级水中的100微升叶酸移入1毫升含5％PLG的乙酸乙酯中，并以50％的幅度超声1分钟。并添加包含1％聚乙酸乙烯酯(PVA)和7％乙酸乙酯的第二种乳化溶液然后涡旋15秒。最后将溶液加入到1％PVA溶液中，在室温下连续搅拌3小时，并通过0.2微米过滤器过滤，以2,000RPM的离心10分钟后收集，冷冻干燥16小时，并储存于-20℃

在一方面，本公开提供装置。装置可以包括假体和本公开的组合物。组合物可以布置在假体中和/或假体的表面上。

该装置可以是假牙(例如，3D打印的聚合物假牙)。假牙可能适合重建先前存在的假牙或用于新的假牙。假牙的例子包括但不限于夹板、护牙套、全口假牙、部分假牙、填充物等。该装置可由(例如，包含)聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、双-GMA、聚酯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、环氧树脂等或其组合制成。

在一方面，本公开提供制造本公开的装置的方法。

制造装置(例如，假牙，例如夹板、护齿器、全口义齿、部分义齿或填充物等)的方法可以包括：(A)获得扫描、模具或个人口腔模型，该装置将适合该装置；(B)使用聚合物(例如PMMA聚合物)制造与个人的口腔扫描、模具或模型相对应的装置；(C)产生本公开的组合物；(D)用该组合物涂覆装置。

在一个方面，本公开提供了一种用于治疗患有或怀疑患有药物性牙龈过度生长DIGO个体的方法。该方法可以包括利用本公开的设备。

治疗个体的方法可以包括向个体施用本公开的组合物足够的时间来治疗药物性牙龈过度生长DIGO。在各种实例中，组合物可直接施用于患处。

治疗个体的方法可以包括：(A)获得个体口腔的扫描、模具或模型，其中装置(例如，假牙，例如夹板、护齿器、全口义齿、部分义齿或填充物等)将适合；(B)使用聚合物(例如PMMA聚合物)制造与个人的扫描、模具或口腔模型相对应的装置；(C)产生本公开的组合物；(D)用组合物涂覆装置；(E)将完整的设备给予个人足够的时间来治疗DIGO；(F)可选地，监测个人对器械治疗的反应。

在各种实例中，聚合物选自聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)聚合物、双-GMA聚合物、聚酯聚合物、聚丙烯酸酯聚合物、聚乙烯聚合物、环氧聚合物等，以及它们的组合。

本文公开的各种实施例和实施例中描述的方法的步骤足以实施本发明。因此，在一个实施例中，该方法基本上由本文公开的方法的步骤的组合组成。在另一个实施例中，该方法由这样的步骤组成。

以下声明描述了本披露的各种示例。

声明1.一种组合物，其包含包含多个微球的聚合物凝胶，其中所述多个微球的各个微球封装叶酸。

声明2.根据声明1所述的组合物，其聚合物凝胶选自甲基纤维素凝胶、壳聚糖凝胶、聚乳酸乙醇酸凝胶及其组合。

声明3.根据声明2或声明2所述的组合物，其聚合物凝胶是甲基纤维素凝胶。

声明4.根据前述声明中任一项所述的组合物，其所述聚合物凝胶包含磷酸盐缓冲盐水和1-5％重量百分比的甲基纤维素，包括每0.1％的重量值及其之间的范围(例如，1、1.1、1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3,3.1,.3,3.3.3.2、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5)。

声明5.根据声明4所述的组合物，其甲基纤维素的浓度为3％(按体积量)。

声明6.根据前述声明中任一项所述的组合物，其所述多个微球选自聚乳酸乙醇酸微球、聚己内酯(PCL)微球、壳聚糖微球、淀粉微球、聚乳酸微球、聚(酯酰胺)微球，藻酸盐微球等，以及它们的组合。

声明7.根据前述声明中任一项的组合物，其所述微球是聚乳酸乙醇酸微球。

声明8.根据前述声明中任一项所述的组合物，其叶酸的浓度为2.5至150微克/毫升，包括每0.01微克/毫升值及其之间的范围(例如，2.5至40微克/毫升)。

声明9.根据前述声明中任一项的组合物，其叶酸的浓度为100微克/毫升。

声明10.根据前述声明中任一项所述的组合物，其微球的浓度为0.001至0.07毫克/微升，包括每0.001毫克/微升及其之间的范围。

声明11.根据前述声明中任一项所述的组合物，其微球的浓度为0.06毫克/微升。

声明12.根据前述陈述中任一项所述的组合物，其所述多个微球体进一步包含一种或多种药物、一种或多种肽、一种或多种生长因子、一种或多种核酸等，或其组合

声明13.根据声明12所述的组合物，其一种或多种药物选自抗生素、抗炎药、抗体及其组合。一种或多种药物可以相同或不同(例如，结构相同或不同)。药物的非限制性实例包括抗生素、抗炎药(例如，NSAID、***样物质等及其组合)、抗体等及其组合。抗生素的例子包括但不限于，青霉素类(例如，氟氯西林(氟氧苯唑青霉素，氟氯西林酸)、安莫西林+克拉维酸钾(安美汀，CLAMOXYM)、哌拉西林+他唑巴坦(達梭黴素))、头孢菌素类(例如，头孢氨苄(KEFLEX IBILEX)、头孢唑啉(KEFZOL)、头孢曲松(罗氏芬)、大环内酯类(例如阿奇霉素(ZITHROMAX)、罗红霉素(RULIDE))、唑类(例如氟康唑(大扶康)、伏立康唑(威凡))和鸟嘌呤类似物(例如，阿昔洛韦(ZOVIRAX)、伐昔洛韦(VALTREX))。生长因子的非限制性因子包括PDGF,EGF,TGF-,TGF-，KGF,FGF,IL-1,IGF-1,VEGF,SDF,BMPS,WNTS,IGF,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,LIF,IGF-2,MSP,MSF,TGF-Α,ANG,AM,GDF-8,NGF,SHH,NGF,PDGF,FGFR,TNF,等及其组合。

声明14.一种根据上述任何一种声明制作合成物的方法包括：(A)制造多个微球体，其中所述单个微球体封装叶酸；(B)将多个微球与包含胶凝化合物的水溶液混合，其中形成根据前述陈述中任一项的组合物。

声明15.根据声明14所述的方法，其胶凝化合物选自甲基纤维素、壳聚糖、淀粉、聚乳酸乙醇酸等，以及它们的组合。

声明16.根据声明14和声明15所述的方法，其胶凝化合物是甲基纤维素。

声明17.根据声明14-16中任一项所述的方法，其所述制造包括双乳化液溶剂蒸发方法。

声明18.根据声明17所述的方法，其双乳化液溶剂蒸发方法包括(A)将一定量的叶酸与微球前体溶液混合：(B)将聚乙酸乙烯酯(PVA)溶液加入到微球中前导溶液；(C)混合微球前体和PVA溶液；(D)离心微球前体和PVA溶液，形成沉淀和上清液；(E)收集上清液；(F)浓缩上清液以形成固体，其中固体是多个微球。

声明19.根据声明18所述的方法，其所述双乳化液溶剂蒸发方法还包括过滤。

声明20.根据声明18或声明19所述的方法，其浓缩是冻干。

声明21.一种装置，包括：(A)假体；(B)根据声明1-13中任一项所述的组合物，其该组合物布置在假体中和/或假体的表面上。

声明22.根据声明21所述的装置，其假体选自夹板、护齿套、全口义齿、部分义齿和填充物。

声明23.根据声明21或声明22所述的装置，其聚合物凝胶是甲基纤维素凝胶。

声明24.根据声明21-23中任一项所述的装置，其所述多个微球是聚乳酸乙醇酸微球。

声明25.根据声明21-24中任一项所述的装置，其所述多个微球体还包含一种或多种药物、一种或多种肽、一种或多种生长因子、一种或多种核酸等，或其组合。

声明26.根据声明21-25中任一项所述的装置，其假体包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、BIS-GMA、聚酯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、环氧树脂或它们的组合。

声明27.根据声明21-26中任一项所述的设备，其中该设备是3D打印的。

声明28.一种制造装置的方法包括：(A)获得适合装置的个人口腔的扫描件、模具或模型；(B)用聚合物制造与个人扫描、模具或口腔模型相对应的装置；(C)根据声明1-13中的任何一项生成组合；(D)用该组合物涂覆装置。

声明29.根据声明28所述的方法，其该装置是假牙。

声明30.根据声明29所述的方法，其假牙选自夹板、护齿套、全口义齿、部分义齿和填充物。

声明31.根据声明28-30中任一项所述的方法，其聚合物选自聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)聚合物、BIS-GMA聚合物、聚酯聚合物、聚丙烯酸酯聚合物、聚乙烯聚合物、环氧聚合物及其组合。

声明32.根据声明28-31中任一项所述的方法，其聚合物凝胶是甲基纤维素凝胶。

声明33.根据声明28-32中任一项所述的方法，其所述多个微球体是聚乳酸乙醇酸微球体。

声明34.根据声明28-32中任一项所述的方法，其所述多个微球还包含一种或多种药物、一种或多种肽、一种或多种生长因子、一种或多种核酸等，或其组合。

声明35.一种治疗患有或怀疑患有药物性牙龈过度生长(DIGO)个体的方法包括：(B)用聚合物制造与个人扫描、模具或口腔模型相对应的装置；(C)根据声明1-13中的任何一项生成组合；(D)用组合物涂覆装置；(E)将完整的设备给予个人足够的时间来治疗药物性牙龈过度生长DIGO；(F)可选地，监测个人对器械治疗的反应。

声明36.根据声明35所述的方法，其该装置是假牙。

声明37.根据声明36所述的方法，其假牙选自夹板、护齿套、全口义齿、部分义齿和填充物。

声明38.根据声明35-37所述的方法，其聚合物选自聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)聚合物、BIS-GMA聚合物、聚酯聚合物、聚丙烯酸酯聚合物、聚乙烯聚合物、环氧聚合物等，以及它们的组合。

声明39.根据声明35-38中任一项所述的的方法，其聚合物凝胶是甲基纤维素凝胶。

声明40.根据声明35-39中任一项所述的方法，其所述多个微球体是聚乳酸乙醇酸微球体。

陈述41.根据陈述35-40中任一项所述的方法，其所述多个微球还包含一种或多种药物、一种或多种肽、一种或多种生长因子、一种或多种核酸等，或其组合。

声明42.一种治疗患有或怀疑患有药物性牙龈过度生长(DIGO)的个体的方法包括对该个体施用根据声明1-13中任一项所述的组合物，以及给予足够长的时间来治疗药物性牙龈过度生长DIGO。

声明43.根据声明42所述的方法，其聚合物凝胶是甲基纤维素凝胶。

声明44.根据声明42或声明43所述的方法，其所述多个微球是聚乳酸乙醇酸微球。

声明45.根据声明42-44中任一项所述的方法，其中所述多个微球还包含一种或多种药物、一种或多种肽、一种或多种生长因子、一种或多种核酸等，或其组合。

以下提供实施例以说明本披露。它们在任何情况下均不被限制。

示例1

本实施例提供了对本公开方法和材料的描述。

细胞培养。正常人口腔角质形成细胞(NOKSI)和成纤维细胞(HOF)维持在DULBECCO的最小培养基EAGLE(SIGMA-ALDRICH,ST.LOUIS,MO,USA)中，并添加10％胎牛血清(ATLASBI-OLOGICALS,FORT COLLINS,CO,USA)和100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素(LIFETECHNOLOGIES,CARLSBAD,CA,USA)。细胞在37℃的培养箱中在5％CO2的加湿室中生长。

细胞培养中的药物治疗。细胞被单独或用脂多糖、环孢菌素、苯妥英和叶酸的不同组合进行处理。它们均购自SIGMA-ALDRICH(ST.LOUIS,MO,USA)。它们的使用范围为0微克/毫升至40微克/毫升，最佳浓度为10微克/毫升。

蛋白质印迹分析。将细胞以每板5X105个细胞的密度接种在60毫米平板中，并用DULBECCO磷酸盐缓冲盐水(GIBCO，WALTHAM，MA，USA)短暂洗涤。使用含有蛋白酶抑制剂混合物(SIGMA-ALDRICH)的RIPA裂解缓冲液制备全细胞裂解物。使用BCA试剂(PIERCE,WALTHAM,MA,USA)测定总蛋白质浓度。20微克总蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离并转移到聚偏二氟乙烯膜上并进行免疫印迹。将印迹在1％牛血清白蛋白(BSA)(SIGMA-ALDRICH)中温育1小时以阻断非特异性结合，然后在一抗(来自CELL SIGNALINGTECHNOLOGY的MYD88和PP65，以及人LITAF THERMOFISHER)中孵育过夜SIGMA)在4℃下在振荡器上。第二天，将印迹在含有1％TWEEN20(TBST)的TRIS缓冲盐水中洗涤3次(每次10分钟)，然后与二抗(山羊抗兔IGG HRP)以1:10,000稀释度温育1小时。洗涤后，使用凝胶成像分析***(BIORAD)使条带可视化。使用软件IMAGEJ(NIH,USA)量化条带强度，并通过Β-肌动蛋白(CELL SIGNALING)将相对蛋白质水平标准化。为了对动物组织样品进行蛋白质印迹，从BABLB/C和C57BL/6小鼠研究中收集牙龈组织。软组织与下颌骨分离，然后被压碎。进行布拉德福德测定以测量每个样品的蛋白质浓度。静置后，将20微克全组织蛋白裂解物将用于蛋白质印迹分析。

酶联免疫吸附测定(ELISA)。使用小鼠TNF-Α酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒(PEPROTECH，美国)和TGF-ΒEMAX免疫分析***(PROMEGA美国)进行酶联免疫吸附测定ELISA，分别检测TNF-Α和TGF-Β。将总细胞或组织蛋白裂解物归一化后，每个样品中的20微克蛋白用于检测TNF-Α或TGF-Β。并根据制造商的说明进行酶联免疫吸附测定ELISA。对于TNF-Α，在96孔测定板的每孔中加入比例为100纳克/100微升的捕获的抗体，并在室温下孵育过夜。每孔加入200微升封闭缓冲液，室温孵育1小时。加入20微克的每种蛋白质样品以及TNF-Α标准品(从2纳克/毫升到0纳克/毫升)并将测定板温育2小时。同时每孔加入50纳克/100微升检测抗体，温育2小时。加入以1:2000稀释的亲和素-HRP偶联抗体，持续30分钟。随后每孔加入100微升ABTS溶液并温育直至颜色发生变化。其光吸收值在405和450NM处读取并通过校正为650NM。为了检测TGF-Β，ELISA测定板被TGF-Β单克隆抗体所包被，并在4℃下温育过夜。随后加入TGFΒ1X缓冲液并以在37℃，35分钟而不摇动的操作下以阻止非特异性结合。接着加入全蛋白裂解物或TGF-Β的标准品(0–1,000皮克/毫升)，然后加入抗TGFΒ1多克隆抗体，分别温育1小时和2小时。样品会与TGF-ΒHRP偶联物在室温下孵育2小时。加入TMB ONE溶液15分钟后，使用100微升的1N盐酸以终止反应，并在读板器上记录450NM处的吸光度。数据将采用EXCEL软件进行分析。在每个步骤中，样品用PBST或洗涤缓冲液洗涤四次，每孔使用200微升。

免疫染色和荧光显微。培养的细胞用4％多聚甲醛固定，然后用含有0.1％TRITONX-100(PBS-T)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)透化，并用含有5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS-T阻止。然后，将细胞与抗PP65抗体(CELL SIGNALING，美国)一起孵育，然后与ALEXA FLUOR 488的偶联GOAT ANTI-RABBIT二级抗体(INVITROGEN，GRAND ISLAND)一起孵育。添加罗丹明鬼笔环肽(INVITROGEN)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(VECTOR LABS,BURLINGAME)以分别显示肌动蛋白和细胞核。使用ZOE显微镜(BIORAD，美国)安装和检查样品。使用IMAGEJ(NIH)软件进行图像分析。

流式细胞术。NOKSI细胞以每板1X 106个细胞的密度接种在100毫米平板中。用药物、LPS和叶酸单独或组合处理细胞。在使用CORNING CELL LIFTER(CORNING)和PBS中的10毫摩尔/升EDTA分离NOKSI后，用FACS缓冲液(含有1％BSA[SIGMA]和2毫摩尔/升EDTA的PBS)洗涤细胞。细胞通过免疫荧光染色剂CD282(TLR2)和CD284(TLR4)染色。加入在染色缓冲液中以1:1000稀释的荧光标记抗体，其中含有2％FBS的PBS，并在黑暗中冰上孵育30分钟。随后将细胞离心并在染色缓冲液中洗涤三次，并在数据采集前通过70ΜM细胞过滤器。使用FLOWJO(TREESTAR,ASHLAND,OR,USA)进行数据分析。所有孵育均在冰上进行。

报告基因测定。TNF-Α启动因子缺失构建体Δ-1220(-1220至+65)和Δ-450(-450至+65)由SWITCHGEAR GENOMICS(美国)合成，用于荧光素酶报告基因检测。使用FUGENE试剂(SWITCHGEAR GENOMICS，美国)将人TNF-Α启动因子构建体或空PLIGHTSWITCH启动子报告载体作为对照转染到NOKSI中。细胞接种密度为5X 103每孔96孔板。GOCLONE报告中基因构建体和转染试剂以最佳组合混合并孵育30分钟。将培养基更换为接种的细胞并将反应混合物轻轻滴加到接种的细胞上，轻轻摇动平板并孵育接下来的24小时。将LIGHTSWITCH检测试剂添加到转染的平板中并在室温下孵育30分钟。用光度计(WALLAC VECTOR3；PERKINELMER，BOSTON，MA)测量荧光素酶活性。

染色质免疫沉淀(CHIP)测定。CHIP分析使用SIMPLECHIP PLUS ENZYMATICCHROMATIN IP试剂盒(编号9005；CELL SIGNALING TECHNOLOGIES)进行。NOKSI会将以每100毫米板1X 106个细胞的密度进行培养。细胞通过24小时的药物、LPS和叶酸单独或组合处理后。细胞与1％甲醛交联，并在室温下使用0.125M甘氨酸淬灭反应10分钟。在冷条件下，碎片染色质用核酸酶处理并进行超声处理。染色质免疫沉淀用兔抗LITAF抗体(THERMOFISHER，美国)、兔抗组蛋白H3(阳性对照；1:50)(细胞信号，美国)和正常RABBIT IGG(阴性对照)(细胞信号，美国)。反向交联后，用DNA纯化试剂盒(QUAGEN)提取和纯化DNA片段。使用SYBRGREEN(APPLIED BIOSYSTEMS)通过实时定量PCR对免疫沉淀的DNA进行定量。图中显示了TNF-Α启动子中LITAF结合位点的引物序列。使用比较CT方法根据IGG对照的阈值循环(CT)值计算富集倍数。

微球制造。使用双乳化液溶剂蒸发法将叶酸封装在聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微球中(8515DLG7E，LAKESHORE BIOMATERIALS，BIRMINGHAM，AL，USA)。简而言之，将溶解在分子级水中的100微升蛋白质移入1毫升含5％PLG的乙酸乙酯(SIGMA-ALDRICH CORP.,ST.LOUIS,MO,USA)中并进行超声处理(SONICS AND MATERIALS INC.，美国康涅狄格州纽敦)，震级为50％，持续1分钟。然后加入由1％聚乙酸乙烯酯(PVA)(SIGMA-ALDRICH)和7％乙酸乙酯组成的第二种乳化液并涡旋15秒。然后将溶液加入1％PVA溶液，在室温下连续搅拌3小时，并通过0.2微米过滤器(NALGENE，THERMOFISHER SCIENTIFIC，ROCKVILLE，MD，USA)过滤，以2,000RPM离心10分钟收集(EPPENDORF，HAMBURG，GERMANY)，冷冻干燥16小时(LABCONCO，KANSAS CITY，MO，USA)，并在-20OC下储存。用这种技术制造的微球在2到200微米之间。

扫描电子显微镜。对于扫描电子显微镜(SEM)分析，将微球附着在胶带表面以保持牢固。样品使用离子溅射“AU-PB”靶溅射镀金120秒，并使用扫描电子显微镜(HITACHI，S-4700，日本)在15KV的加速电压下进行检查。

凝胶制备和叶酸释放研究。叶酸(100微克/毫升)(SIGMA-ALDRICH,ST LOIS,MO)如上所述被封装在PLG微球中。将所得冻干粉配制成含有20毫克叶酸微球和5％甲基纤维素(SIGMA-ALDRICH,ST LOUIS,MO)的口服凝胶，溶于330微升磷酸盐缓冲盐水。在应用前每天新鲜制备凝胶并重复直到研究期结束(14天)。

动物研究。结扎诱导的炎症模型先前已有描述。然而，传统的小鼠体内牙龈过度生长模型利用磨牙结扎在技术上是艰巨的，并且难以标准化。因此，我们开发了一种新的体内前结扎模型来开发DIGO。我们检查了两种小鼠品系，并使用了BALB/C和C57BL/6。在使用***和甲苯噻嗪的麻醉条件下，将无菌结扎线(5-0丝线)置于小鼠两侧下中切牙周围14天。每天检查小鼠的缝合线位置。每天腹膜内注射环孢菌素50毫克/千克/体重或赋形剂直至第14天。用于溶解药物的赋形剂是10％乙醇和10％聚乙二醇蓖麻油(SIGMA-ALDRICH,ST.LOISMO)在无菌蒸馏水中体积100％。在第14天对所有小鼠使用二氧化碳进行安乐死，然后进行颈椎脱位。

BALB/C小鼠的研究由五组组成，即；阴性对照(无疾病)、疾病组(结扎和环孢菌素)、预防治疗组：(结扎、环孢菌素和叶酸(口服和局部)。

在联合防治组中，提供叶酸治疗的两种模式，包括口服和局部凝胶应用。在环孢素IP注射开始时，同时在第0天起将叶酸凝胶制剂涂在下颌切牙周围的结扎表面上。

使用C57BL/6，在上述麻醉条件下对33只雄性小鼠进行了14天的DIGO诱导。C57BL/6的研究分为5组，分别为:

1–对照组/控制组

2-疾病：结扎+环孢素(口服)。

3-预防：结扎+环孢素与叶酸(口服)。

4-积极治疗：结扎+环孢素与叶酸(局部)。

5-预防和治疗：连接+环孢素与叶酸(口服和局部)。

预防组从结扎开始到研究结束(14天)，在饮用水中加入叶酸(10微克/毫升)。积极治疗组从注射环孢素开始的第0天开始，在下颌切牙周围的结扎表面涂抹叶酸凝胶制剂。预防和治疗组提供口服和局部涂胶两种叶酸处理方式。

MYD88基因敲除小鼠。此外，野生型和MYD88基因敲除小鼠被用于证实我们的DIGO研究。在这项研究中，雄性和雌性均来自野生型和基因敲除型小鼠。用无菌结扎(5-0丝线)缠绕野生型型(公3母7)和MYD88基因敲除型(公14母11)小鼠下中切牙，连续14天。本研究共分为三组，分别为:

1-阴性对照组/阴性控制组

2-疾病(野生型)：结扎+环孢素(口服)。

3-疾病(MYD88基因敲除)：结扎+环孢素(口服)。

宏观分析。解剖下颌骨并用立体显微镜获取牙龈咬合面、颊面和舌面图像。然后将下颌骨分成两半，进行蛋白质印迹法和免疫组织化学评价。

三维数字成像。用口腔内三维扫描仪(TRIOS；3形状；哥本哈根；丹麦)对下颌骨进行数字化。数字化的铸件被送往计算机辅助设计和计算机辅助制造(CAD-CAM)软件。将图像传输到标准镶嵌语言(STL)文件中并进行定量分析。利用IMAGEJ软件从三维图像中提取组织的表面积和体积。

组织病理学和免疫组织化学。小鼠下颌骨在4℃、45RPM的摇床上用10％甲醛固定过夜，然后用70％乙醇替代。用10％乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙1周，分级乙醇脱水，二甲苯清除，石蜡包埋。以颊-腭方向切4微米连续切片，用苏木精-伊红(HE)染色，在光镜下观察并进行组织形态学评价，和使用IMAGE J软件进行定量分析。

对于免疫组织化学，未染色切片在二甲苯中脱脂(脱皮/脱蜡DEPARAFFINIZED)10分钟，然后转移到乙醇中20分钟。抗原提取采用10毫摩尔/升柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)在微波炉中以最高功率10煮沸3分钟。切片在室温下冷却，用TBST洗涤2次，每次5分钟。切片再用2％的过氧化氢在PBS中处理10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，然后用TBST清洗。PBS中二级抗体物种血清(VECTASTAIN UNIVERSAL ABC-AP KIT(PK-6200))用于阻断背景染色1小时。然后，在4℃下用原样抗体对选定的分子标记物(如MYD88、LITAF和P65)进行过夜/通宵孵育。单个抗体MYD88、LITAF和PP65的最佳浓度变化较大，分别为20微克/毫升、5微克/毫升和1微克/毫升。随后进行生物素化(1微克/毫升)二抗/二级抗体30分钟，使用TBST洗2次，每次5分钟。加入亲和素-生物素溶液孵育30MIN，并重复洗涤步骤。样品在IMMPACT DAB EQV(显色原和过氧化物酶)中作为显色底物孵育，进行反染色并安装进行组织学检查。

人体组织样本。这些样本被去识别化，临床组织切片从印度贝尔高姆的KLE VK牙科科学研究所的口腔和颌面病理学部门的学术机构档案中获取。然而，这些病例都有已知的病史，因为服用处方药物而导致牙龈过度生长。这些患者临床表现为DIGO，并进行组织病理学检查。对因药物治疗导致牙龈过度生长的患者组织进行组织学切片去识别化并存档。切片用苏木精伊红、MASON三色、PICROSIRIUS RED等常规组织学染色，研究组织结构。免疫染色方法同上(与上述方法相同)。

统计分析。数据以重复实验的平均值和标准差表示。采用STUDENT’S T检验进行统计学分析。当P值<0.05时，认为组间差异显著。

示例2

本示例提供了对本专利的制作方法和使用本专利组合物的描述。

动物研究。先前的DIGO小鼠模型涉及放置在臼齿周围的结扎，在技术上是艰巨的，很难标准化。因此，本项目试图通过在下颌前区放置缝线来建立一种新的前结扎模型。需要强调的是，该模型更适合于主要影响前牙龈的人类临床疾病表现。从美国威明顿市CHARLESRIVER实验室采集两种4周龄雄性小鼠，即BALB/C和C57BL/6J。从C57BL/10XM种类的转基因动物，即MYD88基因敲除小鼠，最初是从ME，BAR HARBOR的JACKSON实验室获得，而布法罗大学口腔生物学博士JILL KRAMER为本研究提供了这些动物，并扩展这领。所有动物手术均由布法罗大学动物护理和使用委员会批准。

研究设计。进行了三项动物研究，分别在下面进行描述。

小鼠研究1:建立DIGO疾病模型的初步研究。无菌缝合线(5-0丝线，羊肠线，强生&强生，萨默维尔市，NJ)被放置在BALB/C(雄性)小鼠麻醉条件的两侧下中央切口周围，使用0.1毫升注射器和25号针在腹腔内使用***麻醉条件(90-100毫克/公斤体重)和甲苯噻嗪(5-10毫克/公斤体重)(图37)。每天检查小鼠的缝合线位置，并在必要时更换。每天腹腔注射环孢素(50毫克/千克/体重)或对照剂，直至第28天。对照组被注射了用于溶解药物的载体，即在蒸馏水中加入10％乙醇和10％聚乙二醇蓖麻油(均为SIGMA-ALDRICH,ST.LOISMO)。在预防性治疗方面，每天在饮用水中随意/无限制(AD LIBITUM)添加叶酸(10微克/毫升)，在前龈上涂抹含有叶酸(100微克/毫升)微球的甲基纤维素凝胶。本研究分为三组:

1.对照组(N＝1)：未执行任何干预。

2.疾病组(N＝4)：放置缝线、注射环孢素(腹腔注射)。

3.预防组(N＝4)：放置缝线、注射环孢素、叶酸(口服、局部)。

治疗持续28天，并在时间过程中拍摄数字图像。

小鼠研究2：DIGO的预防和积极治疗验证研究。继DIGO小鼠模型在14天内成功建立并显示出突出表型后，进行了第二次小鼠研究，以检查叶酸的预防和积极治疗。对于积极治疗组，让DIGO(缝线放置和环孢素注射)进展1周，然后在两组小鼠的剩余研究中拆除缝线并停止环孢素注射(图23)。其中一组小鼠作为疾病对照组(图23A)，另一组小鼠使用叶酸(凝胶和饮用水)(图23B)。在预防和治疗组中，从缝合时开始直到研究结束(14天)，饮用水中加入叶酸(10微克/毫升)(SIGMA-ALDRICH,ST.LOIS MO)。此外，重复每天使用凝胶，直到研究结束(14天)。本研究分为四组：

1.对照组(N＝1)：未执行任何干预。

2.疾病组(N＝4)：放置缝线、注射环孢素(腹腔注射)。

3.预防组(N＝4)：放置缝线、注射环孢素、叶酸(口服.、局部)。

4.治疗对照组(疾病)(N＝3):仅放置缝线、注射环孢霉素1周。

5.治疗组(N＝3):仅置缝线、注射环孢霉素1周，叶酸(口服.、局部)。

小鼠研究3：验证MYD88在DIGO中的作用的转基因小鼠研究。在最后的研究中，我们使用了野生型和MYD88基因敲除小鼠来证实MYD88介导DIGO的作用，如上文所述。简单地说，无菌缝合线(5-0丝线，羊肠线，强生&强生，萨默维尔市，NJ)被放置在BALB/C(雄性和雌性)小鼠麻醉条件的两侧下中央切口周围，使用0.1毫升注射器和25号针在腹腔内使用***麻醉条件(90-100毫克/公斤体重)和甲苯噻嗪(5-10毫克/公斤体重)。本研究中的三组小鼠分别是:每天检查小鼠的缝合线位置，并在必要时更换。每天腹腔注射环孢素(50毫克/千克/体重)或对照剂，直至第14天。本研究分为三组:

1.对照组(N＝3)。

2.疾病组(野生型，N＝10，公3母6)：放置缝线、注射环孢素(腹腔注射)。

3.疾病组(MYD88，N＝10，公3母6)：放置缝线、注射环孢素(腹腔注射)。

牺牲和强制解剖。在研究结束时，动物被二氧化碳窒息和颈椎错位所牺牲。对下颌骨进行解剖和处理，以便进行成像或分子分析。

数码照片。解剖的下颌骨使用数码相机(IPHONE 6S PLUS,1200万像素，光学图像稳定)拍照。

带立体显微镜的二维平面测量图。为了进一步评估样本，使用立体显微镜(尼康SMZ1000)对解剖的下颌骨进行数字图像采集，通过2D平面测量评估牙龈过度生长。

三维数字成像与体积分析。使用3SHAPE

口腔内数字扫描仪扫描所有解剖组织，并从每次扫描创建一个3D STL(STEREOLITHOGRAPHY)文件。AUTODESK

(AUTODESK 23INC.，CA，USA)用于将每个单独的扫描叠加在另一个上，使每个不同的小鼠研究分开。下颌切牙、牙间***和臼齿的解剖标志被用来确保扫描的准确覆盖。然后使用AUTODESK

从每次数字扫描中选择性地去除下颌切牙。扫描结果全部保存并导入AUTODESK

(AUTODESK INC.，CA，USA)，其中平面切割用于同时裁剪所有扫描结果，只包括表明生长增加或减少的牙龈组织的重要部分。裁剪后的扫描被保存并导入到开源软件平台3DSLICER 4.8中，使用“VOLUMES”模块对其进行体积分析。在GRAPHPAD

(GRAPHPAD SOFTWARE INC.，CA，USA)中对量化的体积值进行统计分析。

人类研究议定书。机构审查委员会(IRB)通过在线门户网站CLICK向布法罗大学提交了一份建议，以使用DIGO寻找人类临床样本。去识别的样本是从印度牙科学校的学术机构档案中获取的，包括KLE VK牙科科学研究所的口腔和颌面病理学部门和印度贝尔高姆马拉地曼达尔牙科科学研究所。所有病例均被诊断为DIGO，并有服用处方药的病史。这些患者临床表现为DIGO，并进行了组织病理学检查以确定诊断。

组织病理学和免疫组织化学。小鼠下颌骨在4℃、45RPM的摇床上用10％甲醛固定过夜，然后用70％乙醇替代。用10％乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙1周，分级乙醇脱水，二甲苯清除，石蜡包埋。以颊-腭方向切4微米连续切片，用苏木精-伊红(HE)染色，在光镜下观察并进行组织形态学评价，和使用IMAGE J软件进行定量分析。

对于免疫组织化学，未染色切片在二甲苯中脱脂(脱皮/脱蜡DEPARAFFINIZED)10分钟，然后转移到乙醇中20分钟。抗原提取采用10毫摩尔/升柠毫摩尔/升檬酸盐缓冲液(PH6.0)在微波炉中以最高功率10煮沸3分钟。切片在室温下冷却，用TBST洗涤2次，每次5分钟。切片再用2％的过氧化氢在PBS中处理10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，然后用TBST清洗。PBS中二级抗体物种血清(VECTASTAIN UNIVERSAL ABC-AP KIT(PK-6200))用于阻断背景染色1小时。然后，在4℃下用原样抗体对选定的分子标记物(如MYD88、LITAF和P65)进行过夜/通宵孵育。单个抗体MYD88、LITAF和PP65的最佳浓度变化较大，分别为20微克/毫升、5微克/毫升和1微克/毫升。随后进行生物素化(1微克/毫升)二抗/二级抗体30分钟，使用TBST洗2次，每次5分钟。加入亲和素-生物素溶液孵育30MIN，并重复洗涤步骤。样品在IMMPACT DAB EQV(显色原和过氧化物酶)中作为显色底物孵育，进行反染色并安装进行组织学检查。

蛋白质印迹法。收集第1组和第2组小鼠的牙龈组织。软组织从下颌骨分离，然后压碎。采用BRAD-FORD法测定每个样品的蛋白浓度。标准化后，将20微克全组织蛋白裂解液与LDS蛋白质印迹法样品缓冲液(4X)混合，并在100℃煮沸10分钟。蛋白质印迹法检测MYD-88、LITAF和NFKB。样品经SDS聚丙烯酰胺凝胶后转移到PVDF膜上。在阻隔缓冲区(TBST中1％BSA)中通过轻柔摇晃进行60分钟的孵化后，在阻断缓冲液中，用以下最优稀释的一种抗体孵育膜过夜：兔子抗鼠MYD88的稀释量为1/50，兔子抗鼠LITAF的稀释量为1/200，兔子抗鼠NFKB的的稀释量为1/100。用TBST(1％TWEEN 20,PBS)洗涤3次，每次5分钟，然后将膜放入1至5000稀释的HRP标记的二级抗体中孵育1小时。样品用TBST共3次，每次5分钟。以抗Β-ACTIN HRP标记的小鼠单克隆IGG1抗体(CELL SIGNALING,USA)作为负载对照。用IMAGEJ软件(NIH,USA)测量条带强度，用Β-ACTIN标准化相对蛋白水平。

小鼠研究1:建立DIGO疾病模型的初步研究。该初步研究在BALB/C小鼠中进行，发现环孢霉素(疾病)组的牙龈过度生长在第6天增加，在研究过程中到28天更为显著(图38A)。这些过度生长表现为不同区域的红斑、炎症和溃疡。相比之下，叶酸组在第8天出现明显的肿胀和炎症减少(图38B)。临床图像显示，在整个研究过程中，FA组的DIGO明显降低(图38B)。这项研究的一个主要结果是，小鼠体内的DIGO在14天内就能明显显现出来，因此未来的研究可以在较短的时间内进行。

带立体显微镜的二维平面测量图。为了进一步评估样本，使用立体显微镜(尼康SMZ1000)对解剖的下颌骨拍照，以评估疾病和治疗组样本的牙龈过度生长。评估后，我们观察到，与预防组相比，疾病组的3只小鼠样本出现了更多的牙龈过度生长。此外，与第1和第3只小鼠相比，疾病组第2只小鼠的DIGO表现最为突出(图39A)。

牙龈过度生长的三维体积分析。由于下颌骨的解剖特征和曲率，无法使用IMAGE J在立体显微镜图像中计算牙龈过度生长。因此，我们使用3SHAPE

口内数字扫描仪扫描解剖的下颌骨。在对下颌骨进行扫描后，我们从每次扫描中创建了一个3D STL(STEREOLITHOGRAPHY)文件，并将每个单独的扫描叠加在一起，使每个不同的小鼠研究分别进行。从疾病组样本和预防组样本的叠加可以推断，疾病组样本的体积明显高于预防组样本(图39B)。这一发现表明，与疾病组相比，叶酸治疗可减少牙龈过度生长。

免疫组织化学分析。为了证实MYD88在DIGO中的作用，我们用MYD88和LITAF抗体检测组织病理切片，检测抗原并揭示其在病理组织中的分布。数码图像采用尼康ECLIPSETE2000-U显微镜，配备尼康DS-FI1彩色相机(2560×1920像素)和SPOT ADVANCED软件(4.0.4.版本)。然后，我们检查了BALB/C小鼠模型的组织病理学图像，并评估了MYD88在疾病组与阴性对照组和叶酸治疗组的表达。我们观察到疾病组上皮细胞中MYD88的表达明显高于预防组和对照组。(图39)。

小鼠研究2：DIGO的预防和积极治疗验证研究。在C57B/J6小鼠上进行的第二项小鼠研究旨在验证叶酸治疗的有效性，并检查治疗策略。疾病组第8天出现明显的DIGO，扩大牙龈出现明显的红斑和溃疡(图40A)。小鼠品系(BALB/C与C57B/6J)的差异似乎没有造成重大差异。临床图像显示，叶酸预防性治疗显著减少了牙龈过度生长(图40B)。在积极治疗组中，牙龈过度生长似乎在移除缝线和停止注射环孢霉素后有所减少，但过度生长持续到研究结束(第14天)。叶酸治疗在这组被注意到是有效的，以及有效地减少牙龈过度生长。

带立体显微镜的二维平面测量图。对这些样本的牙龈的立体显微镜图像分析发现，与未治疗的对照组小鼠(图25A)相比，疾病组显示出明显的牙龈过度生长(图25B)，而预防组显示牙龈过度生长的增长很小(图25C)。需要谨慎指出的是，与颊面相比，舌面牙龈过度生长似乎最突出。如图所示，在这些小鼠中发现了一系列牙龈增大的情况。尽管如此，所有的老鼠似乎都对叶酸的预防治疗有反应。

在积极治疗组中，放置缝线、CSA治疗和切除1周后的牙龈过度生长发现，随着时间的推移，牙龈过度生长似乎有所减少(图24)。叶酸积极治疗组似乎甚至进一步减少这些牙龈过度生长，表明即使在疾病建立后治疗的有效性。经过仔细的评估，我们观察到两组在下颌骨解剖的切面、颊面或舌面无显著差异。

牙龈过度生长的三维体积分析。正如我们在第一个实验中所做的，我们使用3SHAPE TRIOS口腔内数字扫描仪扫描解剖的下颌骨，并分析牙龈体积。我们观察到，具有代表性的对照(未经处理，灰色)样本和疾病样本重叠的3D体积显示后者显著增加(图41A)。另一方面，对照组和叶酸处理组的重叠体积差异不大，舌面有明显增加(图41B)。此外，疾病和治疗牙龈的覆盖面积有显著差异(图41C)。所有***的复合叠加突出了它们的表观体积的显著差异(图41D)。3D形态分析的定量分析显示，疾病组和治疗组的平均体积分别为23.17±1.134立方米和16.19±0.9224立方米，差异有统计学意义(P<0.005)(图41E)。这些结果验证了叶酸作为DIGO有效治疗的能力。

免疫组织化学分析。通过MYD88、LITAF和NFKB表达的免疫染色，从对照组(未处理)、疾病和叶酸处理的小鼠牙龈组织捕捉代表性组织病理切片的数字图像。与治疗组和对照组相比，疾病组的上皮细胞MYD88表达显著升高(图42A)。此外，疾病组上皮细胞中LITAF的表达高于对照组和治疗组，且分布均匀。总的来说，三组标本的组织病理学检查显示，MYD88和LITAF上皮表达在疾病组高于治疗组。然而，NFKB上皮表达似乎在对照组中较高，其次是疾病组。这些模式也与活性叶酸治疗组一致(图42B)。综上所述，这些结果与叶酸调节MYD88表达的能力一致，从而使其在DIGO中的实现治疗反应。

小鼠牙龈样本免疫印迹分析。为了进一步验证，我们对三组小鼠的牙龈组织样本进行MYD88、LITAF和PHOSPHO-P65表达的免疫印迹分析。我们的研究结果显示，与对照组和治疗组相比，疾病组的MYD88表达更高(图43A)。MYD88通路下游的LITAF和PHOSPHORP65显示出类似的模式(图43B和C)。该分析证实了叶酸在MYD88介导的牙龈过度生长减少中的作用。

小鼠研究3:验证MYD88在DIGO中的作用的转基因小鼠研究。为了证实MYD88在介导DIGO中的潜在作用，我们接下来检查了一个转基因小鼠模型，该模型在C57BL/10XM菌株中具有外显子3纯合缺失。大约年龄匹配(4-6周)的男性和女性被用于该研究。在14天内拍摄了临床图像。我们观察到，与野生型同窝小鼠相比，MYD88-/-小鼠的牙龈过度生长减少(图44)。野生型雌性的牙龈过度生长随着时间的推移变得更加严重，而MYD88-/-雌性的肿胀和炎症减少(图44A)。野生型雄性牙龈生长过度开始于第4天，并随着时间的推移而增加，直到第14天研究结束(图44B)。相比之下，MYD88-/-雄性在第4天显示了牙龈过度生长的减少，随着研究的时间推移不太明显。

牙龈过度生长的三维体积分析。采用3D数字分析技术对野生型和MYD88-/-小鼠的下颌骨进行了检测。容量分析显示，无论性别，野生型疾病样本的牙龈体积都高于MYD88-/-小鼠(图45A和C)。野生型DIGO样本在所有组中均值最高，雌性和雄性体积均值分别为23立方米和22立方米(图45B和D)。另一方面,MYD88-/-雌性和雄性的平均体积分别为19立方米和17立方米(图45B和D)。这些结果具有统计学意义，N＝9/8P<0.05。

对人类病人样本的研究。人类协议的批准。UB IRB审查认为该方案为非人类研究，因为需要存档的、去识别的样本。在获得批准后，9份人体样本从印度运出并在实验室接收。

组织病理学分析。H&E染色的DIGO人类样本的整体组织学分析显示轻度角化过度、网状嵴延长的假上皮瘤性增生、棘皮样变、显著的纤维间质和基质中很少的细胞(图46)。在一些样本中很少有明显的炎症细胞，这似乎取决于疾病的阶段和额外的、无意的创伤或刺激。在部分病人#1和2，DIGO典型的纤维特性是显而易见的，包括

HYPERPARAKERATOSIS PSEUDOEPITHELIAMATOUS增生,棘皮症和突出的纤维间质(图46A和B)。在部分病人#3到5，上皮增生和炎症浸润的特点是突出的(图46C-E)。最后，在病人#6中，血管和炎症的突出血管明显暗示创伤或刺激(图46F)。这些组织学特征表明DIGO的病因病理过程是循环的，可以从活动性、血管和炎症病变到确定的、主要的纤维化病变。

免疫组织化学分析。为了研究MYD88在DIGO患者发病病理机制中的作用，我们使用了免疫组织化学。组织病理学检查显示MYD88的上皮表达增加(图47)。目前正在对这些免疫染色组织切片进行定量确认。

药物引起的牙龈过度生长是目前医疗管理中常用药物的不幸副作用。口腔牙龈组织的纤维性后遗症除了具有美学和功能上的意义外，还具有独特的抗纤维性。传统的上颌第二臼齿周围结扎的动物模型在技术上有很大的挑战。基于我们在本研究中的分析，我们发现模拟DIGO的有效缝合位置是代表人类常规临床表现的下前门牙。缝线放置(诱导斑块积聚)和环孢霉素(药物)注射有效地模拟了DIGO的临床过程。我们的方法提供了一个技术上简单、可靠和可复制的DIGO小鼠模型。在这个小鼠模型中，14天足够诱发疾病，使我们能够测试叶酸逆转这些过度生长的效率。这与之前所描述的臼齿结扎模型所需要的28天形成了对比。在本研究中，我们还注意到，如之前的研究建议，在不使用抗生素的情况下，简单地拆除牙龈缝合线，可以在一定程度上减少牙龈炎症和过度生长，但不是完全减少。我们相信，易于获取和相对快速的时间过程将使该模型非常有用，以便调查DIGO以及其他牙龈炎症和纤维化疾病。

由于牙龈的弯曲和复杂的几何形状，再加上疾病引起的肿胀，常规的二维平面测量不足以准确估计牙龈过度生长。本研究采用立体显微镜和三维数字成像技术进行体积评估。在此之前，立体显微镜已被用于检查牙龈过度生长的严重程度，以及计算第二臼齿的宽度(微米)与牙龈宽度(微米)的比率。虽然这项技术在视觉上很有帮助，但它在多个平面上的分辨率有限，并且被指出与我们的定量分析不一致。因此，我们研究了用数字扫描仪和数字体积重建的三维平面测量。我们注意到这项技术提供了高分辨率、可靠的牙龈轮廓估计。我们相信这是该技术首次用于软组织容量分析，并将成为未来临床和研究的另一个有价值的工具。

在这项研究中，尽管我们联系了美国的几家研究机构，但还是无法获得人类DIGO样本。此外，DIGO的诊断通常是基于病史和临床检查，并与已知的药物摄入相关。因此，手术标本被丢弃，很少进行组织病理学分析。因此，在本研究中，我们从印度的研究机构采购了去识别的患者存档样本。我们的H和E染色DIGO人类样本的组织病理学检查显示假上皮瘤性增生，网状嵴拉长，炎症浸润，纤维间质。本研究的组织病理学结果与既往报道的研究结果一致，显示上皮增生、网状嵴伸长、致密疏松的***及炎性浸润。免疫染色分析清楚地显示，上皮细胞中MYD88表达增加，表明该分子在DIGO的发病机制中起关键作用。在缺乏MYD88的转基因小鼠模型上的验证清楚地证明了它在促进这种疾病的纤维化后遗症方面的关键作用。有趣的是，与雌性小鼠相比，雄性小鼠表现出更严重的疾病表型。

这项研究的一个主要创新是评估了局部和全身补充叶酸的治疗益处，以预防或积极治疗环孢素诱导的牙龈过度生长。在饮用水中添加叶酸(随机添加10微克/毫升)，将含有叶酸(100微克/毫升)PLGA微球的甲基纤维素凝胶每日涂于前龈。这与之前的研究相反，之前的研究只使用***的叶酸补充剂或叶酸漱口水。我们将叶酸包埋在聚乳酸-乙酸乙酯(PLG)微球中，并将这些微球包埋在甲基纤维素凝胶中，以便口服。这确保了比所有以前的研究更长的局部接触时间。在我们的研究中，叶酸对预防环孢素诱导的牙龈过度生长非常有效。这一发现与先前报道的局部叶酸预防DIGO的显著益处相一致。此外，我们还能够建立叶酸治疗能力，积极减少先前建立的牙龈过度生长。

我们能够确定MYD88基因是发病机制中的关键分子，也是叶酸在体内治疗的治疗靶点。这一途径的鉴定涉及使用细胞、生化和分子分析的几项体外研究。这一重要的实验室分析帮助我们设计了精确的剂量测量和在DIGO中针对叶酸的分子靶向治疗。在DIGO中，上皮细胞导致纤维化反应的机制尚未被推测。然而，我们认为这是疾病过程中因果途径的首次证明。之前的工作主要集中在胶原蛋白的产生和成纤维细胞增殖的作用。一些研究也检查了炎症细胞在介导ECM合成和周转中的作用。小鼠和人类组织的组织病理学分析清楚地显示上皮细胞增生，这种反应性特征提示它可能在疾病过程中发挥作用，从而导致我们的探索。

本研究的结论和意义:本研究开发了一种新的DIGO小鼠模型。我们发现前龈的有效缝合位置可以模拟人类的临床表现。此外，缝合和环孢素注射提供了技术上简单、可靠和可复制的DIGO小鼠模型。对小鼠和人类DIGO组织的分析显示，MYD88在介导DIGO中发挥关键作用。此外，本研究结果表明，叶酸可有效预防和治疗环孢素诱导的牙龈过度生长。另外，叶酸似乎通过在DIGO中降低MYD88来调节其治疗益处。

示例3

这个例子提供了使用当前披露的组合的结果。

叶酸可减少口腔角质细胞TNF-Α。口腔角质细胞接种于密度为2.5×104/平方厘米的60毫米板中。粘附后用不同浓度的叶酸(2.5微克/毫升–40微克/毫升)处理细胞，ELISA检测TNF-Α含量(P<0.05)。参见图2。

叶酸可减少LPS刺激下口腔角质细胞中的TNF-Α。口腔角质细胞接种于密度为2.5×104/C平方的60毫米板中。细胞粘附后分别用LPS(10微克/毫升)、CSA(10微克/毫升)、FA(10微克/毫升)处理24小时。使用ELISA法测定TNF-Α分泌量(P<0.05)。参见图3。

叶酸抑制口腔角质细胞TNF-Α启动子活性。用全长TNF-Α启动子和四种缺失结构(Δ1-4)转染口腔角质细胞，分别用CSA(10微克/毫升)、LPS(10微克/毫升)、CSA(10微克/毫升)、LPS(10微克/毫升)和叶酸(10微克/毫))处理。检测TNF-Α荧光素酶报告基因活性。(P<0.05)。参见图5。

参见图6。叶酸抑制在口腔角质细胞CSA诱导的LITAF表达，P-P65和MYD88蛋白质。口腔角质细胞被播种在密度为2.5X 104/平方厘米的60毫米板，并使用LPS(10微克/毫升)、CSA(10微克/毫升)和FA(10微克/毫升)处理24小时，并确定LITAF，MYD88和P-P65蛋白质水平。口腔角质细胞经过培养，用CSA、LPS或FA处理，孵育24小时。参见图6。

叶酸抑制CCSA诱导的口腔角质细胞中磷酸化P65的激活。口腔角质细胞经过培养，用CSA、LPS或FA独或联合处理，孵育24小时。采用免疫荧光图像测定P-P65(绿色)向细胞核(蓝色)的移位。使用鬼笔环肽(细胞骨架，红色)和DAPI(细胞核)对细胞进行反染色。参见图7。

叶酸抑制口腔角质细胞。培养口腔角质细胞并使用不同浓度、不同时间点的FA(10微克/毫升)处理。24小时，使用蛋白质印迹检测FA对MYD88的剂量依赖效应。使用蛋白质印迹检测FA处理后MYD88下调的动力学。参见图8。

叶酸抑制苯妥英素诱导的口腔角质细胞TNF-Α。培养口腔角质细胞，并用LPS(10微克/毫升)、PHE(10微克/毫升)、FA(10微克/毫升)处理24小时。使用ELISA法测定TNF-Α分泌量。(P<0.05)。参见图9。

MYD88表达通过叶酸治疗减少。口腔角质细胞接种于60毫米板/培养皿内。这些细胞用LPS(10微克/毫升)、PHE(10微克/毫升)、FA(10微克/毫升)处理24小时。使用蛋白质印迹检测MYD88蛋白含量。利用IMAGEJ软件对蛋白谱带进行定量分析。参见图10。

LITAF通过叶酸治疗减少。口腔角质细胞接种于培养皿中。这些细胞用LPS(10微克/毫升)、PHE(10微克/毫升)、FA(10微克/毫升)处理24小时。使用蛋白质印迹检测LITAF蛋白含量。利用IMAGEJ软件对蛋白谱带进行定量分析。参见图11。

对口腔角质细胞采用不同血清型(026:B6、055:B5)和不同LPS浓度(1微克/毫升、10微克/毫升)、不同叶酸浓度(2.5～40微克/毫升)处理24小时，使用蛋白质印迹检测LITAF蛋白含量。利用IMAGEJ软件对蛋白谱带进行定量分析。参见图12。

叶酸可降低NF-KB(P-P65)磷酸化水平。口腔角质细胞接种于培养皿中。这些细胞用LPS(10微克/毫升)、PHE(10微克/毫升)、FA(10微克/毫升)处理24小时。使用蛋白质印迹检测磷酸化P65(P-P65)蛋白含量。利用IMAGEJ软件对蛋白谱带进行定量分析。参见图13。

叶酸降低了P-P65的核转位。口腔角质细胞接种于24孔板。这些细胞用LPS(10微克/毫升)、PHE(10微克/毫升)、FA(10微克/毫升)处理24小时。磷-P65(P-P65)蛋白向细胞核的转移是由荧光显微镜确定的，如绿色所示。细胞和细胞核位置的形态由分别由红色和蓝色显示的鬼笔环肽和DAPI染色决定。参见图14。

CHIP-QPCR检测显示LITAF与TNF-Α启动子结合。口腔角质细胞接种于24孔板。这些细胞用LPS(10微克/毫升)、PHE(10微克/毫升)、FA(10微克/毫升)处理24小时。采用CHIP-QPCR检测LITAF与人TNF-Α启动子的结合情况。*P<0.05(治疗VS未治疗)，#P<0.05(有FAVS无FA)。参见图15。

叶酸处理不改变TLR2和TLR4的表达。只用LPS(10微克/毫升)处理口腔角质形成细胞24小时。FACS检测分析显示口腔角质细胞表面的TLR4受体量。使用LPS(10微克/毫升)和PHE(10微克/毫升)处理细胞24小时。FACS检测分析显示细胞表面TLR2和TLR4受体量。使用LPS(10微克/毫升)、PHE(10微克/毫升)和FA(5、10、10微克/毫升)分别处理细胞24小时。FACS检测分析显示口腔角质细胞表面的TLR4和TLR4受体量。FACS检测分析显示LPS、PHE和不同浓度叶酸处理后口腔角质形成细胞表面的TLR2和TLR4受体。参见图16。

叶酸治疗通过抑制口腔角质细胞TNF-Α信号通路减少口腔成纤维细胞中TGF-Β的表达。人口腔成纤维细胞(HOF)细胞经CSA、PHE、LPS、TGF-Β抑制剂(SB)、TNF-Α抑制剂、RHTNF-Α(TNF-Α蛋白)和从口腔角质细胞中收集的条件培养基(CM)培养。ELISA结果显示HOF细胞分泌TGF-Β的量。参见图17。

叶酸通过TNF-Α激活TGF-Β信号降低人口腔成纤维细胞中胶原蛋白的表达。将人口腔成纤维细胞(HOF)接种于密度为2.5×104/平方厘米的60毫米板中，用含LPS(10微克/毫升)、CSA(10微克/毫升)、苯妥英(10微克/毫升)或叶酸(10微克/毫升)的口腔角质细胞培养液(CM)处理24小时。采用QPCR检测胶原蛋白I ALPHA 1(COL1A1)基因表达。用RTGF-Β、SB-431542(SB)、RTNF-Α或TNF-Α抑制剂(TNF-ΑINH)处理HOF细胞。实时定量PCR结果显示治疗后COL1A1在HOF细胞中的表达。(P<0.05)。参见图18。

体内DIGO体内模型采用两种不同的正常(野生型)小鼠品系：1.C57BL/6和2.BALB/C。使用MYD88基因敲除小鼠的转基因小鼠和野生型小鼠窝伴。雄性和雌性小鼠都被使用。在下切牙周围结扎，并让小鼠注射环孢素A(CSA)。该给药***/由叶酸聚合物(PCL/PLGA)微球配制成凝胶。

利用体内DIGO模型评估叶酸治疗的疗效，使用叶酸包裹的PLGA微球与甲基纤维素凝胶混合。这是应用于小鼠的牙龈。在门牙周围放置丝制缝线以促进菌斑积聚和诱发炎症。参见图22。

利用体内DIGO模型评估叶酸治疗的疗效。4周雄性C57/B6小鼠经结扎和环孢素(CSA)诱导牙龈肿胀，上方显示干预时间过程，下方显示缝线放置和拆除的临床图像。叶酸(FA)治疗组于DIGO建立后1周开始，拆除缝线，停止CSA注射。参见图23。

为了评估治疗组的牙龈肿胀情况，需牺牲小鼠。牺牲后，解剖小鼠下颚并用立体显微镜成像，用数码相机拍摄标本。在这些研究中，小鼠被分为两组，两组均接受CSA和缝线治疗1周，随后拆除缝线并停止CSA注射。其中一组随后每天服用叶酸(治疗组)，直到研究结束。参见图24。

为了评估预防组的牙龈肿胀情况，需牺牲小鼠。牺牲后，解剖小鼠下颚并用立体显微镜成像，用数码相机拍摄标本的咬合面、颊面和舌面。将小鼠分为3组，分别为未处理组(对照组)、疾病组(CSA&缝线)和预防组(CSA，缝线&叶酸)。参见图25。

对牙龈样本进行蛋白质印迹检测，以评估DIGO涉及的信号通路。参见图26。

四周雄性BALB/C小鼠在切口之间有一个缝合处，单独注射环孢素(CSA)，或与叶酸(CSA+FA)结合预防。数字图是在一段时间内捕获的。在第8天进行了数字3D平面测量，以评估两组小鼠的牙龈扩大情况。参见图27。

对预防组的牙龈组织进行评价。小鼠被牺牲，总蛋白质从解剖的牙龈组织中分离出来。使用蛋白质印迹检测龈组织裂解液中LITAF、PHOSPHO-P65、MYD88的表达。将蛋白质印迹的条带强度标准化为Β-肌动蛋白，并用密度仪定量。参见图28。

叶酸降低小鼠牙龈组织中TNF-Α的表达。用ELISA法检测小鼠牙龈组织裂解物的TNF-Α水平(N＝5)。参见图29。

在野生型和MYD88-/-(基因敲除)小鼠的雄性和雌性小鼠中诱导DIGO，并捕捉其牙龈组织图像。参见图30。

与MYD88基因敲除小鼠相比，野生型小鼠具有显著的DIGO诱导。使用数字三维平面测量评估周围切牙的牙龈扩大。对两组牙龈扩大情况的做定量分析。参见图31。

尽管本披露已针对一个或多个具体实施例和/或示例进行了描述，但可以理解的是，本披露的其他实施例和/或示例可以在不偏离本披露范围的情况下进行。

Claims (45)

1.一种组合物，包括包含多个微球的聚合凝胶，其中多个微球的单个微球封装叶酸。

2.宣称1所述的组合物，其所述聚合凝胶是从甲基纤维素凝胶、壳聚糖凝胶、聚乳酸羟基乙酸共聚物凝胶及其组合中选择的。

3.宣称1所述的组合物，其所述聚合物凝胶为甲基纤维素凝胶。

4.宣称3所述的组合物，其聚合物凝胶包括磷酸盐缓冲盐水和1-5％体积重量的甲基纤维素。

5.宣称4所述的组合物，其甲基纤维素浓度是3％的体积重量。

6.宣称1所述的组合物，其所述多个微球是从聚乳酸羟基乙酸共聚物微球、聚己内酯(PCL)微球、壳聚糖微球、淀粉微球、聚乳酸微球、聚(酰胺酯)微球、海藻酸钠微球及其组合中选择的。

7.宣称6所述的组合物，其所述微球为聚乳酸羟基乙酸共聚物微球。

8.宣称1所述的组合物，其叶酸的浓度为2.5-150微克/毫升。

9.宣称8所述的组合物，其叶酸的浓度为100微克/毫升。

10.宣称1所述的组合物，其微球的浓度为0.001-0.07毫克/微升。

11.宣称10所述的组合物，其微球的浓度为0.06毫克/微升。

12.宣称1所述的组合物，其所述多个微球进一步包括一种或多种药物、一种或多种肽、一种或多种生长因子、一种或多种核酸或其组合。

13.宣称12所述的组合物，其一种或多种药物是从抗生素、消炎药、抗体及其组合中选择的。

14.构成宣称1的方法，包括:

(a)制造多个微球，其中单个微球封装叶酸；和

(b)将多个微球与含有胶凝化合物的水溶液混合，

其中，构成宣称1的组合物。

15.宣称14所述的方法，其胶凝化合物是从甲基纤维素、壳聚糖、淀粉、聚乳酸羟基乙酸共聚物及其组合中选择的。

16.宣称15所述的方法，其胶凝化合物是甲基纤维素。

17.宣称14所述的方法，其所述制造包括一种双乳化液溶剂蒸发法。

18.宣称17所述的方法，其所述双乳化溶剂蒸发法包括

(a)将一定量的叶酸与微球前驱体溶液混合:

(b)在微球前体溶液中加入聚醋酸乙烯酯(PVA)溶液；

(c)将微球前驱体与PVA溶液混合；

(d)将微球前驱体和PVA溶液离心，形成团粒和上清液；

(e)收集上清液；和

(f)浓缩上清液，使其形成固体，

其中固体为多个微球。

19.宣称18所述的方法，其所述双乳化溶剂蒸发法进一步包括过滤。

20.宣称18所述的方法，其浓缩是冻干。

21.一种设备，包括：

(a)一个假肢；和

(b)宣称1所述的组合物，

其中，所述组合物配置在假体和/或假体的表面上。

22.宣称21所述的装置，其假体从夹板、口腔保护器、全口义齿、部分义齿和填充物中选择。

23.宣称21所述的装置，其所述聚合物凝胶是一种甲基纤维素凝胶。

24.宣称21所述的装置，其多个微球是聚乳酸羟基乙酸共聚物微球。

25.宣称21所述的装置，其多个微球进一步包括一种或多种药物、一种或多种肽、一种或多种生长因子、一种或多种核酸或其组合。

26.宣称21所述的装置，其假体包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、甲基丙烯酸缩水甘油酯、聚酯纤维、聚丙烯酸酯、聚乙烯、环氧树脂或其组合。

27.宣称21所述的装置，其设备是3D打印。

28.一种制造装置的方法，包括:

(a)获取个体口腔的扫描、模具或模型，使装置适合个体的口腔；

(b)用聚合物制造与所述个体口腔扫描、模具或模型相对应的装置；

(c)生成宣称1所述的组合物；和

(d)使该组合物覆盖于装置。

29.宣称28所述的方法，其装置是一个假牙。

30.宣称28所述的方法，其假牙从夹板，口腔保护器，全口义齿，部分义齿和填充物中选择。

31.宣称28所述的方法，其聚合物从聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)聚合物、甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物、聚酯纤维聚合物、聚丙烯酸酯聚合物、聚乙烯聚合物、环氧树脂聚合物及其组合中选择。

32.宣称28所述的方法，其聚合物凝胶是甲基纤维素凝胶。

33.宣称28所述的方法，其多个微球为聚乳酸羟基乙酸共聚物微球。

34.宣称28所述的方法，其所述多个微球进一步包括一种或多种药物、一种或多种肽、一种或多种生长因子、一种或多种核酸或其组合。

35.一种治疗患有或怀疑患有药物诱导牙龈过度生长(DIGO)的个体的方法，包括:

(a)获取个体口腔的扫描、模具或模型，使装置适合个体的口腔；

(b)用聚合物制造与所述个体口腔扫描、模具或模型相对应的装置；

(c)生成宣称1所述的组合物；和

(d)使该组合物覆盖于装置。

(e)将已完成的装置给予患者，并给予足够的时间治疗DIGO；和

(f)可选地，监测个体对装置治疗的反应。

36.宣称35所述的方法，其装置是一个假牙。

37.宣称36所述的方法，其假牙从夹板，口腔保护器，全口义齿，部分义齿和填充物中选择。

38.宣称35所述的方法，其聚合物从聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)聚合物、甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物、聚酯纤维聚合物、聚丙烯酸酯聚合物、聚乙烯聚合物、环氧树脂聚合物及其组合中选择。

39.宣称35所述的方法，其聚合物凝胶是甲基纤维素凝胶。

40.宣称35所述的方法，其多个微球为聚乳酸羟基乙酸共聚物微球。

41.宣称35所述的方法，其多个微球进一步包括一种或多种药物、一种或多种肽、一种或多种生长因子、一种或多种核酸或其组合。

42.一种治疗患有或怀疑患有药物诱导的牙龈过度生长(DIGO)的个体的方法，包括给予个体宣传1的组合物，以及足够的时间来治疗DIGO。

43.宣称42所述的方法，其聚合物凝胶是一种甲基纤维素凝胶。

44.宣称42所述的方法，其多个微球为聚乳酸羟基乙酸共聚物微球。

45.宣称42所述的方法，其多个微球进一步包括一种或多种药物、一种或多种肽、一种或多种生长因子、一种或多种核酸或其组合。

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