CN113817724B

CN113817724B - 一种FII-RNA pulldown试剂盒和方法及其应用

Info

Publication number: CN113817724B
Application number: CN202111160837.9A
Authority: CN
Inventors: 刘郁林; 张超; 屈义
Original assignee: Guangzhou Huijun Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Huijun Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2041-09-30
Also published as: CN113817724A

Abstract

本发明提供了一种FII‑RNApulldown试剂盒和方法及其应用，属于生物技术领域，所述FII标签是一段短RNA序列，与目标RNA序列融合表达时，几乎不影响目标RNA的结构或功能。在进行RNApulldown时，由于FII标签与配体的强亲和力，预先偶联在磁珠上的配体会高效捕获目标RNA‑FII，再与待测蛋白样品混合孵育后，即可调取目标RNA的结合蛋白，整个过程操作简单、省时、RNA也不易降解。在体外转录或者体内表达获得目标RNA‑FII后，无需对转录后的RNA进行纯化，操作简单，方便，应用范围广泛。

Description

一种FII-RNA pulldown试剂盒和方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种FII-RNA pulldown试剂盒和方法及其应用。

背景技术

RNA结合蛋白(RBPs)在转录后水平调节基因的表达起着重要的作用，包括mRNA前体的剪接、多腺苷化和稳定性的维持，mRNA从细胞核向细胞质的运输，mRNA的定位和翻译等。有很多RBPs能够识别RNA中的特定核苷酸序列，因此，为了研究RNA与蛋白的相互作用建立了很多方法，包括EMSA、SELEX技术、RNAfootprinting、RNA免疫沉淀(RIP)和RNApulldown技术。

探究RNA-蛋白的相互关系是RNA(尤其是非编码RNA)功能研究的一个重要方向。RNA pulldown，就是用靶RNA调取与之相互作用蛋白质。使用体外转录法标记生物素RNA探针，再与蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而将靶RNA结合蛋白从蛋白提取液中分离出来。RBPs洗脱后，通过Western-blot实验检测待定的RBPs是否与靶RNA结合；通过LC-MS/MS实验，筛选并鉴定与靶RNA结合的蛋白。

然而，目前RNA pulldown研究的探针主要是生物素标记的单链探针，该方法存在分离到的蛋白假阳性率过高，RNA探针结合蛋白的亲和力不够等较为明显的缺点。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种FII-RNA pulldown试剂盒和方法及其应用，所述FII标签与目标RNA序列融合表达时，不影响目标RNA的结构或功能，提高了蛋白结合的亲和力。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种FII标签，所述FII标签为一段短RNA序列，所述FII标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种RNA pulldown试剂盒，包括下述试剂：

链霉亲和素磁珠，配体，RNA structure buffer，RIPA裂解缓冲液，NT2缓冲液，漂洗液，洗脱缓冲液，磷酸盐缓冲液，蛋白酶抑制剂，RNA酶抑制剂。

优选的，所述配体为：

1)SEQ ID NO.2所示的多肽；

2)1)中的氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或几个氨基酸后形成的仍然具有改造前与FII标签高度亲和力的多肽。

优选的，所述RIPA裂解缓冲液可应用于多种细胞类型，所述细胞类型包括：Hela，jurkat，A431，A549，MOPC，NIH/3T3，U2OS。

优选的，所述蛋白酶抑制剂为PMSF或Cocktail；所述RNA酶抑制剂为RecombinantRNase Inhibitor或SUPERaseIn^TMRNase Inhibitor。

本发明提供了一种RNA pulldown方法，包括如下步骤：

S1、通过体外转录或体内表达制备目标RNA-FII；

S2、磁珠预处理：向50uL磁珠中加入0.5mLNT2缓冲液，去掉NT2缓冲液，重复洗涤1次；用200μLNT2缓冲液重悬磁珠，并加入20uL配体，混合器孵育，使配体固定在磁珠上；取上述磁珠，加入0.5mL漂洗液，去掉漂洗液，重复操作1次，加入300μLNT2缓冲液重悬磁珠，得到配体磁珠，备用；

S3、利用磁珠上的特异性配体捕获目标RNA-FII：将S1所得的目标RNA-FII加入到S2所得的配体磁珠中，室温混合孵育30min；

S4、提取细胞全蛋白：取待测细胞经磷酸盐缓冲液漂洗得到细胞沉淀，向所述细胞沉淀中加入150uL包含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，通过超声破碎或者加完裂解缓冲液后反复冻融破碎，离心，收集上清液，-80℃保存；

S5、pulldown：将S4所得上清液与S3所得捕获目标RNA-FII的磁珠室温混合孵育1h；将孵育好的磁珠-目标RNA-蛋白混合物去掉上清，依次经漂洗液和NT2缓冲液漂洗后离心收集磁珠，所得磁珠用洗脱缓冲液进行洗脱，经离心后得到上清液即为所述目标RNA结合蛋白复合物。

优选的，所述S1体外转录制备目标RNA-FII的步骤包括：

1)PCR获得T7-RNA-FII转录模板，通过T7 RNA聚合酶体外转录得到带有FII标签的目标RNA；

2)将步骤1)所得目标RNA变性后离心，向离心所得沉淀中加入RNA structurebuffer和RNA酶抑制剂，室温放置30min，即得包含FII标签的目标RNA。

优选的，所述S1体内表达制备目标RNA-FII的步骤包括：

构建RNA-FII质粒载体，转染宿主细胞，使其在体内转录得到带FII标签的目标RNA。

本发明还提供了上述的FII标签或所述的试剂盒在体内和体外RNA pulldown中的应用。

本发明还提供了上述的FII标签或所述的试剂盒在线性RNA或环状RNA的RNApulldown中的应用。

本发明提供了一种FII标签，所述FII标签是一段短RNA序列，与目标RNA系列融合表达时，几乎不影响目标RNA的结构或功能。在进行pulldown时，配体通过生物素与链霉亲和素的结合力预先偶联在磁珠上，由于FII标签与配体的亲和力很强，当待测蛋白样品加入到预处理的磁珠中，磁珠上的配体能够快速抓取带FII标签的目标RNA，整个过程操作简单、省时、RNA也不易降解。在体外转录或者体内表达获得目标RNA-FII后，无需对转录后的RNA进行纯化，操作简单，方便，应用范围广泛。

附图说明

图1为PCR产物琼脂糖电泳图；其中1为反义链模板，2为正义链模板，3为FII反义链模板，4为FII正义链模板。

图2为转录产物琼脂糖电泳图；其中1为生物素标记反义链，2为生物素标记正义链，3为FII标记反义链，4为FII标记正义链。

图3为AK159072RNA在HEK 293T细胞中的表达水平检测。

图4为线性RNA pulldown SDS-PAGE胶图。

图5为circRNA ANRIL在HEK 293T细胞中的表达水平检测。

图6为circRNA pulldown SDS-PAGE胶图。

图7为circRNA pulldown产物中circRNA的富集水平。

具体实施方式

本发明中，所述FII标签是一段短RNA序列，共16nt，具体序列为：GGCGCTGACTTTGCGC(SEQ ID NO.1)。本发明所述FII标签与配体的亲和力高，且对RNA本身的影响小，与目标RNA序列融合表达时，几乎不影响目标RNA的结构或功能。

本发明还提供一种RNA pulldown试剂盒，包括下述试剂：

本发明中，所述配体为：1)SEQ ID NO.2所示的多肽；2)1)中的氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或几个氨基酸后形成的仍然具有改造前与FII标签高度亲和力的多肽。本发明中，所述配体的氨基酸序列为：GGDARTKRHRRELKRAIRKDGYSS(SEQ ID NO.2)；所述配体通过生物素与链霉亲和素的结合力预先偶联在磁珠上。本发明中，所述配体通过强亲和力作用与所述的FII标签进行结合，具有很强的亲和力。本发明中，所述磷酸盐缓冲液的pH优选为7.2；所述RIPA裂解缓冲液可应用于多种细胞类型，所述细胞类型优选的包括：Hela，jurkat，A431，A549，MOPC，NIH/3T3，U2OS细胞系。本发明中，所述蛋白酶抑制剂优选为PMSF或Cocktail，所述RNA酶抑制剂优选为Recombinant RNase Inhibitor或SUPERaseIn^TMRNaseInhibitor。本发明所述漂洗液和洗脱缓冲液选用本领域pulldown中常用的漂洗液和洗脱缓冲液即可。本发明中，所述漂洗液优选的由以下试剂组成：50mM Tris-HCl、300mM NaCl、1％NP40、0.1％SDS、0.5％脱氧胆酸钠、1mM EDTA、0.05mM DTT，pH7.4；所述洗脱缓冲液优选的由以下试剂组成：50mM Tris-HCl、150mM NaCl、20mM生物素，pH7.5。本发明对所述试剂盒中链霉亲和素磁珠、RNA structure buffer，RIPA裂解缓冲液，NT2缓冲液，漂洗液，洗脱缓冲液，磷酸盐缓冲液，蛋白酶抑制剂，RNA酶抑制剂等试剂的来源并没有特殊限定，采用本领域常规的市售产品即可。

本发明还提供了一种RNA pulldown方法，包括如下步骤：

S1、通过体外转录或体内表达制备目标RNA-FII；

S3、利用磁珠上的特异性配体捕获目标RNA-FII：将S1所得的目标RNA-FII加入到S2所得的配体磁珠中，室温混合孵育30min。

本发明中，所述S1体外转录制备目标RNA-FII的方法优选的包括如下步骤：

本发明中，所述S1体内表达制备目标RNA-FII的方法优选的包括如下步骤：

本发明对所述构建RNA-FII质粒载体的方法并没有特殊限定，采用本领域常规的构建方法即可。

本发明还提供了上述的FII标签或上述的试剂盒在体内或体外的RNA pulldown中的应用。本发明中，所述FII标签或所述试剂盒在体内或体外的RNA pulldown中优选的通过体外转录或者体内表达的方式融合到目标RNA上，从而获得目标RNA-FII。本发明还提供了上述的FII标签或上述的试剂盒在线性RNA或环状RNARNA pulldown中的应用。本发明中，所述FII标签或所述试剂盒在线性RNA或环状RNA的RNA pulldown中优选的融合在目标RNA上，用与FII标签亲和的配体直接捕获目标RNA-FII。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1线性RNA的体内FII-RNA pulldown、体外FII-RNA pulldown及生物素标记的RNA pulldown

一、体外转录和纯化

1.引物设计

针对AK159072基因上下游设计引物，AK159072基因序列如SEQ ID NO.3所示。

涉及得到的扩增AK159072基因的上下游引物序列为：

T7-AK159072-F:TAATACGACTCACTATAGGGTACCTGGTTGATCCTGCC(SEQ ID NO.4)

T7-AK159072-R:ATGATCCTTCCGCAGGT(SEQ ID NO.5)；

扩增AK159072反义链的引物序列为：

T7-antisenseAK159072-F:TACCTGGTTGATCCTGCC(SEQ ID NO.6)

T7-antisenseAK159072-R:TAATACGACTCACTATAGGGATGATCCTTCCGCAGGTT(SEQ IDNO.7)；

扩增FII-AK159072的引物序列为：

T7-FII-AK159072-F:TAATACGACTCACTATAGGGGGCGCTGACTTTGCGCTACCTGGTTGATCCTGCC(SEQ ID NO.8)

T7-FII-AK159072-R：ATGATCCTTCCGCAGGT(SEQ ID NO.5)；

扩增FII-AK159072反义链的引物序列为：

T7-FII-antisenseAK159072-F:TACCTGGTTGATCCTGCC(SEQ ID NO.6)

T7-FII-antisenseAK159072-R:TAATACGACTCACTATAGGGGGCGCTGACTTTGCGCATGATCCTTCCGCAGGTT(SEQ ID NO.9)。

2.PCR扩增

(1)PCR反应体系及扩增条件

PCR分别扩增AK159072、AK159072反义链、FII-AK159072以及FII-AK159072反义链目的片段：分别以pUC57载体质粒作为模板，使用PrimeSTAR高保真酶扩增目的片段，具体反应体系与条件如下表1所示：

表1反应体系

Template	1μL
		上游引物	2μL
下游引物	2μL
		PrimeSTAR Max(2×)	25μL
ddH<sub>2</sub>O	20μL
		总体积	50μL

其中，上游引物和下游引物分别选择与目的片段所对应的上下游引物。

扩增条件：

(2)凝胶电泳检测

目的片段PCR扩增成功后，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，通过与DNAmark比对，判断是否扩增成功；

(3)PCR产物回收

得到的正义链(AK159072 RNA)和反义链(antisenseAK159072RNA)PCR产物经1％凝胶电泳后，在紫外灯下，用手术刀切取含目的基因片段的凝胶条带至干净1.5mL EP管中，按照DNA凝胶回收试剂盒实验步骤回收DNA目的片段，具体步骤参考试剂盒说明书，即得到PCR产物。

3.T7体外转录RNA

3.1T7体外转录生物素标记的RNA

在Rnase-free的0.2mL EP反应管，分别取0.5μg的上述PCR产物，用T7体外转录试剂盒(购自Invitrogen公司，货号：AM1344)进行转录，转录体系如下表2，其中，10*BiotinRNA labeling Mix购自Roche，货号：11685597910：

表2转录体系

Component	Amount
		10*Reaction Buffer	2uL
10*Biotin RNA labeling Mix	2uL
		Template DNA	0.5ug
Enzyme Mix	2uL
		Rnase-free H<sub>2</sub>O	Up to20uL

37℃孵育2h，然后在反应体系中加入1uL DNase I，37℃孵育15min将DNA模板消化。

3.2T7体外转录FII标记的RNA

在Rnase-free的0.2mL EP反应管，分别取0.5μg的上述PCR产物，用T7体外转录试剂盒(购自Invitrogen公司，货号：AM1344)进行转录，转录体系如下表3：

表3转录体系

Component	Amount
		10*Reaction Buffer	2uL
rNTP Mix	2uL
		Template DNA	0.5ug
Enzyme Mix	2uL
		Rnase-free H<sub>2</sub>O	Up to20uL

将转录后的RNA用RNeasy Mini Kit(购自QIAGEN，货号：74104)试剂盒纯化，具体步骤可参考试剂盒说明书。

4.实验结果

PCR产物经1％琼脂糖电泳分析得到附图1，转录后的产物(即生物素标记的RNA和FII标记的RNA)经1％琼脂糖电泳分析得到附图2。

由附图1可观察到PCR产物经1％琼脂糖电泳后观察到的片段大小与目的片段大小相符。由附图2可观察到转录产物(即生物素标记的RNA和FII标记的RNA)经1％琼脂糖电泳后观察到的片段大小与目的片段相比稍大，与预期位置相符。

二、体内FII-RNA表达水平检测

1.针对AK159072的基因序列设计定量引物，AK159072的基因序列如SEQ ID NO.3所示。设计得到的引物序列如下表4所示：

表4引物序列

2.RNA抽提

(1)取对照组与实验组，室温解冻后，加入1mLTrizol，12,000g，4℃离心10min；其中，对照组为将转染空载体FII质粒，实验组为转染FII-AK159072RNA的pcDNA3.1质粒；

(2)每管加入0.2mL氯仿，盖紧离心管管盖，上下颠倒混匀(请勿涡漩激烈振荡)，室温静置5-10min，12000g，4℃离心15min；

(3)溶液分为三层，RNA溶解在水相中，小心吸取400μL水相至另一个新的RNasefree的EP管中；

(4)加入400μL异丙醇，混匀，室温放置10min，12000g，4℃离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，弃上清；

(5)加入1mL 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12000g离心5min，去上清；

(6)室温放置样品5min，待样品干燥后加入40μL Rnase Free水溶解沉淀。

3.去基因组DNA

(1)根据下表5在冰上配制反应体系，总体积为10μL。为了保证反应液配制的准确性，先按反应数+2的量配制预混体系，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品：

表5反应体系

(2)涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

(3)42℃孵育2min(室温反应时，可以延长到30min)。

(4)反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。

4.cDNA的合成逆转录反应

根据下表6在冰上配制反应体系，反应液配制需在冰上进行。为了保证反应液配置的准确性，先按数+2的量配制成预混溶液，然后再分装10μL到每个反应管中，取配制的预混液10μL加入至已完成去基因组的步骤反应管中。

表6逆转录反应体系

(2)混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

(3)cDNA合成反应条件：

a.若下游进行荧光定量PCR检测，42℃孵育15min，85℃孵育5min。

b.若下游进行普通PCR检测，42℃孵育30-50min，85℃孵育5min。

注意：对于二级结构复杂或GC含量高的模板，可以提高逆转录温度至50℃，增强逆转录效率。

(4)反应结束后，短暂离心后置于冰上，再进行后续PCR或荧光定量PCR，如果需要长时间保存，置于-20℃。

5.实时荧光定量PCR

每个样本分别设置3个目的基因和3个内参基因的平行实验。PCR反应体系为20μL，反应体系如下表7所示：

表7实时荧光定量PCR反应体系

其中，Forward Primer为表4中内参基因或目的RNA的上游引物，Reverse Primer为表4中内参基因或目的RNA的下游引物。

反应条件为：

循环结束后从60℃升高到98℃获取熔解曲线。

6.数据分析

实验数据采用2^-ΔΔct法进行分析，并在Graphpad Prism软件中做柱状图统计比较，所述柱状图如附图3所示。

由附图3可知，该RNA在此细胞中的表达为中等表达。

三、RNA pulldown

1、体外RNA pulldown

1.1 FII-RNA pulldown

磁珠预处理：

(1)分别取3μg FII标签标记的目标RNA，加入适量RNA结构缓冲液，使得目标RNA形成二级结构。然后将目标RNA 95℃加热2min，冰浴3min，室温静置30min；

(2)磁珠准备：取50μL磁珠，向磁珠中加入0.5mLNT2缓冲液，上下颠倒混匀30次，放入磁性分离器中，去掉上清，重复该操作一次，再用200μLNT2缓冲液重悬磁珠，加入20μL配体，4℃混合器孵育2h；

(3)将上述配体磁珠放入磁性分离器，去掉上清，加入0.5mL漂洗液，上下颠倒混匀30次，放入磁性分离器中，去上清，重复该操作一次，加入300μLNT2缓冲液重悬，切记将液体沿壁加入或滴加，上下缓慢翻转混匀，即为配体磁珠备用，漂洗后磁珠均分为两份；

(4)将制备好的配体磁珠加入到第(1)步的FII标记的目标RNA中，室温孵育1h；

(5)将第(4)步获得的磁珠放入磁性分离器中，去掉上清，加入NT2缓冲液冲洗3次，切记将液体沿壁加入或滴加，上下缓慢翻转混匀，制备得到磁珠-目标RNA混合物。

1.2生物素标记的RNA pulldown

磁珠预处理：

(1)分别取3μg生物素标记的目标RNA，加入适量RNA结构缓冲液，使得目标RNA形成二级结构。然后将目标RNA 95℃加热2min，冰浴3min，室温静置30min；

(2)磁珠准备：在磁珠中加入生物素标记的目标RNA，4℃混合器孵育2h，得到磁珠-目标RNA混合物。

1.3 pulldown

(1)用500μL裂解液(使用时加入RNase抑制剂)裂解HEK293T细胞，并用细胞破碎器破碎细胞，冰上裂解15min，4℃、12000rpm离心20min，弃沉淀，保留上清；

(2)分别向步骤1.1及1.2中获得的所述磁珠-目标RNA混合物中加入上述上清液，室温孵育1h，得磁珠-目标RNA-蛋白混合物；

(3)将孵育好的磁珠-目标RNA-蛋白混合物弃上清，使用漂洗液冲洗5次，每次1mL；

(4)向磁珠中加入洗脱缓冲液，室温、混匀仪上洗脱15min；

(5)放入磁性分离器中，将上清转移到新的EP管中，该液体即为洗脱产物；

(6)取洗脱产物于混合物中加2×SDS上样缓冲液，95℃变性10min，跑SDS-PAGE凝胶电泳。

2、体内FII-RNA pulldown

2.1磁珠预处理

(1)每组实验取50μL磁珠，向磁珠中加入0.5mLNT2缓冲液，上下颠倒混匀30次，放入磁性分离器中，去掉上清，重复该操作一次，再用200μLNT2缓冲液重悬磁珠；

(2)向上述磁珠中加入20μL配体，4℃混匀仪上孵育2h；

(3)将上述磁珠放入磁性分离器，去掉上清，加入0.5mL漂洗液，上下颠倒混匀30次，放入磁性分离器中，去上清，重复该操作一次，加入300μLNT2缓冲液重悬，切记将液体沿壁加入或滴加，上下缓慢翻转混匀，即为配体磁珠备用。

2.2 pull down

(1)用600μL加入RNase抑制剂的裂解液分别裂解对照组和实验组细胞，并用细胞破碎器破碎细胞，冰上裂解15min，4℃、12000rpm离心20min，弃沉淀，保留上清；其中，对照组即转染空载体FII质粒的HEK 293T细胞，实验组为转染FII-AK159072RNA的pcDNA3.1质粒的HEK 293T细胞；

(2)将步骤2.1中的配体磁珠均分为两份，一份加入对照组蛋白上清，一份加入实验组蛋白上清，4℃孵育2h；

(3)放入磁性分离器上，去掉上清，加入1mL漂洗液，手动混匀30次，放到磁性分离器中，去掉上清，重复该操作二次，再用适量的NT2缓冲液漂洗一次；

(4)放入磁性分离器中去掉上清，加入50μL洗脱缓冲液，涡旋震荡20s，放在混匀仪上，室温洗脱15min；

放入磁性分离器中，收集上清，转移到新的EP管中，该液体即为洗脱产物；

(5)取洗脱产物于混合物中加2×SDS上样缓冲液，95℃变性10min，跑SDS-PAGE凝胶。

3、SDS-PAGE电泳与染色

按照下表8配制好胶

表8配胶试剂

浓度	4％浓缩胶	12％分离胶
			ddH<sub>2</sub>O mL	3.04	3.37
30％acry/bis mL	0.65	4.00
			Tris-HClpH8.8 mL	--	2.50
Tris-HClpH6.8 mL	1.25	--
			10％SDS μl	50	100
20％AP μl	12.5	25
			TEMD μl	5	5
总体积mL	5	10

将准备好样品上样，恒流，16mA/胶，直至溴酚蓝跑至胶底部，完成电泳。电泳结束后，用硝酸银染色：

(1)固定：30min(乙醇：乙酸：水＝4：1：5体积比)；

(2)敏化：30min(乙酸钠10.2g，硫代硫酸钠0.471g，乙醇45mL，加水至150mL)；

(3)水洗4次，每次10min；

(4)银染：30min(硝酸银0.375g，加水至15mL)；

(5)水洗2次每次40s；

(6)显色：显影至条带清楚(碳酸钠4.5g，72μL甲醛，加水至180mL)；

(7)终止：5min(Na2EDTA2.19g，加水至150mL)。

SDS-PAGE电泳所得结果如附图4所示，可以看出，通过FII标签做线性RNApulldown实验，体外FII标签调取RBP的效果优于生物素标记法；同时，由于生理条件的差异，针对同一种线性RNA，体外FII标签调取的RBP和体内FII标签调取的RBP不完全相同。

实施例2 circRNA的FII-RNA pulldown及探针法circRNA pulldown

一、circRNA表达水平检测

1.针对circRNA ANRIL的序列设计定量引物，circRNA ANRIL的序列如SEQ IDNO.14所示。设计得到的引物序列如下表9所示：

表9引物序列

2.RNA抽提

(1)取对照组与实验组，室温解冻后，加入1mL Trizol，12000g，4℃离心10min；其中，对照组为转染空载体FII质粒，实验组为转染FII-circANRIL的PLO-ciR质粒；

(5)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12000g离心5min，去上清；

(7)向RNA中各加入1uL RNase R，37℃反应1h，反应完后进行反转录；

3.去基因组DNA

(1)根据下表10在冰上配制反应体系，总体积为10μL。为了保证反应液配制的准确性，先按反应数+2的量配制预混体系，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品：

表10反应体系

(2)涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

(3)42℃孵育2min(室温反应时，可以延长到30min)。

(4)反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。

4.cDNA的合成逆转录反应

(1)根据下表11在冰上配制反应体系，反应液配制需在冰上进行。为了保证反应液配置的准确性，先按反应数+2的量配制成预混溶液，然后再分装10μL到每个反应管中，取配制的预混液10μL加入至已完成去基因组的步骤反应管中。

表11逆转录反应体系

(2)混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

(3)cDNA合成反应条件：

a.若下游进行荧光定量PCR检测，42℃孵育15min，85℃孵育5min。

b.若下游进行普通PCR检测，42℃孵育30-50min，85℃孵育5min。

(4)反应结束后，短暂离心后置于冰上，再进行后续PCR或荧光定量PCR，如果需要长时间保存，需置于-20℃。

5.实时荧光定量PCR

每个样本分别设置3个目的基因和3个内参基因的平行实验。PCR反应体系为20μL，反应体系如下表12所示：

表12实时荧光定量PCR反应体系

其中，Forward Primer为表9中GAPDH或环状RNA的上游引物序列，Reverse Primer为表9中GAPDH或环状RNA的下游引物序列。

反应条件为：

循环结束后从60℃升高到98℃获取熔解曲线。

6.数据分析

实验数据采用2^-ΔΔct法进行分析，并在Graphpad Prism软件中做柱状图统计比较，所述柱状图如附图5所示。

由附图5可知，circRNA ANRIL在此细胞株中的表达为中高表达。

二、RNA pulldown

1.体内FII-circRNA pulldown

1.1磁珠预处理

(1)磁珠准备：每组实验取50μL磁珠，向磁珠中加入0.5mL NT2缓冲液，上下颠倒混匀30次，放入磁性分离器中，去掉上清，重复该操作一次，再用200μLNT2缓冲液重悬磁珠；

(2)向上述磁珠中加入20μL配体，室温混匀仪上孵育30min；

1.2.circRNA pulldown

(1)用1000μL加入RNase抑制剂与蛋白酶抑制剂的裂解液裂解HEK 293T细胞，并用细胞破碎器破碎细胞，冰上裂解15min，4℃、12000rpm离心20min，弃沉淀，取部分实验组上清作为RNA-Input，剩下的用于后续实验；

(2)将步骤1.1中的配体磁珠均分为两份，一份加入对照组蛋白上清，一份加入实验组蛋白上清，4℃孵育2h；

放入磁性分离器中，收集上清，转移到新的EP管中，该液体即为洗脱产物。

2.探针法circRNA pulldown

(1)用1000μL加入RNase抑制剂与蛋白酶抑制剂的NT2缓冲液裂解HEK 293T细胞，并用细胞破碎器破碎细胞，冰上裂解15min，4℃、12000rpm离心20min，弃沉淀，取部分对照组上清作为RNA-Input，剩下的用于后面实验；

(2)将上一步的蛋白上清均分为两份，一份加入适量探针：GAGTACGAGGCGCTTTGTCAGCGCC(SEQ ID NO.17)，一份加入等体积无RNase水，4℃孵育混合器上孵育2h；

(3)取适量的磁珠，放入磁性分离器中，去掉液体，向磁珠中加入1mL漂洗缓冲液，手动混匀30次，放入磁性分离器中，去掉液体，重复该操作3次；

(4)将磁珠均分加入到第(2)步的EP管，4℃混合器孵育2h；

(5)向漂洗好的磁珠中加入适量的生物素洗脱液，室温洗脱15min；

(6)放入磁性分离器中，将液体转移到新的EP管中，该液体即为洗脱产物。

3.SDS-PAGE电泳与染色

按照下表13配制好胶

表13配胶体系

(1)固定：30min(乙醇：乙酸：水＝4：1：5体积比)；

(3)水洗4次，每次10min；

(4)银染：30min(硝酸银0.375g，加水至15mL)；

(5)水洗2次每次40s；

(6)显色：显影至条带清楚(碳酸钠4.5g，72ul甲醛，加水至180mL)；

终止：5min(Na2EDTA 2.19g，加水至150mL)。

SDS-PAGE电泳所得结果如附图6所示，可以看出，探针法circRNA pulldown相对于FII-circRNA pulldown法调取的蛋白明显少很多，并且两个方法的对照组调取的蛋白差不多，表明FII-circRNA pulldown优于探针法-circRNA pulldown。

4.RNA提取

(1)向RNA(Input)与洗脱产物中加入1mL Trizol，混匀，每管加入200ul氯仿；

(2)混匀，12000rpm 4度离心15min，取上层液体到新的EP管中；

(3)向每管加入600ul异丙醇，混匀，负二十度沉淀30min；

(4)12000rpm、4℃、离心15min，倒掉上清，沉淀即为RNA，用75％乙醇漂洗，漂洗两次；

(5)用15ul无RNA酶的水溶解RNA，加入1ul RNase，37℃反应1h，备用；

5.RNA-RT

5.1去基因组DNA

(1)根据下表14在冰上配制反应体系，总体积为10μL。为了保证反应液配制的准确性，先按反应数+2的量配制预混体系，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品：

表14 RNA-RT去基因组DNA反应体系

(2)涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

(3)42℃孵育2min(室温反应时，可以延长到30min)。

(4)反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。

5.2cDNA的合成逆转录反应

(1)根据表15在冰上配制反应体系，反应液配制于冰上进行。为了保证反应液配置的准确性，先按数+2的量配制成预混溶液，然后再分装10μL到每个反应管中，取配制的预混液10μL加入至已完成去基因组的步骤反应管中。

表15 cDNA的合成逆转录反应体系

(2)混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

(3)cDNA合成反应条件：

a.若下游进行荧光定量PCR检测，42℃孵育15min，85℃孵育5min。

b.若下游进行普通PCR检测，42℃孵育30-50min，85℃孵育5min。

(4)反应结束后，短暂离心后置于冰上，再进行后续PCR或荧光定量PCR，如果需要长时间保存，请置于-20℃。

5.3实时荧光定量PCR

每个样本分别设置3个目的基因和3个内参基因的平行实验。PCR反应体系为20μL，反应体系如表16：

表16实时荧光定量PCR反应体系

其中，引物序列：

ANRIL-QF：GCCGCCAATGTATTTCTCTGC(SEQ ID NO.18)

ANRIL-QR：AGGGACACTGGATGTAGGAGA(SEQ ID NO.19)

反应条件为：

循环结束后从60℃升高到98℃获取熔解曲线。

5.4数据分析

实验数据采用2^-ΔΔct法进行分析，并在Graphpad Prism软件中做柱状图统计比较，所得柱状图如附图7所示。

由附图7可以看出circRNA pulldown产物中circRNA的富集水平，探针法circRNApulldown与FII-circRNA pulldown都可以在实验组中调取到目的RNA，表明本次实验是成功的。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 广州辉骏生物科技股份有限公司

<120> 一种FII-RNA pulldown试剂盒和方法及其应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcgctgact ttgcgc 16

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Gly Asp Ala Arg Thr Lys Arg His Arg Arg Glu Leu Lys Arg Ala

1 5 10 15

Ile Arg Lys Asp Gly Tyr Ser Ser

20

<210> 3

<211> 1237

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgatggagca acttaggtcc tggtgacaga ggcatgtggt ggaagatact cacatcatga 60

tggactagga aatatacatc aagtcaggaa tcaggggctg ggtattttat atatatgtgt 120

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtatacat atacatgtaa aatgtaatat 180

ataatatata ttatatacac atatattata ttatattgta ttatattata ttacatatta 240

atacatatta tatatatata atatatgtat aaatgtatta tatacaatgt tcttcagata 300

tataatatat cctccatagt tttgcttgta agcatggact tttttacctg gcttgtttgt 360

tctcagaaat aactaccctt gagacttaat attttatgaa gaaatgtgta ggctaaaagc 420

ttaggcttgt tccctgacta gctcataact aaattatcca tttattattt tctaagttct 480

gtcagatgcc ttgttacctc tctgcagttt cgtgtgaccc tctccttcag tgttggggca 540

atctctcatg cctatttctc agaagctgat atctctctgc caaatatccc atgggccata 600

ggctttttat tgataggtga tgcttccata cactgcacaa gagattcttt ctacatcttc 660

ctttaatgac ttaactttta gctaggtttc caataccaat atcaaaacca acaccaaaac 720

cagaaccaaa actaaacaaa aagcatcaat aagaaggtcc aagtttttaa accatgaacc 780

tgtggaggaa ggggggttat gtgactgctt tcgtcaagaa agctccttaa ccagaaaagc 840

aaacaactca aagtagcttc aggaagttcc tgaaactgac cagattcact aggcccctcc 900

ctgcgacagt gagtaataaa agttgagagt cccttcagac tgaagagaga taatctgcaa 960

agatgtaata atctaggacc atctatgttc acttgatatc aagggatatc aagtgatact 1020

aagtcatatg tattgttacc ctctctatat gctaggttct gtcctgtacg tcagaaatag 1080

gttgtattcc ttaagcttca taggaaggat gtgaggaaga tgatatctta ggagttggct 1140

cccaaatttc ctaatagcac atgacattgg ttggtcgagt ttgtgatgtt ttgactttga 1200

gggggtggtt cctatgattc ccccaaaata gatgctg 1237

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taatacgact cactataggg tacctggttg atcctgcc 38

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgatccttc cgcaggt 17

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tacctggttg atcctgcc 18

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taatacgact cactataggg atgatccttc cgcaggtt 38

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taatacgact cactataggg ggcgctgact ttgcgctacc tggttgatcc tgcc 54

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taatacgact cactataggg ggcgctgact ttgcgcatga tccttccgca ggtt 54

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgcaccacca actgcttagc 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggcatggact gtggtcatga g 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agcttaggct tgttccctga c 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctgaaggaga gggtcacacg 20

<210> 14

<211> 793

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaattcgcgg ccgccaatgt atttctctgc ttcatacact atccaaggtg ataaaagtgt 60

ttatgaagag ggattaggaa atatctgctg tgtttaggtc atagtccaac caaaggatta 120

attaacattt gcctcttttt tctcctacat ccagtgtccc ttttgatgag aagaataagc 180

ctcattctga ttcaacagca gagatcaaag aaaagacttc tgttttctgg ccaccagata 240

tatgttatct gtgcttaaag aattgaaaaa cacacatcaa aggagaattt tcttggaaag 300

agagggttca agcatcactg ttaggtgtgc tggaatcctt taacaggcgc tgacaaagcg 360

cctcgtactc ttcttagcgg aggttcgatc aagaaagtgg cgctgacaaa gcgccttcac 420

ccgagtcagt actgctttct agaagaaaac cggggagatc tatttggaat gtatctaact 480

ccaaagaaac catcagaggt aacagtagag acggggtttc accatgttgg ccagactggt 540

cttgaactcc cgacctcgtg attcgcccgc ctcggcctcc caaagtgctg ggattacagg 600

tgtgagacac cacgcccggc ggatagagag aattttgaca ggtgaggagg tattccaatg 660

caaaagaata ataggagcaa aagcacagtg gtgagaaatt ggaggggaac tgtgaaaatt 720

gccacataga ttagaggcag gaaaataaag gacggctaag tttatatagt gaacagtgag 780

caagcttgaa ttc 793

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gccgccaatg tatttctctg c 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agggacactg gatgtaggag a 21

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gagtacgagg cgctttgtca gcgcc 25

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gccgccaatg tatttctctg c 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agggacactg gatgtaggag a 21

Claims

1.一种FII标签，其特征在于，所述FII标签为一段短RNA序列，所述FII标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种RNA pulldown试剂盒，其特征在于，包括下述试剂：

链霉亲和素磁珠，配体，RNA structure buffer，RIPA裂解缓冲液，NT2缓冲液，漂洗液，洗脱缓冲液，磷酸盐缓冲液，蛋白酶抑制剂，RNA酶抑制剂；所述配体为SEQ ID NO.2所示的多肽。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述RIPA裂解缓冲液可应用于多种细胞类型，所述细胞类型包括：Hela，jurkat，A431，A549，MOPC，NIH/3T3，U2OS。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂为PMSF或Cocktail；所述RNA酶抑制剂为Recombinant RNase Inhibitor或SUPERaseIn^TMRNase Inhibitor。

5.一种RNA pulldown方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、通过体外转录或体内表达制备目标RNA-FII；所述FII为权利要求1所述的FII标签；

S2、磁珠预处理：向50μL磁珠中加入0.5mLNT2缓冲液，去掉NT2缓冲液，重复洗涤1次；用200μL NT2缓冲液重悬磁珠，并加入20uL配体，混合器孵育，使配体固定在磁珠上；取上述磁珠，加入0.5mL漂洗液，去掉漂洗液，重复操作1次，加入300μL NT2缓冲液重悬磁珠，得到配体磁珠，备用；所述配体为SEQ ID NO.2所示的多肽；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述S1体外转录制备目标RNA-FII的步骤包括：

1)PCR获得T7-RNA-FII转录模板，通过T7 RNA聚合酶体外转录得到带有权利要求1所述FII标签的目标RNA；

2)将步骤1)所得目标RNA变性后离心，向离心所得沉淀中加入RNA structure buffer和RNA酶抑制剂，室温放置30min，即得包含FII标签的目标RNA。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述S1体内表达制备目标RNA-FII的步骤包括：

8.权利要求1所述的FII标签和权利要求2-4任一项所述的试剂盒在体内和体外RNApulldown中的应用。

9.权利要求1所述的FII标签和权利要求2-4任一项所述的试剂盒在线性RNA或环状RNA的RNA pulldown中的应用。