CN113817680A - 大鼠神经细胞评价模型的构建及其评价药物神经毒性的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于评价候选化合物神经毒性的方法，该方法包括：(1)在候选化合物存在时培养神经干细胞球，并确定该神经干细胞球面积的情况；(2)在该候选化合物存在时培养神经干细胞，并确定神经干细胞DNA合成的情况；(3)在该候选化合物存在时混合培养神经元和星形胶质细胞，并确定神经突总长度和神经突数量的情况；以及(4)在该候选化合物存在时混合培养神经元和星形胶质细胞，并确定神经细胞数量以及该神经元和该星形胶质细胞的数量占该神经细胞数量的百分比变化的情况。该方法改变了单一体外筛选模型和指标不能特异性评价候选化合物多毒性靶点的缺点，从四个角度综合评价神经毒性，可用于预测药物发育神经毒性和急性神经毒性。

Description

大鼠神经细胞评价模型的构建及其评价药物神经毒性的用途
技术领域
本发明涉及神经生物学领域，涉及大鼠神经细胞评价模型的构建方法，本发明还涉及该评价模型在评价药物神经毒性方面的用途。
背景技术
神经毒性(Neurotoxicity，NT)是许多新药及其先导化合物、环境化合物、农药等常见的毒副作用，早期筛选神经毒性药物可避免药品研发企业后续的大量投入，以及确定是否需要进一步开展药物的神经毒性评价工作。神经***对许多内源性和外源性物质都十分敏感，其结构和功能的微小变化都能引起神经生物学和行为学的改变，尤其是在神经发育阶段，一旦受损可能是永久性的损伤。神经***相对复杂，涉及的毒性靶点和受体通路也较多，如今对许多药物神经毒性作用的确切机制尚不明确。现今，经济合作与发展组织(OECD)和国际人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)关于神经毒性评价的指导原则仅限于体内实验，主要为神经行为学观察和组织病理学检查，其结果主观性强，试验操作费时费力，并不能从毒性作用机制上解释和评价药物的神经毒性作用。然而单一的体外筛选模型或指标又不能完全评价神经毒物所有的毒性靶点，因此，需建立针对不同类型神经毒物的体外筛选模型，从多个特异性检测终点综合评价或筛选几类神经毒物的神经毒性作用，今后可用于预测药物的急性神经毒性和发育神经毒性。
神经干细胞由于具备可增殖性和多能分化性，分化产生三种组成中枢神经的主要细胞类型：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，是药物神经毒性筛选的良好工具。本发明构建了原代大鼠神经干细胞及定向分化神经细胞模型，用于神经毒物的体外评价研究，探索神经细胞模型各检测终点如神经突生长、神经细胞总数、神经元和星形胶质细胞的数量占神经细胞数量的百分比等指标在评价不同种类神经毒物的特异性和敏感性。
由大鼠胚胎脑组织中获取的神经干细胞，通过体外一系列消化、传代、增殖和分化过程，培养为成熟的，分化比例一定的神经元和星形胶质细胞混合细胞模型。巢蛋白(Nestin)、微管相关蛋白(MAP2、β-Tubulin III)、突触素(Synaptophysin)和胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP)抗体分别用于鉴定神经干细胞、发育成熟及早期分化的神经元、神经突触和星形胶质细胞。将神经干细胞用于药物影响神经球生长毒性和EdU增殖毒性研究，定向分化神经元用于评价药物影响神经突生长毒性研究，以及药物在神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞过程中的发育神经毒性研究。
由大鼠原代细胞定向分化的混合细胞模型比细胞系更接近体内原位细胞的神经生长模式，可检测涉及神经毒性的多项检测终点，用于替代或部分替代临床前安全性评价动物试验还可大量节省动物使用数量。该模型可用于有效评价抗肿瘤药物、抗癫痫药物、麻醉剂以及神经毒性化合物的神经毒性和发育神经毒性。
本发明的研究结果表明探索神经毒性体外筛选模型及生物学指标的应用范围，可为不同种类神经毒物的早期筛选或评价提供快速、有效的方法，并有利于方法学之间的比较研究和验证，多种体外检测指标的综合测试和组合应用也为药品监管科学提供了新方法和新思路。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种神经毒物体外筛选模型，评价各检测终点的敏感性和特异性，并用于各类型神经毒物的筛选，为监管机构提供神经毒性体外评价策略，以解决现有体内评价方法的局限性，从神经细胞模型形态学特异性终点，发育神经毒性终点等综合评价神经毒物的多靶点毒性。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种用于评价候选化合物神经毒性的方法，该方法包括：
(1)在候选化合物存在时培养神经干细胞球，并确定该神经干细胞球面积的情况；
(2)在该候选化合物存在时培养该神经干细胞，并确定该神经干细胞DNA合成的情况；
(3)在该候选化合物存在时混合培养神经元和星形胶质细胞，并确定神经突总长度和神经突数量的情况；以及
(4)在该候选化合物存在时培养该神经元和该星形胶质细胞，并确定神经细胞数量以及该神经元和该星形胶质细胞的数量占该神经细胞数量的百分比变化的情况。
进一步地，该候选化合物选自以下的一种或多种：长春新碱、顺铂、瑞芬太尼、氧化铁纳米粒子、丙泊酚、丙戊酸钠、苯妥英钠、丙烯酰胺、乙醇和9-顺式视黄酸。
进一步地，该方法进一步包括：在该候选化合物不存在时培养该神经干细胞球或神经干细胞、该神经元和/或该星形胶质细胞，并与该候选化合物存在时的该情况相比较。
进一步地，该神经干细胞球或神经干细胞来源于胚龄为14～14.5天的大鼠胎脑组织。
进一步地，该方法进一步包括：添加大鼠神经干细胞成神经元细胞诱导分化培养基和/或含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，将该神经干细胞分化成该神经元和/或该星形胶质细胞。
进一步地，使用CCD显微成像***和分析软件计算该神经干细胞球的面积。
进一步地，使用EDU细胞增殖毒性检测法确定该神经干细胞的DNA合成情况。
进一步地，该EDU细胞增殖毒性检测法的采样时间点为给予该候选化合物后约24小时。
进一步地，该神经干细胞球是第一次体外传代的神经干细胞或第二次体外传代的神经干细胞。
进一步地，确定该神经突总长度和该神经突数量的情况的采样时间点为给予该候选化合物后约48小时和/或约72小时；
进一步地，确定该神经细胞数量以及该神经元和该星形胶质细胞的数量占该神经细胞数量的百分比的情况的采样时间点为给予该候选化合物后约48小时和/或约72小时。
根据本发明的另一方面，提供了一种根据上述方法在评价药物神经毒性中的用途。
本发明的有益效果：
本发明通过获取大鼠胚胎脑组织中的神经干细胞在体外培养，通过增殖和分化为神经元和星形胶质细胞，构建体外神经发育模型和成熟稳定的神经细胞混合培养模型用于药物筛选。采用高内涵筛选***，应用大鼠神经干细胞及分化细胞模型筛选11种药物/化合物影响神经球生长、神经干细胞增殖、神经突生长、神经干细胞分化作用等，体外高通量高内涵筛选药物的神经毒性及发育神经毒性作用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本申请要求保护的范围。
图1是神经细胞形态及免疫细胞鉴定结果图。图A：第1代培养7天左右的神经球(100×)；图B：第2代神经球(100×)；图C：神经球单层贴壁生长(100×)；图D：抗MAP-2抗体标记神经元阳性(200×)；图E：抗Nestin抗体标记神经干细胞阳性(200×)；图F：抗GFAP抗体标记星形胶质细胞阳性(100×)；图G：神经干细胞免疫组化染色阴性(200×)；图H：神经干细胞Nestin-IgG(Cy3)免疫荧光染色与Hoechst核染色合成图(200×)；图I：分化神经元β-Tubulin III-IgG-Alexa Fluor 488与分化星形胶质细胞GFAP-IgG-Alexa Fluor594免疫荧光染色合成图(200×)；图J：分化神经元Synaptophysin-IgG-Alexa Fluor 594免疫荧光染色与Hoechst核染色合成图(200×)；图K：分化神经元MAP-2-IgG-Alexa Fluor 594免疫荧光染色与Hoechst核染色合成图(200×)；图L：分化星形胶质细胞GFAP-IgG-AlexaFluor594免疫荧光染色与Hoechst核染色合成图(200×)。
图2表示给药48h和72h后药物对神经突生长的毒性作用曲线图。各给药组神经突总长度和神经突数量占对照组的百分比，并以两个独立实验分析四个总孔的平均值±标准偏差表示(Mean±SD，n＝4)。“*”表示神经突总长度存在显著性差异(P<0.05)，“#”表示神经突数量存在显著性差异(P<0.05)。
图3表示药物影响神经干细胞分化毒性实验结果曲线图。双Y轴曲线图中左侧Y轴曲线表示细胞总数；右侧Y轴曲线表示星形胶质细胞和神经元所占细胞总数的百分比(星形胶质细胞％和神经元％)。(Mean±SD，n＝4)。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
正如背景技术部分所描述的，现有体内评价方法存在局限性，体外筛选模型也存在毒性靶点评价指标单一，缺乏特异性的问题。为了解决上述问题，本发明提供了一种用于评价候选化合物神经毒性的方法，该方法包括：
(1)在候选化合物存在时培养神经干细胞球，并确定该神经干细胞球面积的情况；
(2)在该候选化合物存在时培养该神经干细胞，并确定该神经干细胞DNA合成的情况；
(3)在该候选化合物存在时混合培养神经元和星形胶质细胞，并确定神经突总长度和神经突数量的情况；以及
(4)在该候选化合物存在时培养该神经元和该星形胶质细胞，并确定神经细胞数量以及该神经元和该星形胶质细胞的数量占该神经细胞数量的百分比变化的情况。
在本发明中，作为标准专利术语，术语“包括”指“包含”，不排除其他组分。结合术语“包括”所描述的本发明各方面中的任何方面也包括较窄的实施方式，其中术语“包括”用更窄的术语“基本上由……组成”或者“由……组成”替换。如本说明书中所用，术语“包含”或者“包括……的”不应解读为限制本发明，而应理解为列举示例性组分。
在一种优选的实施方式中，本发明选用的候选化合物包括但不限于已知具有神经毒性的抗肿瘤药物长春新碱和顺铂，具有发育神经毒性作用的抗癫痫药丙戊酸钠和苯妥英钠，具有神经毒性和发育神经毒性的化合物乙醇和丙烯酰胺，麻醉剂丙泊酚和瑞芬太尼，以及能够通过血脑屏障的纳米制剂氧化铁纳米粒子，以及能够促进神经***发育和分化的9-顺式视黄酸对照品。
本发明选用的候选化合物还可以是本发明中未提及的其它具有潜在或已知神经毒性和发育神经毒性的化合物，以及在本发明提交之时还未被合成或发现的化合物。
在一种优选的实施方式中，该方法进一步包括：在该候选化合物不存在时培养该神经干细胞球或神经干细胞、该神经元和/或该星形胶质细胞，并与该候选化合物存在时的该情况相比较。
在一种优选的实施方式中，该神经干细胞球或神经干细胞来源于胚龄为14～14.5天的大鼠胎脑组织。
在一种优选的实施方式中，该方法进一步包括：添加大鼠神经干细胞成神经元细胞诱导分化培养基和/或含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，将该神经干细胞分化成该神经元和/或该星形胶质细胞。
在一种优选的实施方式中，使用CCD显微成像***和分析软件计算该神经干细胞球的面积。
在一种优选的实施方式中，使用EDU细胞增殖毒性检测法确定该神经干细胞的DNA合成情况。
其中，本发明所采用的EdU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)细胞增殖毒性检测法相对于常用的检测细胞增殖能力的MTT比色法、CCK8试剂盒法以及Brdu法而言，更加快速和灵敏。
在一种优选的实施方式中，该EDU细胞增殖毒性检测法的采样时间点为给予该候选化合物后约24小时。
关于数值的术语“约”或“大约”意指该数值的±5％，但明确地包括确切的数值。例如，“约”24小时的时间是指从22.8小时至25.2小时的时间，但也明确地包括刚好24小时的时间。
在一种优选的实施方式中，该神经干细胞球是第一次体外传代的神经干细胞或第二次体外传代的神经干细胞。
在一种优选的实施方式中，确定该神经突总长度和该神经突数量的情况的采样时间点为给予该候选化合物后约48小时和/或约72小时。
其中，神经突生长是神经元体外研究的重要方面，有许多很好的体外方法已经用于检测药物对神经突生长的化学作用，如PC12细胞是广泛用于神经生物学研究的细胞系，本发明首次构建大鼠原代神经元检测，结果证明同样具有较好的检测性，并确定了最佳采样时间点。不同的候选化合物选择的采样时间点不同。
在一种优选的实施方式中，确定该神经细胞数量以及该神经元和该星形胶质细胞的数量占该神经细胞数量的百分比的情况的采样时间点为给予该候选化合物后约48小时和/或约72小时。
其中，在特定时间点，通过确定神经细胞数量以及由神经干细胞分化而成的神经元和星形胶质细胞的数量占该神经细胞数量的百分比的情况，进行候选化合物发育神经毒性体外评价，是现有技术未曾报道过的。不同的候选化合物选择的采样时间点不同。
根据本发明的另一方面，提供了一种根据上述方法在评价药物神经毒性中的用途。
实施例
1.材料和方法
1.1细胞来源
怀孕14～14.5天(E14～E14.5)SD大鼠。购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
1.2主要试剂及仪器
1.2.1试剂
OriCellTMSD大鼠神经干细胞完全培养基(货号：RASNF-01001)，生产厂家：赛业生物科技；OriCellTM大鼠神经干细胞成神经元细胞诱导分化培养基(货号：RAXNX-90081)，生产厂家：赛业生物科技；DMEM/F12高糖培养基(批号：Lot.No.NAA1328)，厂家：HycLone；胎牛血清(FBS)(批号：Lot.No.1565565)，厂家：Gibco；D-Hanks液(批号：Lot.No.8115074)，厂家：Invitrogen；胰酶-EDTA(批号：Lot.No.20141211)，厂家：北京北科慧宇实验器材有限公司；胶原I，鼠尾(批号：Lot.No.1834231)，厂家：Gibco；抗-Nestin抗体，克隆鼠-401(批号：Lot.No.2780475)，厂家：Millipore；兔产抗-MAP2多克隆抗体(批号：Lot.No.2344988)，厂家：Millipore；兔产抗-GFAP抗体(批号：Lot.No.2360000)，厂家：Abcam；鼠产抗-β-TubulinIII单克隆抗体(批号：Lot.No.054M4819V)，厂家：Sigma；兔产抗-Synaptophysin抗体(批号：Lot.No,310333)，厂家：Sigma；山羊抗-兔IgG-FITC(批号：Lot.No.G1314-M105)，厂家：Southernbiotech；山羊pAb to Ms IgG(Cy3)(批号：Lot.No.GR251063-6)，厂家：Abcam；山羊抗-鼠IgG-Alexa Fluor 488(批号：Lot.No.1705900)，厂家：Thermo FisherScientific；山羊抗-兔IgG-AlexaFluor 594(批号：Lot.No.1704538)，厂家：ThermoFisher Scientific；
Figure BDA0003285372420000081
EdU Alexa
Figure BDA0003285372420000082
488流式细胞术检测试剂盒(50次检测)，Lot.No.1711804，厂家(品牌)：Thermo Fisher(invitrogen)。
1.2.2仪器
实体显微镜：型号MZ APO，厂家LEICA；灯型号：LG-PS2，厂家OLYMPUS；倒置显微镜：型号：CKX31，厂家：日本OLYMPUS；倒置荧光显微镜：型号：IX71，厂家：日本OLYMPUS；光学显微镜：型号：BX-51，厂家：OLYMPUS；超净工作台：型号：BCN1360B，厂家：北京东联哈尔仪器制造有限公司；CO2培养箱：型号：10-0221，厂家：日本R.K.J；高速冷冻离心机：型号：H-500FRS，厂家：日本KOKUSAN；CCD显微成像***：型号：DP73-ST-SET，厂家：OLYMPUS；CellSens standard分析软件：厂家：OLYMPUS；流式细胞仪：型号：FACS Calibur，厂家；In Cell数据采集：型号：In CellAnalyzer 2000，厂家：GE Healthcare Life Sciences。
1.3受试物
注射用硫酸长春新碱(简称，长春新碱，VCR)(批号：Lot.No.1405V1)，厂家：深圳万乐药业有限公司；注射用顺铂冻干型(CDDP)(批号：Lot.No.H20023460)，厂家：齐鲁制药有限公司；瑞芬太尼(Remifentanil)(171260-200601)，厂家：中检院标准物质；氧化铁(II，III)，氧化铁纳米粒子(Iron-Oxide Nanoparticles，ION)：规格：10mL，直径5nm的磁性纳米颗粒溶液，胺官能化的，1mg/mL Fe，在H2O中的分散体，批号：MKBR2641V，厂家：Sigma；丙泊酚注射液(Propofol)(批号：Lot.No.H20040079)，厂家：四川国瑞药业有限责任公司；丙戊酸钠(Sodium Valproate)(批号：Lot.No.100963-201302)，厂家：中检院标准物质；苯妥英钠(Phenytoin Sodium)(批号：Lot.No.100210-201303)，厂家：中检院标准物质；丙烯酰胺(Acrylamide)(批号：Lot.No.20150427)，厂家：国药集团化学试剂有限公司；乙醇(Ethanol)(批号：Lot.No.20150917)，厂家：国药集团化学试剂有限公司；9-顺式视黄酸(9cRA)(批号：Lot.No.R4643)，厂家：sigma；神经生长因子(NGF)(批号：Lot.No.GF028)，厂家：Millipore；DMSO(批号：Lot.No.RNBD9351)，厂家：Sigma。
其中神经生长因子能促进神经球/神经干细胞生长，本发明中将其作为阴性对照药。9-顺式视黄酸能促进神经干细胞分化。
受试物配置：受试物使用当天，用细胞培养基稀释受试物使其浓度达到设置的三个剂量组浓度，培养基中DMSO的含量为0.1％。
2.构建大鼠神经干细胞及分化细胞模型
2.1大鼠神经干细胞(NSCs)培养及分化
将E14～14.5SD大鼠经异氟烷麻醉后，剖开腹腔，完全放血，连同胎盘和胎膜摘取双侧子宫中的胚胎组织，置于75％乙醇溶液中10min。浸泡消毒时间不宜过长，否则引起胚胎脱水。浸泡消毒后，将其置于无菌操作台，小心剥离胎膜和胎盘，将完整的胚胎移入D-Hanks液中，反复吹打清洗掉血液，将经过2～3遍D-Hanks液清洗的胚胎置于体视显微镜下，用游丝镊或极细精密镊子剥离胚胎脑部皮肤、颅骨、脑膜，清楚肉眼可见的大血管，取出全脑。
按上述方法收集所有胚胎的脑组织，通常1只孕鼠怀有15～20只胎鼠。清洗后汇集入置于冰板上的D-Hanks液中。用弯头眼科剪将脑组织剪碎后，加入0.25％胰酶-EDTA37℃5％CO2温箱中消化15min，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化。
将消化好的脑组织吹打成单细胞悬液，于200目筛网过滤，1000rpm/min离心5min，弃掉上清液，用1mL SD大鼠神经干细胞完全培养基洗细胞2次，加入适量SD大鼠神经干细胞完全培养基后吹打成单细胞悬液，细胞计数调整密度为5×105/cm2，接种于25mL或75mL细胞培养瓶中。
神经干细胞于37℃5％CO2温箱中培养3-4天时，观察细胞生长状态，神经干细胞聚集成神经球，此时采取半数换液法，取出半数细胞培养基和神经干细胞的混合液置于新的培养瓶中，再分别加入等量新的培养基后继续培养3-4天。
神经干细胞传代：将形成一定大小的神经球培养液离心，1000rpm/min离心5min，重悬后反复吹打成单细胞悬液，再继续于新的SD大鼠神经干细胞完全培养基中培养1代。此时，形成的第2代神经干细胞球生长稳定可用于之后的实验。
神经干细胞定向分化为神经元：将单个神经干细胞或神经球接种于包被有多聚赖氨酸的多孔培养板中，使细胞贴壁生长。将培养基更换为大鼠神经干细胞成神经元细胞诱导分化培养基，分别于更换培养基后6h，24h，48h观察细胞形态及鉴定。或者在细胞传代时更换为大鼠神经干细胞成神经元细胞诱导分化培养基，再将细胞接种于包被有多聚赖氨酸的多孔培养板中，待细胞贴壁后进行鉴定和检测实验用。
神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞：将大鼠神经干细胞成神经元细胞诱导分化培养基更换为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。待细胞贴壁后用MAP2抗体对神经元和GFAP抗体对星形胶质细胞进行免疫荧光方法鉴定。
2.2免疫荧光技术鉴定神经细胞
采用以下步骤对大鼠神经干细胞，定向分化神经元，分化的神经元和星形胶质细胞进行免疫荧光标记。一抗分别采用抗-Nestin抗体标记神经干细胞或神经球，抗-MAP2多克隆抗体、抗-β-Tubulin III单克隆抗体或抗-Synaptophysin抗体标记神经元，抗-GFAP抗体标记星形胶质细胞。二抗采用山羊抗-兔IgG-FITC和山羊pAb to Ms IgG(Cy3)或山羊抗-鼠IgG-Alexa Fluor488和山羊抗-兔IgG-AlexaFluor 594显色。
具体步骤为：贴壁细胞用预温的PBS洗3次；4％多聚甲醛室温固定细胞20min；PBS洗3次；0.2％TritonX-100透化15min；PBS洗3次；5％羊血清封闭37℃孵育30min；加入一抗分别为PBS 1:100稀释的抗-Nestin抗体；1:1000稀释的抗-MAP2多克隆抗体或1:500稀释的抗-β-Tubulin III单克隆抗体；1:200稀释的抗-Synaptophysin抗体；1:1000稀释的抗-GFAP抗体。4℃过夜；PBS洗3次；加入用PBS 1:1000稀释的二抗，避光室温孵育30min；PBS洗3次；Hoechst染核室温避光5min，丙三醇封片后倒置荧光显微镜下观察或加入PBS后直接进入In CellAnalyzer 2000高内涵分析细胞成像***进行图像扫描。
3.大鼠神经干细胞模型评价研究
3.1神经球生长毒性
3.1.2试验设计及分组
将第一代神经球培养3-4天时，按照神经球密度1×104/孔移至96孔板中。每种受试物分为低剂量组、中剂量组和高剂量组，同时设置空白对照组和阳性对照组(NGF组)。每种受试物的给药浓度分组如表1。每孔给药后使得最终培养基+药物体积为100μL。同时接种3个相同的培养板，每个试验组设置4个复孔，分别于给药后24h、48h和72h时收集50μL神经球培养液，显微镜下观察神经球生长情况，采用CCD显微成像***和Cell Sens standard分析软件测量神经球大小，然后采用SPSS统计分析软件对各实验组间的平均数据进行显著性分析(*P<0.05差异显著，**P<0.01差异非常显著)。
表1神经球生长毒性实验给药分组设计
Figure BDA0003285372420000111
注：“/”表示未设定组别。
3.1.3统计学方法
数据采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，按照以下方法统计：(1)首先用tukey和REGWQ检验方法进行方差齐性检验，如果数据均一(检验P>0.05)，则说明方差是齐性的；同时单因素方差分析(F检验)结果显著(P≤0.05)，则进行参数法tukey HSD多重比较；如果单因素方差分析(F检验)结果不显著(P>0.05)，则结束检验。(2)如果方差齐性分析检验结果显著(P≤0.05)，则说明方差为不齐性；同时单因素方差分析(F检验)结果显著(P≤0.05)，则进行参数法Dunnett T3多重比较；如果单因素方差分析(F检验)结果不显著(P>0.05)，则结束检验。
3.2神经干细胞EdU增殖毒性
3.2.1试验前准备
第2代神经干细胞培养4-6天左右再次形成神经球，从25cm2/75cm2培养瓶中吸取神经球和培养基的混合液，按照每孔750μL体积接种到12孔板中，按照试验设计共计接种97孔(由于每个样品数较多，一个试剂盒只能检测50个样本，因此实验分两次进行)，准备次日进行给药。
试剂配置及保存：
试剂盒中所有试剂在使用前要求室温孵育；
10mM EdU溶液：试剂A中加入4mL DMSO混匀。使用后，将剩余溶液储存在≤20℃，稳定性长达1年；
Alexa
Figure BDA0003285372420000121
488azide工作液：试剂B中加入130μL DMSO混匀。使用后，将剩余溶液储存在≤20℃，稳定性长达1年；
500mL 1×Click-iT渗透洗涤剂：50mL试剂E加到450mL 1％BSA溶液中。当少量制备时，按试剂E:1％BSA溶液＝1:10的比例进行稀释。使用后，将剩余溶液储存在2-6℃，1×Click-iT渗透洗涤剂稳定性为6个月，10×溶液稳定性为1年。注意：试剂E中含叠氮化钠，酸性条件下产生高毒性的叠氮酸。弃液前稀释自来水中的叠氮化合物，避免在管道中累积潜在的***性沉积物；
10×Click-iT EdU缓冲添加剂：向小瓶中加入2mL去离子水，搅拌直至Click-iTEdU缓冲剂完全溶解。使用后，将剩余溶液储存在≤20℃，稳定性长达1年。
3.2.2试验设计及分组
给药设计和受试物配置：一次试验设计一个不加EdU的空白孔(进行流式检测数据的染料背景分析)、一个加入EdU的空白孔、其余各孔为加入EdU的11个受试物剂量组，每份样品共设计3个复孔。各受试物组给药时，于每孔/12孔板中750μL神经球培养基中加入250μL的受试物与培养基的稀释液，混匀后使得每孔终体积为1mL，使得各受试物组终浓度与神经球生长试验中的受试物低、中、高剂量组浓度相同。EdU细胞增殖毒性试验受试物配置方法见表2。
表2EdU细胞增殖毒性实验受试物配置方法
Figure BDA0003285372420000131
注：“/”表示未设该剂量组。
3.2.3试验步骤
EdU标记神经干细胞：神经球悬浮于培养基中且达到生长的最佳状态时进行给药，给药后24h时取出12孔板，于超净台中加入1μL配置好的10mM EdU溶液混匀，使得10mM EdU溶液与培养基的稀释比例为1:1000(10μM)。将加入EdU的培养板再次放入37℃培养箱孵育2h。注意加入EdU的浓度和孵育时间可以调整，如果EdU浓度低则要延长孵育时间，浓度较高则缩短孵育时间。孵育2h后取出培养板，将每孔中的神经球采用机械分离法打散成单细胞悬液，该操作动作轻柔以免破坏细胞结构。将每孔单细胞悬液移入流式管中，1000r/m离心3min，弃上清液。
固定和渗透：用3mL含1％BSA的PBS洗涤细胞一次，1000r/m离心3min，弃上清液。向沉淀中加入100μL Click-iT固定剂(试剂D)，并充分混匀。室温下避光孵育细胞15min。用3mL含1％BSA的PBS洗涤细胞，1000r/m离心3min，弃上清液。将沉淀细胞重悬于100μL 1×Click-iT渗透洗涤剂中，并充分混匀，孵育15min。
Click-iT反应：首先，准备1×Click-iT EdU缓冲添加剂，用去离子水1:10稀释10×Click-iT EdU缓冲添加剂。然后，准备Click-iT反应试剂见表3。注意Click-iT反应试剂要在准备后的15min内使用。每个样本中加入0.5mL的Click-iT反应试剂，并充分混匀。反应混合物在室温下避光孵育30min。用3mL 1×Click-iT渗透洗涤剂洗涤一次，1000r/m离心3min，弃上清液。加入400～500μL的1×Click-iT渗透洗涤剂重悬细胞，准备于流式细胞仪上进行分析。注意在上机子之前，用300目的过滤网进行过滤，目的是将较大的没有充分分离的神经干细胞球滤掉，以免阻塞流式细胞仪的进样管。
每份样品收集5000个左右的细胞，采用流式细胞仪Alexa
Figure BDA0003285372420000142
488azide检测EdU，使用紫外发射滤光片(450/40nm)的405nm激发。
表3 Click-iT反应试剂配置
Figure BDA0003285372420000141
3.3神经突生长毒性
3.3.1试验设计及分组
当第2代神经干细胞再次聚集成大小适中的神经球，用机械分离法将神经球打散成单细胞悬液后以密度为1～5×105接种于多聚赖氨酸包被的96孔板中，注意细胞接种时应将96孔板四边留白并加入D–Hanks液或无菌PBS以防边缘效应。待单细胞贴壁后，加入DMEM/F12高糖培养基使神经干细胞定向分化为神经元和星形胶质细胞。本发明分别检测给药48h和72h顺铂、瑞芬太尼、氧化铁(II，III)、丙泊酚注射液、丙戊酸钠和苯妥英钠、丙烯酰胺、乙醇和9-顺式视黄酸对神经突生长的毒性作用。注射用顺铂(冻干型)、瑞芬太尼、氧化铁(II，III)、丙泊酚注射液、丙戊酸钠、苯妥英钠、丙烯酰胺、乙醇、9-顺式视黄酸分组情况见表4。
表4神经突生长毒性实验给药分组设计
Figure BDA0003285372420000151
注：“/”表示未设定组别。
3.3.2免疫荧光标记神经元和星形胶质细胞
对给药后的各个细胞孔采用免疫荧光标记法标记神经元和星形胶质细胞。一抗分别采用抗-β-Tubulin III单克隆抗体标记神经元，抗-GFAP抗体标记星形胶质细胞。二抗采用山羊pAb to Ms IgG(Cy3)和山羊抗-兔IgG-FITC显色。
具体步骤为：贴壁细胞用预温的PBS洗3次；4％多聚甲醛室温固定细胞20min；PBS洗3次；0.2％TritonX-100透化15min；PBS洗3次；5％羊血清封闭37℃孵育30min；加入一抗分别为PBS 1:500稀释的抗-β-Tubulin III单克隆抗体；1:1000稀释的抗-GFAP抗体。4℃过夜；PBS洗3次；一同加入用PBS 1:1000稀释的山羊pAb to Ms IgG(Cy3)和山羊抗-兔IgG-FITC二抗，避光室温孵育30min；PBS洗3次；Hoechst染核室温避光5min。细胞孔中加入PBS后直接进入In CellAnalyzer 2000高通量高内涵分析细胞成像***进行图像扫描和采集。
3.3.3高通量筛选药物神经突生长毒性
3.3.3.1In Cell数据采集
打开In Cell仪器，进入In Cell 1000软件***。在Plate/Slide View窗口下设定参数预览各孔情况。之后，建立获取图像的Protocol并保存。在Acquisition Mode中对目标区域运行方案，Acquisition Session窗口下拍照。
3.3.3.2 In Cell Analyzer 1000数据分析
图像在In Cell Analyzer 1000Workstation软件中的Neurite OutgrowthAnalysis模块下对神经突总长度(Total Neurite Length)、神经突数量(Neurite Count)等参数进行分析。详细操作步骤参见In Cell Analyzer 1000Workstation软件说明书。
3.4神经干细胞分化毒性
3.4.1试验设计及分组
当第2代神经干细胞再次聚集成神经球，用机械分离法打散成单细胞悬液后按密度为1～5×105接种于96孔板中。待单细胞贴壁后，加入DMEM/F12高糖培养基使神经干细胞定向分化为神经元和星形胶质细胞。本发明中共接种6个培养板，其中给予顺铂和瑞芬太尼24h和48h的96孔板各1个，给予氧化铁(II，III)、丙泊酚注射液、丙戊酸钠和苯妥英钠48h和72h的96孔板各1个，给予丙烯酰胺、乙醇、9-顺式视黄酸和神经生长因子48h和72h的96孔板各1个。注射用顺铂(冻干型)、瑞芬太尼、氧化铁(II，III)、丙泊酚注射液、丙戊酸钠、苯妥英钠、丙烯酰胺、乙醇、9-顺式视黄酸和神经生长因子分组情况见表5。
表5神经干细胞分化毒性实验给药分组设计
Figure BDA0003285372420000161
注：“/”表示未设定组别。
3.4.2免疫荧光标记神经元和星形胶质细胞
试验操作参照3.3.2。
3.4.3高通量分析药物影响神经干细胞分化
3.4.3.1 In Cell数据采集
操作方法与3.3.3.1中的步骤相同，包括开机，放样品，预览，建立方案，保存方案文件，成像，拍照和关机。
3.4.3.2 In Cell Analyzer 1000数据分析
图像在In Cell Analyzer 1000 Workstation软件中的Multi Target AnalysisModule模块下对细胞数量(Cell Count)变化、分化的神经元和星形胶质细胞百分比变化情况进行分析。详细操作步骤参见In Cell Analyzer 1000Workstation软件说明书。
4结果与分析
4.1大鼠神经干细胞及分化细胞形态观察及鉴定
第1代大鼠神经干细胞聚集形成神经球，球体折光性较好(见图1A)。如果神经球聚集过大，会造成中心部分的神经干细胞缺乏营养，镜下观察神经球中心呈深色(见图1B)，不利于之后各项指标的检测，神经球形成神经网络不易分离和传代。干细胞传至2或3代时稳定。
培养板用多聚赖氨酸包被后神经球贴壁，神经干细胞由贴壁神经球的中心向外生长延伸，最初胞体呈多边形较小，突触短而不明显(图1C，图1H)。定向分化为神经元胞体呈梭形，神经突触不断伸长，交错成网状(图1E，图1I，图1J，图1K)。分化为混合细胞生长的包括胞体呈梭形、突触明显的神经元以及胞体较大的星形胶质细胞(图1D，图1F，图1I，图1L)。随时间延长，星形胶质细胞比例增加。细胞免疫化学技术及细胞免疫荧光技术鉴定。
4.2神经球生长毒性
给药后24h、48h和72h，长春新碱对神经球生长毒性作用最强，从给药24h低剂量组可见神经球解离破碎。顺铂、氧化铁纳米粒子、丙泊酚注射液和丙烯酰胺从高剂量组可见神经球解离破碎，对神经球具有明显的毒性作用。丙戊酸钠和苯妥英钠的高剂量组可见明显的神经球减小，对神经球生长具有抑制作用。瑞芬太尼、乙醇、9-顺式视黄酸和神经生长因子未见明显神经干细胞毒性作用和抑制神经球生长作用，神经生长因子作用的神经球随时间延长球体明显增大，促进神经球生长。
Cell Sens standard分析软件测量神经球大小，采用SPSS统计分析软件对各个受试物剂量组与空白对照组和阳性对照组进行显著性差异分析，结果见表6。
给药24h，低、中、高剂量组长春新碱神经球大小(面积)与NGF组相比显著减小(P<0.05差异显著)。给药48h和72h，各剂量组长春新碱神经球解离破碎。
给药24h，高剂量组顺铂神经球大小(面积)与空白对照组相比显著减小(P<0.05)；给药48h，低、高剂量组顺铂神经球大小(面积)与空白对照组相比极显著减小(P<0.01)，中剂量组顺铂神经球大小(面积)与空白对照组相比显著减小(P<0.05)；给药72h，高剂量组顺铂神经球大小(面积)与空白对照组相比显著减小(P<0.05)。
给药24h，低、中、高剂量组瑞芬太尼神经球大小(面积)与NGF组相比显著减小(P<0.05)；给药48h和72h，各剂量组瑞芬太尼神经球大小(面积)与空白对照组和NGF组相比均未见统计学差异。
给药48h，中剂量组氧化铁纳米粒子神经球大小(面积)与空白对照组和NGF组相比极显著减小(P<0.01)。给药24h，各剂量组氧化铁纳米粒子神经球大小(面积)与空白对照组和NGF组相比均未见统计学差异。给药72h，低、中剂量组氧化铁纳米粒子神经球大小(面积)与空白对照组和NGF组相比均未见统计学差异，高剂量组氧化铁纳米粒子全部神经球解离破碎。
给药48h，低剂量组丙泊酚注射液神经球大小(面积)与空白对照组和NGF组相比显著和极显著减小(P<0.05，P<0.01)，中剂量组丙泊酚注射液神经球大小(面积)与NGF组相比显著减小(P<0.05)。给药24h，各剂量组丙泊酚注射液神经球大小(面积)与空白对照组和NGF组相比均未见统计学差异。给药72h，低、中剂量组丙泊酚注射液神经球大小(面积)与空白对照组和NGF组相比均未见统计学差异，高剂量组丙泊酚注射液全部神经球解离破碎。
给药48h和72h，高剂量组丙戊酸钠神经球大小(面积)与空白对照组相比极显著和显著减小(P<0.01，P<0.05)；给药48h，高剂量组丙戊酸钠神经球大小(面积)与NGF组相比显著减小(P<0.05)。给药24h，各剂量组丙戊酸钠神经球大小(面积)与空白对照组和NGF组相比均未见统计学差异。
给药24h，高剂量组苯妥英钠神经球大小(面积)与NGF组相比显著减小(P<0.05)。给药48h，高剂量组苯妥英钠神经球大小(面积)与空白对照组相比极显著减小(P<0.01)，中、高剂量组苯妥英钠神经球大小(面积)与NGF组相比显著和极显著减小(P<0.05，P<0.01)。给药72h，各剂量组苯妥英钠神经球大小(面积)与空白对照组和NGF组相比均未见统计学差异。
给药24h，高剂量组丙烯酰胺神经球大小(面积)与NGF组相比显著减小(P<0.05)。给药48h，各剂量组丙烯酰胺神经球大小(面积)与空白对照组和NGF组相比均未见统计学差异。给药72h，低、中剂量组丙烯酰胺神经球大小(面积)与空白对照组和NGF组相比均未见统计学差异，高剂量组丙烯酰胺全部神经球解离破碎。
给药48h，中剂量组乙醇神经球大小(面积)与空白对照组和NGF组相比显著减小(P<0.05)。给药24h和72h，各剂量组乙醇神经球大小(面积)与空白对照组和NGF组相比均未见统计学差异。
给药48h，低剂量组9-顺式视黄酸神经球大小(面积)与NGF组相比显著减小(P<0.05)。给药24h和72h，各剂量组9-顺式视黄酸神经球大小(面积)与空白对照组和NGF组相比均未见统计学差异。
表6神经球生长/毒性作用观察结果
Figure BDA0003285372420000191
Figure BDA0003285372420000201
注：“L”表示低剂量组，“M”表示中剂量组，“H”表示高剂量组。
4.3神经干细胞EdU增殖毒性
给药24h后，低、中、高剂量组长春新碱给药后EdU检测神经干细胞DNA合成(即细胞增殖)与空白对照组相比显著降低(P<0.05差异显著)。低、中、高剂量组顺铂与空白对照组相比显著降低(P<0.05差异显著)。中、高剂量组瑞芬太尼与空白对照组相比显著降低(P<0.05差异显著)。高剂量组氧化铁(II，III)与空白对照组相比显著降低(P<0.05差异显著)。高剂量组丙泊酚注射液与空白对照组相比显著降低(P<0.05差异显著)。高剂量组丙戊酸钠与空白对照组相比显著降低(P<0.05差异显著)。高剂量组苯妥英钠与空白对照组相比显著降低(P<0.05差异显著)。高剂量组丙烯酰胺与空白对照组相比显著降低(P<0.05差异显著)。中、高剂量组乙醇与空白对照组相比显著降低(P<0.05差异显著)。低、中、高剂量组9-顺式视黄酸和神经生长因子与空白对照组相比无显著差异。长春新碱、顺铂、瑞芬太尼、氧化铁(II，III)、丙泊酚注射液、丙戊酸钠、苯妥英钠、丙烯酰胺、乙醇均具有EdU神经干细胞增殖毒性作用且呈剂量效应关系。
4.4神经突生长毒性
给药48h，顺铂800ng/mL和1600ng/mL剂量组神经突总长度和神经突数与空白对照组相比有显著增加(P<0.05)(如图2a所示)。给药48h和72h，氧化铁纳米粒子200μg/mL剂量组神经突总长度和神经突数与空白对照组相比有显著增加(P<0.05)(如图2c和图2j所示)。给药48h，丙泊酚200μg/mL剂量组神经突总长度和神经突数与空白对照组相比有显著增加(P<0.05)(如图2d所示)。给药48h，丙戊酸钠200μg/mL剂量组神经突数与空白对照组相比有显著增加(P<0.05)(如图2e所示)。给药72h，丙烯酰胺200μg/mL剂量组神经突总长度与空白对照组相比有显著增加(P<0.05)(如图2n所示)。其余各给药剂量组与空白对照组相比无显著性差异或无剂量相关性，具体见图2其它图示。
4.5神经干细胞分化毒性
顺铂给药24h和48h，神经细胞总数随剂量增加而降低，48h神经细胞总数明显低于24h且剂量效应关系更为显著。24h，神经干细胞分化为初期神经元，未见分化的星形胶质细胞；48h，随给药剂量增加药物对神经元的毒性作用较为显著(如图3a和3b所示)。
瑞芬太尼给药24h，神经细胞总数随给药剂量增加未见显著变化；48h，给予1.6μg/mL剂量的瑞芬太尼可见神经细胞总数降低；给药24h和48h神经细胞总数未见差异。同样24h，神经干细胞分化为初期神经元，未见分化的星形胶质细胞；48h，给予1.6μg/mL剂量的瑞芬太尼对星形胶质细胞的毒性作用较为显著，其余各剂量组未见显著的神经元和星形胶质细胞毒性作用(如图3c和3d所示)。
氧化铁(II，III)给药48h和72h，神经细胞总数均随给药剂量增加而降低，且两个时间点神经细胞总数及剂量效应关系未见显著差异。给药48h和72h，随给药剂量增加药物对神经元的毒性作用较为显著(如图3e和3f所示)。
丙泊酚给药48h和72h，神经细胞总数随给药剂量增加(从100μg/mL剂量起)而降低，且两个时间点神经细胞总数及剂量效应关系未见显著差异。给药48h和72h，随给药剂量增加药物对神经元的毒性作用较为显著，且在给药72h对神经元的毒性作用趋势更为显著(如图3g和3h所示)。
丙戊酸钠给药48h，神经细胞总数随给药剂量增加(从100μg/mL剂量起)具有降低趋势，但在给药72h时，神经细胞总数随给药剂量增加则明显降低。给药48h和72h时，随给药剂量增加(从100μg/mL剂量起)药物对神经元的毒性作用较为显著(如图3i和3j所示)。
苯妥英钠给药48h和72h，神经细胞总数随给药剂量增加具有降低趋势。给药48h和72h时，给予200μg/mL剂量的苯妥英钠对神经元具有显著的毒性作用(如图3k和3l所示)。
丙烯酰胺给药48h和72h，神经细胞总数随给药剂量增加而降低，且在给药72h时降低趋势更为明显。给药48h和72h，随给药剂量增加药物对神经元的毒性作用较为显著，且在给药72h时对神经元的毒性作用趋势更为显著(如图3m和3n所示)。
乙醇给药48h，神经细胞总数随给药剂量增加未见显著变化；给药72h，神经细胞总数随给药剂量增加而降低。给药48h，各剂量乙醇对神经元和星形胶质细胞均未见显著毒性作用；给药72h，随给药剂量增加药物对神经元和星形胶质细胞均具有一定的毒性作用(如图3o和3p所示)。
9-顺式视黄酸给药48h和72h，神经细胞总数随给药剂量增加未见显著变化(如图3q和3r所示)。
图3s和图3t示出了阴性对照和神经生长因子组，均随时间延长神经细胞总数增加，且阴性对照和给予神经生长因子在48h和72h时，分化的星形胶质细胞比例高于神经元。
4.6结论
神经球生长毒性试验，给予空白对照和神经生长因子神经球大小与时间成正比，且神经生长因子比空白对照促进神经球生长聚集显著。丙戊酸钠和苯妥英钠显示抑制神经球生长，具有发育神经毒性作用。长春新碱、顺铂、氧化铁纳米粒子、丙泊酚注射液和丙烯酰胺直接引起神经干细胞坏死，对于这些具有明显神经毒性的化合物神经球生长不是理想的评价指标。
本发明采用EdU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)细胞增殖毒性检测法可以准确的在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子中，有效地检测细胞处于S期的百分数。EdU与Apollo荧光染料的特异性反应能快速检测细胞DNA复制活性，可用于高通量评价或筛选药物引起的神经干细胞增殖毒性作用。EdU与BrdU检测方法相比，EdU染料体积小，是BrdU抗体的1/500，在细胞内容易扩散，无需DNA变性(酸解、热解和酶解等)，能有效避免样品损伤，无需抗原抗体反应，可在细胞与组织水平上更准确地反映DNA的复制活性。本发明预试验对给药后6h、24h和48h分别进行了神经干细胞EdU增殖毒性研究，试验结果表明给药6h，受试物各剂量组之间以及与空白对照组之间并未观察到明显的剂量效应关系。给药48h，受试物低剂量组即可见明显的细胞增殖毒性作用，中、高剂量组几乎不能检测出细胞增殖率。而给药24h，不仅可见明显的受试物与空白对照组的细胞增殖毒性差异，且受试物各剂量组之间也具有明显的剂量效应关系，因此给药24h是筛选药物对神经干细胞增殖毒性作用的合适时间点。此外，本发明还对神经干细胞的选择进行了预试验，分别对第一代神经干细胞和第一次体外传代的神经干细胞进行了EdU增殖毒性研究，结果表明受试物作用于第一代神经干细胞EdU细胞增殖毒性检测处于S期的神经干细胞增殖比例大约为80～90％，然而对于某些受试物由于此时的神经干细胞均处于较高的增殖阶段，并不能检测出明显的剂量效应关系，如乙醇，而在传代的神经干细胞中则能检测出明显的剂量效应关系，这可能与传代细胞增殖活力等多指标的状态稳定有关，因此在药物的发育神经毒性筛选研究试验中均采用细胞培养稳定的第一次传代或第二次传代的神经干细胞作为载体。
本发明首次通过候选化合物对原代大鼠神经干细胞分化的神经元进行神经突生长的研究，结果表明，顺铂、氧化铁纳米粒子、丙泊酚、丙烯酰胺和9-顺式视黄酸表现为促进神经突生长；瑞芬太尼和苯妥英钠具有抑制神经突生长趋势。然而，其中顺铂、氧化铁纳米粒子、丙泊酚和丙烯酰胺在相同时间点和剂量水平下还表现为抑制神经球生长、具有神经干细胞增殖毒性作用，以及对神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞具有毒性作用，表明这些化合物可能具有潜在的发育神经毒性。这说明神经球生长毒性、细胞增殖毒性、神经干细胞分化毒性检测终点较神经突生长毒性检测终点更为敏感，但它们又缺乏神经突生长检测终点的特异性，因此需要针对不同作用机制的神经毒物特点将这四种方法组合使用，提高这些检测终点组合应用的敏感性和特异性。
神经干细胞分化毒性研究中，在分析两个时间点，各个给药剂量组对神经细胞总数的影响时，注意顺铂于低剂量组在给药48h比24h神经细胞总数明显降低，说明顺铂低剂量组即对神经细胞产生毒性作用；瑞芬太尼、氧化铁(II，III)、丙泊酚、苯妥英钠的低剂量组在给药48h或72h与给药24h或48h相比神经细胞总数未见显著差异，说明以上药物低剂量组对神经细胞数量产生一定的毒性作用，影响细胞的正常增殖；空白对照、神经生长因子、丙戊酸钠、丙烯酰胺、乙醇和9-顺式视黄酸的试验组或低剂量组在给药72h与给药48h相比神经细胞总数有所增加，说明随时间延长细胞正常增殖，未受药物作用的影响。
每个药物不同剂量水平对神经细胞数量的影响，如果未见神经细胞总数具有剂量效应关系，说明药物对神经元和星形胶质细胞均未产生毒性作用，神经元和星形胶质细胞的比例也不会随剂量改变而发生明显的比例变化，这与本试验结果相一致，如给药48h和72h的9-顺式视黄酸各剂量组、给药48h的乙醇各剂量组和给药24h的瑞芬太尼剂量组。如果神经细胞总数随剂量增加而降低，则需要分析该药物对神经元还是对星形胶质细胞产生了毒性作用，依据神经元和星形胶质细胞百分比曲线图，若神经元比例降低明显说明药物主要对神经元产生一定的毒性作用，反之对星形胶质细胞产生主要的毒性作用，若神经元和星形胶质细胞比例变化不大说明药物对神经元和星形胶质细胞均产生一定毒性作用。因此，通过以上结果比较可以定性和定量评价药物的神经毒性作用。
构建大鼠神经干细胞及分化细胞模型体外高通量高内涵筛选和评价了11种受试物(药物或化合物)影响神经球生长、神经干细胞增殖、神经突生长和神经干细胞分化的作用，其评价结果相互印证，表明：单一一种评价方式并不能准确评价受试物(药物或化合物)的神经毒性，只有多角度的综合评价体系才可能全面地反应受试物(药物或化合物)的神经毒性(如表7所示)。例如，长春新碱在神经球生长毒性试验中表现较强毒性，因此在该剂量水平下无需对神经干细胞增殖和分化，神经突生长进行检测。顺铂也是一种抗肿瘤药物，通过四项指标检测可见其较明显的神经干细胞和神经元毒性。麻醉剂瑞芬太尼和丙泊酚的各项指标表明其具有发育神经毒性，在干细胞增殖、分化和神经突生长中均显示抑制作用，二者不同之处表现为瑞芬太尼抑制神经干细胞分化为星形胶质细胞，丙泊酚抑制神经干细胞分化为神经元。抗癫痫药丙戊酸钠除未见神经突生长毒性其余指标与苯妥英钠结果一致，表现为神经干细胞增殖和分化神经元毒性。神经毒性化合物丙烯酰胺和乙醇未见明显的神经突生长毒性，但均表现神经干细胞增殖和分化毒性，乙醇表现为神经元和星形胶质细胞双向分化毒性。氧化铁纳米粒子表现为神经干细胞增殖毒性和神经突生长毒性，以及分化神经元毒性。视黄酸和神经生长因子作为阴性对照均未表现神经毒性和发育神经毒性。上述不同作用机制神经毒物的检测结果表明其神经毒性作用特点不尽相同，通过神经毒性特异性检测指标神经突生长，神经干细胞增殖、分化的有效结合和结果的关联成为体外筛选神经毒物的主要策略。
表7神经毒性体外评价指标结果汇总
Figure BDA0003285372420000251
注：“/”表示未检测；“+”表示阳性；“-”表示阴性。
以上对本申请实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本申请的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本申请的思想，基于本申请的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本申请保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

Claims (10)

1.一种用于评价候选化合物神经毒性的方法，所述方法包括：
(1)在候选化合物存在时培养神经干细胞球，并确定所述神经干细胞球面积的情况；
(2)在所述候选化合物存在时培养所述神经干细胞，并确定所述神经干细胞DNA合成的情况；
(3)在所述候选化合物存在时混合培养神经元和星形胶质细胞，并确定神经突总长度和神经突数量的情况；以及
(4)在所述候选化合物存在时培养所述神经元和所述星形胶质细胞，并确定神经细胞数量以及所述神经元和所述星形胶质细胞的数量占所述神经细胞数量的百分比变化的情况。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述候选化合物选自以下的一种或多种：长春新碱、顺铂、瑞芬太尼、氧化铁纳米粒子、丙泊酚、丙戊酸钠、苯妥英钠、丙烯酰胺、乙醇和9-顺式视黄酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：在所述候选化合物不存在时培养所述神经干细胞球或神经干细胞、所述神经元和所述星形胶质细胞，并与所述候选化合物存在时的所述情况相比较。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经干细胞球或神经干细胞来源于胚龄为14～14.5天的大鼠胎脑组织。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：添加大鼠神经干细胞成神经元细胞诱导分化培养基和/或含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，将所述神经干细胞分化成所述神经元和/或所述星形胶质细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用CCD显微成像***和分析软件计算所述神经干细胞球的面积。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用EDU细胞增殖毒性检测法确定所述神经干细胞DNA合成的情况；
优选地，所述EDU细胞增殖毒性检测法的采样时间点为给予所述候选化合物后约24小时。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述神经干细胞球是第一次体外传代的神经干细胞或第二次体外传代的神经干细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，确定所述神经突总长度和所述神经突数量的情况的采样时间点为给予所述候选化合物后约48小时和/或约72小时；
优选地，确定所述神经细胞数量以及所述神经元和所述星形胶质细胞的数量占所述神经细胞数量的百分比的情况的采样时间点为给予所述候选化合物后约48小时和/或约72小时。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法在评价药物神经毒性中的用途。
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