CN113817577B - 一种具有核酸自动提取纯化功能的液滴微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种具有核酸自动提取纯化功能的液滴微流控芯片,包括磁珠法核酸提取纯化区域、试剂样本混合区域以及微液滴生成区域,每个区域之间由微流道连通;所述磁珠法核酸提取纯化区域包括样本存储腔、洗脱液存储腔、磁体、矩形磁珠偏转流道、第一负压腔、压差洗脱流道和磁分离流道;所述试剂混合区域包括T形三通流道、试剂腔和非对称混匀器;所述微液滴生成区域包括十字形四通流道、储油腔和第二负压腔。本发明通过将核酸提取纯化、试剂混匀、微液滴生成集成在一张芯片上,可实现核酸的自动化提取及液滴生成,为核酸的预处理和数字化分析提供了简便、可行的操作方案,特别适合传染性疾病的现场快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及微流控生物芯片技术领域,尤其涉及一种具有核酸自动提取纯化功能的液滴微流控芯片。
背景技术
现有的核酸提取纯化方式主要包括苯酚氯仿抽提法、离心柱纯化法以及磁珠法核酸分离技术。其中,苯酚氯仿抽提法利用苯酚使蛋白质变性,十二烷基磺酸钠使细胞膜裂解,在蛋白酶K、EDTA的作用下消化蛋白质或多肽,使DNA从核蛋白中游离出来。再经过沉淀、萃取、多次洗涤等过程后可获得纯化的核酸。但苯酚、氯仿等试剂的毒性大、核酸回收率低、操作难度大,且很难进行微量化操作。离心柱和磁珠法核酸提取纯化方式,利用硅胶载体或纳米磁珠只对核酸有较强的亲和力和吸附力,但对其它生化成分不吸附的原理,可低成本地获得质量较好的核酸纯化产品,这两种方法均为目前市场的主流提取方法。但是,上述提取方式仍然需要多步操作,提取纯化过程十分繁琐。
为了简化提取纯化过程,国内外众多主流分子诊断公司相继开发出多种基于磁珠法自动化核酸提取设备,比如天隆科技有限公司推出的GeneRotex系列核酸提取仪、华大智造生产的MGISP自动化核酸提取***、Thermol Fisher开发的KingFisher Presto核酸提取***以及Roche生产的MagNA系列全自动核酸纯化仪等。上述全自动的核酸提取纯化设备通过***集成,代替了繁重的人力操作,同时显著地提高了检测的准确性和可靠性。然而,这些仪器设备仅具有核酸提取纯化的单一功能,无法集成样本加入、试剂混匀等功能于一个装置或一个***中,不利于即时检测、伴随诊断等现场快速实时检测和分析。因此,建立提取纯化高效、集成度高、样品空间暴露少、检测灵敏度高、结果准确可靠的检测方法显得尤为重要。
发明内容
为了解决上述问题,有必要提供一种具有核酸自动提取纯化功能的液滴微流控芯片。
本发明提出一种具有核酸自动提取纯化功能的液滴微流控芯片,包括磁珠法核酸提取纯化区域、试剂样本混合区域以及微液滴生成区域,每个区域之间由微流道连通;
所述磁珠法核酸提取纯化区域包括样本存储腔、洗脱液存储腔、磁体、矩形磁珠偏转流道、第一负压腔、压差洗脱流道和磁分离流道;
所述样本存储腔和所述洗脱液存储腔置于所述矩形磁珠偏转流道的短边一侧,并通过微流道与所述矩形磁珠偏转流道连通;所述第一负压腔和所述压差洗脱流道置于所述矩形磁珠偏转流道的另一短边一侧,并通过微流道与所述矩形磁珠偏转流道连通;所述压差洗脱流道的出口与所述磁分离流道连通;所述磁体置于所述矩形磁珠偏转流道和所述磁分离流道的中间;
所述试剂混合区域包括T形三通流道、试剂腔和非对称混匀器;
所述T形三通流道的第一入口连通所述试剂腔,第二入口连通所述磁分离流道,出口与所述非对称混匀器的入口连通;
所述微液滴生成区域包括十字形四通流道、储油腔和第二负压腔;
所述十字形四通流道的第一入口与所述非对称混匀器的出口连通,相对的第二及第三入口均与所述储油腔连通,出口流道与所述第二负压腔连通。
基于上述,所述样本存储腔和所述第一负压腔位于同一侧,所述洗脱液存储腔和所述压差洗脱流道位于同一侧。
基于上述,所述微流道的加工采用铣床加工或软光刻工艺加工。
基于上述,所述压差洗脱流道的高压窄流道和低压宽流道的宽度比在1:1.5到1:15之间。
基于上述,所述十字形四通流道的几何尺寸选择为高40~150 μm,宽30~200 μm。
基于上述,与所述储油腔连通的微流道对称设计并包围所述磁珠法核酸提取纯化区域和所述试剂样本混合区域,所述磁珠法核酸提取纯化区域设计在所述试剂样本混合区域下方。
基于上述,所述第一负压腔和所述第二负压腔内分别设置有注射泵。
本发明还提供了具有核酸自动提取纯化功能的液滴微流控芯片的应用,将所述具有核酸自动提取纯化功能的液滴微流控芯片应用于数字RT-PCR、数字LAMP、数字RPA、数字CRISPR、单细胞分析或单分子检测。
本发明的有益效果为:通过将核酸提取纯化、试剂混匀、微液滴生成集成在一张芯片上,可实现核酸的自动化提取及液滴生成,为核酸的预处理和数字化分析提供了简便、可行的操作方案,特别适合传染性疾病的现场快速检测。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述部分中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1为本发明实施例1微流控芯片结构示意图。
图2为本发明实施例1磁体吸附磁珠示意图。
图3为本发明实施例2 SARS-CoV-2利用液滴数字RT-PCR检测阴性标本的结果图。
图4为本发明实施例2 SARS-CoV-2利用液滴数字RT-PCR检测阳性标本的结果图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点,下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但是,本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施,因此,本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1
如图1和图2所示,本发明提出一种具有核酸自动提取纯化功能的液滴微流控芯片,包括磁珠法核酸提取纯化区域、试剂样本混合区域以及微液滴生成区域,每个区域之间由微流道连通;
所述磁珠法核酸提取纯化区域包括样本存储腔1、洗脱液存储腔2、第一负压腔3、压差洗脱流道4、矩形磁珠偏转流道5、磁体6和磁分离流道7;所述样本存储腔1和所述洗脱液存储腔2置于所述矩形磁珠偏转流道5的短边一侧,并通过微流道与所述矩形磁珠偏转流道5连通;所述第一负压腔3和所述压差洗脱流道4置于所述矩形磁珠偏转流道5的另一短边一侧,并通过微流道与所述矩形磁珠偏转流道5连通;所述压差洗脱流道4的出口与所述磁分离流道7连通;所述磁体6置于所述矩形磁珠偏转流道5和所述磁分离流道7的中间,分别起到偏转磁珠和磁颗粒团71形成的作用;
所述试剂混合区域包括试剂腔8、T形三通流道9和非对称混匀器10;所述T形三通流道9的第一入口连通所述试剂腔8,第二入口连通所述磁分离流道7,出口与所述非对称混匀器10的入口连通;
所述微液滴生成区域包括十字形四通流道11、储油腔12和第二负压腔13;所述十字形四通流道11的第一入口与所述非对称混匀器10的出口连通,相对的第二及第三入口均与所述储油腔12连通,出口流道与所述第二负压腔13连通。所述非对称混匀器10流出的混合试剂在所述十字形四通流道11的第二入口和第三入口流入的液滴生成油的流动聚焦作用下,生成大量油包水液滴。其中,第二负压腔13可作为液滴存储池存储单分散液滴供后续测试使用。
优选地,所述样本存储腔1和所述第一负压腔3位于同一侧,所述洗脱液存储腔2和所述压差洗脱流道4位于同一侧。与所述储油腔12连通的微流道对称设计并包围所述磁珠法核酸提取纯化区域和所述试剂样本混合区域,所述磁珠法核酸提取纯化区域设计在所述试剂样本混合区域下方。
优选地,所述微流道的加工采用铣床加工或软光刻工艺加工。
优选地,所述压差洗脱流道4的高压窄流道和低压宽流道的宽度比在1:1.5到1:15之间。
优选地,所述十字形四通流道11的几何尺寸选择为高40~150 μm,宽30~200 μm。
优选地,所述第一负压腔3和所述第二负压腔13内分别设置有注射泵。
本发明的使用方法如下:
(1)将第一负压腔3和第二负压腔13分别与注射泵连通,以提供稳定的负压。将磁体6置于磁珠偏转流道5和磁分离流道7中间的位置;将核酸提取液和磁珠加到咽拭子存储液中,充分混匀。
(2)将磁珠混合液、洗脱液、反应试剂和液滴生成油分别加入到样本存储腔1、洗脱液存储腔2、试剂腔8和储油腔12中。
(3)两个注射泵同时运行,上述所有溶液同时流入芯片。当磁珠混合液和洗脱液同时流经磁珠偏转流道5时会以层流的形式流动,在磁体6的作用下,磁珠混合液中的磁珠会发生偏转,由样本溶液转移至洗脱液中,并流经压差洗脱流道4。吸附有核酸的磁珠依次经历快速高压、慢速低压的洗脱过程将核酸解吸附;当磁珠流经磁分离流道7时,所有的磁珠在磁体6的磁力下都吸附于磁分离流道7的流道侧壁形成磁颗粒团71;解吸附的核酸溶液在T形三通流道9与反应试剂汇合并进入非对称混匀器10充分混合;混合溶液流经十字形四通流道11并与液滴生成油在流动聚焦作用下生成油包水的液滴。
(4)液滴可收集于第二负压腔13中,用于后续核酸的数字化分析。
实施例2
本实施例提供了具有核酸自动提取纯化功能的液滴微流控芯片的应用,将所述具有核酸自动提取纯化功能的液滴微流控芯片应用于数字RT-PCR、数字LAMP、数字RPA、数字CRISPR、单细胞分析或单分子检测。
数字RT-PCR检测SARS-CoV-2(COVID-19)的应用实例
采用实施例1的芯片对SARS-CoV-2(COVID-19)进行预处理和液滴生成。微液滴采用Bio-Rad QX200数字RT-PCR***进行液滴统计和数据分析。详细地操作过程如下:
S1:SARS-CoV-2(COVID-19)目标序列选择、样本准备和PCR引物设计。
样本信息
RT-PCR引物和探针
S2:芯片准备
第一负压腔3和第二负压腔13分别与注射泵连通,第一负压腔3的注射泵的体积流量为50 μL/min,第二负压腔13的注射泵的体积流量为40 μL/min。将磁体6置于磁珠偏转流道5和磁分离流道7中间的适当位置;将10 mg磁珠加到1 mL正常人的咽拭子存储液中,充分混匀;同时将10 mg磁珠加到10 fM合成的SARS-CoV-2序列溶液中模拟阳性标本检测。
S3:SARS-CoV-2检测过程
将100 μL磁珠-核酸预混液、100 μL洗脱液、30 μL数字RT-PCR反应试剂和100 μL液滴生成油分别加入到样本存储腔1、洗脱液存储腔2、试剂腔8和储油腔12中。
两个注射泵同时运行,上述所有溶液同时流入芯片中。当磁珠混合液和洗脱液在磁珠偏转流道5以层流的形式流动,磁珠混合液中的磁珠在磁体6的作用下发生偏转,转移至洗脱液中,吸附有核酸的磁珠依次经历快速高压、慢速低压的差压洗脱过程将核酸解吸附,并在磁体6的磁力下吸附于流道侧壁形成磁颗粒团71;解吸附的核酸溶液在T形三通流道9与数字RT-PCR反应试剂汇合并进入非对称混匀器10中充分混合;混合溶液流经十字形四通流道11并与液滴生成油在流动聚焦作用下生成2~3万个油包水的液滴存储在第二负压腔中。
1.5 min后,关闭所有注射泵。将液滴收集在96孔板中,并使用Bio-Rad QX200数字RT-PCR***的液滴读取仪(QX200 Droplet Reader)对液滴的荧光信号进行逐个采集。
S4:数据分析
当液滴中含有目标核酸序列会产生荧光信号,没有目标序列时不产生荧光信号,因此荧光液滴的数目可以表示样本中目标核酸的含量。如图3所示为正常人的咽拭子检测结果,液滴均不产生荧光(阴性信号),为阴性结果;如图4所示为模拟阳性标本的检测结果,荧光液滴(阳性信号)明显与背景液滴(阴性信号)产生区分,阳性标本的检测浓度为637拷贝/μL。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (4)
1.一种具有核酸自动提取纯化功能的液滴微流控芯片,其特征在于:包括磁珠法核酸提取纯化区域、试剂样本混合区域以及微液滴生成区域,每个区域之间由微流道连通;
所述磁珠法核酸提取纯化区域包括样本存储腔、洗脱液存储腔、磁体、矩形磁珠偏转流道、第一负压腔、压差洗脱流道和磁分离流道;
所述样本存储腔和所述洗脱液存储腔置于所述矩形磁珠偏转流道的短边一侧,并通过微流道与所述矩形磁珠偏转流道连通;所述第一负压腔和所述压差洗脱流道置于所述矩形磁珠偏转流道的另一短边一侧,并通过微流道与所述矩形磁珠偏转流道连通;所述压差洗脱流道的出口与所述磁分离流道连通;所述磁体置于所述矩形磁珠偏转流道和所述磁分离流道的中间;所述样本存储腔和所述第一负压腔位于同一侧,所述洗脱液存储腔和所述压差洗脱流道位于同一侧;所述压差洗脱流道的高压窄流道和低压宽流道的宽度比在1:1.5到1:15之间;
所述试剂混合区域包括T形三通流道、试剂腔和非对称混匀器;
所述T形三通流道的第一入口连通所述试剂腔,第二入口连通所述磁分离流道,出口与所述非对称混匀器的入口连通;
所述微液滴生成区域包括十字形四通流道、储油腔和第二负压腔;
所述十字形四通流道的第一入口与所述非对称混匀器的出口连通,相对的第二及第三入口均与所述储油腔连通,出口流道与所述第二负压腔连通;
所述第一负压腔和所述第二负压腔内分别设置有注射泵;
所述液滴微流控芯片的使用方法如下:
(1)将所述第一负压腔和所述第二负压腔分别与注射泵连通,以提供稳定的负压;将所述磁体置于所述矩形磁珠偏转流道和所述磁分离流道中间的位置;将核酸提取液和磁珠加到咽拭子存储液中,充分混匀;
(2)将磁珠混合液、洗脱液、反应试剂和液滴生成油分别加入到所述样本存储腔、所述洗脱液存储腔、所述试剂腔和所述储油腔中;
(3)两个注射泵同时运行,上述所有溶液同时流入芯片;
当磁珠混合液和洗脱液同时流经所述矩形磁珠偏转流道时会以层流的形式流动,在所述磁体的作用下,磁珠混合液中的磁珠会发生偏转,由样本溶液转移至洗脱液中,并流经所述压差洗脱流道;吸附有核酸的磁珠依次经历快速高压、慢速低压的洗脱过程将核酸解吸附;
当磁珠流经所述磁分离流道时,所有的磁珠在所述磁体的磁力下都吸附于所述磁分离流道的流道侧壁形成磁颗粒团;解吸附的核酸溶液在所述T形三通流道与反应试剂汇合并进入所述非对称混匀器充分混合;混合溶液流经所述十字形四通流道并与液滴生成油在流动聚焦作用下生成油包水的液滴;
(4)液滴可收集于所述第二负压腔中,用于后续的数字RT-PCR、数字LAMP、数字RPA、数字CRISPR、单细胞分析或单分子检测。
2.根据权利要求1所述的具有核酸自动提取纯化功能的液滴微流控芯片,其特征在于:所述微流道的加工采用铣床加工或软光刻工艺加工。
3.根据权利要求1所述的具有核酸自动提取纯化功能的液滴微流控芯片,其特征在于:所述十字形四通流道的几何尺寸选择为高40~150 μm,宽30~200 μm。
4.根据权利要求1所述的具有核酸自动提取纯化功能的液滴微流控芯片,其特征在于:与所述储油腔连通的微流道对称设计并包围所述磁珠法核酸提取纯化区域和所述试剂样本混合区域,所述磁珠法核酸提取纯化区域设计在所述试剂样本混合区域下方。
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- 2021-10-20 CN CN202111220906.0A patent/CN113817577B/zh active Active
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