CN113817063A - 抗人异常凝血酶原抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗体领域，具体涉及抗人异常凝血酶原抗体，以及所述抗体用于制备肝细胞癌检测试剂盒的用途。本发明的抗人异常凝血酶原抗体能够特异性结合人异常凝血酶原，能够从原料层面进一步避免来自血清或者血浆中凝血酶原的干扰，也可以进一步避免动物血清制品中其他物种来源异常凝血酶原的干扰，从源头规避相关的风险，降低试剂开发的难度，具有良好的应用前景。

Description

抗人异常凝血酶原抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗人异常凝血酶原抗体及其应用。

背景技术

正常凝血酶原是在肝细胞内由主要依赖维生素K的γ谷氨酰羧化酶及相关辅酶参与下，将结构域N端的第6，7，14，16，19，20，25，26，29和32位的10个谷氨酸(Glu)残基γ羧化为γ-羧基谷氨酸(Gla)，使之成为有活性的正常凝血酶原，上述任何位点的一个或多个Glu残基羧化不全，都可能形成异常凝血酶原(Des-γ-carboxyprothrombin，以下简称DCP)，失去凝血功能。目前将该N端称之为Glu-Gla区域，除了该区域外，正常凝血酶原和异常凝血酶原在结构上没有其他不同，均由凝血酶原片段F1、凝血酶原片段F2及C端的凝血酶区域组成。DCP，又名维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导的蛋白质(Protein induced by vitamin Kabsence-II,PIVKA-II)。其含量升高多见于维生素K缺乏、使用华法林治疗及肝细胞癌(以下简称HCC)患者，因此DCP被认为可以作为HCC的诊断标志物。近几年来，随着更多研究工作的开展，DCP在HCC的临床应用价值得到普遍认可，被纳入各种权威指南中，推荐用于高危人群的筛查、肝癌的辅助诊断、治疗效果监测、及作为预后和复发的预测工具。

随着DCP临床应用价值的被认可，各式各样的免疫检测方法应运而生，而免疫检测方法的灵敏度和特异性对于DCP应用于临床诊断的重要性毋庸置疑。当采用的抗体和样本中的DCP之外的其他抗原或者物质发生非特异的相互作用时，便会增加假阳性诊断的可能，提高个体不能得到准确诊断的风险，因此检测方法中所采用的抗体是否特异结合人样本中的DCP是保障其免疫检测方法灵敏度和特异性的关键。

在日本特开昭60-60557号公报和日本特开平5-249108号公报中，分别报道了利用特异性识别DCP单克隆抗体MU-3(17-27aa)和抗凝血酶原的兔多克隆抗体进行测定的免疫检测方法,前者把特异性识别DCP单克隆抗体MU-3(17-27aa)作为包被，避免了样本预处理环节，简化了流程，使DCP的检测方法相较早期放免方法更为实用，而后者将特异识别DCP单克隆抗体MU-3(17-27aa)调整为标记，减少样本中凝血酶原干扰以便获得更稳定的检测数据；在专利US9120862B2中报道的免疫检测方法中采用了一株特异识别DCP的单克隆抗体3C10(13-27aa)和一株抗凝血酶原抗体6H6(1-13aa)；在专利CN 104520710 B中报道的免疫检测方法则是采用了一株特异识别DCP的抗体MU-3(17-27aa)、一株特异识别凝血酶原F1片段抗体hPTN7-2和一株特异识别凝血酶原F2抗体20B8，通过三株抗体的联合应用，尤其是F1及F2片段抗体的按比例使用，建立了血清/血浆相关性高的检测***；在其他出版物中，H.Kinukawa et al.Clinical Biochemistry xxx(2015)xxx–xxx公开了一种DCP免疫检测方法，采用了特异识别DCP的3C10(13-27aa)抗体，同时结合另外一株抗凝血酶原抗体MCA1-8(33-46aa)构建了DCP的化学发光检测试剂。

目前的研究主要围绕采用识别DCP特定表位的抗体及凝血酶原的抗体搭配检测DCP或者相应抗体的应用办法，尚无特异性检测人DCP抗体的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种新的氨基酸序列的抗人异常凝血酶原抗体，含有编码该抗体的核酸的载体、转基因细胞系、重组菌、重组病毒以及该抗体在制备用于检测人异常凝血酶原试剂盒中的应用，解决了上述背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供抗人异常凝血酶原抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，能够特异性结合人异常凝血酶原，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示。

SEQ ID NO:1 GYTFTSYV

SEQ ID NO:2 IFPYNDVT

SEQ ID NO:3 ARWGGRNY

SEQ ID NO:4 QSLLDSDGKTY

SEQ ID NO:5 LVS

SEQ ID NO:6 WQGTHFPYT

优选地，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为如下任一种：

(1)如SEQ ID NO:7所示；

SEQ ID NO:7

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYIFPYNDVTEYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARWGGRNYWGQGTSVTV

(2)如SEQ ID NO:7所示的序列经一个或多个氨基酸的缺失、替换或***得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如SEQ ID NO:7所示的序列具有至少80％同源性且具有相同功能蛋白的氨基酸序列；所述同源性优选为至少85％；更优选为至少95％。

优选地，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列为如下任一种：

(1)如SEQ ID NO:8所示；

SEQ ID NO:8

DVVMTQTPLTLSITIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLQISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIKR

(2)如SEQ ID NO:8所示的序列经一个或多个氨基酸的缺失、替换或***得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如SEQ ID NO:8所示的序列具有至少80％同源性且具有相同功能蛋白的氨基酸序列。所述同源性优选为至少85％；更优选为至少95％。

本发明所述的抗体能够特异性结合人异常凝血酶原，其抗原识别区位于人异常凝血酶原的31-45位氨基酸区域内。

第二方面，本发明提供编码所述抗人异常凝血酶原抗体的核酸。

第三方面，本发明提供包含上述核酸的重组载体。

第四方面，本发明提供包含上述核酸的转基因细胞系。

第五方面，本发明提供包含上述核酸的重组菌。

第六方面，本发明提供包含上述核酸的重组病毒。

第七方面，本发明提供所述抗人异常凝血酶原抗体在制备肝细胞癌检测试剂盒中的应用。

第八方面，本发明提供肝细胞癌的检测试剂盒，其包含所述抗人异常凝血酶原抗体。

上述肝细胞癌的检测试剂盒除包含所述抗人异常凝血酶原抗体外，还可包含检测所需的其它试剂或材料，包括但不限于缓冲液、二抗等。

凝血酶原在血浆中的含量可以达到0.1-0.15mg/ml,即使凝血酶原在转化成凝血酶过程中会有一定消耗，在血清制品中依然会有15％左右的残留。一方面在检测人体中的DCP时如果试剂盒采用了凝血酶原的抗体，检测结果可能会受到血清或者血浆中凝血酶原的干扰，影响检测的准确性；另一方面，动物血清制品目前广泛应用于体外诊断试剂开发的各个环节，不单是采用凝血酶原的抗体可能会受到干扰，如果抗体不是特异识别人DCP的话，也有可能受到其他物种来源DCP的干扰，从而影响了检测结果的准确性,如果要避免该非特异可能要采取其他手段比如通过体系调整或者通过其他阻断剂来避免或者干脆直接不使用相关动物血清或相关制品，而这限制试剂开发条件同时也一定程度增加了试剂开发的复杂性。

本发明的有益效果在于：本发明的抗人异常凝血酶原能够特异识别人抗异常凝血酶原，可以从原料层面进一步避免来自血清或者血浆中凝血酶原的干扰，也可以进一步避免动物血清制品中其他物种来源异常凝血酶原的干扰，从源头规避相关的风险，降低试剂开发的难度，有相对较为广阔的应用前景。

附图说明

图1为DCP重组抗原的SDS-PAGE电泳鉴定图，其中，

泳道M：蛋白质分子量标记；

泳道1：人DCP 1-50aa-pGEX-20T；

泳道2：人DCP 1-50aa-pColdTF。

结果显示目的蛋白均得以大量表达，目的片段大小与理论值接近，并且具备较高的纯度。

图2为抗人DCP单克隆抗体的SDS-PAGE纯度鉴定图，其中

泳道M：蛋白质分子量标记；

泳道1：抗人DCP单克隆抗体。

图3为实施例1中抗原1和抗原2与抗人DCP单克隆抗体的抗原抗体间接法反应活性图。

图4为DCP雏形检测试剂与对照试剂相关性图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1异常凝血酶原重组抗原的制备

根据Gene Bank上检索到的凝血酶原序列(Accession number:NM_000506.5),进行重组表达克隆设计，全长序列如SEQ ID NO：9所示。根据DCP与正常凝血酶原差异的地方主要集中在前50个氨基酸，并且已报道的抗体表位普遍为线性表位，因此利用商品化载体pColdTF及pGEX-20T载体分别构建凝血酶原1-50aa的表达质粒，利用大肠杆菌表达***进行目的蛋白的表达，因为该蛋白在大肠杆菌中无法进行γ羧基化修饰，因此表达产物即为异常凝血酶原即DCP相应1-50aa,具体核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

因为两个表达载体均采用相同的酶切位点，因此引物相同，利用primer5.0，以BgLII及EcoR I为酶切位点进行引物设计，具体上下游引物(由通用生物合成)序列分别如SEQID NO：11及SEQ ID NO：12所示,克隆目的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。质粒构建后经测序和小量表达鉴定双重验证无误后，利用大肠杆菌表达***进行大量表达，收集菌体超声破碎离心，上清经镍介质(GE公司)亲和层析纯化获得蛋白，pGEX-20T及pColdTF载体表达的抗原分别命名为抗原1和抗原2，利用SDS-PAGE鉴定结果如图1所示，泳道1、2分别为抗原1和抗原2，结果显示目的蛋白均得以大量表达，目的片段大小与理论值接近，并且具备较高的纯度。

SEQ ID NO：9:

ATGGCGCACGTCCGAGGCTTGCAGCTGCCTGGCTGCCTGGCCCTGGCTGCCCTGTGTAGCCTTGTGCACAGCCAGCATGTGTTCCTGGCTCCTCAGCAAGCACGGTCGCTGCTCCAGCGGGTCCGGCGAGCCAACACCTTCTTGGAGGAGGTGCGCAAGGGCAACCTGGAGCGAGAGTGCGTGGAGGAGACGTGCAGCTACGAGGAGGCCTTCGAGGCTCTGGAGTCCTCCACGGCTACGGATGTGTTCTGGGCCAAGTACACAGCTTGTGAGACAGCGAGGACGCCTCGAGATAAGCTTGCTGCATGTCTGGAAGGTAACTGTGCTGAGGGTCTGGGTACGAACTACCGAGGGCATGTGAACATCACCCGGTCAGGCATTGAGTGCCAGCTATGGAGGAGTCGCTACCCACATAAGCCTGAAATCAACTCCACTACCCATCCTGGGGCCGACCTACAGGAGAATTTCTGCCGCAACCCCGACAGCAGCACCACGGGACCCTGGTGCTACACTACAGACCCCACCGTGAGGAGGCAGGAATGCAGCATCCCTGTCTGTGGCCAGGATCAAGTCACTGTAGCGATGACTCCACGCTCCGAAGGCTCCAGTGTGAATCTGTCACCTCCATTGGAGCAGTGTGTCCCTGATCGGGGGCAGCAGTACCAGGGGCGCCTGGCGGTGACCACACATGGGCTCCCCTGCCTGGCCTGGGCCAGCGCACAGGCCAAGGCCCTGAGCAAGCACCAGGACTTCAACTCAGCTGTGCAGCTGGTGGAGAACTTCTGCCGCAACCCAGACGGGGATGAGGAGGGCGCGTGGTGCTATGTGGCCGGGAAGCCTGGCGACTTTGGGTACTGCGACCTCAACTATTGTGAGGAGGCCGTGGAGGAGGAGACAGGAGATGGGCTGGATGAGGACTCAGACAGGGCCATCGAAGGGCGTACCGCCACCAGTGAGTACCAGACTTTCTTCAATCCGAGGACCTTTGGCTCGGGAGAGGCAGACTGTGGGCTGCGACCTCTGTTCGAGAAGAAGTCGCTGGAGGACAAAACCGAAAGAGAGCTCCTGGAATCCTACATCGACGGGCGCATTGTGGAGGGCTCGGATGCAGAGATCGGCATGTCACCTTGGCAGGTGATGCTTTTCCGGAAGAGTCCCCAGGAGCTGCTGTGTGGGGCCAGCCTCATCAGTGACCGCTGGGTCCTCACCGCCGCCCACTGCCTCCTGTACCCGCCCTGGGACAAGAACTTCACCGAGAATGACCTTCTGGTGCGCATTGGCAAGCACTCCCGCACCAGGTACGAGCGAAACATTGAAAAGATATCCATGTTGGAAAAGATCTACATCCACCCCAGGTACAACTGGCGGGAGAACCTGGACCGGGACATTGCCCTGATGAAGCTGAAGAAGCCTGTTGCCTTCAGTGACTACATTCACCCTGTGTGTCTGCCCGACAGGGAGACGGCAGCCAGCTTGCTCCAGGCTGGATACAAGGGGCGGGTGACAGGCTGGGGCAACCTGAAGGAGACGTGGACAGCCAACGTTGGTAAGGGGCAGCCCAGTGTCCTGCAGGTGGTGAACCTGCCCATTGTGGAGCGGCCGGTCTGCAAGGACTCCACCCGGATCCGCATCACTGACAACATGTTCTGTGCTGGTTACAAGCCTGATGAAGGGAAACGAGGGGATGCCTGTGAAGGTGACAGTGGGGGACCCTTTGTCATGAAGAGCCCCTTTAACAACCGCTGGTATCAAATGGGCATCGTCTCATGGGGTGAAGGCTGTGACCGGGATGGGAAATATGGCTTCTACACACATGTGTTCCGCCTGAAGAAGTGGATACAGAAGGTCATTGATCAGTTTGGAGAGTAG

SEQ ID NO：10:

ATGGCGCACGTCCGAGGCTTGCAGCTGCCTGGCTGCCTGGCCCTGGCTGCCCTGTGTAGCCTTGTGCACAGCCAGCATGTGTTCCTGGCTCCTCAGCAAGCACGGTCGCTGCTCCAGCGGGTCCGGCGAGCCAACACCTTCTTGGAGGAG

SEQ ID NO：11:

AGATCTATGGCGCACGTCCGAGGCTTGC

SEQ ID NO:12:

GAATTCCTCCTCCAAGAAGGTGTTGGCTCGCC

SEQ ID NO：13:

MAHVRGLQLPGCLALAALCSLVHSQHVFLAPQQARSLLQRVRRANTFLEE

实施例2异常凝血酶原单克隆抗体的制备

1、免疫原的准备：免疫原为实施例1中制备的抗原1。将抗原1用10mmol/L PBS稀释至0.4mg/mL，按照终浓度为200ug/ml取相应抗原与弗氏佐剂等体积混合，使其成油包水状乳剂。初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂。

2、基础免疫：选择6-8周龄BALB/c雌鼠进行皮下多点注射免疫，免疫原注射剂量为500μL/只/次，免疫间隔为2周，完整免疫程序为4针，在第2、3、4针免疫后2周用眼眶采血法采集分离血清用于间接ELISA测定免疫效价，确定小鼠血清效价达到平台期后，于细胞融合前72小时，以100ug/只剂量抗原1进行脾脏免疫。

3、杂交瘤细胞筛选

3.1饲养细胞之巨噬细胞的制备：

(i)6周龄左右的BALB/c小鼠引颈处死，在75％酒精溶液中浸泡5min后；取出放入事先置于超净工作台的无菌平皿中，利用止血钳调整小鼠姿态，使其腹部朝上，整体更为舒展，将小鼠摆横，用止血钳夹近小鼠腹部偏下位置皮肤，骤然发力反方向撕拉开皮肤，充分暴露腹部。

(ii)无菌眼科弯镊提起腹膜，然后用5mL注射器向腹腔内注入适量培养基，以使其腹部充分鼓胀为准，放下注射器，双手持止血钳配合将小鼠对侧四肢提起轻柔摇晃，使腹腔中巨噬细胞充分浸润后用同一注射器吸出注入事先配制好的含20％胎牛血清的1640HT培养基中备用。

3.2饲养细胞之胸腺细胞的制备：

(i)三周龄BALB/c小鼠引颈处死，在75％酒精溶液中浸泡5min后；取出放入事先置于超净工作台的无菌平皿中，利用止血钳调整小鼠姿态，使其腹部朝上，整体更为舒展，将小鼠摆横，用止血钳夹近小鼠胸部偏下位置皮肤，骤然发力反方向撕拉开皮肤，充分暴露胸腹部。

(ii)左手用无菌弯镊隔胸腹部皮肤夹住胸骨尖，沿着胸骨体外沿剪开，充分暴露胸腔隔膜，并始终保持夹住胸骨尖，尽可能暴露胸腔的状态。

(iii)右手持干净的眼科剪剪开胸腔隔膜，充分暴露胸腔，用弯镊探入胸腔，夹住胸腺根部，完整取出胸腺，放入事先放置于平皿并用培养基浸润的200目筛网中进行研磨，得到胸腺饲养细胞液，全数转移进上述含20％胎牛血清的1640HT培养基中备用。

3.3小鼠骨髓瘤细胞的制备：融合前5天复苏小鼠骨髓瘤细胞，每次融合约需6瓶35cm²90％-100％密度的小鼠骨髓瘤细胞。

3.4脾细胞的制备：

(i)取待融合的BALB/c小鼠，眼眶采血，待血流停止，断颈处死小鼠，浸泡于75％酒精溶液中5min，随即放入超净台内无菌平皿上，右侧卧位。

(ii)用3.1所述方法暴露腹腔，无菌手术打开腹腔取出脾脏，放入事先放置于平皿并用培养基浸润的200目筛网中进行研磨，制备脾脏细胞悬液转移到50ml无菌离心管中。

(iii)补加适量RPMI-1640培养液30-35ml,用弯管清除明显的脂肪聚团及其他杂质后，1500rpm/min,5min/次，离心收集脾脏细胞，离心去上清，补加新的培养基30-35ml,重复上述过程2次清洗脾脏细胞。

(iv)用RPMI-1640培养液重悬细胞，计数。

3.5细胞融合：

(i)融合前先将1mL的PEG-1450和35mL的RPMI-1640无血清培养基和200mL事先配好的含20％胎牛血清的HAT完全培养基预温至37℃。

(ii)将制备的骨髓瘤细胞与脾细胞按比例1×10⁸脾细胞+1×10⁷骨髓瘤细胞，约10:1混合于50mL离心管内，离心1500rpm×5min，离心后，尽可能倒掉上清液，轻轻弹击管底，使细胞疏松成糊状。

(iii)1mL移液器管吸取1ml PEG加入离心管内，边加边轻轻用弯管吹打混匀，时间控制在60s左右，随即加入35mL预温的RPMI-1640完全培养液终止融合反应。

(iv)静置1-5min后，离心1000rpm×5min，小心弃上清液，用手指轻柔弹匀细胞后，加入上述完全培养基充分重悬细胞后，全数移入到已经事先添加饲养层细胞的完全培养基中，混匀后，按200ul/孔铺入96孔细胞培养板，放入CO₂孵育箱中培养。

(v)7天后，用15％HT完全培养基给孔中的细胞上清进行100％的换液；7天后，吸取上清检测。

3.6杂交瘤的筛选：利用实施例1中制备的抗原2差异筛选，间接ELISA筛选，包被抗原200ng/mL，每孔包被0.1mL，加入细胞上清50uL检测，并挑选出阳性克隆孔。

3.7杂交瘤细胞的克隆化：采用有限稀释法，先把细胞按一定浓度进行梯度稀释，然后接种到96孔细胞培养板的每个孔中，尽可能使孔内只有一个细胞生长。杂交瘤单克隆阳性细胞株重复克隆至少3次，最终需要100％阳性后确认为稳定克隆株。

3.8抗体分型：在抗原2包被的板中平行加入50ul/孔稳定细胞株上清，于37度培养箱放置30min后，洗板5次，拍干后加入50ul/孔IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM分型酶，反应30min后，洗板加入100ul/孔显色液，15min后用终止液终止读板，根据结果确定抗体为IgG1型。

4.单抗制备

4.1单抗腹水的生产

致敏BALB/c小鼠，1周后，将对数生长期的稳定杂交瘤细胞重悬以1500rpm离心5min收集细胞，沉淀细胞用无血清培养液悬浮，并将细胞数调至(1-2)×10⁶/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL进行腹水诱导。7～10d后，小鼠腹部明显膨大后，收集腹水。收集的腹水置离心管离心，12000rpm，10min，离心后收集上清备用。

4.2单抗腹水的纯化

经硫酸铵沉淀和Protein A亲和层析纯化(购自美国GE公司)，获得高纯度的单克隆抗体(命名为10D9-1)，抗体12％SDS-PAGE纯度鉴定结果如图2所示。

4.3单抗间接法活性测定

EIA方法评价纯化后抗体与抗原的反应性，分别包被抗原1和抗原2，均200ng/mL，每孔包被100ul，将待评估抗体稀释到1ug/ml、0.1ug/ml、0.01ug/ml、0.001ug/ml、0.0001ug/ml,评价抗体与抗原的反应性，结果抗体与两个抗原均有很好的反应性，具体图3所示。

实施例3单抗表位鉴定

1、15肽鉴定

抗原1用碳酸缓冲液(20mmol/L CB，pH 9.6)稀释后按照200ng/ml包被于聚氯乙烯板上，将纯化好的抗体与合成的DCP1-50aa多肽(生工合成，多肽长度为15aa,按先后重叠5个氨基酸进行合成，如表中下划线所示，具体序列信息见表1)按比例100ng/ml抗体：50ug/ml多肽等体积孵育30min，即为检测样品；对照样品为100ng/ml抗体：PBS，孵育30min，将孵育后的检测样品和对照样品双孔重复加入到抗原1包被的板内孵育30min，洗板5次，加入GAM-HRP(1/5000稀释)孵育30min，洗板5次，加入底物孵育15min。酶标仪波长450-620读值，最后将检测出来的OD值进行计算分析，计算公式为(对照样品OD均值－检测样品OD均值)/对照样品OD均值，判定标准为：大于90％以上显示有良好的竞争效果，显示抗体应该识别该表位，10D9-1识别表位位于31-45aa，具体数据如下表2所示。

表1 DCP15肽合成信息

序列号	表位	氨基酸序列信息
			DP1	1-15	ANTFLEEVRK<u>GNLER</u>
DP2	11-25	<u>GNLER</u>ECVEE<u>TCSYE</u>
			DP3	21-35	<u>TCSYE</u>EAFEA<u>LESST</u>
DP4	31-45	<u>LESST</u>ATDVF<u>WAKYT</u>
			DP5	41-55	<u>WAKYT</u>ACETARTPRD

表2 10D9-115肽反应性鉴定结果

序列编号	10D9-1
		DP1	-6％
DP2	-4％
		DP3	-4％
DP4	96％
		DP5	-2％

2、8肽鉴定

抗原1用碳酸缓冲液(20mmol/L CB，pH 9.6)稀释后按照200ng/ml包被于聚氯乙烯板上，将纯化好的10D9-1与由生工合成的DCP 8肽(将31-45aa,按照多肽长度为8aa,单个氨基酸位移方式合而成，具体序列信息见表3)按比例100ng/ml抗体：50ug/ml多肽等体积孵育30min，即为检测样品；对照样品为100ng/ml抗体：PBS，孵育30min，将孵育后的检测样品和对照样品双孔重复加入到抗原1包被的板内孵育30min，洗板5次，加入GAM-HRP(1/5000稀释)孵育30min，洗板5次，加入底物孵育15min。酶标仪波长450-620读值，最后将检测出来的OD值进行计算分析，计算公式为(对照样品OD值－检测样品OD值)/对照样品OD值，判定标准为：大于90％以上显示有良好的竞争效果，显示抗体应该识别该表位，结果显示本抗人异常凝血酶原单克隆抗体与任一8肽均不反应，具体数据如下表4所示。

表3 DCP8肽合成信息

序列编号	表位信息	氨基酸序列信息
			DP41	31-38	LESSTATD
DP42	32-39	ESSTATDV
			DP43	33-40	SSTATDVF
DP44	34-41	STATDVFW
			DP45	35-42	TATDVFWA
DP46	36-43	ATDVFWAK
			DP47	37-44	TDVFWAKY
DP48	38-45	DVFWAKYT

表4 10D9-18肽反应性鉴定结果

序列编号	10D9-1
		DP41	-2％
DP42	10％
		DP43	33％
DP44	29％
		DP45	-9％
DP46	4％
		DP47	11％
DP48	10％

实施例4单抗种属特异性评价

在UniProt上查找31-45aa区段与人DCP同源性较高(70％以上),尤其是其动物血清制品广泛应用于体外诊断行业中，可能引起交叉反应产生干扰的物种的相应序列，如牛、绵羊、山羊、马、兔等，具体物种如表5所示，根据差异位点分类，最终合成其血清制品在体外诊断行业广泛应用的物种对应31-45aa多肽(字体倾斜，合计8条)，用于评价，评价方法如下：抗原1用碳酸缓冲液(20mmol/L CB，pH 9.6)稀释后按照200ng/ml包被于聚氯乙烯板上，将纯化好的10D9-1与由生工合成的不同物种31-45aa多肽，按比例100ng/ml抗体：50ug/ml多肽等体积孵育30min，即为检测样品；对照样品为100ng/ml抗体：PBS，孵育30min，将孵育后的检测样品和对照样品双孔重复加入到抗原1包被的板内孵育30min，洗板5次，加入GAM-HRP(1/5000稀释)孵育30min，洗板5次，加入底物孵育15min。酶标仪波长450-620读值，最后将检测出来的OD值进行计算分析，计算公式为(对照样品OD值－检测样品OD值)/对照样品OD值，判定标准为：大于90％以上显示有良好的竞争效果，显示抗体应该识别该表位，结果显示本发明的抗人异常凝血酶原单克隆抗体与其他物种的31-45aa均不反应，即该抗体特异识别人DCP 31-45aa，具体数据如下表6所示。

表5不同物种DCP31-45aa氨基酸序列信息

编号	物种	学名	表位信息	氨基酸序列信息
					1	人	Homosapiens	31-45	LESSTATDVFWAKYT
2	猕猴	Macacamulatta	31-45	LESLSATDAFWAKYT
					3	安哥拉疣猴	Colobusangolensispalliatus	31-45	LESLSATDAFWAKYT
4	东非狒狒	Papioanubis	31-45	LESLSATDAFWAKYT
					5	白顶白眉猴	cercocebusatys	31-45	LESLSATDAFWAKYT
6	食蟹猴	macacafascicularis	31-45	LESLSATDAFWAKYT
					7	平顶猴	Macacanemestrina	31-45	LESLSATDAFWAKYT
8	鼠耳蝠	Myotislucifugus	31-45	LESLSATDAFWAKYT
					9	家牛	Bostaurus	31-45	LESLSATDAFWAKYT
10	绵羊	Ovisaries	31-45	LESPSATDVFWAKYT
					11	白鲸	Delphinapterusleucas	31-45	LESPSATDVFWAKYT
12	白暨豚	Lipotesvexillifer	31-45	LESPSATDVFWAKYT
					13	宽吻海豚	Tursiopstruncatus	31-45	LESPSATDVFWAKYT
14	秦岭川金丝猴	Rhinopithecusroxellana	31-45	LESPSATDAFWAKYT
					15	黑白仰鼻猴	Rhinopithecusbieti	31-45	LESPSATDAFWAKYT
16	抹香鲸	Physetermacrocephalus	31-45	LESPSATDAFWAKYT
					17	家马	Equuscaballus	31-45	LESSSATEAFWAKYT
18	家兔	Oryctolaguscuniculus	31-45	LESSSATEAFWAKYT
					19	家鼠	Musmusculus	31-45	LESPQDTDVFWAKYT
20	大白鼠	Rattusnorvegicus	31-45	LESPQDTDVFWAKYT
					21	山羊	Caprahircus	31-45	LESPGATDVFWAKYT
22	原鸡家鸡	Gallusgallus	31-45	LESTVDTDAFWAKYT

表6本发明10D9-1对不同物种31-45aa交叉反应性

实施例5抗体酶免平台应用效果评价

DCP抗体11H8-3(英博迈产品目录,货号M3404,结合DCP 11-25aa氨基酸序列)，5ug/ml包被，包被缓冲溶液为20mmol/L PB7.4,100ul/孔37度2小时包被于聚氯乙烯板上，10D9-1标记上辣根过氧化物酶,标记浓度为1mg/ml。DCP质控品、样本血清、阳性对照、空白对照，分别加入相应孔中30ul，置37°温育30min，清洗板5次加入10D9-1-HRP(20ug/ml)温育30min，清洗板5次，加入底物温育15min。酶标仪波长450-620读值，根据标准曲线返算测定结果显示该抗体配对检测与背景(雅培)有较好的相关性，具体如表7。

表7抗体酶免平台评价结果

背景值(mAu/ml)	定值
		11364	10655
15085	14144
		2151	2017
3756	3522
		8873	8319
4961	4651
		1010	947
455	427
		683	640

实施例6抗体发光平台评价结果

6.1 11H8-3抗体磁微粒包被

(1)将磁微粒和EDC平衡至室温，取浓度为4mg/ml的磁微粒，加入一定浓度的活化剂EDC，置于室温活化30min。

(2)取活化后的磁微粒，利用集磁设备集磁后去除上清液，加入MES缓冲溶液重悬。

(3)加入一定量的11H8-3抗体，混匀后室温反应3h。

(4)利用磁力架集磁后去除上清液，加入等体积的含一定蛋白的磷酸盐缓冲液，室温反应3h。

(5)利用集磁设备集磁后去除上清液，加入等体积的清洗液重复洗涤4次。

(6)将清洗后的磁微粒保存于磁珠稀释液中，放置于2-8℃储存。

6.2本发明抗人异常凝血酶原单克隆抗体吖啶酯标记

(1)将吖啶酯加入含磷酸盐缓冲液的本发明抗人异常凝血酶原单克隆抗体混匀后，室温避光反应30min。

(2)加入终止缓冲液，混匀后室温避光反应30min.

(3)将标记的吖啶酯透析后，先加入等体积甘油混匀，再加入10％BSA混合，-20℃避光保存。

6.311H8-3-10D9-1组建的DCP雏形试剂上机检测

将构建好的DCP试剂置于全自动化学发光仪Caris200上，按照全自动化学发光仪Caris200的标准操作规程检测样本。选择市场主流的商品化试剂雅培DCP化学发光检测试剂作为对照试剂，严格按照商品化试剂说明书操作，将构建好的DCP雏形检测试剂与商品化的DCP检测试剂(雅培)平行检测58例临床样本，两者检测结果的相关系数r值为0.981，显示利用特异性识别人DCP的抗体10D9-1抗体构建的雏形试剂具备优良的检测效果，具体如图4所示。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

序列表

<110> 厦门英博迈生物科技有限公司

<120> 抗人异常凝血酶原抗体及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Human Des-γ-carboxyprothrombin VH CDR1

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Human Des-γ-carboxyprothrombin VH CDR2

<400> 2

Ile Phe Pro Tyr Asn Asp Val Thr

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Human Des-γ-carboxyprothrombin VH CDR3

<400> 3

Ala Arg Trp Gly Gly Arg Asn Tyr

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Human Des-γ-carboxyprothrombin VL CDR1

<400> 4

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> Human Des-γ-carboxyprothrombin VL CDR2

<400> 5

Leu Val Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Human Des-γ-carboxyprothrombin VL CDR3

<400> 6

Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 113

<212> PRT

<213> Human Des-γ-carboxyprothrombin VH

<400> 7

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Phe Pro Tyr Asn Asp Val Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Gly Arg Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr

100 105 110

Val

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> Human Des-γ-carboxyprothrombin VL

<400> 8

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Ile Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Gln Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 10

<211> 1869

<212> DNA

<213> Human prothrombin

<400> 10

atggcgcacg tccgaggctt gcagctgcct ggctgcctgg ccctggctgc cctgtgtagc 60

cttgtgcaca gccagcatgt gttcctggct cctcagcaag cacggtcgct gctccagcgg 120

gtccggcgag ccaacacctt cttggaggag gtgcgcaagg gcaacctgga gcgagagtgc 180

gtggaggaga cgtgcagcta cgaggaggcc ttcgaggctc tggagtcctc cacggctacg 240

gatgtgttct gggccaagta cacagcttgt gagacagcga ggacgcctcg agataagctt 300

gctgcatgtc tggaaggtaa ctgtgctgag ggtctgggta cgaactaccg agggcatgtg 360

aacatcaccc ggtcaggcat tgagtgccag ctatggagga gtcgctaccc acataagcct 420

gaaatcaact ccactaccca tcctggggcc gacctacagg agaatttctg ccgcaacccc 480

gacagcagca ccacgggacc ctggtgctac actacagacc ccaccgtgag gaggcaggaa 540

tgcagcatcc ctgtctgtgg ccaggatcaa gtcactgtag cgatgactcc acgctccgaa 600

ggctccagtg tgaatctgtc acctccattg gagcagtgtg tccctgatcg ggggcagcag 660

taccaggggc gcctggcggt gaccacacat gggctcccct gcctggcctg ggccagcgca 720

caggccaagg ccctgagcaa gcaccaggac ttcaactcag ctgtgcagct ggtggagaac 780

ttctgccgca acccagacgg ggatgaggag ggcgcgtggt gctatgtggc cgggaagcct 840

ggcgactttg ggtactgcga cctcaactat tgtgaggagg ccgtggagga ggagacagga 900

gatgggctgg atgaggactc agacagggcc atcgaagggc gtaccgccac cagtgagtac 960

cagactttct tcaatccgag gacctttggc tcgggagagg cagactgtgg gctgcgacct 1020

ctgttcgaga agaagtcgct ggaggacaaa accgaaagag agctcctgga atcctacatc 1080

gacgggcgca ttgtggaggg ctcggatgca gagatcggca tgtcaccttg gcaggtgatg 1140

cttttccgga agagtcccca ggagctgctg tgtggggcca gcctcatcag tgaccgctgg 1200

gtcctcaccg ccgcccactg cctcctgtac ccgccctggg acaagaactt caccgagaat 1260

gaccttctgg tgcgcattgg caagcactcc cgcaccaggt acgagcgaaa cattgaaaag 1320

atatccatgt tggaaaagat ctacatccac cccaggtaca actggcggga gaacctggac 1380

cgggacattg ccctgatgaa gctgaagaag cctgttgcct tcagtgacta cattcaccct 1440

gtgtgtctgc ccgacaggga gacggcagcc agcttgctcc aggctggata caaggggcgg 1500

gtgacaggct ggggcaacct gaaggagacg tggacagcca acgttggtaa ggggcagccc 1560

agtgtcctgc aggtggtgaa cctgcccatt gtggagcggc cggtctgcaa ggactccacc 1620

cggatccgca tcactgacaa catgttctgt gctggttaca agcctgatga agggaaacga 1680

ggggatgcct gtgaaggtga cagtggggga ccctttgtca tgaagagccc ctttaacaac 1740

cgctggtatc aaatgggcat cgtctcatgg ggtgaaggct gtgaccggga tgggaaatat 1800

ggcttctaca cacatgtgtt ccgcctgaag aagtggatac agaaggtcat tgatcagttt 1860

ggagagtag 1869

<210> 10

<211> 150

<212> DNA

<213> Human Des-γ-carboxyprothrombin

<400> 10

atggcgcacg tccgaggctt gcagctgcct ggctgcctgg ccctggctgc cctgtgtagc 60

cttgtgcaca gccagcatgt gttcctggct cctcagcaag cacggtcgct gctccagcgg 120

gtccggcgag ccaacacctt cttggaggag 150

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agatctatgg cgcacgtccg aggcttgc 28

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaattcctcc tccaagaagg tgttggctcg cc 32

<210> 13

<211> 50

<212> PRT

<213> Human Des-γ-carboxyprothrombin

<400> 13

Met Ala His Val Arg Gly Leu Gln Leu Pro Gly Cys Leu Ala Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Cys Ser Leu Val His Ser Gln His Val Phe Leu Ala Pro Gln

20 25 30

Gln Ala Arg Ser Leu Leu Gln Arg Val Arg Arg Ala Asn Thr Phe Leu

35 40 45

Glu Glu

50

Claims (10)

1.抗人异常凝血酶原抗体，其特征在于，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，能够特异性结合人异常凝血酶原，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO:1～3所示；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4～6所示。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

3.根据权利要求1或2任一项所述的抗人异常凝血酶原抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、单价抗体、多特异性抗体或Fab片段中的一种或多种。

4.编码权利要求1或2任一项所述的抗人异常凝血酶原抗体的核酸。

5.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求4所述的核酸。

6.一种转基因细胞系，其特征在于，所述转基因细胞系含有如权利要求4所述的核酸。

7.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌含有如权利要求4所述的核酸。

8.一种重组病毒，其特征在于，所述重组病毒含有如权利要求4所述的核酸。

9.权利要求1～3任一项所述的抗人异常凝血酶原抗体在制备肝细胞癌检测试剂盒中的应用。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～3任一项所述的抗体。

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