CN113811770B - 抑制干扰的药代动力学免疫测定 - Google Patents

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Abstract

本文报道了一种用于确定含血清样品中的双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：首先将已经固定化有与所述双特异性抗体特异性结合的捕获抗体的固相与所述样品一起孵育，以形成固定化的捕获抗体‑双特异性抗体‑复合物，此后将所述固相与同所述捕获抗体竞争与所述双特异性抗体的结合的替换抗体一起孵育，并且由此形成包含替换抗体‑双特异性抗体‑复合物的溶液，以及在所述溶液中确定所述替换抗体‑双特异性抗体‑复合物。

Description

抑制干扰的药代动力学免疫测定
技术领域
本发明属于免疫测定领域，更具体地说属于药代动力学免疫测定领域。本文报道了用于在干扰性单特异性抗体存在的情况下检测含血清样品中的双特异性抗体的干扰抑制免疫测定等。
背景技术
为了分析体外或体内来源的样品中的治疗性单克隆抗体(tmAb)，需要进行相应的测定，尤其是在tmAb开发的早期阶段。这需要提供特异性结合试剂，例如用于确定tmAb的抗独特型抗体。
特别是对于tmAb的完整药代动力学评价，了解在类似治疗条件下给药后血浆/血清样品中的可溶性tmAb浓度很重要。
Lee,J.W.,等人(AAPS J.13(2011)99-110)报告称，支持药物开发的生物分析的主要驱动因素是数据的预期用途。测量循环中的mAb及其抗原配体(L)的可靠方法对于评估暴露-应答关系以支持疗效和安全性评价以及剂量选择至关重要。
De Zwart等人(Bioanal.8(2016)2065-2070)在一份***中报道了生物分析方法验证中联合用药的干扰测试。de Zwart等人根据以往经验使用的调查数据得出结论，对于计划内和计划外联合用药，不存在联合用药干扰试验药的LC-MS/MS测定的情况(数据来自389项观察)，而对于基于LBA的测定，调查数据仅确定了36项测定中报告干扰的一项。
配体结合测定(LBA)广泛用于分析蛋白质生物治疗药物和抗原配体(L)，以支持药代动力学/药效学(PK/PD)和安全性评估。
发明内容
本文报道了一种用于确定含血清样品中的至少双特异性(治疗性)抗体的存在或量的免疫测定。更详细地，所述测定是两步测定，包括用于减少来自同样存在于样品中的单特异性(治疗性)抗体的干扰的替换步骤。因此，可以减少在免疫测定中由包含所述至少双特异性抗体的一个结合位点的第二抗体的存在引起的干扰。在根据本发明的免疫测定中，首次采用这种中间替换步骤来减少免疫测定干扰。
根据本发明的一个方面是一种用于确定含血清样品中的多特异性治疗性抗体，优选双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将已经固定化有与所述治疗性抗体特异性结合的捕获抗体的固相与所述样品一起孵育以形成固定化的捕获抗体-治疗性抗体-复合物，
b)任选地洗涤所述固相，其中所述捕获抗体-治疗性抗体-复合物保持与所述固相结合，
c)将所述固相与在空间上干扰所述捕获抗体与所述治疗性抗体的结合，或同所述捕获抗体竞争与所述治疗性抗体的结合，或同所述治疗性抗体上和所述捕获抗体相同的表位结合的替换抗体孵育，从而将治疗性抗体从固相分离并形成包含替换抗体-治疗性抗体-复合物的溶液，
d)在步骤c)中获得的所述溶液中确定所述替换抗体-治疗性抗体-复合物，从而确定含血清样品中的所述治疗性抗体。
根据本发明的进一步方面是一种用于从含血清样品中富集治疗性抗体，优选多特异性，最优选双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将已经固定化有与所述治疗性抗体特异性结合的捕获抗体的固相与所述样品一起孵育以形成固定化的捕获抗体-治疗性抗体-复合物，
b)任选地洗涤所述固相，其中所述捕获抗体-治疗性抗体-复合物保持与所述固相结合，
c)将所述固相与同所述捕获抗体竞争与所述治疗性抗体的结合的替换抗体一起孵育，并且由此将所述治疗性抗体从所述固相分离，并形成包含替换抗体-治疗性抗体-复合物的溶液，从而从含血清的样品中富集所述治疗性抗体。
在所有方面和实施例的一个实施例中，替换抗体是具有与捕获抗体相同的特异性并且具有(稍微)更高亲和力的抗体。在一个实施例中，替换抗体具有与治疗性抗体结合的KD值(作为结合亲和力的量度)，该值比捕获抗体的KD值低一个数量级。
在所有方面和实施例的一个实施例中，捕获抗体被生物素化，固相与链霉亲和素缀合，并且通过抗体的生物素和固相的链霉亲和素的相互作用来进行捕获抗体的固定化。
在所有方面和实施例的一个实施例中，在免疫测定中进行替换抗体-治疗性抗体-复合物的检测。在一个实施例中，免疫测定是桥接免疫测定，优选桥接ELISA。
在所有方面和实施例的一个实施例中，标记替换抗体，并且通过检测所述标记来进行替换抗体-治疗性抗体-复合物的确定。在一个实施例中，替换抗体与异羟基洋地黄毒苷缀合，并且通过抗异羟基洋地黄毒苷抗体来进行检测。
在所有方面和实施例的一个实施例中，治疗性抗体包含与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点。在一个实施例中，治疗性抗体是双特异性三价抗体，该治疗性抗体具有一个与第一抗原特异性结合的结合位点和两个与第二抗原特异性结合的结合位点。
在所有方面和实施例的一个实施例中，捕获抗体或替换抗体或两者都是抗独特型抗体。在一个实施例中，捕获抗体或替换抗体或两者是与治疗性抗体的第一结合位点特异性结合的抗独特型抗体。
在所有方面和实施例的一个优选实施例中，捕获抗体是针对双特异性治疗性抗体的第一结合位点/与双特异性治疗性抗体的第一结合位点特异性结合的抗独特型抗体。
在所有方面和实施例的一个优选实施例中，替换抗体是针对双特异性治疗性抗体的第一结合位点/与双特异性治疗性抗体的第一结合位点特异性结合的抗独特型抗体。
在所有方面和实施例的一个优选实施例中，捕获抗体和替换抗体是针对双特异性治疗性抗体的第一结合位点/与双特异性治疗性抗体的第一结合位点特异性结合的不同抗独特型抗体。
在所有方面和实施例的一个实施例中，经由与治疗性抗体的第二结合特异性进行特异性结合的固定化的抗独特型抗体来进行替换抗体-治疗性抗体可溶性复合物的捕获，并且经由与替换抗体缀合的可检测标记进行检测。
在所有方面和实施例的一个实施例中，步骤d)是将步骤c)中获得的溶液与第二固相一起孵育以形成固定化的第二捕获分子-治疗性抗体-替换抗体复合物，与治疗性抗体(例如，第二抗原或与治疗性抗体的第二结合位点特异性结合的抗独特型抗体或与人抗体的恒定区/恒定结构域特异性结合的抗体)特异性结合的第二捕获分子，优选地第二捕获抗体(其不同于第一捕获抗体)已经固定化到所述第二固相，其中所述溶液包含替换抗体-治疗性抗体-复合物，并且通过确定所述固定化的第二捕获分子-治疗性抗体-替换抗体复合物进行确定。在一个实施例中，第二捕获分子不同替换抗体竞争与治疗性抗体的结合。
在所有方面和实施例的一个实施例中，替换抗体是具有与捕获抗体相同的结合特异性(相同表位)或捕获抗体本身的抗体。
在所有方面和实施例的一个实施例中，将步骤c)中的固相与约6.67nM或更高浓度的替换抗体一起孵育。
在所有方面和实施例的一个实施例中，含血清样品包含治疗性抗体(其为多特异性抗体)和包含治疗性抗体的一个结合位点的单特异性抗体，且所述方法是在确定治疗性抗体的存在或量时减少单特异性抗体的干扰的方法。在一个实施例中，样品获自在施用治疗性抗体之前已施用单特异性抗体的个体。
在所有方面和实施例的一个实施例中，治疗性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体或四特异性抗体。在一个优选实施例中，治疗性性抗体是双特异性(治疗性)抗体。在一个实施例中，双特异性(治疗性)抗体是TCB。
在所有方面和实施例的一个实施例中，双特异性(治疗性)抗体包括
-第一Fab片段和第二Fab片段，其中第一Fab片段和第二Fab片段的每个结合位点与第二抗原特异性结合，
-第三Fab片段，其中第三Fab片段的结合位点与第一抗原特异性结合，并且其中第三Fab片段包含结构域交叉，使得可变轻链结构域(VL)和可变重链结构域(VH)被彼此替换，以及
-包含第一Fc区多肽和第二Fc区多肽的Fc区，
其中第一Fab片段和第二Fab片段各自包含重链片段和全长轻链，
其中第一Fab片段的重链片段的C-末端与第一Fc区多肽的N-末端融合，
其中第二Fab片段的重链片段的C-末端与第三Fab片段的可变轻链结构域的N-末端融合，且第三Fab片段的重链恒定结构域1的C-末端与第二Fc区多肽的N-末端融合。
在所有方面和实施例的一个实施例中，双特异性(治疗性)抗体是抗CD3/CD20双特异性抗体。在一个实施例中，抗CD3/CD20双特异性抗体是以CD20为第二抗原的TCB。在一个实施例中，双特异性抗CD3/CD20抗体是RG6026。
在所有方面和实施例的一个实施例中，单特异性抗体是抗CD20抗体。在一个实施例中，抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗。
在所有方面和实施例的一个实施例中，所述方法用于确定具有靶结合能力的多特异性(双特异性)抗体。
在所有方面和实施例的一个实施例中，所述方法用于确定多特异性(双特异性)抗体的两个(两个)结合位点的靶结合能力。
在所有方面和实施例的一个实施例中，样品包含至少10％(v/v)的血清。在一个实施例中，样品包含约50％(v/v)的血清。
在所有方面和实施例的一个实施例中，固相是多孔板(MTP)的孔。在一个实施例中，MTP是96孔-多孔板。在一个实施例中，多孔板的孔具有320μL-360μL的总体积。在一个实施例中，多孔板的孔具有100μL-200μL的工作体积。
在所有方面和实施例的一个实施例中，替换抗体具有0.75μg/mL或更高的浓度。在一个优选的实施例中，替换抗体具有约1μg/mL或更高的浓度。
在所有方面和实施例的一个实施例中，将超过100μL的包含替换抗体的溶液添加到固相中。在一个实施例中，将超过115μl的包含替换抗体的溶液添加到固相中。在一个优选的实施例中，添加135μL或更多的包含替换抗体的溶液。
在所有方面和实施例的一个实施例中，与替换抗体一起孵育1小时或更长时间。在一个实施例中，与替换抗体一起孵育1.5小时或更长时间。在一个实施例中，与替换抗体一起孵育2小时或更长时间。在一个优选的实施例中，与替换抗体一起孵育约2.5小时或更长时间。
在所有方面和实施例的一个实施例中，将超过100μL的包含约0.75μg/mL或更高浓度的替换抗体的溶液添加到固相中并孵育约1.5小时或更长时间。
附图说明
图1用于确定双特异性抗体的免疫测定方案：通过捕获试剂将双特异性抗体固定化到固相(SA-MTP；链霉亲和素包被的微量滴定板)和通过检测试剂确定结合的双特异性抗体。
图2偏倚的免疫测定方案：单特异性抗体与固相直接相互作用，并且由此偏倚特异性捕获步骤。
图3采用抗独特型抗CD3结合位点抗体作为捕获抗体和抗独特型抗CD20结合位点抗体作为检测抗体的桥接免疫测定的浓度-应答曲线，用于在相应的单特异性抗CD20抗体存在的情况下确定双特异性CD20-TCB。
图4采用抗独特型抗CD3结合位点抗体作为捕获抗体和抗独特型抗CD20结合位点抗体作为检测抗体的桥接免疫测定的浓度-应答曲线，用于在相应的单特异性抗CD20抗体不存在的情况下确定双特异性CD20-TCB。
图5采用抗独特型抗CD3结合位点抗体作为捕获抗体和抗P329G抗体作为检测抗体的桥接免疫测定的浓度-应答曲线，用于在相应的单特异性抗CD20抗体存在和不存在的情况下确定双特异性CD20-TCB。
图6根据本发明的桥接免疫测定的浓度-应答曲线包括在相应的单特异性抗CD20抗体存在和不存在的情况下的额外置换步骤。
具体实施方式
本文报道了一种用于使用替换步骤确定含血清样品中的至少双特异性抗体的免疫测定。由此，可以减少在免疫测定中由包含该至少双特异性抗体的一个结合位点的第二抗体的存在引起的干扰。在根据本发明的免疫测定中，首次采用这种中间替换步骤来减少免疫测定干扰。
本发明至少部分地基于以下发现：通过在固相上捕获多特异性治疗性抗体之后***额外的替换步骤，可以改善免疫测定中含血清样品中的多特异性治疗性抗体的检测(减少或甚至消除由包含多特异性抗体的一个结合位点的第二抗体的存在引起的非特异性干扰)。在替换步骤中，将捕获抗体-治疗性抗体-复合物与同捕获抗体(在空间上)竞争与治疗性抗体的结合的替换抗体一起孵育，所述竞争例如通过与治疗性抗体上的相同表位或密切相关的表位结合。替换抗体对捕获抗体的置换影响捕获的治疗性抗体从固相解吸以形成中间可溶性复合物。然后可以在随后的步骤中在由包含治疗性抗体的一个结合位点的抗体引起的干扰减少或甚至消除的情况下检测该中间复合物。
定义
术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-20％范围。在一个实施例中，术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-10％范围。在一个实施例中，术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-5％范围。
术语“治疗性(单克隆)抗体”和“药物”在本文中可互换使用。这些术语以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。
抗体通常包含两个所谓的轻链多肽(轻链)和两个所谓的重链多肽(重链)。重链多肽和轻链多肽中的每一者都含有可变结构域(可变区)(通常是多肽链的氨基末端部分)，该可变结构域包含能够与抗原相互作用的结合区。重链多肽和轻链多肽中的每一者都包含恒定区(通常是羧基末端部分)。重链的恒定区介导抗体i)与携带Fcγ受体(Fc R)的细胞(诸如吞噬细胞)或ii)与携带新生儿Fc受体(FcRn)(也称为Brambell受体)的细胞的结合。它还介导与一些因子的结合，这些因子包括经典补体***的因子，诸如组分(C1q)。抗体重链的恒定结构域包含CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，而轻链仅包含一个恒定结构域CL，它可以是κ同种型或λ同种型。
免疫球蛋白轻链或重链的可变结构域又包含不同的区段，即四个框架区(FR)和三个高变区(HVR)。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指在序列中高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的抗体可变结构域的区域每一种。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括：
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另有说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat等人编号。
如在本申请中所用的术语“价”表示(抗体)分子中存在指定数目的结合位点。因此，术语“二价”“四价”和“六价”分别表示(抗体)分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。如本文所报道的双特异性抗体是“二价”的一个优选实施例。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些抗体中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“(与抗原)结合”表示抗体在体外测定中(在一个实施例中，在结合测定中)与其抗原结合，其中抗体结合至表面，并且通过表面等离子体共振(SPR)测量抗原至抗体的结合。结合意为对例如抗体对于靶标A或靶标B的结合能力或抗体对于捕获分子(例如，针对该抗体的抗人Fab捕获)的结合能力的测量。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量形式呈递)之外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
术语“样品”包括但不限于来自生物或以前生物的任何量的物质。这种生物包括但不限于人、小鼠、猴、大鼠、兔和其他动物。在一个实施例中，样品获自猴，尤其是食蟹猴，或兔，或小鼠，或大鼠，或人。在一个优选的实施例中，样品是人样品。在一个实施例中，此类物质包括但不限于来自个体的全血、血浆或血清，它们是临床常规中最广泛使用的样品来源。
术语“固相”表示非流体物质，并且包括：由诸如聚合物、金属(顺磁性颗粒、铁磁性颗粒)、玻璃和陶瓷等材料制成的颗粒(包括微粒和珠粒)；凝胶物质，诸如二氧化硅凝胶、氧化铝凝胶和聚合物凝胶；毛细管，其可以由聚合物、金属、玻璃和/或陶瓷制成；沸石和其他多孔物质；电极；微量滴定板；固体条；以及比色皿、管或其他光谱仪样品容器。固相组分与惰性固体表面的区别在于，“固相”在其表面上包含至少一个部分，其旨在与样品中的物质发生相互作用。固相可以是固定组分，诸如管、条、比色皿或微量滴定板，或者可以是非固定组分，诸如珠粒和微粒。可以使用允许蛋白质和其他物质非共价连接或共价连接的多种微粒。此类颗粒包括聚合物颗粒，诸如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)；金颗粒，诸如金纳米颗粒和金胶体；以及陶瓷颗粒，诸如二氧化硅颗粒、玻璃颗粒和金属氧化物颗粒。参见例如Martin,C.R.,等人,Analytical Chemistry-News&Features,70(1998)322A-327A或Butler,J.E.,Methods 22(2000)4-23。
术语“免疫测定”表示利用特异性结合分子(例如抗体)来捕获和/或检测用于定性或定量分析的特定靶标的任何技术。通常，免疫测定的特征在于以下步骤：1)固定或捕获分析物以及2)检测和测量分析物。分析物可以被捕获，即结合在任何固体表面，例如膜、塑料板或其他一些固体表面上。
多特异性抗体
在某些实施例中，药物是双特异性抗体。在一个实施例中，药物是双特异性三价抗体。在一个优选的实施例中，药物是单克隆、双特异性、三价抗体。
在某些实施例中，药物是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中，结合特异性中的一个针对第一抗原，而另一个针对不同的第二抗原。可以将双特异性抗体制成全长抗体或抗体片段。在一个实施例中，抗体是双特异性抗体，其与第一抗原和第二抗原特异性结合。在一个实施例中，双特异性抗体具有i)与第一抗原特异性结合的第一结合特异性，和ii)与第二抗原特异性结合的第二结合特异性。在一个实施例中，抗体是双特异性三价抗体。在一个优选的实施例中，抗体是单克隆、双特异性、三价抗体。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540,WO 93/08829，以及Traunecker,A.等人,EMBO J.10(1991)3655-3659)和“杵臼结构”工程化(参见例如US 5,731,168)。多特异性抗体也可以通过如下方法来制备：工程化静电操纵效应以制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如US 4,676,980，以及Brennan,M.等人,Science229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny,S.A.等人,J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；使用单链Fv(scFv)二聚体(Gruber,M.等人,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；以及如Tutt,A.等人,J.Immunol.147(1991)60-69中所述制备三特异性抗体。
多特异性抗体在WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792或WO 2010/145793中描述。
不同的双特异性抗体形式是已知的。
可以使用本文报道的方法的示例性双特异性抗体形式是
-结构域交换形式：包含第一Fab片段和第二Fab片段的多特异性IgG抗体，其中在第一Fab片段中
a)仅CH1和CL结构域相互替换(即第一Fab片段的轻链包含VL和CH1结构域，并且第一Fab片段的重链包含VH和CL结构域)；
b)仅VH和VL结构域彼此替换(即第一Fab片段的轻链包含VH和CL结构域，并且第一Fab片段的重链包含VL和CH1结构域)；或者
c)CH1和CL结构域相互替换并且VH和VL结构域彼此替换(即第一Fab片段的轻链包含VH和CH1结构域，并且第一Fab片段的重链包含VL和CL结构域)；并且
其中第二Fab片段包含：包含VL和CL结构域的轻链以及包含VH和CH1结构域的重链；
结构域交换抗体可包含第一重链和第二重链，所述第一重链包含CH3结构域，所述第二重链包含CH3结构域，其中两个CH3结构域通过各自的氨基酸取代以互补方式工程化，以支持第一重链和修饰的第二重链的异二聚化，例如如WO 96/27011、WO 98/050431、EP1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、或WO 2013/096291中公开的(以引用方式并入本文)；
-单臂单链形式(＝单臂单链抗体)：包含第一结合位点和第二结合位点的抗体，所述第一结合位点与第一抗原特异性结合，所述第二结合位点与第二抗原特异性结合，其中单独的链如下：
-轻链(可变轻链结构域+轻链κ恒定结构域)
-组合轻链/重链(可变轻链结构域+轻链恒定结构域+肽连接基+可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+带有杵突变的CH3)
-重链(可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+带有臼突变的CH3)；
-双臂单链形式(＝双臂单链抗体)：包含第一结合位点和第二结合位点的抗体，所述第一结合位点与第一抗原特异性结合，所述第二结合位点与第二抗原特异性结合，其中单独的链如下：
-组合轻链/重链1(可变轻链结构域+轻链恒定结构域+肽连接基+可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+带有臼突变的CH3)
-组合轻链/重链2(可变轻链结构域+轻链恒定结构域+肽连接基+可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+带有杵突变的CH3)；
-共同轻链双特异性形式(＝共同轻链双特异性抗体)：包含第一结合位点和第二结合位点的抗体，所述第一结合位点与第一抗原特异性结合，所述第二结合位点与第二抗原特异性结合，其中单独链如下：
-轻链(可变轻链结构域+轻链恒定结构域)
-重链1(可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+带有臼突变的CH3)
-重链2(可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+带有杵突变的CH3)
-双靶向Fab：Fab在VH和VL结构域的互补对中包含两个(非重叠)互补位，其中第一互补位包含(由其组成)来自VL结构域的CDR1和CDR3以及VH结构域的CDR2的氨基酸残基，并且第二互补位包含(由其组成)来自VH结构域的CDR1和CDR3和VL结构域的CDR2的残基；上下文中的术语“非重叠”表示包含在DutaFab的第一互补位内的氨基酸残基不包含在第二互补位中，并且包含在DutaFab的第二互补位内的氨基酸不包含在第一互补位中
-T细胞双特异性形式(TCB)：双特异性抗体，其包含
-第一Fab片段和第二Fab片段，其中第一Fab片段和第二Fab片段的每个结合位点与第二抗原特异性结合，
-第三Fab片段，其中第三Fab片段的结合位点与第一抗原特异性结合，并且其中第三Fab片段包含结构域交叉，使得可变轻链结构域(VL)和可变重链结构域(VH)被彼此替换，以及
-包含第一Fc区多肽和第二Fc区多肽的Fc区，
其中第一Fab片段和第二Fab片段各自包含重链片段和全长轻链，
其中第一Fab片段的重链片段的C-末端与第一Fc区多肽的N-末端融合，
其中第二Fab片段的重链片段的C-末端与第三Fab片段的可变轻链结构域的N-末端融合，且第三Fab片段的重链恒定结构域1的C-末端与第二Fc区多肽的N-末端融合。
在一个实施例中，双特异性抗体是结构域交换抗体。
在一个实施例中，双特异性抗体是单臂单链抗体。
在一个实施例中，双特异性抗体是双臂单链抗体。
在一个实施例中，双特异性抗体是共有轻链双特异性抗体。
在一个实施例中，双特异性抗体是双重靶向Fab。
在一个实施例中，双特异性抗体是共有T细胞双特异性抗体。
多价、多特异性抗体与不同的靶标特异性结合，很可能对每个靶标具有不同的亲和力和复杂的稳定性。只有完全活性的多价、多特异性抗体才能与所有靶标结合，并在相应的测定中显示出完全的生物活性。
本文使用的术语“CD20-TCB”表示靶向CD20的TCB(CD20-TCB；RG6026；TCB形式的抗CD3/CD20抗体)，其具有长半衰期和高效力，这是通过与CD20的高亲和力二价结合以及先前表征的2:1TCB分子形式的B和T细胞结合域的头对尾取向来实现的(参见例如Bacac,M.等人Clin.Cancer Res.22(2016))3286-3297；Bacac,M.等人Oncoimmunology 5(2016)e1203498)。
免疫测定法
本领域描述了不同免疫测定的原理。例如，Hage,D.S.(Anal.Chem.71(1999)294R-304R)。Lu,B.等人(Analyst 121(1996)29R-32R)报道了用于免疫测定的抗体的取向固定。例如，Wilchek,M.和Bayer,E.A.,在Methods Enzymol.184(1990)467-469中报道了亲和素-生物素介导的免疫测定。
单克隆抗体及其恒定结构域包含许多反应性氨基酸侧链，用于与结合对，例如多肽/蛋白质的成员、聚合物(例如PEG、纤维素或聚苯乙烯)或酶缀合。氨基酸的化学反应性基团是例如氨基(赖氨酸、α-氨基)、硫醇基(胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)、羧酸基(天冬氨酸、谷氨酸)和糖醇基。这种方法是例如由Aslam M.和Dent,A.在“Bioconjugation”,MacMillan Ref.Ltd.1999,第50-100页中描述。
抗体最常见的反应性基团之一是氨基酸赖氨酸的脂肪族ε-胺。一般来说，几乎所有的抗体都含有丰富的赖氨酸。赖氨酸胺在pH 8.0以上(pKa＝9.18)是相当好的亲核试剂，因此容易且干净地与各种试剂反应，形成稳定的键。胺反应性试剂主要与赖氨酸和蛋白质的α-氨基反应。反应性酯，特别是N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)酯，是最常用的胺基改性试剂。在水性环境中反应的最佳pH是pH 8.0至9.0。异硫氰酸酯是胺修饰试剂，并且与蛋白质形成硫脲键。它们与水溶液中的蛋白质胺反应(最佳pH为9.0至9.5)。醛在温和的水性条件下与脂族和芳族胺、肼和酰肼反应，形成亚胺中间体(希夫碱)。希夫碱可以用温和或强还原剂(诸如硼氢化钠或氰基硼氢化钠)选择性还原，以衍生出稳定的烷基胺键。已用于改性胺的其他试剂是酸酐。例如，二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)是含有两个胺反应性酸酐基团的双功能螯合剂。它可以与氨基酸的N-末端和ε-胺基反应形成酰胺键。酸酐环打开形成多价金属螯合臂，能够与配位复合物中的金属紧密结合。
抗体中另一个常见的反应性基团是来自含硫氨基酸胱氨酸及其还原产物半胱氨酸(或半胱氨酸，half cystine)的硫醇残基。半胱氨酸含有游离硫醇基团，它比胺类更具亲核性，且通常是蛋白质中反应性最强的官能团。硫醇通常在中性pH下具有反应性，因此可以在胺存在的情况下选择性地与其他分子偶联。由于游离巯基具有相对反应性，因此具有这些基团的蛋白质通常以其氧化形式作为二硫基或二硫键与其一起存在。在此类蛋白质中，需要用诸如二硫苏糖醇(DTT)等试剂还原二硫键以生成反应性游离硫醇。硫醇反应性试剂是那些将与多肽上的硫醇基团偶联，形成硫醚偶联产物的试剂。这些试剂在弱酸性至中性pH下反应迅速，因此可以在胺基团存在的情况下选择性地反应。文献报道了几种硫醇化交联试剂的诸如Traut试剂(2-亚氨基硫烷)、琥珀酰亚胺(乙酰硫基)乙酸酯(SATA)和磺基琥珀酰亚胺6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺]己酸酯(Sulfo-LC-SPDP)的使用提供经由反应性氨基引入多个巯基的高效方式。卤代乙酰基衍生物，例如碘乙酰胺，形成硫醚键，且也是硫醇修饰的试剂。另外有用的试剂是马来酰亚胺。马来酰亚胺与硫醇反应性试剂的反应与碘乙酰胺的反应基本相同。马来酰亚胺在弱酸性至中性pH下反应迅速。
抗体中另一个常见的反应性基团是羧酸。抗体在C-末端位置以及天冬氨酸和谷氨酸的侧链内含有羧酸基团。羧酸在水中相对较低的反应性通常使得难以使用这些基团来选择性地修饰多肽和抗体。完成此操作后，通常使用水溶性碳二亚胺将羧酸基团转化为反应性酯，并与亲核试剂诸如胺、酰肼或肼反应。含胺试剂应该是弱碱性的，以便在赖氨酸的碱性更强的ε-胺存在的情况下与活化的羧酸选择性地反应，形成稳定的酰胺键。当pH值升至8.0以上时，可能发生蛋白质交联。
高碘酸钠可用于氧化与醛的抗体连接的碳水化合物部分内的糖的醇部分。每个醛基都可以与胺、酰肼或肼反应，如针对羧酸所述。由于碳水化合物部分主要存在于抗体的可结晶片段区(Fc-区)，因此可通过远离抗原结合位点的碳水化合物定点修饰实现缀合。形成希夫碱中间体，可通过用氰基硼氢化钠(温和且选择性)或硼氢化钠(强)水溶性还原剂还原该中间体，将其还原为烷基胺。
示踪和/或捕获和/或检测抗体与其缀合配偶体的缀合可以通过不同的方法，诸如化学结合，或经由结合对的结合来进行。如本文所用，术语“缀合配偶体”表示例如固体支持物、多肽、可检测标记、特异性结合对的成员。在一个实施例中，捕获和/或示踪和/或检测抗体与其缀合配偶体的缀合通过经由N-末端和/或ε-氨基(赖氨酸)、不同赖氨酸的ε-氨基、抗体氨基酸骨架的羧基-、巯基-、羟基-和/或酚官能团、和/或抗体的碳水化合物结构的糖醇基团的化学结合来进行。在一个实施例中，捕获抗体经由结合对与其缀合配偶体缀合。在一个优选的实施例中，捕获抗体与生物素缀合并且经由固体支持物固定化的亲和素或链霉亲和素进行固定至固体支持物。在一个实施例中，捕获抗体经由结合对与其缀合配偶体缀合。在一个优选的实施例中，示踪抗体通过作为可检测标记的共价键与异羟基洋地黄毒苷缀合。
发色体(荧光或发光基团和染料)、酶、NMR活性基团或金属颗粒、半抗原，例如异羟基洋地黄毒苷是“可检测标记”的实例。可检测标记也可以是可光活化的交联基团，例如叠氮基或吖丙啶基团。可通过电化学发光检测的金属螯合物也是优选的信号发射基团，特别优选钌螯合物，例如钌(双吡啶基)32+螯合物。合适的钌标记基团描述于例如EP 0 580979、WO 90/05301、WO 90/11511和WO 92/14138中。对于直接检测，标记基团可选自任何已知的可检测标志物基团，诸如染料、发光标记基团，诸如化学发光基团，例如吖啶酯或二氧杂环丁烷，或荧光染料，例如荧光素、香豆素、若丹明、恶嗪、试卤灵、花青及其衍生物。标记基团的其他实例是发光金属复合物，诸如钌或铕复合物、酶(例如，如用于ELISA或用于CEDIA(克隆酶供体免疫测定，例如EP-A-0 061 888))和放射性同位素。
间接检测***包括，例如，检测试剂，例如检测抗体用结合对的第一配偶体标记。合适的结合对的实例是抗原/抗体、生物素或生物素类似物诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素/亲和素或链霉亲和素、糖/凝集素、核酸或核酸类似物/互补核酸和受体/配体，例如类固醇激素受体/类固醇激素。在一个优选的实施例中，第一结合对成员包括半抗原、抗原和激素。在一个优选的实施例中，半抗原选自地高辛、异羟基洋地黄毒苷和生物素及其类似物。这种结合对的第二配偶体，例如抗体、链霉亲和素等通常被标记以允许直接检测，例如通过上述标记。
免疫测定通常可以采用三种不同的形式进行。一种是直接检测，一种是间接检测，或通过夹心测定。直接检测免疫测定使用可直接测量的检测(或示踪)抗体。酶或其他分子允许产生信号，该信号将产生颜色、荧光或发光，从而使信号可视化或测量(也可以使用放射性同位素，尽管现在它并不常用)。在间接测定中，与分析物结合的一抗用于为二抗(示踪抗体)提供确定的靶标，该二抗与由一抗(称为检测剂或示踪抗体)提供的靶标特异性结合。二抗产生可测量的信号。夹心测定使用两种抗体，一种捕获抗体和一种示踪(检测剂)抗体。捕获抗体用于结合(固定化)溶液中的分析物或在溶液中与其结合。这允许从样品中特异性地去除分析物。示踪(检测剂)抗体在第二步中用于产生信号(如上所述直接或间接)。夹心形式需要两个抗体，每个抗体在靶标分子上都有不同的表位。此外，它们不得相互干扰，因为两种抗体必须同时与靶标结合。
在免疫测定中确定双特异性抗体的不同原理是本领域技术人员已知的：
1)捕获使用
-抗原之一；
-针对结合位点之一的抗独特型抗体；
2)检测使用
-相应的其他抗原；
-针对相应的其他结合位点的抗独特型抗体；
这些可以相互独立地组合。
根据本发明的替换免疫测定的方面
本发明至少部分地基于以下发现：血清样品中的多特异性治疗性抗体的确定可能受到包含治疗性抗体的一种结合特异性的单特异性抗体的干扰的阻碍。在施用多特异性治疗性抗体之前，可能由于施用所述单特异性抗体而存在这些抗体。
通常，在用于确定含血清样品中的多特异性治疗性抗体的免疫测定中，在第一步骤中，通过与固相结合的捕获试剂来实现从样品中提取治疗性抗体，该固相对于多特异性治疗性抗体具有特异性，诸如例如与多特异性治疗性抗体的结合特异性进行特异性结合。在第二步骤中，通过检测试剂来实现固相捕获的多特异性治疗性抗体的确定，例如与不同于捕获步骤中使用的多特异性治疗性抗体的结合特异性进行特异性结合。在图1中，举例说明针对双特异性治疗性抗体的第一结合特异性和第二结合特异性的抗独特型抗体作为示例性捕获试剂和检测试剂。
如果样品除多特异性治疗性抗体外还包含具有至少一个结合特异性与治疗性抗体的结合位点之一相似的结合位点的单特异性抗体，则由此产生的干扰可通过与固相(非特异性)结合而发生，并由此产生假阳性信号，即基于捕获试剂的特异性偏倚测定的特异性。这如图2所示。如果单特异性抗体的存在超过多特异性抗体的存在，例如在一个实施例中为1,000倍或更多，在一个实施例中为10,000倍或更多，或在一个实施例中为100,000倍或更多，则这一点尤其紧迫。
现已发现，如果所形成的捕获抗体-治疗性抗体复合物通过与替换固定化的复合物中的捕获抗体的替换抗体一起孵育而从固相解吸，则可减少或甚至消除由单特异性抗体引起的这种非特异性偏倚。由此产生的替换抗体-治疗性抗体复合物是可溶的，并且在转移到新的隔室后可以被特异性检测。用于检测的解吸的复合物的捕获优选经由治疗性抗体的第二结合特异性进行，从而使桥接测定反转。在该步骤中不解吸非特异性结合的单特异性抗体。由此可减少或甚至消除单特异性抗体的干扰。
在一个优选的实施例中，本文报道了一种用于确定含血清样品中的多特异性治疗性抗体，优选双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将已经固定化有与所述治疗性抗体特异性结合的捕获剂的固相与所述样品一起孵育以形成固定化的捕获剂-治疗性抗体-复合物，
b)将所述固相与同所述捕获剂竞争与所述治疗性抗体的结合的替换剂一起孵育，并且由此通过形成包含替换剂-治疗性抗体-复合物的溶液将所述治疗性抗体从所述固相分离，
c)在步骤b)中获得的所述溶液中确定所述替换剂-治疗性抗体-复合物，并且由此确定含血清样品中的所述治疗性抗体。
捕获剂和替换剂可以是与治疗性抗体特异性结合的任何化合物，只要这两种药剂在治疗性抗体的结合位点上相互竞争，即只要替换剂在与治疗性抗体结合时置换捕获剂。影响替换效率但不影响替换发生的次要参数是替换抗体的使用量/过量和孵育时间。
捕获剂和替换剂的示例性组合是：
-捕获剂：抗独特型抗体1；替换剂：抗独特型抗体2；抗独特型抗体1和抗独特型抗体2相互竞争与治疗性抗体的结合；
-捕获剂：治疗性抗体的一种抗原；替换剂：抗独特型抗体；抗独特型抗体同抗原竞争与治疗性抗体的结合；
-捕获剂：抗独特型抗体；替换剂：抗原；抗独特型抗体同抗原竞争与治疗性抗体的结合；
-捕获剂：抗原；替换剂：抗原
-捕获剂：抗突变体Fc区抗体(例如抗P329G抗体或抗L234A/L235A抗体)；替换剂：抗突变体Fc区抗体(例如，分别为相同的抗PG抗体或相同的抗L234A/L235A抗体)。
在一个优选的实施例中，本文报道了一种用于确定含血清样品中的多特异性治疗性抗体，优选双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将已经固定化有与所述治疗性抗体特异性结合的捕获抗体的固相与所述样品一起孵育以形成固定化的捕获抗体-治疗性抗体-复合物，
b)将所述固相与同所述捕获抗体竞争与所述治疗性抗体的结合的替换抗体一起孵育，并且由此通过形成包含替换抗体-治疗性抗体-复合物的溶液将所述治疗性抗体从所述固相分离，
c)在步骤b)中获得的所述溶液中确定所述替换抗体-治疗性抗体-复合物，并且由此确定含血清样品中的所述治疗性抗体。
下面以TCB形式的抗CD3/CD20双特异性抗体(CD20-TCB)举例说明根据本发明的方法。该实例仅作为根据本发明的方法的示例呈现，且不应被解释为进行限制。本发明的真实范畴在所附权利要求书中阐述。
CD20-TCB和(抗CD20抗体)预处理代表了治疗淋巴瘤患者的有效且更安全的方法，并且目前正在复发性/难治性非霍奇金淋巴瘤患者的I期多中心研究(NCT03075696)中进行评价(参见Bacac,M.等人,Clin.Cancer.Res.24(2018)1-13)。
当使用根据图1中描述的方案的现有技术的标准桥接免疫测定(采用抗独特型抗CD3结合位点抗体作为捕获抗体且抗独特型抗CD20结合位点抗体作为检测抗体)在相应的单特异性抗CD20抗体(浓度为200μg/mL)存在的情况下确定双特异性CD20-TCB(浓度为1ng/mL)时，只能获得浅曲线(参见实例1a，图3)。
在单特异性抗CD20抗体不存在的情况下，获得了陡峭的曲线(参见实例1b，图4)。
使用抗独特型抗CD3结合位点抗体捕获分析物进行的特异性桥接免疫测定是在CD20-TCB不存在且样品仅包含单特异性抗CD20抗体的情况下进行。在这种情况下，可以在抗独特型抗CD3结合位点抗体存在和不存在的情况下获得信号(参见实例1c)。
因此，单特异性抗CD20抗体在CD20-TCB桥接测定中的干扰源于与固相的非特异性相互作用。
CD20-TCB包含Fc区(P329G，根据Kabat编号)中的特异性突变。因此，进行了使用抗P329G-Fc区抗体作为检测抗体的替代桥接测定。其中在相应抗CD20抗体存在和不存在的情况下获得了正确的桥接信号。但是，当使用此测定设置时，无法获得有关CD20-TCB的CD20结合位点的靶标结合能力的信息，因为该结合位点不再有助于生成的信号(参见实例2，图5)。
测试了本领域已知的不同方法以解决抗CD20抗体的非特异性结合，从而可以在单个测定中解决CD20-TCB的两个结合位点的靶结合能力。
捕获抗体和检测抗体的简单切换是不可行的，因为固定化的抗独特型抗CD20结合位点抗体将被样品中存在的单特异性抗CD20抗体饱和，并且由此将大大降低测定灵敏度。
接下来测试用于将捕获抗体固定在固相上的链霉亲和素密度的降低。从而可以减少非特异性结合，但仍然影响低质量控制(LQC)的准确度和量化质量控制(LLQC)的下限(参见实例3)。这种效应也不是稳健的，因此例如发生了高的测定间变化，导致不适合的免疫测定(参见实例3)。
测试了不同的缓冲剂。与在通用缓冲剂中进行的测定相比，使用PBS中1％酪蛋白与中密度链霉亲和素固相结合，会降低单特异性抗CD20抗体的干扰。确定了合适的测定范围，并通过质量控制(QC)的准确度评估和测定间精度来评价测定性能。结果显示出干扰减少，但同时QC和干扰减少不稳健，表明高的测定间变化(参见实例4)。LLQC级别的特异性/选择性评估还揭示，该方法不够稳健，因为未达到有关准确度的验证标准(数据未示出)。同样，使用中链霉亲和素密度、通用缓冲剂和酸性洗涤条件(pH 5.5)导致干扰减少，但同时QC和干扰减少不稳健，表明高的测定间变化(参见实例5)。
现在已经发现通过在该方法中包括中间替换/置换步骤解决了上述问题。即，首先抗独特型抗CD3结合位点抗体捕获CD20-TCB，并且此后从固体表面置换形成的复合物以进行分析。更详细地，通过与固定化的抗独特型抗CD3结合位点抗体在第一测定板上孵育来实现从样品中捕获CD20-TCB。在达到平衡后或在指定时间后用可溶性抗独特型抗CD3结合位点抗体(与捕获抗体相同或不同，例如与相同的表位结合或在空间上干扰，只要可以进行置换)替换复合物中的固定化的捕获抗体。因此，不受该理论的束缚，仅结合的CD20-TCB被释放到上清液中，而非特异性结合的单特异性抗CD20抗体保持与固相结合。此后，将上清液转移到第二测定板上，在该板上固定化抗独特型抗CD20结合位点抗体作为捕获抗体，即反转桥接。
因此，当使用根据本发明的免疫测定设置时，在大量过量(约1:250,000)的单特异性抗CD20抗体存在的情况下，达到了1ng/mL或更低的测定灵敏度以及鉴定具有靶向结合能力的CD20-TCB的要求。此外，根据本发明的免疫测定在一个工作日内进行是可行的并且是稳健的。
此外，根据本发明的免疫测定设置可以在基质含量高达50％的血清的情况下进行，从而提高灵敏度。
图6示出根据本发明的包括置换步骤的桥接免疫测定的浓度-应答曲线。在相应的单特异性抗CD20抗体存在和不存在的情况下都可以获得良好的应答。实例6叙述了相应的说明和数据。
下表提供了不同测定形式及其上述特征性质的比较(ID＝独特型)。
根据本发明的用于CD20-TCB的测定成功通过了鉴定。
测定内变化 n 准确度[平均值，％] 精度[CV,％]
LLQC标称值0.625ng/mL 4 111 6.8
LQC标称值1.875ng/mL 4 109 5.5
MQC标称值7.5ng/mL 5 104 2.8
HQC标称值30ng/mL 5 103 1.9
ULQC标称值40ng/mL 5 102 3.2
测定间变化 n 准确度[平均值，％] 精度[CV,％]
LLQC标称值0.625ng/mL 7 107 9.5
LQC标称值1.875ng/mL 7 103 8.3
MQC标称值7.5ng/mL 7 103 4.4
HQC标称值30ng/mL 7 99 2.8
ULQC标称值40ng/mL 7 98 2.6
提供以下实例和附图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求书中阐明。应当理解，在不脱离本发明实质的前提下，可以对阐明的程序进行修改。
实例1
使用双抗独特型抗体的桥接免疫测定
一般过程：
鼠单克隆抗体由Roche Diagnostics GmbH(德国)生产。使用生物素化的M-4.25.93-IgG作为抗独特型抗CD3结合位点抗体，并且使用异羟基洋地黄毒苷化的M-6.15.528-IgG-Dig作为抗独特型抗CD20结合位点抗体。
CD20-TCB校准品或QC(质量控制品)以及含有CD20-TCB和抗CD20抗体的样品是在从瑞士Trina Bioreactives获得的100％混合人血清或100％食蟹猴混合血清(Seralab，英国)中制备的。
在通用缓冲剂(Roche Diagnostics GmbH，德国)中制作抗体制剂和血清样品稀释液。每次洗涤包括3个步骤，使用300μL PBS、0.05％Tween 20(Sigma Aldrich，德国)，孵育步骤在室温、以500rpm振荡进行，并且每孔的工作体积为100μL。
为了捕获，链霉亲和素板(高结合能力，Microcoat GmbH，贝恩里德，德国)用0.2μg/mL M-4.25.93-IgG-Bi包被一小时，并且通过洗涤去除未结合的抗体，然后添加稀释的(1:10)血清样品并孵育一小时。洗涤后，通过连续添加M-6.15.528-IgG-Dig(0.2μg/mL，50分钟)和与辣根过氧化物酶共价结合的<Dig>-Fab片段(Roche Diagnostics GmbH，德国；40mU，50分钟)来进行分析物检测。在该步骤之间和之后应用洗涤步骤。添加ABTS(2′2′-次偶氮基-双-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸；Roche Diagnostics GmbH，德国)作为显色反应的底物，通过405nm(参考波长490nm)的光度读数来监测。一式两份分析样品，并且计算平均吸光度值并进一步处理。通过使用非线性4参数曲线拟合函数(Wiemer-Rodbard)的校准曲线的反向计算来确定浓度。准确度是根据加标血清样品中的标称浓度计算得出的。
a)包含CD20-TCB和200μg/mL抗CD20抗体的样品：
b)仅包含CD20-TCB的样品：
c)仅包含抗CD20抗体的样品(在10％食蟹猴血清中的CD20-TCB校准曲线上反向计 算的值)：
实例2
具有抗独特型抗体捕获和抗P329G抗体检测的桥接免疫测定一般过程：
一般：4步夹心Elisa
·在室温且以500rpm振荡进行孵育
·工作值：100μL
·洗涤(以下表示为w)：3x300μL PBS，0.05％Tween 20
·重复n＝2，计算平均吸光度值
·校准曲线拟合：非线性4参数曲线拟合函数(Wiemer-Rodbard)
·测定范围：1ng/mL-100ng/mL
试剂：
·人混合血清；Trina Bioreactives，瑞士
·鼠单克隆抗体；Roche Diagnostics GmbH，德国
о抗独特型抗CD3结合位点抗体，生物素化：M-4.25.93-IgG-Bi
о抗P329G抗体，异羟基洋地黄毒苷化：M-1.7.24-IgG-Dig
·链霉亲和素板(高结合能力)；Microcoat GmbH,Bernried，德国
·通用缓冲剂(以下表示为UB)；Roche Diagnostics GmbH，德国
·洗涤缓冲剂；1x PBS，0.05％Tween(Sigma Aldrich，德国)
·与辣根过氧化物酶共价结合的<Dig>-Fab片段(<Dig>-Fab-POD)；RocheDiagnostics GmbH，德国
·2′2′-次偶氮基-双-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)；RocheDiagnosticsGmbH，德国
测定行为：
·包被：0.2μg/mL M-4.25.93-IgG-Bi，1小时，w
·样品：在UB中1到10，1小时，w
·检测1：0.2μg/mL M-1.7.24-IgG-Dig，50分钟，w
·检测2：50mU<Dig>-Fab-POD，50分钟，w
·底物反应：ABTS，在405nm处重复吸光度测量(参考波长490nm)
a)包含CD20-TCB和200μg/mL抗CD20抗体的样品：
b)仅包含CD20-TCB的样品：
实例3
用固定化密度降低的双抗独特型抗体的桥接免疫测定
一般过程：
与实例1中所述的过程相同，不同之处在于使用具有中等结合能力的链霉亲和素板，Microcoat GmbH,Bernried，德国
a)包含CD20-TCB和200μg/mL抗CD20抗体的样品：
b)仅包含CD20-TCB的样品：
实例4
用PBS中的1％酪蛋白作为测定缓冲剂用固定化密度降低的双抗独特型抗体的桥接免疫测定
一般过程：
一般：4步夹心Elisa
·在室温且以500rpm振荡进行孵育
·工作值：100μL
·洗涤(以下表示为w)：3x 300μL PBS，0.05％Tween 20
·重复n＝2，计算平均吸光度值
·校准曲线拟合：非线性4参数曲线拟合函数(Wiemer-Rodbard)
·测定范围：1ng/mL-64ng/mL
试剂：
·人混合血清；Trina Bioreactives，瑞士
·鼠单克隆抗体；Roche Diagnostics GmbH，德国
о抗独特型抗CD3结合位点抗体，生物素化：M-4.25.93-IgG-Bi
о抗独特型抗CD20结合位点抗体，异羟基洋地黄毒苷化：M-6.15.528-IgG-Dig
·链霉亲和素板(中等结合能力)；Microcoat GmbH,Bernried，德国
·酪蛋白(Hammersten)；VWR Prolabo Chemicals，德国·测定缓冲剂(以下表示为AB)：1x PBS中的1％酪蛋白(Roche Diagnostics GmbH，德国)
·洗涤缓冲剂；1x PBS，0.05％Tween(Sigma Aldrich，德国)
·与辣根过氧化物酶共价结合的<Dig>-Fab片段(<Dig>-Fab-POD)；RocheDiagnostics GmbH，德国
·2′2′-次偶氮基-双-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)；RocheDiagnosticsGmbH，德国
测定行为：
·包被：0.25μg/mL M-4.25.93-IgG-Bi，1小时，w
·样品：在AB中1到10，1小时，w
·检测1：0.25μg/mL M-6.15.528-IgG-Dig，60分钟，w
·检测2：40mU<Dig>-Fab-POD，60分钟，w
·底物反应：ABTS，在405nm处重复吸光度测量(参考波长490nm)
a)包含CD20-TCB和200 μg/mL抗CD20抗体的样品：
b)仅包含CD20-TCB的样品：
实例5
在酸性(pH 5.5)洗涤条件下用固定化密度降低的双抗独特型抗体的桥接免疫测定
一般过程：
一般：4步夹心Elisa
·在室温且以500rpm振荡进行孵育
·工作值：100μL
·洗涤(以下表示为w)：3x 300μL PBS，0.05％Tween 20，pH5.5
·重复n＝2，计算平均吸光度值
·校准曲线拟合：非线性4参数曲线拟合函数(Wiemer-Rodbard)
·测定范围：1ng/mL-64ng/mL
试剂：
·人混合血清；Trina Bioreactives，瑞士
·鼠单克隆抗体；Roche Diagnostics GmbH，德国
о抗独特型抗CD3结合位点抗体，生物素化：M-4.25.93-IgG-Bi
о抗独特型抗CD20结合位点抗体，异羟基洋地黄毒苷化：M-6.15.528-IgG-Dig
·链霉亲和素板(中等结合能力)；Microcoat GmbH,Bernried，德国
·测定缓冲剂：通用缓冲剂(以下表示为UB)；Roche DiagnosticsGmbH，德国
·洗涤缓冲剂；1xPBS，0.05％Tween，pH 5.5(Sigma Aldrich，德国，pH用2M HCl调节，Sigma Aldrich，德国)
·与辣根过氧化物酶共价结合的<Dig>-Fab片段(<Dig>-Fab-POD)；RocheDiagnostics GmbH，德国
·3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)；Roche Diagnostics GmbH，德国
·1M H2SO4；Carl Roth，德国
测定行为：
·包被：0.25μg/mL M-4.25.93-IgG-Bi，1小时，w
·样品：在UB中1到10，1小时，w
·检测1：0.25μg/mL M-6.15.528-IgG-Dig，60分钟，w
·检测2：10mU<Dig>-Fab-POD，60分钟，w
·底物反应：TMB，用50μL 1M H2SO4停止
·450nm处的光度读数(参考波长690nm)
a)包含CD20-TCB和200μg/mL抗CD20抗体的样品：
b)仅包含CD20-TCB的样品：
实例6
根据本发明的桥接免疫测定
一般过程：
鼠单克隆抗体由Roche Diagnostics GmbH(德国)生产。使用生物素化的M-4.35.77-IgG以及异羟基洋地黄毒苷化的M-4.25.93-IgG作为抗独特型抗CD3结合位点抗体，并且使用生物素化的M-6.15.528作为抗独特型抗CD20结合位点抗体。
CD20-TCB校准品或QC(质量控制品)以及含有CD20-TCB和抗CD20抗体的样品是在从瑞士Trina Bioreactives获得的100％混合人血清中制备的。在通用缓冲剂(RocheDiagnostics GmbH，德国)中制作抗体制剂和血清样品稀释液。每次洗涤包括用300μL PBS、0.05％Tween 20(Sigma Aldrich，德国)的3个步骤。孵育步骤在室温以500rpm振荡进行。该过程分为两部分，在两个链霉亲和素包被的微量滴定板(SA-MTP 1和2，高结合能力，Microcoat GmbH，Bernried，德国)上进行。
部分1:为了捕获，将SA-MTP 1用135μL/孔的0.21μg/mL M-4.35.77-IgG-Bi包被一小时，并且通过洗涤去除未结合的抗体，然后连续添加67.5μL/孔通用缓冲剂和67.5μL/孔血清样品(产生50％基质)并孵育35分钟。洗涤后，添加135μL的1μg/mL M-4.25.93-Dig(检测抗体)，并且将板孵育2.5小时，无需随后用于解吸的洗涤步骤(替换步骤)。
部分2：将检测抗体添加到SA-MTP1后90分钟，SA-MTP2用100μL/孔0.25μg/mL M-6.28.530-Bi包被一小时，然后洗涤。此后，将100μL的形成复合物(药物检测抗体)从SA-MTP1转移到SA-MTP2，并孵育35分钟。添加与辣根过氧化物酶共价结合的100μL/孔50mU<Dig>-Fab片段(Roche Diagnostics GmbH，德国)作为第二检测试剂，并将板孵育45分钟。在该步骤之前和之后应用洗涤步骤。使用100μL/孔ABTS(2′2′-次偶氮基-双-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸；Roche Diagnostics GmbH，德国)作为显色反应的底物，通过405nm(参考波长490nm)的光度读数来监测。一式两份分析样品，并且计算平均吸光度值并进一步处理。通过使用非线性4参数曲线拟合函数(Wiemer-Rodbard)的校准曲线的反向计算来确定浓度。准确度是根据加标血清样品中的标称浓度计算得出的。
a)包含CD20-TCB和200μg/mL抗CD20抗体的样品：
b)仅包含CD20-TCB的样品：

Claims (26)

1.一种用于确定含血清样品中的双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将已经固定化有与所述双特异性抗体特异性结合的捕获抗体的固相与所述含血清样品一起孵育以形成固定化的捕获抗体-双特异性抗体-复合物，
b)洗涤所述固相，其中所述捕获抗体-双特异性抗体-复合物保持与所述固相结合，
c)将所述固相与替换抗体一起孵育，并且由此形成包含替换抗体-双特异性抗体-复合物的溶液，其中所述替换抗体与所述捕获抗体竞争结合所述双特异性抗体，
d)在步骤c)中获得的所述溶液中确定所述替换抗体-双特异性抗体-复合物，并且由此确定含血清样品中的所述双特异性抗体；
其中所述捕获抗体是抗独特型抗体，且所述替换抗体是抗独特型抗体，
其中所述含血清样品包含所述双特异性抗体和含有所述双特异性抗体的一个结合位点的单特异性抗体，并且所述方法是在确定所述双特异性抗体时减少所述单特异性抗体的干扰的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其中标记所述替换抗体，并且通过检测所述标记来确定所述替换抗体-双特异性抗体-复合物。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述替换抗体是所述捕获抗体。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中将步骤c)中的所述固相与6.67nM或更高浓度的所述替换抗体一起孵育。
5.根据权利要求3所述的方法，其中将步骤c)中的所述固相与6.67nM或更高浓度的所述替换抗体一起孵育。
6.根据权利要求1、2和5中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体是抗CD3/CD20双特异性抗体。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述双特异性抗体是抗CD3/CD20双特异性抗体。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述双特异性抗体是抗CD3/CD20双特异性抗体。
9.根据权利要求6所述的方法，其中双特异性抗CD3/CD20抗体是RG6026。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其中双特异性抗CD3/CD20抗体是RG6026。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述单特异性抗体是抗CD20抗体。
12.根据权利要求2或5所述的方法，其中所述单特异性抗体是抗CD20抗体。
13.根据权利要求3所述的方法，其中所述单特异性抗体是抗CD20抗体。
14.根据权利要求4所述的方法，其中所述单特异性抗体是抗CD20抗体。
15.根据权利要求6所述的方法，其中所述单特异性抗体是抗CD20抗体。
16.根据权利要求10所述的方法，其中所述单特异性抗体是抗CD20抗体。
17.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述单特异性抗体是抗CD20抗体。
18.根据权利要求11和13-16中任一项所述的方法，其中所述抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗。
21.根据权利要求11、13-16、19和20中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体是抗CD3/CD20双特异性抗体。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述双特异性抗体是抗CD3/CD20双特异性抗体。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述双特异性抗体是抗CD3/CD20双特异性抗体。
24.根据权利要求12所述的方法，其中所述双特异性抗体是抗CD3/CD20双特异性抗体。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述双特异性抗CD3/CD20抗体是RG6026。
26.根据权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗CD3/CD20抗体是RG6026。
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