CN113804667A - 一种新型可膨胀生物样本的水凝胶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型可膨胀生物样本的水凝胶及其应用,涉及生物检测技术领域,其中,一种交联剂包括N,N’‑亚甲基双丙烯酰胺、N,N’‑乙烯基双丙烯酰胺、N,N’‑(丙烷‑1,3‑二基)二丙烯酰胺或N,N’‑(丁烷‑1,4‑二基)二丙烯酰胺;一种包含该交联剂的水凝胶,包括不同长度的交联剂;一种荧光衰减缓冲液为1%1,4‑二偶氮双环[2,2,2)‑辛烷(DABCO);该水凝胶在生物组织膨胀中的应用、在扩展显微技术的应用以及在检测生物组织的应用;一种荧光衰减缓冲液在检测生物组织的应用。本发明提供的新的水凝胶,当在水中透析时,该样品能够各向同性溶胀数倍,该水凝胶一步形成与扩展显微技术的简便操作相结合,可在常规显微镜上实现超分辨率。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,尤其涉及一种新型可膨胀生物样本的水凝胶及其应用。
背景技术
显微镜通过获取细胞和组织中详细的分子分布和结构信息,在发现生物学和医学方面发挥着关键作用。然而,传统荧光显微镜对超结构细节的解释受到大约200nm的光学衍射极限的限制。近年来,一些新的显微学技术,如受激发射损耗显微术(STED)、随机光学重建显微术(STORM)和光激活定位显微术(PALM),已经跨越了这一障碍。这些超分辨显微技术可以达到30-50nm的分辨率,但其广泛应用仍然受到昂贵的仪器设备、特定的软件、费力的操作和复杂的数据处理的限制。
理想的超分辨率显微镜技术应易于操作,并在普通实验室仪器上进行简单的数据处理既可以获得。陈等人提出了一种新的策略,即膨胀显微镜(ExM),通过物理样品膨胀后再成像。这一策略要求标本固定、免疫染色并嵌入水凝胶中,水凝胶在水中透析时会强烈膨胀。该方法在常规显微镜下可获得70nm的横向分辨率。整个过程不需要特殊的机器或特殊的数据处理。这使得ExM成为几乎所有实验室都能负担得起的生物样品超分辨率成像方法。从那时起,ExM被迅速应用于神经科学、病理学和mRNA发现。然而,上述方法的分辨率仍低于现代超分辨显微镜(如STED或STROM)的分辨率。ExM的扩展能力限制了其应用。
国内外研究中提高ExM扩展能力的工作很少。有人提出了一种称为迭代展开显微镜(iExM)的方法,这种方法需要对样品进行两轮嵌入和展开。通过这个复杂的过程,iExM可以扩展大约20倍。还有一种新的方法,它可以将样品扩大约10倍,称为X10显微镜。X10显微镜的分辨率与现代超分辨率显微镜的分辨率相当,但该过程需要小心地从单体溶液中除氧,以获得理想的分辨率。
以上技术对于膨胀组织已经达到较好的效果,并且在很多领域已经有所应用,但是有一些不可磨灭的缺点:
1.整个过程手动操作的流程较多,自动化的程度较低。
2.整个反应的时间较长,获得数据的速度较慢。
因此,本领域的技术人员致力于开发一种提高分辨能力新型可膨胀生物样本的水凝胶,该水凝胶与现代超分辨率技术(例如STORM,SMLM和STED)兼容,检测过程自动化程度高,获取数据速度快。这种结合将使荧光显微镜的分辨率达到几纳米水平,能够用荧光显微镜而不是电子显微镜来研究超微结构的变化。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷,本发明所要解决的技术问题是提供一种提高分辨能力的新型可膨胀生物样本的水凝胶,能够与现代超分辨率技术(例如STORM,SMLM和STED)兼容,在常规显微镜上实现超分辨率检测,即使荧光显微镜的分辨率达到几纳米水平,从而能够用荧光显微镜而不是电子显微镜来研究超微结构的变化,而且过程自动化程度高,获取数据速度快。
为实现上述目的,本发明提供了一种交联剂,包括N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、N,N’-乙烯基双丙烯酰胺、N,N’-(丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺或N,N’-(丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺,其中,N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的化学式为化学式1,N,N’-乙烯基双丙烯酰胺的化学式为化学式2,N,N’-(丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺的化学式为化学式3,N,N’-(丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺的化学式为化学式4:
本发明还提供了一种水凝胶,包括不同长度的交联剂,交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、N,N’-乙烯基双丙烯酰胺、N,N’-(丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺和N,N’-(丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺中的一种或者几种。
进一步地,当在水中透析时,水凝胶能够各向同性溶胀数九倍;
进一步地,将水凝胶命名为九倍溶胀水凝胶(9S水凝胶);
本发明还提供了一种荧光衰减缓冲液,荧光衰减缓冲液为1%1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷(DABCO)。
本发明还提供了一种水凝胶在生物组织膨胀中的应用。
进一步地,生物组织包括骨架蛋白或网格蛋白,水凝胶由凝胶溶液一步形成。
本发明还提供了一种水凝胶在扩展常规显微技术实现高分辨率成像的应用。
进一步地,通过芯片来辅助扩展过程,扩展过程为使用常规实验室荧光显微镜在细胞水平上发现细胞超结构细节。
本发明还提供了一种水凝胶在检测生物组织的应用。
进一步地,生物组织包括骨架蛋白或网格蛋白。
本发明还提供了一种荧光衰减缓冲液在检测生物组织的应用。
进一步地,一种荧光衰减缓冲液用于在扩展后的标本成像过程中抵抗光漂白。
进一步地,一种荧光衰减缓冲液用于在扩展后的标本成像过程中抵抗约90%的光漂白。
进一步地,一种芯片来辅助整个扩展过程以便于使用常规实验室荧光显微镜在细胞水平上发现细胞超结构细节。
在本发明的较佳实施方式中,详细说明本发明提供的水凝胶应用于骨架蛋白的成像过程;
在本发明的另一较佳实施方式中,详细说明本发明提供的水凝胶应用于网格蛋白的成像过程。
本发明的技术效果体现为:
9S水凝胶的一步形成与扩展显微技术的简便操作相结合,可在常规显微镜上实现超分辨率。本发明还设计了一种芯片来辅助整个扩展过程以便于使用常规实验室荧光显微镜在细胞水平上发现细胞超结构细节。本发明还设计了一种荧光衰减缓冲液,用于在扩展后的标本成像过程中抵抗光漂白。9S水凝胶与现代超分辨率技术(例如STORM,SMLM和STED)兼容,这种结合将使荧光显微镜的分辨率达到几纳米水平,使用荧光显微镜而不是电子显微镜来研究超微结构的变化。9S水凝胶的一步形成与扩展显微技术的简便操作相结合,可在常规显微镜上实现约30nm的分辨率,相当于超分辨率。本发明设计了一种荧光衰减缓冲液,用于在扩展后的标本成像过程中抵抗约90%的光漂白。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明提供的水凝胶用于组织膨胀的原理示意图;
图2是本发明提供的一个较佳实施例1的凝胶用于骨架蛋白的成像荧光显微图;
图3是本发明提供的一个较佳实施例2的凝胶用于网格蛋白的成像荧光显微图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例,使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现,本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
如图1所示,本发明提供的水凝胶用于组织膨胀的原理为:首先通过固定的方式将细胞的结构保存,接而对细胞上感兴趣的靶标进行染色,染色后的细胞可以通过铆钉剂使细胞上附带上可以参与成胶的结构,然后将细胞浸在成胶液里进行成胶,进而使用细胞松散试剂使细胞结构松散,最后将凝胶放在水中透析,从而使得凝胶附带细胞各向均性的膨胀。
实施例1:可膨胀的凝胶用于骨架蛋白的成像
1.将Hela细胞在含有10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中的自制模具中培养。将细胞维持在37℃,5%CO2的环境中。
2.Hela细胞以每个模具约10000个细胞的密度播种,并培养过夜。
3.对于微管蛋白,可在固定之前用提取缓冲液(PEM缓冲液(PEM缓冲液(100mMPIPES,1mM EDTA和1mM MgCl2),pH=7,补充有0.5%TritonX-100))提取细胞30秒。
4.将样品用含有3.2%多聚甲醛和0.1%戊二醛的PBS缓冲液中固定10分钟。
5.然后用含有0.1%NaBH4的PBS缓冲液还原7min。
6.接而用含有100mM甘氨酸的PBS缓冲液处理10min。
7.将细胞在PBS中清洗3次,每次5分钟。然后用封闭/通透缓冲液(含3%BSA和0.5%Triton X-100的1x PBS)孵育30分钟。
8.将细胞与一抗在封闭/通透缓冲液中于4℃孵育过夜(>6h),并用PBS洗涤3次。
9.将样品与荧光二抗在封闭/通透缓冲液中孵育2小时。用PBS洗涤三遍后,标本即可用于扩展前成像。
10.用锚定液处理样本使细胞上带有双键,然后用PBS洗涤3次。
11.将细胞在室温下浸入凝胶单体溶液中10分钟,然后替换单体溶液。依次将四甲基乙二胺(TEMED)加速剂(10%w/w)和过硫酸铵(APS)引发剂(10%w/w)的储备溶液添加到单体溶液中,开始成胶过程。
12.成胶后将凝胶浸入消化缓冲液中在37℃下处理4h完成消化过程。
13.将消化液吸出,并加入20mL去离子水中以使凝胶膨胀。直至凝胶大小不变膨胀过程完成。成像前使用成像缓冲液(去离子水中的1%DABCO)处理过的凝胶。
如图2凝胶用于骨架蛋白的成像荧光显微镜图所示,图中右上部分为膨胀前骨架蛋白的成像,左下部分为膨胀后骨架蛋白的成像,显然左下部分膨胀后可以看到细胞的精细结构,发现细胞超结构细节,而膨胀前的右上部分骨架蛋白的成像并不能看到细胞超结构细节,说明本发明提供的水凝胶可应用于细胞的扩展。这种结合将使荧光显微镜在细胞成像上的分辨率达到几十纳米水平,如果与其他超分辨显微镜结合,该方法可以研究几纳米尺度下细胞超微结构的变化。
实施例2:可膨胀的组织用于网格蛋白的成像
1.将Hela细胞在含有10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中的自制模具中培养。将细胞维持在37℃,5%CO2的环境中。
2.Hela细胞以每个模具约10000个细胞的密度播种,并孵育过夜。
3.将样品用PBS缓冲液中的3.2%多聚甲醛固定10分钟,
4. 100mM甘氨酸还原10min。
5.将细胞在PBS中清洗3次,每次5分钟。然后用封闭/通透缓冲液(含3%BSA和0.5%Triton X-100的1x PBS)孵育30分钟。
6.将细胞与一抗在封闭/通透缓冲液中于4℃孵育过夜(>6h),并用PBS洗涤3次。
7.将样品与荧光二抗在封闭/通透缓冲液中孵育2小时。用PBS洗涤三遍后,标本即可用于扩展前成像。
8.用锚定液处理样本使细胞上带有双键,然后用PBS洗涤3次。
9.将细胞在室温下浸入凝胶单体溶液中10分钟,然后替换单体溶液。依次将四甲基乙二胺(TEMED)加速剂(10%w/w)和过硫酸铵(APS)引发剂(10%w/w)的储备溶液添加到单体溶液中,开始成胶过程。
10.成胶后将凝胶浸入消化缓冲液中在37℃下处理4h完成消化过程。
11.将消化液吸出,并加入20mL去离子水中以使凝胶膨胀。直至凝胶大小不变膨胀过程完成。成像前使用成像缓冲液(去离子水中的1%DABCO)处理过的凝胶。
如图3凝胶用于网格蛋白的成像荧光显微图所示,图中上部分为膨胀前网格蛋白的成像,下部分为膨胀后网格蛋白的成像,显然下部分膨胀后可以看到细胞的精细结构,发现细胞超结构细节,而膨胀前的上部分网格蛋白的成像并不能看到细胞超结构细节,说明本发明提供的水凝胶可应用于细胞的扩展。这种结合将使荧光显微镜在细胞成像上的分辨率达到几十纳米水平,如果与其他超分辨显微镜结合,该方法可以研究几纳米尺度下细胞超微结构的变化。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
2.一种包含如权利要求1所述的交联剂的水凝胶,其特征在于,包括不同长度的交联剂,所述交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、N,N’-乙烯基双丙烯酰胺、N,N’-(丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺和N,N’-(丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺中的一种或者几种。
3.一种荧光衰减缓冲液,其特征在于,所述荧光衰减缓冲液为1%DABCO。
4.一种如权利要求2所述的水凝胶在生物组织膨胀中的应用。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述生物组织包括骨架蛋白或网格蛋白,所述水凝胶由凝胶溶液一步形成。
6.一种如权利要求2所述的水凝胶在扩展常规显微技术实现高分辨率成像的应用。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述应用为通过芯片来辅助所述扩展过程,所述扩展过程为使用常规实验室荧光显微镜在细胞水平上发现细胞超结构细节。
8.一种如权利要求2所述的水凝胶在检测生物组织的应用。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述生物组织包括骨架蛋白或网格蛋白。
10.一种如权利要求3所述的荧光衰减缓冲液在检测生物组织的应用。
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