CN113801851A

CN113801851A - 一种体细胞核移植方法及其应用

Info

Publication number: CN113801851A
Application number: CN202110666994.0A
Authority: CN
Inventors: 周琪; 李伟; 王乐韵; 李治琨; 王立宾
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2020-06-17
Filing date: 2021-06-16
Publication date: 2021-12-17

Abstract

本发明涉及一种体细胞核移植方法及其应用。该方法利用单倍体胚胎干细胞体系获得单等位基因同时敲除26个H3K27me3相关的印记基因中的一个或多个的供体体细胞进行核移植。结果显示，单等位敲除Slc38a2、Slc38a4、Sfmbt2、Etv6、Platr4、Gramd1b、Slc38a1、Gab1、Mbnl2、Smoc1、Bmp7、Rbms1、Fam198b、Sh3gl3、Hunk、Jade1、E2f3、Tle3、Runx1、Epas1、Bbx、Enc1、Inhbb、Sox21、Otx2、Rbp2中的一个或多个(如Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1这四个中的一个或多个)H3K27me3的印记基因使得这些基因的印记表达模式趋于正常。同时，利用该供体体细胞进行克隆可以将体细胞克隆效率提升至14％，而野生型的对照组体细胞克隆效率为0。另外，该方法获得的克隆动物，大胎盘‑大胎儿现象得到了修正。

Description

一种体细胞核移植方法及其应用

技术领域

本发明涉及动物生物技术领域，具体地，本发明涉及一种体细胞核移植方法及其应用。

背景技术

体细胞核移植技术(SCNT)可将体细胞核重编程使其达到全能性状态，其在动物育种和再生医学领域中具有巨大的应用潜力(Rideout et al.，2001)。然而，核移植胚胎极低的发育效率和经常观察到的发育异常表明体细胞重编程存在表观遗传障碍(Lu andZhang,2015)。在这些异常中，大胎综合征(LOS)是最常见的一种，在克隆牛、羊和老鼠中均有发现。该综合症指的是一组异质性的症状，包括出生时体型过大和严重的出生缺陷(Yanget al.，2007)。在鉴定和克服核移植过程中关键的表观遗传障碍方面研究已经取得了进展，包括抑制组蛋白去乙酰化、减少DNA甲基化和去除体细胞异质性的H3K9me3等(Dai etal，2010；Gao et al；2018；Kishigami et al，2006；Matoba et al.，2014)，这些方法均能显著提高核移植胚胎的发育效率，但对所有克隆哺乳动物的缺陷影响作用不大。尽管在克隆动物中也观察到印记异常，但DNA甲基化介导的典型基因组印记相对稳定，超出当前***质的重编程的能力(Humpherys et al.，2014)。例如，利用原始生殖细胞进行克隆不能恢复缺陷印记状态或产生可存活的幼崽(Inoue et al.，2002；Kamimura，2014；Lee，2002；Tucci，2019)。基于以上原因，基因组印记通常不被认为是核移植重编程的表观遗传障碍(Fulka et al.，2004；Kamimura，2014)。目前进行克隆的供体细胞均为体细胞，而最新研究发现小鼠胚外组织的胚胎的印记模式与胎体来源的不同，这印证着以目前常规的供体细胞进行克隆其外组织发育是存在异常的。

因此，体细胞核移植方法还需进一步研究。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

通过体细胞核移植的方式进行成功的克隆需要克服明显存在的表观遗传障碍。尽管在胚胎期E6.5天的胚胎上胚层和胚外组织中H3K27me3依赖的印记基因会呈现出差异性表达，但基因组印记通常不被认为是核移植失败的一个障碍。基于上述问题，发明人通过大量的实验探索，获得了一种显著提升核移植效率的方法，该方法利用单倍体胚胎干细胞体系获得单等位基因敲除26个H3K27me3相关的印记基因中的一个或多个的供体体细胞进行核移植。结果显示，单等位敲除Slc38a2、Slc38a4、Sfmbt2、Etv6、Platr4、Gramd1b、Slc38a1、Gab1、Mbnl2、Smoc1、Bmp7、Rbms1、Fam198b、Sh3gl3、Hunk、Jade1、E2f3、Tle3、Runx1、Epas1、Bbx、Enc1、Inhbb、Sox21、Otx2、Rbp2中的一个或多个(如Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1这四个中的一个或多个)H3K27me3的印记基因使得这些基因的印记表达模式趋于正常。同时，利用该供体体细胞进行克隆可以将体细胞克隆效率提升至14％，而野生型的对照组体细胞克隆效率为0。另外，该方法获得的克隆动物，大胎盘-大胎儿现象得到了修正。

为此，在本发明的第一方面，本发明提供了一种经修饰的单倍体胚胎干细胞，其中，所述单倍体胚胎干细胞被敲除了选自下列的基因：Slc38a2、Slc38a4、Sfmbt2、Etv6、Platr4、Gramd1b、Slc38a1、Gab1、Mbnl2、Smoc1、Bmp7、Rbms1、Fam198b、Sh3gl3、Hunk、Jade1、E2f3、Tle3、Runx1、Epas1、Bbx、Enc1、Inhbb、Sox21、Otx2、Rbp2，以及其任何组合。

需要说明的是，所述单倍体胚胎干细胞指只含有一套染色体，但拥有类似于正常干细胞***分化能力的细胞群。

在一些实施方案中，所述单倍体胚胎干细胞中另外的H19和IG被敲除，并且任选地，另外的Rasgrf1被敲除。

在一些实施方案中，所述单倍体胚胎干细胞中另外的H19、IG和Rasgrf1被敲除。

需要说明的是，H19、IG和Rasgrf1被敲除的单倍体胚胎干细胞的制备方法详见《Generation of Bimaternal and Bipaternal Mice from Hypomethylated HaploidESCs with Imprinting Region Deletions》(Li et al.,2018,Cell Stem Cell 23,1–12，November 1,2018)。

在一些实施方案中，所述单倍体胚胎干细胞被敲除了选自下列的基因：Sfmbt2、Jade1、Gab1、Smoc1，以及其任何组合。

在一些实施方案中，所述单倍体胚胎干细胞中，Sfmbt2被敲除，并且任选地，选自下列的基因被敲除：Jade1、Gab1、Smoc1，以及其任何组合。

在一些实施方案中，所述单倍体胚胎干细胞中，选自下列的基因或基因组合被敲除：

仅敲除Sfmbt2，

或者，仅敲除Sfmbt2和Jade1，或仅敲除Sfmbt2和Gab1，或仅敲除Sfmbt2和Smoc1，

或者，仅敲除Sfmbt2、Jade1和Gab1，或仅敲除Sfmbt2、Jade1和Smoc1，或仅敲除Sfmbt2、Smoc1和Gab1，

或者，Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1被同时敲除。

在本发明的第二方面，本发明提供了制备前述经修饰的单倍体胚胎干细胞的方法，其包括：通过基因敲除技术，获得所述经修饰的单倍体胚胎干细胞，其中，所述基因敲除技术将单倍体胚胎干细胞中的选自下列的基因敲除：Slc38a2、Slc38a4、Sfmbt2、Etv6、Platr4、Gramd1b、Slc38a1、Gab1、Mbnl2、Smoc1、Bmp7、Rbms1、Fam198b、Sh3gl3、Hunk、Jade1、E2f3、Tle3、Runx1、Epas1、Bbx、Enc1、Inhbb、Sox21、Otx2、Rbp2，以及其任何组合。

在一些实施方案中，所述基因敲除技术将单倍体胚胎干细胞中另外的H19和IG敲除，并且任选地，将另外的Rasgrf1敲除。

在一些实施方案中，所述基因敲除技术将单倍体胚胎干细胞中另外的H19、IG和Rasgrf1敲除。

在一些实施方案中，所述基因敲除技术将单倍体胚胎干细胞中的选自下列的基因敲除：Sfmbt2、Jade1、Gab1、Smoc1，以及其任何组合。

在一些实施方案中，所述基因敲除技术将单倍体胚胎干细胞中的Sfmbt2敲除，并且任选地，将选自下列的基因敲除：Jade1、Gab1、Smoc1，以及其任何组合。

在一些实施方案中，所述基因敲除技术将单倍体胚胎干细胞中的选自下列的基因或基因组合敲除：

仅敲除Sfmbt2，

或者，同时敲除Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1。

在一些实施方案中，所述基因敲除技术为使用CRISPR的基因敲除技术。

在一些实施方案中，所述基因敲除技术为使用CRISPR-Cas9的基因敲除技术。

在一些实施方案中，利用CRISPR-Cas9基因敲除技术，使用两条sgRNA来敲除所述Gab1基因，所述两条sgRNA的序列分别为SEQ ID NO:1和2，

或者，利用CRISPR-Cas9基因敲除技术，使用两条sgRNA来敲除所述Jade1基因，所述两条sgRNA的序列分别为SEQ ID NO:3和4，

或者，利用CRISPR-Cas9基因敲除技术，使用两条sgRNA来敲除所述Sfmbt2基因，所述两条sgRNA的序列分别为SEQ ID NO:5和6，

或者，利用CRISPR-Cas9基因敲除技术，使用两条sgRNA来敲除所述Smoc1基因，所述两条sgRNA的序列分别为SEQ ID NO:7和8。

在一些实施方案中，前述经修饰的单倍体胚胎干细胞是通过如下方法获得的：

针对Sfmbt2、Smoc1、Gab1、Jade1这四个基因各设置一对sgRNA，这些sgRNA均靶向各自基因所有转录本的通用外显子区域。随后将携带这些sgRNA和Cas9的质粒利用电转仪电转至H19、IG、及Rasgrf1基因敲除的带有绿色荧光蛋白表达的单倍体胚胎干细胞。细胞数量级为10^6级别。电转后的单倍体胚胎干细胞在单倍体胚胎干细胞培养基上培养两天后，利用流式细胞分选仪，分选出带有绿色荧光蛋白的单倍体胚胎干细胞。优选地，随后利用PCR技术对已经进行转染的细胞进行鉴定，鉴定出带有这四个基因完全敲除的单倍体胚胎干细胞。

在一些实施方案中，制备前述经修饰的单倍体胚胎干细胞的方法进一步包括：利用PCR技术对获得的所述单倍体胚胎干细胞进行鉴定。

在一些实施方案中，所述鉴定时采用的分别针对Sfmbt2、Smoc1、Gab1和Jade1的引物序列为：

针对Gab1，鉴定时采用的引物序列为SEQ ID NO:11和12，

或者，针对Jade1，鉴定时采用的引物序列为SEQ ID NO:13和14，

或者，针对Sfmbt2，鉴定时采用的引物序列为SEQ ID NO:15和16，

或者，针对Smoc1，鉴定时采用的引物序列为SEQ ID NO:17和18。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种体细胞，其中，所述体细胞被单等位敲除了选自下列的基因：Slc38a2、Slc38a4、Sfmbt2、Etv6、Platr4、Gramd1b、Slc38a1、Gab1、Mbnl2、Smoc1、Bmp7、Rbms1、Fam198b、Sh3gl3、Hunk、Jade1、E2f3、Tle3、Runx1、Epas1、Bbx、Enc1、Inhbb、Sox21、Otx2、Rbp2，以及其任何组合。

在一些实施方案中，所述体细胞中另外的H19和IG被单等位敲除，并且任选地，另外的Rasgrf1被单等位敲除。

在一些实施方案中，所述体细胞中另外的H19、IG和Rasgrf1被单等位敲除。

在一些实施方案中，所述体细胞被单等位敲除了选自下列的基因：Sfmbt2、Jade1、Gab1、Smoc1，以及其任何组合。

在一些实施方案中，所述体细胞中，Sfmbt2被单等位敲除，并且任选地，选自下列的基因被单等位敲除：Jade1、Gab1、Smoc1，以及其任何组合。

在一些实施方案中，所述体细胞中，选自下列的基因或基因组合被单等位敲除：

仅敲除Sfmbt2，

或者，Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1被同时敲除。

在一些实施方案中，所述体细胞来源于哺乳动物(优选非人哺乳动物)。

在一些实施方案中，所述哺乳动物为小鼠、羊、牛、猪或猴子。

在一些实施方案中，所述体细胞为成纤维细胞。

在一些实施方案中，所述成纤维细胞为胎儿或成体成纤维细胞(如尾尖成纤维细胞)。

在本发明的第四方面，本发明提供了制备前述体细胞的方法，其包括：

(1)提供前述经修饰的单倍体胚胎干细胞，

(2)将所述单倍体胚胎干细胞的细胞核注入到预激活的***中，获得第一重构胚胎；

(3)将所述第一重构胚胎培养发育成胎儿；

(4)从所述胎儿分离获得所述体细胞。

在一些实施方案中，在步骤(3)中，通过使用四倍体囊胚，将所述第一重构胚胎培养发育成胎儿。

在一些实施方案中，所述方法包括：

1)提供前述经修饰的单倍体胚胎干细胞，

2)将所述单倍体胚胎干细胞的细胞核注入到预激活的***中，获得第一重构胚胎并进行培养，获得第一囊胚，

3)分离所述第一囊胚，获得内细胞团细胞，或由第一囊胚建立起的胚胎干细胞系，

4)将所述内细胞团细胞或所述胚胎干细胞系注入到四倍体囊胚中，培养获得第二重构胚胎，

5)将所述第二重构胚胎进行发育(例如，将所述第二重构胚胎移植到***母体子宫中进行所述发育)，获得胎儿，

6)从所述胎儿分离获得所述体细胞。

在一些实施方案中，所述***母体子宫为哺乳动物(优选非人哺乳动物)***母体子宫。

在一些实施方案中，所述***母体子宫为小鼠、羊、牛、猪或猴子母体子宫。

需要说明的是，***激活指的是，由于成熟的***停滞于第二次减数***中期(MⅡ期)，只有在***或某些理化因素的刺激下，***才能恢复并完成减数***，这一过程称为***激活。

在一些实施方案中，所述预激活的***是通过如下方法获得的：将***在8-12mM(如10mM)浓度的含Srcl₂无钙的CZB培养液中预激活处理20-40分钟(如30分钟)。

在一些实施方案中，所述预激活处理是在适宜的温度和少量CO₂的培养箱中进行的。在一些优选的实施方案中，所述预激活处理是在37℃，5％CO₂培养箱中进行的。

需要说明的是，所述四倍体囊胚不能正常发育，但是可以形成胎盘，可以用于验证干细胞是否具有全能性。所述四倍体囊胚是将两枚2细胞的二倍体胚胎经过外部刺激，生成的四倍体的胚胎。

在一些实施方案中，所述四倍体囊胚是通过电融合或化学融合方法获得的。

在一些实施方案中，所述四倍体囊胚是通过如下方法获得的：获取哺乳动物2细胞期胚胎，将所述2细胞期胚胎放入胚胎融合液中，利用电融合仪，在直流电场强度为1-3kV/cm(如2kV/cm)，脉冲时程30-50μs(如40μs)时电击所述2细胞期胚胎，获得所述四倍体囊胚(如获得具有两套染色体组的所述四倍体囊胚)；任选地，将所述囊胚放入培养液(如M16培养液)中培养(优选地，所述培养是在适宜的温度和少量CO₂的培养箱中进行的，更优选地，所述培养是在37℃，5％CO₂培养箱中进行的)备用。

在一些实施方案中，所述哺乳动物为非人哺乳动物，如所述哺乳动物为小鼠、羊、牛、猪或猴子。

在一些实施方案中，步骤2)是通过如下步骤进行的：

利用流式细胞分选仪分选出G0-G1期的单倍体胚胎干细胞。随后将四基因完全敲除的单倍体胚胎干细胞的细胞核利用显微操作仪注射到预激活的***中。注射完毕后再将重构的胚胎放入10Mm浓度的含Srcl₂无钙的CZB培养液继续培养5个小时，5个小时后将重构胚胎放置进入M16中继续培养。在一些优选的实施方案中，所述培养是在适宜的温度和少量CO₂的培养箱中进行的。在一些更优选的实施方案中，所述培养是在37℃，5％CO₂培养箱中进行的。

在一些实施方案中，步骤3)是通过如下步骤进行的：

将前述步骤获取的囊胚放入5mg/ML链酶蛋白酶中放入37℃环境中3分钟，去除透明带。随后将去掉透明带的囊胚放入含有10％胎牛血清和20％20抗小鼠全血清的DMEM培养液中，放入适宜的温度和少量CO₂的培养箱(如37℃，5％CO₂培养箱)中孵育3小时。随后用DMEM/胎牛血清(10％)培养液清洗囊胚，并在100％小鼠血清中孵育20min。在一些优选的实施方案中，在四倍体补偿之前，轻轻吹打胚胎，温和地去除TE细胞，并且将分离的ICM细胞置于HER/FBS(GIBCO)培养液中。

在一些实施方案中，步骤4)是通过如下步骤进行的：

挑选前述步骤获得的内细胞团细胞，利用显微操作仪将其注射入前述方法获得的四倍体囊胚中，每个囊胚中注射15枚内细胞团细胞左右。

在一些实施方案中，步骤5)是通过如下步骤进行的：

将前述方法获得的囊胚移植进入假孕小鼠的子宫中进行发育，之后解剖小鼠，获得胎儿。

在一些实施方案中，步骤6)是通过如下步骤进行的：

将获得的所述胎儿用酒精浸泡2h杀菌的手术剪刀，镊子，去除胎儿头部和各个器官。将剩余胚胎切碎，将切碎的组织置于2mL的含有1mM乙二胺四乙酸的0.25％胰蛋白酶中，适宜温度(如37℃)培养箱中消化10分钟。用等体积的含10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM液体稀释，终止消化反应，并轻轻反复吹吸20次以上。将细胞悬液用新鲜培养基稀释，铺在100mm的培养皿上，摇匀，在适宜的温度和少量CO₂的培养箱(如37℃，5％CO₂培养箱)培养两天，获得目标基因单等位敲除的所述体细胞(如胎儿成纤维细胞)。在一些优选的实施方案中，所述体细胞(如胎儿成纤维细胞)均使用第一代细胞。

在本发明的第五方面，本发明提供了前述体细胞或前述方法获得的体细胞用于核移植的用途。

在本发明的第六方面，本发明提供了一种体细胞核移植的方法，其利用供体体细胞进行核移植，其中，所述供体体细胞如前所述。

在一些实施方案中，所述体细胞核移植方法包括：

A-1)将所述供体体细胞注入到目标受体细胞(优选地，所述目标受体细胞是去核的；更优选地，所述受体细胞为去核***)的细胞间隙(优选卵间隙)中，并进行胚胎融合，构建第三重构胚胎，

B-1)激活所述第三重构胚胎。

在一些实施方案中，所述体细胞核移植方法包括：

A-2)将所述供体体细胞的细胞核注入到目标受体细胞(优选地，所述目标受体细胞是去核的；更优选地，所述受体细胞为去核***)中，构建第四重构胚胎，

B-2)激活所述第四重构胚胎。

在一些实施方案中，步骤A-1)是通过如下步骤进行的：

利用显微操作仪去除目标受体细胞(如***)细胞核，随后将所述供体体细胞(如胎儿成纤维细胞)放入灭活的仙台病毒中数秒后取出，随后使用Piezo将带有仙台病毒的供体体细胞注入到去核目标受体细胞(如***)的细胞间隙(如卵间隙)中，随后将胚胎放入适宜的温度和少量CO₂的培养箱(如37℃，5％CO₂培养箱)中直至胚胎融合。

在一些实施方案中，步骤B-1)是通过如下步骤进行的：

将融合的胚胎移到培养液(如M16培养液)中短暂培养后放入含有5mg/mL细胞松弛素B和10mM氯化锶的无钙CZB培养液中激活5-6h，最后于培养液(如M16培养液)中培养。

在一些实施方案中，步骤A-1)或步骤B-1)中，所述培养是在适宜的温度和少量CO₂的培养箱(如37℃，5％CO₂培养箱)中进行的。

在一些实施方案中，所述***是通过如下方法获得的：

挑选适龄雌鼠，注射孕马血清素(PMSG)，注射后13-17小时内注射人绒毛膜***(HCG)。在注射HCG后13-15h后进行取卵操作。收集的***用Hepes-CZB清洗，随后培养在培养液(如M16培养液)中，并放入适宜的温度和少量CO₂的培养箱(如37℃，5％CO₂培养箱)中培养待用。颗粒细胞用透明质酸酶消化去除，在显微操作之前，***置于含3mg/mL BSA的CZB培养液中暂存。

在本发明的第七方面，本发明提供了前述的经修饰的单倍体胚胎干细胞或者前述的体细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与体细胞核移植有关的疾病。

在一些实施方案中，所述与体细胞核移植有关的疾病为大胎综合征。

在一些实施方案中，所述与体细胞核移植有关的疾病为大胎盘和/或大胎儿。

在一些实施方案中，所述与体细胞核移植有关的疾病为妊娠期糖尿病哺乳动物新生胎儿出生体重超重。

在一些实施方案中，所述大胎综合征为哺乳动物(优选非人哺乳动物)大胎综合征。

在本发明的第八方面，本发明提供了一种治疗与体细胞核移植有关的疾病的方法，其包括：利用供体体细胞进行核移植，其中，所述供体体细胞如前所述。

在一些实施方案中，所述治疗与体细胞核移植有关的疾病的方法包括：

B-1)激活所述第三重构胚胎。

B-2)激活所述第四重构胚胎。

在本发明的第九方面，本发明提供了一种动物，其中，所述动物被单等位敲除了选自下列的基因：Slc38a2、Slc38a4、Sfmbt2、Etv6、Platr4、Gramd1b、Slc38a1、Gab1、Mbnl2、Smoc1、Bmp7、Rbms1、Fam198b、Sh3gl3、Hunk、Jade1、E2f3、Tle3、Runx1、Epas1、Bbx、Enc1、Inhbb、Sox21、Otx2、Rbp2，以及其任何组合。

在一些实施方案中，所述动物中另外的H19和IG被单等位敲除，并且任选地，另外的Rasgrf1被单等位敲除。

在一些实施方案中，所述动物中另外的H19、IG和Rasgrf1被单等位敲除。

在一些实施方案中，所述动物被单等位敲除了选自下列的基因：Sfmbt2、Jade1、Gab1、Smoc1，以及其任何组合。

在一些实施方案中，所述动物中，Sfmbt2被单等位敲除，并且任选地，选自下列的基因被单等位敲除：Jade1、Gab1、Smoc1，以及其任何组合。

在一些实施方案中，所述动物中，选自下列的基因或基因组合被单等位敲除：

仅敲除Sfmbt2，

或者，Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1被同时敲除。

在一些实施方案中，所述动物为哺乳动物(优选非人哺乳动物)。

在本发明的第十方面，本发明提供了制备前述动物的方法，其包括：

将前述方法获得的激活后的所述第三重构胚胎或所述第四重构胚胎进行培养；

待所述第三重构胚胎或所述第四重构胚胎发育到合适的阶段(如发育到2细胞，或者发育到4细胞，或者发育到8细胞，或者发育到更多细胞)时，将所述第三重构胚胎或所述第四重构胚胎移植到动物输卵管或子宫，到期获得所述动物。

有益效果：

在成纤维细胞上单等位敲除Slc38a2、Slc38a4、Sfmbt2、Etv6、Platr4、Gramd1b、Slc38a1、Gab1、Mbnl2、Smoc1、Bmp7、Rbms1、Fam198b、Sh3gl3、Hunk、Jade1、E2f3、Tle3、Runx1、Epas1、Bbx、Enc1、Inhbb、Sox21、Otx2、Rbp2中的一个或多个(如Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1这四个中的一个或多个)H3K27me3的印记基因使得这些基因的印记表达模式趋于正常。同时，利用该成纤维细胞进行克隆可以将成纤维细胞克隆效率提升至14％，而野生型的对照组的成纤维供体细胞克隆效率为0。另外，该方法获得的克隆动物，大胎盘-大胎儿现象得到了修正。其中，Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1这四个基因的单基因敲除策略中Sfmbt2是这四个基因中改善克隆效率最显著的单基因。

附图说明

图1表示克隆胎盘中H3K27me3印记的丢失，其中：

A表示常染色体印记基因在E10.5克隆胎盘中的相对基因表达水平的柱状图。显示在克隆胎盘(FPKM>1)中检测到的50个印记基因。体外受精胎儿的胎盘印记基因表达水平设为1。用方框框住的基因名为H3K27me3印记基因。横向的虚线表示克隆胎盘中过表达的印记基因(倍数变化>2)，

B表示X染色体连锁的印记基因在E10.5克隆胎盘中的相对表达水平柱状图。体外受精的胎盘基因表达水平为1。横向的虚线表示克隆胎盘中过表达的印记基因(倍数变化>2)，

C表示柱状图显示了通过SNP鉴定的体外受精和克隆的胎盘中H3K27me3印记基因父母源等位基因表达比值。没有用方框框住的基因名和用方框框住的基因名分别代表了经典和H3K27me3印记基因，

D表示以SNP为标记，通过RT-PCR和Sanger测序检测体外受精和克隆E19.5胎盘中H3K27me3印记基因父母源等位基因表达比例，

E表示基于haESCs3KO的4个H3K27me3印记基因敲除和MII***注射的方案，

F表示左边是:野生型E9.5胚胎及胎盘。右边:阻滞的基于haESCs3KO制备的4个H3K27me3印记基因敲除E9.5胎儿和胎盘。白色三角标注的是胎盘。比例尺为0.5mm；

图2表示制备4个基因单等位敲除的H3K27me3印记基因的体细胞并进行克隆，其中：

A表示制备Δ4-MEFs3KO细胞和将其用作核移植供体细胞进行克隆的方案。将Δ4-embryos3KO注射到***中，待其发育为囊胚时将其内细胞团分离出来，再将ICM注射到野生型四倍体囊胚后移植。之后，用E13.5的Δ4-embryos3KO胎儿制备MEF,再用这些MEF为供体细胞克隆获得Δ4-NT-mice3KO，

B表示IVF，WT-NT和Δ4-NT囊胚的H3K27me3印记基因的免疫荧光结果。红色信号为H3K27me3印记基因染色。绿色信号为CDX2染色，蓝色信号为DNA的DAPI染色。标尺为15μm，

C表示IVF，WT-NT和Δ4-NT囊胚TE细胞中H3K27me3印记基因的免疫荧光的比较。每个点代表单个TE细胞的蛋白与DAPI强度比值。实线代表平均值和标准差。“****”表示p小于0.0001，ns表示差异不显著，由t检验检测；

图3表示携带四个H3K27me3印记基因单等位敲除的的体细胞克隆胚胎的发育结果，其中：

A表示使用TSA处理与未处理的野生型MEF，Δ4-MEFs和Δ4-TTFs着床率的统计，

B表示一次实验中刚刚剖出的Δ4-NT-mice3KO和胎盘的照片。比例尺为10mm，

C表示到期的野生型克隆小鼠和Δ4-NT-mice3KO体重比较，体外受精的幼崽为对照，

D表示到期的野生型克隆小鼠，Δ4-NT-mice3KO胎盘重量比较，体外受精的幼崽胎盘重量为对照，

E表示野生型克隆小鼠胎盘和Δ4-NT-mice3KO胎盘直径的比较图。体外受精来源的胎盘作为对照组。“*”代表p小于0.05，“**”代表p小于0.01，“***”代表p小于0,001，“****”代表p小于0.0001，ns表示无显著性差异，t检验分析，

F表示胎盘切片图，上边是HE染色图，下边是Lamininα1抗体的免疫组化图。上图的黄线，和下图的红线分别标注出了迷路层中的胎儿血管。比例尺为1mm，

G表示迷路层中的胎儿血管所占比例柱状图。“****”代表p小于0.0001，由t检验分析，

H表示IVF，WT-NT和Δ4-NT-mice3KO胎盘切片，上边标有星星的区域为血管区，下边标有星星的区域为胎盘中的无细胞区。比例尺为0.15mm。“*”代表p小于0.05，“**”代表p小于0.01，“***”代表p小于0.001，“****”代表p小于0.0001，ns表示无显著性差异，由t检验分析，

I表示迷路层中无细胞区的所占比例柱形图，

J表示迷路层中的胎儿血管所占比例柱状图；

图4表示纠正单个H3K27me3印记基因可在不同程度上改善SCNT胚胎发育，其中：

A表示Δ4-NT-mice3KO及其后代。带有星号的后代是死亡的仔鼠，这些小鼠从母本那里遗传了IG-DMR的敲除，

B表示纠正后的Δ4-NT-mice3KO每窝产仔数，与WT组相当，

C表示Δ4-NT-mice3KO后代，Sfmbt2Δ/+鼠和WT老鼠大脑转录组比较。n＝2。“*”代表p小于0.05，“**”代表p小于0.01，“***”代表p小于0.001，“****”代表p小于0.0001，ns表示无显著性差异，由t检验分析，

D表示WT-TTFs，Sfmbt2^Δ/+-TTFs，Jade1^Δ/+-TTFs，Gab1^Δ/+-TTFs，Smoc1^Δ/+-TTFs和Δ3-TTFs着床率比较，

E表示Sfmbt2^Δ/+-NT小鼠的照片，

F表示胎盘切片图，上边是HE染色图，下边是lamininα1抗体的免疫组化图。上图的黄线，和下图的红线标注出了迷路层中的胎儿血管。每个样本的扫描图像通过调整比例组合成一张图像。比例尺＝1mm，

G表示迷路层中的胎儿血管所占比例柱状图。所有图中的数据呈现方式为：均值±标准差。“**”代表p小于0.01，“***”代表p小于0.001，ns表示无显著性差异，由t检验分析，

H表示受精胚胎中H3K27me3印记基因在胎盘特异性印记模式示意图及对H3K27me3异质性单等位敲除的体细胞的进行克隆对SCNT幼崽率低和胎盘/子代缺陷的挽救模式图。

以上所有图表，数据均以平均值±方差表示。*T检验值p<0.05，**p<0.01，**p<0.001，**p<0.0001；

图5表示分析H3K27me3印记基因在克隆胚胎中的表达，与图1相关，其中：

A表示在E10.5克隆胎儿中常染色体印记基因相对基因表达水平的柱状图。在克隆胚胎中检测到的59个印记基因(FPKM>1)比较可靠。体外受精胚胎的基因表达水平设为1。用方框框住的基因名是H3K27me3印记基因。横向虚线表示在克隆胚胎中(倍数变化>2)中表达过高的印记基因，

B表示E10.5克隆胎儿中X染色体印记基因的相对表达水平。体外受精胚胎中的基因表达水平设为1。

C表示通过SNP鉴定的体外受精和克隆胚胎中H3K27me3印记基因父母源等位基因表达的比率(父源比母源)。没有用方框框住的基因名和用方框框住的基因名分别是经典的印记基因和H3K27me3印记基因，

D中，上:敲除Jade1外显子3的方案。中:用于敲除的sgRNA序列。下:基因组和cDNA的Sanger测序结果，确认Jade1外显子3的320bp DNA缺失(左)和Jade1 mRNA的移框突变(右)，

E中，上:Smoc1外显子4的敲除方案。中:用于敲除的sgRNA序列。下:基因组和cDNA的Sanger测序结果，确认Smoc1外显子4的639bp DNA缺失(左)和Smoc1 mRNA的移框突变(右)，

F中，上:Gab1外显子3敲除方案。中:用于敲除的sgRNA序列。下:基因组和cDNA的Sanger测序结果，确认Gab1外显子3的773bp DNA缺失(左)和Gab1 mRNA的移框突变(右)，

G中，上:敲除Sfmbt2外显子16-17的方案。中:用于删除的sgRNA序列。下:基因组和cDNA的Sanger测序结果，确认Sfmbt2外显子16-17的3290bp DNA缺失(左)和Sfmbt2 mRNA的移框突变(右)，

H表示WT haESCs和Δ4-haESCs3KO中H3K27me3印记基因的免疫印记检测结果，

I表示替代***的单倍体胚胎干细胞的基因修饰图；

图6表示表征Δ4-NT幼崽的基因表达和存活曲线，与图2相关，其中：

A表示蛋白免疫印迹图，显示H3K27me3印记基因在到期的WT-NT，WT-IVF和Δ4-NT-mice3KO胎盘中的表达情况，

B表示Δ4-NT-mice3KO和WT小鼠的大脑转录组比较。n＝2，

C表示一次实验中出生的Δ4-TTFs3KO克隆老鼠和其胎盘，

D表示WT和Δ4-MEFs/TTFs克隆小鼠的存活曲线图；

图7表示小鼠SCNT中Δ4和Xist缺失的相关性，与图3相关，其中：

A中，上边：Xist基因的敲除方案。中间:Xist敲除所用的sgRNA序列。下边:基因组和cDNA的Sanger测序结果，显示Xist基因17301bp敲除。

B表示Δ4-NT-mice^3KO与ΔXist/Δ4-NT-mice^3KO大脑的转录组比较。n＝2。

C表示E19.5的Δ4-NTmice^3KO和ΔXist/Δ4-NT-mice^3KO胎盘的X染色体印记基因相对表达水平柱状图。Δ4-NT-mice^3KO胎盘的表达水平被设置为1。n＝2。

D表示刚刚剖出的Δ4-TTFs^3KO克隆老鼠和胎盘的照片，

E表示Southern印记杂交结果证实Xist^Δ/Y小鼠中Xist的单等位敲除

F中，左图：TTF^3KO克隆胚胎移植的子宫。右图：单个子宫中剖出的Xist^Δ/Y-TTFs克隆胎儿和着床点。标尺为2mm。

G表示不同阶段胎儿与所有重构胚胎的比例。2-细胞期胚胎被视为E1.0；剖出的着床点被视为E5.0；白眼的胎儿被视为发育阶段小于E10.5；黑眼的胎儿被视为发育阶段大于等于E10.5；黑白眼都有的胎儿也被视为发育阶段小于E10.5。Xist^Δ/Y-TTF，n＝5；WT-MEF和△Xist/△4-MEF^3KO，n＝4；△4-MEF^3KO和△4-TTF^3KO，n＝3。“*”代表p小于0.05，“**”代表p小于0.01，“***”代表p小于0.001，“****”代表p小于0.0001，ns表示无显著性差异，由t检验分析；

图8表示单独的H3K27me3印记基因对克隆胎盘发育的贡献，与图4相关，其中：

A表示单H3K27me3印记基因单等位敲除TTFs获得方案，

B表示Δ4-NT-mice^3KO存活后代基因型鉴定结果，

C表示不同印记基因对于克隆的贡献是不同的，

D和E表示Sfmbt2^Δ/+-NT和Δ3-NT胎儿体重和胎盘重分析，

F表示WT-NT，Sfmbt2^Δ/+-NT和Δ3-NT到期小鼠胎盘的血管区(上)和无细胞不连续区域(下)的切片图。标有星号的区域分别是血管区和无细胞不连续区。标尺为0.15mm，

G表示迷路层中无细胞区的面积比例柱形图，

H表示迷路层中血管区的面积比例柱形图。“*”代表p小于0.05，“**”代表p小于0.01，“***”代表p小于0.001，“****”代表p小于0.0001，ns表示无显著性差异，由t检验。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解，此部分所描述的具体实施例仅可用于解释本发明，并不用于限定本发明。

通过体细胞核移植的方式进行成功的克隆需要克服明显存在的表观遗传障碍。尽管在胚胎期E6.5天的胚胎上胚层和胚外组织中H3K27me3依赖的印记基因会呈现出差异性表达，但基因组印记通常不被认为是核移植失败的一个障碍。本发明中发明人报道了一种显著提升核移植效率的方法，该方法利用单倍体胚胎干细胞体系获得单等位基因敲除26个H3K27me3相关的印记基因中的一个或多个的供体体细胞进行核移植。结果显示单等位敲除Slc38a2、Slc38a4、Sfmbt2、Etv6、Platr4、Gramd1b、Slc38a1、Gab1、Mbnl2、Smoc1、Bmp7、Rbms1、Fam198b、Sh3gl3、Hunk、Jade1、E2f3、Tle3、Runx1、Epas1、Bbx、Enc1、Inhbb、Sox21、Otx2、Rbp2中的一个或多个(如Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1这四个中的一个或多个)H3K27me3的印记基因使得这些基因的印记表达模式趋于正常。同时，利用该成纤维细胞进行克隆可以将成纤维细胞克隆效率提升至14％，而野生型的对照组的成纤维供体细胞克隆效率为0。另外，该方法获得的克隆动物，大胎盘-大胎儿现象得到了修正。其中，Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1这四个基因的单基因敲除策略中Sfmbt2是这四个基因中改善克隆效率最显著的单基因。以上结果表明缺失H3K27me3印记的体细胞是阻碍体细胞核移植胚胎着床后发育的重要障碍因素，在供体细胞中同时修正这些印记基因的表达模式能够克服核移植的这些障碍。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。

需要说明的是，测序数据已保存在中国科学院北京基因组研究所基因组序列档案中，登录号为CRA002383(http://gsa.big.ac.cn)。可以在“关键资源表”中找到用于数据分析和处理的软件列表。

所有小鼠实验均按照中国科学院动物研究所发布的《动物研究使用指南》进行。将所有小鼠饲养在中国科学院的动物设施中。B6D2F1(C57BL/6×DBA/2)，C57BL/6和CD-1背景小鼠购自北京维通利华公司。PWK/PhJ(库存号003715)小鼠和C57BL/6-Tg(CAGEGFP)1Osb/J(库存号003291)购自Jackson实验室。使用雄性C57BL/6小鼠与Δ4-NT小鼠交配，以获得携带分离的非经典印记基因缺失的后代。使用雌性C57BL/6-Tg(CAGEGFP)1Osb/J×PWK/PhJ小鼠提供卵丘细胞进行核移植。使用雌性B6D2F1小鼠(C57BL/6×DBA/2)提供体细胞供体细胞和***，并使用CD-1背景小鼠提供受精胚胎和假孕母鼠。

以下实施例中涉及的关键试剂的来源如下表1所示。

表1：关键试剂的来源

另外，以下实施例中涉及的部分实验操作的具体步骤如下所述：

1、***的收集

挑选适龄雌鼠，注射孕马血清素(PMSG)，注射后13-17小时内注射人绒毛膜***(HCG)。在注射HCG后13-15h后进行取卵操作。收集的***用Hepes-CZB清洗，随后培养在M16(Sigma)培养液中，并放入37℃，5％CO2培养箱中培养待用。颗粒细胞用透明质酸酶消化去除，在显微操作之前，***置于含3mg/mL BSA的CZB培养液中暂存。

2、CRISPR-CAS9基因编辑

按照表2发明人针对每个本发明专利的四个基因每个都构建了一对sgRNAs，这些sgRNA均靶向各自基因所有转录本的通用外显子区域，而Xist的靶向位置为外显子1-6。随后利用neon(Invitrogen)电转仪将sgRNAs和Cas9转染到10⁶haESCs中，两天后，通过流式细胞仪分选GFP阳性的haESCs，并以低密度接种于饲养层细胞上，7天后，挑选单个集落进行PCR检测。与发明人获得具有四倍非经典印记基因缺失的MEFs的方法不同，发明人通过Cas9和敲除Xist的sgRNA表达质粒直接转染Δ4-MEFs^3KO细胞株上产生ΔXist/Δ4-MEFs^3KO。随后将转染的Δ4-MEFs^3KO的细胞核注射到去核的***中进行克隆，重构的胚胎被移植到假孕受体中。取E13.5胚胎以获得新的成纤维细胞株MEFs，通过PCR筛选具有Xist单等位基因敲除的胚胎，并通过桑格测序证实。向C57BL6小鼠的一细胞期胚胎注射Cas9和Xist-敲除的sgRNA表达质粒来获得Xist^Δ/Y小鼠。PCR和桑格测序验证小鼠的基因型。Xist-敲除的雌性小鼠与C57BL6雄性小鼠交配产生Xist^Δ/Y小鼠。Xist^Δ/Y小鼠的基因型通过Southern杂交证实。

3、单倍体干细胞胞浆内注射(Δ4-haESCs^3KO)

(1)超排取卵方法如方法1，获取B6D2F1品系的MII期***,培养箱中待用。

(2)通过流式分选出G0或者G1期的Δ4-haESCs^3KO细胞作为供体。在显微注射之前，将***置于含有10mM SrCl₂的CZB培养液中30min。随后将Δ4-haESCs^3KO细胞分别注入到***中构建重构胚胎。

(3)重构胚胎在含10mM SrCl₂的无钙CZB培养液中激活5h。将完全激活的胚胎在M16中洗两遍并最终培养在M16培养液中，置于37℃，CO₂培养箱中。

(4)第二天，将2-细胞期的重构胚胎移植进假孕的CD-1母鼠体内或者转移至KSOM培养液中培养至囊胚。

4、小鼠胚胎免疫荧光

所有的囊胚在37℃和5％CO2下用5mg/mL的链霉蛋白酶(Sigma)处理5-10分钟以除去透明带，转移至M16中清洗，随后用4％多聚甲醛(PFA)固定30分钟。用PBS清洗后将胚胎转移到盛有200μl含有0.1％Triton X-100的透膜液中，通透30min。在含0.1％Tween-20和0.01％TritonX-100的1％BSA封闭液中，封闭1h。将封闭完成的胚胎转移到一抗(CDX2andGAB1/JADE1/SMOC1)中，4℃，过夜。PBS清洗3次。与二抗在室温条件下共孵育1h。使用的二抗有Alexa 488donkey anti-mouse和Cyanine3 goat anti-rabbit。细胞核染色，DAPI，室温5min。为了比较H3K27me3依赖印记基因的胚胎外蛋白水平，分析了来自IVF,WT-NT,和Δ4-NT囊胚的滋养层细胞中GAB1、JADE1和SMOC1的相对荧光强度，选择CDX2信号阳性的TE细胞进行分析。记录每个TE细胞中GAB1/JADE1/SMOC1蛋白与DAPI信号的比值并进行分析(IMARIS 3D/4D Visualization&Analysis Software)。

5、四倍体补偿

将Δ4-3KO胚胎用口吸管移入预热的链霉蛋白酶溶液中，37℃，3min，去除透明带。将没有透明带的囊胚放在含有10％胎牛血清和20％抗小鼠全血清的DMEM中于37℃孵育3h后。用DMEM/FBS(10％)培养液清洗囊胚，并在100％小鼠血清中孵育20min。在四倍体补偿之前，轻轻吹打胚胎，温和的地移去除TE细胞，并且将分离的ICM细胞置于HER/FBS(GIBCO)培养液中。

四倍体补偿的四倍体囊胚的准备的获得参照先前的描述(Zhao et al.,2009).简而言之，从CD-1母鼠的输卵管中取出2细胞胚胎，并且电融合产生四倍体胚胎。随后将10到15个ICM细胞注射入每个囊胚中并移植到CD-1假怀孕母鼠子宫内。

6、体细胞核移植的供体细胞准备

胎儿成纤维细胞(MEFs)来源于E13.5的Δ4-3KO四倍体补偿胚胎，E13.5的B6D2F1胚胎和E13.5的haESCs3KO胞浆内注射产生的胚胎。用酒精浸泡2h杀菌的手术剪刀，镊子，去除胎儿头部和各个器官。将剩余胚胎切碎，将切碎的组织置于2ml的含有1mM乙二胺四乙酸的0.25％胰蛋白酶中，37℃培养箱中消化10分钟。用等体积的含10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM液体稀释，终止消化反应，并轻轻反复吹吸20次以上。将细胞悬液用新鲜培养基稀释，铺在100mm的培养皿上，摇匀，在37℃，5％CO2培养箱培养两天。冻存细胞(第0代)。在所有实验中，MEFs均使用第一代细胞。

尾尖成纤维细胞(TFFs)来源于6周龄的Δ4-NT-3KO小鼠、B6D2F1小鼠和通过胞浆内注射haESCs3KO细胞产生的小鼠的尾尖获得的。将切下的尾尖组织置于预先涂有纤连蛋白的培养皿底部，并在25℃-27℃下干燥10min。之后，轻轻加入含10％胎牛血清的DMEM，以避免组织从盘底脱落。将培养皿置于37℃下培养，直到成纤维细胞***并在皿底汇集(第0代)。所有的实验中的TTFs都使用3代之前的细胞。

卵丘细胞取自于8周龄大的雌鼠(B6/PWK)，通过注射7.5IU的PMSG和7.5IU的hCG来超排获得。15-17h后，用预热的300IU/ml的透明质酸酶来消化***从而收集卵丘细胞。显微操作之前，***暂存于3mg/mLBSA的CZB培养液中，用石蜡油覆盖置于37℃，5％CO2培养箱中。卵丘细胞用HEPES-CZB培养液清洗两次，4℃备用。

7、体细胞核移植和胚胎培养

SCNT使用Zhou et al(2003)报道的“一步法”。颗粒细胞克隆是用Piezo将颗粒细胞注入到去核的***中；而成纤维克隆，是用灭活的仙台病毒使去核***和成纤维细胞相融合。将操作完的胚胎移到M16培养液中短暂培养后于含有5mg/ml细胞松弛素B和10mM氯化锶的激活液中激活5～6h。之后于M16加TSA中培养4h，最后于M16培养液中培养。

8、胚胎移植

2-细胞期克隆胚胎将胚胎移植入E0.5假孕CD-1母鼠输卵管膨大部；四倍体囊胚移植是将胚胎移植到E2.5假孕CD-1母鼠的子宫内。

9、免疫组化染色和组织学分析

将足月产的胎盘固定在4％多聚甲醛中，然后石蜡包埋和连续切片，厚度在4毫米，然后进行HE染色。为了进行免疫组织化学染色，切片在PBS中冲洗5分钟，然后在室温下与封闭缓冲液(含1％BSA和0.1％Tween-20的PBS)孵育20分钟，随后与一抗共孵育1h。之后，切片在含0.1％Tween-20的PBS中洗三次，与二抗共孵育1h。用全景组织细胞分析仪(LeicaAperio VESA8)照相。胎盘生理参数，包括滋养层面积、脱细胞中断和血管，用Im-ageScope(v12.0.1.5027)软件进行分析。

10、RNA提取及RT-PCR

将胎儿的胎盘消化成单细胞，并进行流式分选，分选出绿色荧光蛋白阳性的细胞。用PureLinkTM RNA Mini Kit对GFP阳性的细胞进行RNA提取。使用HiScript III 1stStrand cDNA Synthesis Kit(Vazyme)进行反转录，在这之前要使用盒子里提供的gDNA清除剂清除。使用PrimerPremier5设计的引物对含有PWK和C57特异性SNP位点的PCR片段进行扩增。使用pClone007 Blunt Vector Kit(TsingKe)对RT-PCR产物进行连接。转化后37℃培养12h，之后挑取单克隆进行测序分析。

11、RNA-Seq文库的制备和数据分析

将胎盘切碎，并用0.25％胰蛋白酶在37℃下消化，在消化过程中，用枪头吹吸几次，使消化更加全面，10～15min后终止消化。流式分选GFP阳性胎盘细胞，收集后RNA测序分析。

对于小鼠的转录组分析，收集WT小鼠，Δ4-NT-3KO和自带小鼠的脑组织进行RNA-Seq。用TRIzol从胎儿中提取总RNA，然后每次用1μg纯化的RNA进行逆转录聚合酶反应。

RNA-seq建库和数据分析：每个样品做2轮PolyA尾的RNA纯化。用Illumina HiSeq4000测序仪进行150bp的双端测序。RNA-seq数据用HISAT2(version 2.1.0)和Cufflinks(version 2.2.1)进行分析。数据统计：部分数据的统计与分析使用GraphPad软件。采用单因素方差分析。

12、蛋白免疫印记(Western)

为了获得从胎儿发育而来的新鲜胎盘细胞，发明人将胎盘切碎，用0.25％胰蛋白酶在37℃，5％CO2消化10-15分钟。并在消化过程中多次吹吸剪碎的组织，然后用流式细胞仪分选和收集GFP阳性的胎盘细胞。将胎盘细胞或haESCs溶解在Pierce IP Lysis Buffer中，置于冰上，并且每30min添加蛋白酶抑制剂和原钒酸钠sodium orthovanadate。随后在4℃离心机中，12000rpm，离心10min，收集上清液与10mL的样品Buffer(1.25mL的0.5MpH6.8Tris-HCl,2.5mL glycerin,2mL 10％SDS,200mL 0.5％溴酚蓝,3.55mL H2O,和0.5mLβ-巯基乙醇)混匀，并在沸水中煮沸5min。样品通过SDS-PAGE进行分离，是10mL的5％的压缩胶(5.7mL ddH 2O,2.5mL 1.5M pH 6.8Tris-HCl,1.7mL 30％acrylamide[acryl:bisacryl＝29:1],100mL 10％SDS,50mL 10％ammonium persulfate,和10mL TEMED)和10mL的分离胶(4.1mL ddH 2O,2.5mL 1.5M pH 8.8Tris-HCl,3.3mL 30％acrylamide[acryl:bisacryl＝29:1],100mL 10％SDS,50mL 10％ammonium persulfate,和5mL TEMED)中100V，1h。然后在200mA、4℃的条件下，电泳1h，转移到硝酸纤维素。随后，将膜在室温条件下，在含有3％BSA(Sigma)的TBST缓冲液(10mM Tris,150mM NaCl,0.1％Tween20,pH 7.4)中封闭1小时。

然后与一抗(含1％BSA的TBST中稀释)共孵育，4℃，过夜。在TBST清洗三次(每次10分钟)，在室温下与二抗共孵育1小时，洗涤三次(每次10分钟)后使用ECL检测信号。

13、Southern blot

从小鼠组织中提取基因组DNA，用核酸内切酶(Takara)在37℃下消化过夜。用0.8％的琼脂糖凝胶分离消化的DNA片段，并转移到带正电荷的尼龙膜(罗氏)上进行杂交。

另外，以下实施例中涉及的序列如下表2所示。

表2：引物名称及其序列

实施例1在E19.5克隆胎盘中出现了异常的H3K27me3印记基因的双等位表达

为了研究H3K27me3印记基因的特异的表达情况，本发明中使用两种近交系小鼠交配的后代为研究对象。

实验方法：

母本为C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J品系的雌性小鼠，父本为PWK/PhJ品系的雄性小鼠。用杂交的F1代小鼠的颗粒细胞进行体细胞核移植，具体步骤如上述实验方法7(即体细胞核移植和胚胎培养部分)中所示。同时采用C57(GFP+)和PWK的***与***进行体外受精的胚胎作为对照。由于E9.5之后这些印记基因并没有被检测过。因此发明人分析了E10.5 SCNT和IVF的胚胎。通过使用流式细胞分选技术来分选带有绿色荧光的胎儿来源的胎盘细胞，这样就不会产生母体细胞的污染。之后对这些分选出来的细胞进行RNA-seq分析。

实验结果：

与体外受精对照相比，克隆胎盘细胞的4个H3K27me3印记基因中，Sfmbt2、Smoc1和Jade1的表达水平提升了2倍多(图1A)。但是只有Sfmbt2是在胎儿中过高表达的(图5A)。并且，在克隆胎盘中Xist也有2倍的高表达，而克隆胎儿中Xist的表达并不过高(图1B和图5B)。许多经典的印记基因，包括H19,Meg3,和Cdkn1c，在E10.5的克隆胎儿中也是异常表达的(图1A和图5A)。

进一步，发明人通过单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)分析，对等位基因的特异表达情况进行了深入的研究。分析显示，在克隆胎儿中，经典的印记基因和H3K27me3印记基因的表达模式保持不变(图5C和表3)。与此不同的是，在克隆胎盘中，4个H3K27me3印记基因的等位基因特异性表达模式丢失了，而典型的印记基因则没有丢失(图1C和表3)。

进一步，发明人分析了晚期胎盘中H3K27me3印记基因的状态，通过分离E19.5体外受精，克隆胎盘中的GFP阳性的细胞，进行逆转录PCR和Sanger测序分析。结果表明，这4个H3K27me3印记基因，在E19.5的体外受精胎盘中还是保持着父源倾向表达的模式，而在克隆的胎盘中，这种模式消失了(图1D)。此外，H3K27me3印记基因在克隆的囊胚中是印记丢失的。因此，非典型印记基因的异常双等位基因表达在整个克隆胚胎着床后发育过程中得以维持。

表3：亲本SNPs的位置和包含SNP的reads的计数

表3续表

实施例2 4个H3K27me3印记基因的单等位敲除能够显著的提升克隆效率

实验方法：

本发明公开一种提高小鼠克隆效率的方法以及可以用于提高克隆效率的细胞株和模型鼠。具体步骤为：

1、获取***。挑选适龄雌鼠，注射孕马血清素(PMSG)，注射后13-17小时内注射人绒毛膜***(HCG)。在注射HCG后13-15h后进行取卵操作。收集的***用Hepes-CZB清洗，随后培养在M16(Sigma)培养液中，并放入37℃，5％CO2培养箱中培养待用。颗粒细胞用透明质酸酶消化去除，在显微操作之前，***置于含3mg/mL BSA的CZB培养液中暂存。

2、获取Sfmbt2、Smoc1、Gab1、Jade1四基因同时敲除的可替代***的单倍体胚胎干细胞。按照表2针对Sfmbt2、Smoc1、Gab1、Jade1这四个基因各设置一对sgRNA，这些sgRNA均靶向各自基因所有转录本的通用外显子区域(图5D-G)。随后发明人将携带这些sgRNA和Cas9的质粒利用电转仪电转至H19、IG、及Rasgrf1基因敲除(图5I)的带有绿色荧光蛋白表达的单倍体胚胎干细胞。细胞数量级为10^6级别。电转后的单倍体胚胎干细胞在单倍体胚胎干细胞培养基上培养两天后，利用流式细胞分选仪，分选出带有绿色荧光蛋白的单倍体胚胎干细胞，随后利用PCR技术对已经进行转染的细胞进行鉴定，鉴定出带有这四个基因完全敲除的单倍体胚胎干细胞。鉴定引物如表2。

3、利用鉴定出来四个基因完全敲除的单倍体胚胎干细胞作为替代***进行体外受精模拟。利用流式细胞分选仪分选出G0-G1期的单倍体胚胎干细胞。随后将已经获取的***利用10Mm浓度的含Srcl2无钙的CZB培养液中预激活处理30分钟。随后将四基因完全敲除的单倍体胚胎干细胞(Δ4-haESCs^3KO)的细胞核利用显微操作仪注射到预激活的***中。注射完毕后再将重构的胚胎放入10Mm浓度的含Srcl2无钙的CZB培养液继续培养5个小时作用，5个小时后将重构胚胎放置进入M16中继续培养。预激活及培养时胚胎均放置在37℃，5％CO2培养箱中培养。待胚胎发育到E3.5天囊胚时待用。

4、获取可替代胚外组织的四倍体囊胚。获取小鼠2细胞期胚胎，将2细胞胚胎放入小鼠胚胎融合液中，利用电融合仪，在直流电场强度为2kV/cm,脉冲时程40μs时电击胚胎获得具有两套染色体组的四倍体小鼠重构胚胎，随后将该胚胎放入M16培养液中培养至E3.5天备用。培养时胚胎均放置在37℃，5％CO2培养箱中培养。

5、获取四基因敲除的二倍体的内细胞团细胞。发明人将步骤3中获取的囊胚放入5mg/ML链酶蛋白酶中放入37℃环境中3分钟，去除透明带。随后将去掉透明带的囊胚放入含有10％胎牛血清和20％20抗小鼠全血清的DMEM培养液中，放入37℃，5％CO2培养箱中孵育3小时。随后用DMEM/胎牛血清(10％)培养液清洗囊胚，并在100％小鼠血清中孵育20min。在四倍体补偿之前，轻轻吹打胚胎，温和的地移去除TE细胞，并且将分离的ICM细胞置于HER/FBS(GIBCO)培养液中。

6、获取四基因敲除的胎儿成纤维供体细胞。挑选步骤5中获取的内细胞团细胞，利用显微操作仪将其注射入步骤4中的囊胚中，每个囊胚中注射15枚内细胞团细胞左右。随后将该囊胚移植进入2.5天的假孕小鼠的子宫中，在小鼠怀孕至E13.5天时，解剖小鼠，获得胚胎期E13.5天的胎儿。随后将胎儿用酒精浸泡2h杀菌的手术剪刀，镊子，去除胎儿头部和各个器官。将剩余胚胎切碎，将切碎的组织置于2ml的含有1mM乙二胺四乙酸的0.25％胰蛋白酶中，37℃培养箱中消化10分钟。用等体积的含10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM液体稀释，终止消化反应，并轻轻反复吹吸20次以上。将细胞悬液用新鲜培养基稀释，铺在100mm的培养皿上，摇匀，在37℃，5％CO2培养箱培养两天，获得四个基因敲除的胎儿成纤维细胞。冻存细胞(第0代)。在所有实验中，胎儿成纤维细胞均使用第一代细胞。

7、利用供体细胞进行细胞核移植。去***利用显微操作仪去除***细胞核，随后将步骤6中获得的胎儿成纤维放入灭活的仙台病毒中数秒后取出，随后使用Piezo将带有仙台病毒的供体细胞注入到去核***的卵间隙中，随后将胚胎放入37℃，5％CO2培养箱中直至胚胎融合。随后将融合的胚胎移到M16培养液中短暂培养后放入含有5mg/ml细胞松弛素B和10mM氯化锶的无钙CZB培养液中激活5～6h，最后于M16培养液中培养。培养时胚胎均放置在37℃，5％CO2培养箱中培养。待该胚胎发育到2细胞时，在2-细胞期克隆胚胎将胚胎移植入E0.5假孕CD-1母鼠输卵管膨大部。等待小鼠到期解剖。等到小鼠胚胎期E19.5天时，解剖出生的4个基因敲除的到期小鼠。

该套流程方法如图2A所示。

实验讨论：

为了解决SCNT胚胎中H3K27me3印记丢失的情况，需要对体细胞中4个H3K27me3印记基因的单等位基因敲除才能恢复。目前，等位基因特异性的基因敲除可以通过不同等位基因上的SNPs靶向DNA位点或采用次优的、依赖距离的基因编辑策略来实现，但这两种方法在体细胞或胚胎干细胞中同时敲除四个单等位基因难以实践应用。同时，由于Sfmbt2或Gab1位点杂合突变的小鼠是父系不育的，因此通过不同杂合突变的小鼠交配也不可能产生四种基因同时敲除的单等位基因缺失的小鼠。

因此发明人使用了发明人实验室自己研发的敲除了H19，IG和Rasgrf1三个DMR的单倍体胚胎干细胞(haESCs3KO)作为敲除平台，这种单倍体胚胎干细胞可以在传代和操作的过程中维持其父源印记的模式，并且注射到***中，其效率也跟球形***差不多。

值得一提的是，经haESCs***注射产生的小鼠，也能通过与野生型雄鼠自然交配产生有活力的后代。

实验结果：

通过CRISPR-Cas9基因敲除技术，发明人制作了Sfmbt2，Jade1，Smoc1和Gab1四个基因移码突变的干细胞系(Δ4-haESCs3KO)(图5D-H)。

在得到了这四个H3K27me3印记基因敲除的单倍体干细胞系后，发明人通过将Δ4-haESCs3KO注射到***中，得到了重构胚胎(Δ4-embryos3KO)，移植到假孕母鼠体内，观察其发育能力(图1E)。通过解剖，发明人发现，Δ4-embryos3KO仅仅能够发育到E9.5，并且它的胎盘发育是有异常的，这说明H3K27me3印记基因的单等位表达在胚胎外组织发育过程中起到了非常关键的作用(图1F和表5)。

为了得到H3K27me3印记基因的单等位基因突变的体细胞核移植供体。发明人通过使用无钙镁的CZB培养液来分离Δ4-embryos3KO囊胚的内细胞团细胞，之后将这些内细胞团细胞注射到野生型ICR品系小鼠胚胎来源的四倍体囊胚中，操作完成之后再将胚胎移植到***母体子宫中(图2A)。发现，四倍体补偿的重构胚胎可以发育到期(表5)。Δ4-embryos3KO胚胎发育能力被四倍体囊胚挽救的现象也进一步证明了胚外组织缺陷限制了其发育。最为重要的是，在E13.5时，发明人使用被挽救的胎儿成功的制作了成纤维细胞(Δ4-MEFs3KO)(图2A)。

发明人用Δ4-MEFs3KO为供体细胞进行体细胞核移植实验。在此之前，发明人实验室报道过一种特殊的着床前胚胎培养法：D-培养法。二细胞晚期之前使用M16培养液培养，二细胞晚期之后使用KSOM培养液培养，使用该方法可以显著提高克隆的囊胚发育效率。然而用Δ4-MEFs3KO细胞为供体细胞的克隆胚胎(Δ4-NT-embryos3KO)与使用野生型MEFs的克隆胚胎的发育效率相比，无论是否使用了D-培养法，囊胚发育效率都没有得到提升。这些结果表明，H3K27me3印记基因敲除并不影响克隆胚胎着床前的发育。

通过对IVF，WT-SCNT和Δ4-NT-embryos3KO的囊胚进行免疫荧光染色，发明人发现，在IVF胚胎ICM中，Gab1，Jade1和Smoc1的信号强度与WT SCNT中的相似，但是其在TE中的强度却比WT克隆TE的显著减弱(图2B)。另一方面，在Δ4-NT-embryos3KO囊胚中，ICM和TE中的信号都比WT SCNT的弱，说明在体细胞核移植囊胚中，单等位基因敲除后，Gab1，Jade1和Smoc1的蛋白水平有效的下降了(图2B)。相对荧光强度分析也显示，IVF和Δ4-NT-embryos^3KO囊胚的TE中，H3K27me3印记基因的表达水平比WT SCNT胚胎更低(图2C)，说明克隆胚胎TE中表达过高的H3K27me3印记基因水平被恢复了。

随后发明人将Δ4-NT-embryos3KO在2细胞胚胎期进行输卵管移植。与对照组相比，Δ4-NT-embryos3KO的着床率有了很大的提升，并且接近于体外受精组的着床率(图3A)。不仅如此，Δ4-NT-embryos3KO的到期发育效率也得到了大幅提升，提升到了8.5～14.2％，而对照组的野生型MEFs其克隆胚胎的到发育期效率为0％，野生型颗粒细胞克隆胚胎的到期发育效率也仅仅为1.1±0.2％。(图3B和表4)。

Δ4-NT-embryos3KO新生小鼠的体重也与对照组的体外受精新生小鼠体重相近，但是却比使用野生型颗粒细胞的克隆小鼠的体重低(图3C)。另外Δ4-NT-mice3KO克隆鼠胎盘的重量与IVF组胎盘重相似，但是比WT组克隆胎盘重更低(图3D)。胎盘的直径也是如此，Δ4-NT-mice3KO的胎盘直径与体外受精的小鼠胎盘相似，比WT克隆组的胎盘更小(图3E)。与此同时，蛋白免疫印记结果显示，在Δ4-NT-mice3KO胎盘中H3K27me3印记基因的蛋白表达量也下降了(图6A)，证明h3k27me3印记基因在克隆胎盘中的过表达可以通过敲除有效的恢复。并且，RNA-seq分析显示，野生型正常小鼠和Δ4-NT-mice3KO小鼠的脑组织有着非常相似的转录组，并且印记基因的表达都比较相似(图6B)。伊红-苏木素染色和胎儿内皮及其相关基底膜的标记物laminiA染色发现，迷路层胎儿血管在WT-MEF克隆胎盘中是有缺陷的，而在Δ4-NT-mice3KO胎盘中被很大程度上被挽救了(图3F-G)。另外，母胎界面上的无细胞的不连续区域，胎盘血管密度过低的表型也被挽救了(图3H-J)(Georgiades et al.,2001)。

为了进一步研究在成体细胞中H3K27me3印记基因敲除后对体细胞核移植的影响，发明人选用了6周龄的Δ4-NT-mice3KO小鼠的尾尖制作了尾尖成纤维细胞(Δ4-TTFs3KO)。用Δ4-TTFs3KO为供体细胞进行核移植，有4.8±1.0％的胚胎移植到***母鼠体内后能发育到期，而WT TTFs克隆的出生效率却只有0％(表4和图6C)。成纤维细胞虽然可以被用来克隆，但是克隆效率很低，因此发明人的，Δ4-MEFs3KO和Δ4-TTFs3KO的克隆效率还是非常可观的。

发明人跟踪了所有Δ4-MEFs/TTFs克隆小鼠存活能力，23个Δ4克隆小鼠，有5只在出生后21天死亡，18只存活，整体存活能力与野生型克隆小鼠没有差异(5只中的1只死亡)(图6D)。综上，这些结果表明，修正四个h3k27me3印记基因的异常双等位基因表达，可以显著提高SCNT的到期率，甚至对成体来源的成纤维细胞也是如此。

经典的文献报道称，修正Xist的异常表达可以有效的提升克隆的到期发育效率。因此，发明人在Δ4-MEFs3KO细胞中，一并转染了Cas9和Xist基因敲除的sgRNA质粒。转染后的Δ4-MEFs3KO被用作供体细胞进行核移植，之后将重构胚胎移植到***母鼠体内。发明人在E13.5时，通过解剖母鼠得到胎儿，再通过PCR和Sanger测序对胎儿Xist是否已经敲除进行检测。发明人使用Xist单等位基因敲除的胎儿用于制作MEFs(ΔXist/Δ4-MEFs3KO)(图7A)。但是，用ΔXist/Δ4-MEFs3KO作为供体细胞时克隆效率只有5.2±0.8％，相较于使用Δ4-MEFs3KO，核移植的效率却并没有进一步提升，这说明，敲除Xist与这4个H3K27me3印记基因敲除并没有协同作用(表4和图7B–D)。

恢复Xist的水平并没有提升SCNT胚胎着床前的发育，Ogura小组的工作证明，注入Xist-siRNA的克隆胚胎的囊胚率与注入对照siRNA的胚胎的囊胚率没有统计学差异(Matoba et al.,2011)。同时，使用睾丸支持粒细胞或卵丘细胞克隆时，单等位基因Xist缺失的体细胞的植入率并不比WT细胞更好。然而，颗粒细胞和睾丸支持细胞的克隆效率都是非常高的，并且相对于成纤维细胞，两者的着床率也很高，限制了Xist敲除对着床率提升的空间。为了更好的了解Δ4和ΔXist的之间潜在的协同作用，发明人使用母源Xist敲除的小鼠来制作XistΔ/Y-TTFs作为供体细胞(图7E)。与之前的结果相似，无论是否使用D-培养法，XistΔ/Y-TTFs的克隆胚胎囊胚率相比WT-MEF克隆也没有提升(表6)。与4个H3K27me3印记基因敲除类似，Xist敲除对于克隆胚胎的着床前发育没有明显影响。

随后，发明人将2-细胞期的XistΔ/Y-TTFs的克隆胚胎移植到假孕母鼠体内。通过解剖发现，移植的134个克隆胚胎有65个着床点，相比于对照组移植240枚胚胎只有5个着床点有显著提升(表4)，这个结果证明，克隆胚胎的着床率可以通过在体细胞中单等位敲除Xist的改善。

与此同时，发明人详细的统计了克隆胚胎发育的5个不同阶段的存活率(2-细胞期/E1.0；着床/E5.0；E10.5；≥E10.5；E19.5)，发现敲除4个H3K27me3印记基因和敲除Xist对于克隆胚胎的贡献非常相似，都能提升克隆胚胎的着床率和植入后发育率(图7F-G)。但是与ΔXist/Δ4-MEFs3KO不同的是，发明人并没有在134个Xist敲除的克隆胚胎中得到到期小鼠(表4)。这些结果为Δ4和ΔXist在核移植发育过程中没有叠加作用提供了一种可能的解释，因为无论是X染色体还是常染色体，H3K27me3依赖的印记基因在克隆胚胎发育过程中功能上有某种重叠，因此对二者进行修正并没有一个很好的发育效率叠加的功能。

另一方面，发明人的结果也表明，在使用成纤维细胞时，修正H3K27me3印记基因促进到期发育的能力比ΔXist强很多(表4)。

经典的文献中曾报道，用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理的克隆胚胎能够显著提升克隆胚胎发育效率。但是，当发明人用TSA处理使用Δ4-MEFs3KO克隆的胚胎之后，克隆胚胎的发育效率也并没有进一步提升，这说明TSA处理和这4个H3K27me3印记基因敲除，这两种处理之间也并没有协同作用(表4)。

为了鉴定Δ4-NT-mice3KO小鼠的生育能力，发明人将这些克隆小鼠与野生型雄性进行交配。由于所有的Δ4-NT-mice3KO小鼠都是雌性的，敲除4个父源表达的H3K27me3印记基因并不影响其在后代中的表达和功能。

Δ4-NT-mice3KO小鼠能够出生存活的胎儿(图4A)。按照孟德尔定律，计算每窝小鼠的产仔数，将每窝中存活的幼崽(没有携带H19和IG-DMR敲除的幼崽)数乘以4，与野生型雌性小鼠产仔数相比，Δ4-NT-mice3KO产仔数(n＝5)是6.80±2.71与野生型雌性的产仔数6.14±1.80相当，提示其有一个正常的生育能力(图4B)。此外,RNA-seq分析表明,Δ4-NT-mice3KO后代有一个正常的转录组(图4C)。

实施例3三基因/单基因H3K27me3印记基因单等位敲除的受精来源的体细胞能够改善胎盘的发育和克隆胎儿的发育

实验方法：

具体步骤与实施例2的实验方法基本相同，区别在于：为了获取该步骤所需的供体细胞，我们将实施例2中所获得的的Δ4-NT-mice3KO小鼠与野生型C57BL6的雄鼠进行交配获得单个基因或多个基因组合的性状分离的小鼠，利用该小鼠的成纤维细胞进行核移植。

实验讨论：

为了进一步研究单个非经典印记基因对克隆的影响，发明人使用单个基因单等位敲除的TTF进行克隆(referred to as Sfmbt2Δ/+-TTFs,Jade1Δ/+-TTFs,Gab1Δ/+-TTFs,Smoc1Δ/+-TTFs)(图8A)。后代中不携带H19,IG和Rasgrf1敲除的被用于克隆(图8B)。

实验结果：

发明人使用这些尾尖成纤维细胞进行核移植。结果显示，与使用野生型TTFs核移植相比，使用Sfmbt2Δ/+-TTFs和Jade1Δ/+-TTFs的克隆胚胎，其着床率有非常显著的提高(表4和图4D)。而使用Gab1Δ/+-TTFs和Smoc1Δ/+-TTFs的克隆胚胎着床率仅有微弱的提升(图4D)，这种差异很可能是由于野生型小鼠和Gab1Δ/+/Smoc1小鼠基因背景不同所致，而不是印记基因敲除无效所致。与使用野生型TTFs克隆的0％到期发育效率相比，用Sfmbt2Δ/+-TTFs克隆能够以2.4±2.3％的效率得到到期克隆鼠，发育效率显著提升了(图4E和表4)。由于Sfmbt2Δ/+-TTFs和Jade1Δ/+-TTFs对着床后发育的显著作用(图4D)，发明人检测了Sfmbt2和Jade1这2个基因单等位敲除的TTFs(Δ2-TTFs)的核移植效率(图8B)。移植了73个胚胎，没有胎儿出生，着床率为43.8％，与Sfmbt2Δ/+-TTFs(44.6％)和Jade1Δ/+-TTFs(46.2％)相似(表4)。随后发明人检测了3个基因单等位敲除的TTF(Sfmbt2Δ/+,Jade1Δ/+,和Gab1Δ/+[Δ3-TTFs])，Δ3-TTFs的着床率为53.4％，比野生型克隆胚胎显著提升(图4D和表4)。另外，Δ3-TTFs克隆胚胎有4.6±0.6％的到其效率，与Δ4-TTFs3KO(4.8±1.0％)(表4和图8C)相仿。与WT克隆鼠体重(1.94±0.11g)相比，Sfmbt2Δ/+-NT-mice(1.26±0.06g)和Δ3-NT-mice(1.27±0.08g)的体重显著降低了(图8D)。Δ3-NTmice的胎盘重(0.15±0.02g)也比WT克隆胎盘显著降低(图8E)。对胎盘的分析也显示，在Sfmbt2Δ/+-NT-mice和Δ3-NT-mice胎盘中，迷路层胎儿血管比例有显著的改善(图4F-G)，但是，胎盘血管密度过低和无细胞不连续区域比例过高的缺陷只在Δ3-NT-mice的胎盘中有了改善，而在Sfmbt2Δ/+-NT-mice的胎盘中这些并没有改善(图8F–H)。由于基因组印记在克隆动物的生殖细胞发育过程中会被完全重建，子代TTFs克隆的结果也是对H3K27me3印记基因敲除提升克隆效率天然的印证。

表4：来自具有各种供体细胞的去核***的SCNT胚胎发育

A versus a；B versus b；C versus c；D versus d；F versus f；G versus g:p<0.01；

E versus e:p<0.05；

H versus h；I versus i；J versus j；K versus k；L versus l:No significantdifference；

Δ2represents monoallelic Sfmbt2,Jade1 double deletions；

Δ3represents monoallelic Sfmbt2,Jade1,and Gab1 triple deletions；

B6/PWK represents C57BL/6x PWK/PhJ mice；

The symbols"-1"and"-2"represent different E13.5 embryos to deriveMEFs.

表5：不同策略下的Δ4-embryo^3KO发育

表6：不同培养方法核移植胚胎的体外发育

A versus a,B versus b,D versus d,E versus e:no significantdifference.

C versus c:p<0.05.

思考与讨论

在体细胞克隆小鼠(Tamashiro et al.，2002)、绵羊(Fletcher et al.，2007)和牛(Smith et al.，2012)中都观察到了大胎儿和大胎盘。有报道称，胎盘的过度生长先于胎儿的过度生长，所以很可能是大胎盘导致了大胎儿。在本发明中，发明人证明了双等位基因表达的h3k27me3印记基因显著阻碍了SCNT胎盘的发育。由于h3k27me3印记在上胚层来源的体细胞系中天然缺失，如果使用体细胞作为供体，h3k27me3印记障碍可能影响所有克隆的胎盘(图4H)。

体细胞供体细胞中h3k27me3印记基因单等位基因缺失后，胎盘重量、迷路层中胎源性血管比例、血管密度、胎盘无细胞不连续区域得到很好的改善。并且，克隆小鼠的体重有了明显恢复。由于印记丢失特异性发生在胎盘中，这一改善不仅证明了胎盘h3k27me3印记异常是造成大胎儿的原因，也支持了克隆动物中胎盘基因异常可能导致LOS表型的假说。

SCNT囊胚的h3k27me3印记异常最早由Matoba等人发现(Matoba等，2018)。然而，这一发现的发展意义直到本申请才被确定。与经典印记基因不同，其在克隆中的丢失比较随机，而非经典印记基因印记丢失则比较固定(图1C和图5C)。这一区别使得H3K27me3成为影响体细胞克隆胚胎的一种新的异常印记类型，这就可以解释为什么H3K27me3印记基因缺失后到期率会增加。

由于没有H19、IG或Rasgrf1缺失的后代TTFs被用于克隆，所以观察到的效果仅仅是由于H3K27me3印记缺失所致。发明人发现单基因单等位敲除(Sfmbt2Δ/+)能非常有效的改善胎盘缺陷并提高克隆出生率(尽管比4KO程度低)。结合基因编辑靶向SNP的表观擦除技术，h3k27me3印记敲除的方法可能也会有更广泛的应用。

据报道XIst呈现H3K27me3印记模式，在胚外组织中印记沉默，并在上胚层中印记丢失。与四个被敲除的h3k27me3印记基因一样，发明人发现Xist在SCNT胎盘中有2倍过表达(图1B)。值得注意的是，睾丸支持细胞中Xist单等位基因的缺失显著提高了克隆率，从1.6％提高到15.4％。这些结果表明，在Xist印记丢失是另一个依赖于h3k27me3的SCNT表观遗传障碍。最近，在人类胚胎中发现了一些疑似的常染色体非经典印记基因，这表明h3k27me3依赖的印记可能在进化上相距较远的哺乳动物中也是保守的。然而，最近有报道称，人类4-8细胞阶段的胚胎中，H3K27me3修饰会被广泛擦除，Xist也未能幸免，这一有争议的结果提示在人类中可能没有H3K27me3印记。此外，母源特异性Xist印记在很多物种中并不保守，这可能会限制Xist敲除在提高动物克隆效率中的应用。

胎儿或成体成纤维细胞被广泛的应用于重要的大型动物克隆，包括绵羊(Schnieke et al.，1997)、牛(Cibelli et al.，1998)、猪(Onishi et al.，2000)和猴子(Liu et al.，2018)等。然而，与其他供体细胞类型相比，小鼠成纤维细胞克隆效率较低。发明人的研究结果表明，h3k27me3依赖性印记基因缺失后，胎儿和成体成纤维细胞克隆效率均显著提高。更重要的是,Δ4或Sfmbt2敲除对到期率的提升比ΔXist成纤维细胞显著更高。发明人不仅证明了依赖h3k27me3的印记缺失是scnt介导的克隆中固有的植入后表观遗传障碍，导致大胎盘和后代缺陷，还证实了修正h3k27me3印记可能是提高动物克隆效率的有效途径。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院动物研究所

<120> 一种体细胞核移植方法及其应用

<130> IDC200253

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<223> Jade1 R

<400> 14

ccctaagcaa ccgaggctgg 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Sfmbt2 F

<400> 15

agttggagct tctggtgagc ctt 23

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Sfmbt2 R

<400> 16

gggtcagtgg ggaggcggat t 21

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Smoc1 F

<400> 17

cccagacggc taggtctgac tcg 23

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Smoc1 R

<400> 18

gggtgaagtg tggggctttg tg 22

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Xist F

<400> 19

tccaagacgc ggagcgata 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Xist R

<400> 20

cggccactac tatgagcagg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Gab1 F

<400> 21

cgggtgaaga gctggatgag 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Gab1 R

<400> 22

gtctaaaggt gccggcttga 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Jade1 F

<400> 23

acttacatgg tgacccgcag 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Jade1 R

<400> 24

ctttctgaga cctccagccc 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Sfmbt2 F

<400> 25

atagagctgc aggactccca 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Sfmbt2 R

<400> 26

cttggtcact gatgcagggt 20

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Smoc1 F

<400> 27

ggaagaaaag tctcctttcg tttct 25

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Smoc1 R

<400> 28

gcgccctgtg tctactagg 19

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ΔXist F

<400> 29

tccaagacgc ggagcgata 19

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ΔXist R

<400> 30

cggccactac tatgagcagg 20

Claims

1.一种经修饰的单倍体胚胎干细胞，其中，所述单倍体胚胎干细胞被敲除了选自下列的基因：Slc38a2、Slc38a4、Sfmbt2、Etv6、Platr4、Gramd1b、Slc38a1、Gab1、Mbnl2、Smoc1、Bmp7、Rbms1、Fam198b、Sh3gl3、Hunk、Jade1、E2f3、Tle3、Runx1、Epas1、Bbx、Enc1、Inhbb、Sox21、Otx2、Rbp2，以及其任何组合；

任选地，所述单倍体胚胎干细胞中另外的H19和IG被敲除，并且任选地，另外的Rasgrf1被敲除；

优选地，所述单倍体胚胎干细胞被敲除了选自下列的基因：Sfmbt2、Jade1、Gab1、Smoc1，以及其任何组合；

更优选地，所述单倍体胚胎干细胞中，Sfmbt2被敲除，并且任选地，选自下列的基因被敲除：Jade1、Gab1、Smoc1，以及其任何组合；

最优选地，所述单倍体胚胎干细胞中，选自下列的基因或基因组合被敲除：

仅敲除Sfmbt2，

或者，Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1被同时敲除。

2.制备权利要求1所述的经修饰的单倍体胚胎干细胞的方法，其包括：

通过基因敲除技术，获得所述经修饰的单倍体胚胎干细胞，其中，所述基因敲除技术将单倍体胚胎干细胞中的选自下列的基因敲除：Slc38a2、Slc38a4、Sfmbt2、Etv6、Platr4、Gramd1b、Slc38a1、Gab1、Mbnl2、Smoc1、Bmp7、Rbms1、Fam198b、Sh3gl3、Hunk、Jade1、E2f3、Tle3、Runx1、Epas1、Bbx、Enc1、Inhbb、Sox21、Otx2、Rbp2，以及其任何组合；

任选地，所述基因敲除技术将单倍体胚胎干细胞中另外的H19和IG敲除，并且任选地，将另外的Rasgrf1敲除；

优选地，所述基因敲除技术将单倍体胚胎干细胞中的选自下列的基因敲除：Sfmbt2、Jade1、Gab1、Smoc1，以及其任何组合；

更优选地，所述基因敲除技术将单倍体胚胎干细胞中的Sfmbt2敲除，并且任选地，将选自下列的基因敲除：Jade1、Gab1、Smoc1，以及其任何组合；

最优选地，所述基因敲除技术将单倍体胚胎干细胞中的选自下列的基因或基因组合敲除：

仅敲除Sfmbt2，

或者，同时敲除Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1；

或者优选地，所述基因敲除技术为使用CRISPR的基因敲除技术。

3.一种体细胞，其中，所述体细胞被单等位敲除了选自下列的基因：Slc38a2、Slc38a4、Sfmbt2、Etv6、Platr4、Gramd1b、Slc38a1、Gab1、Mbnl2、Smoc1、Bmp7、Rbms1、Fam198b、Sh3gl3、Hunk、Jade1、E2f3、Tle3、Runx1、Epas1、Bbx、Enc1、Inhbb、Sox21、Otx2、Rbp2，以及其任何组合；

任选地，所述体细胞中的另外的H19和IG被单等位敲除，并且任选地，另外的Rasgrf1被单等位敲除；

优选地，所述体细胞被单等位敲除了选自下列的基因：Sfmbt2、Jade1、Gab1、Smoc1，以及其任何组合；

更优选地，所述体细胞中，Sfmbt2被单等位敲除，并且任选地，选自下列的基因被单等位敲除：Jade1、Gab1、Smoc1，以及其任何组合；

最优选地，所述体细胞中，选自下列的基因或基因组合被单等位敲除：

仅敲除Sfmbt2，

或者，Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1被同时敲除；

或者优选地，所述体细胞来源于哺乳动物(优选非人哺乳动物)；

更优选地，所述哺乳动物为小鼠、羊、牛、猪或猴子；

或者优选地，所述体细胞为成纤维细胞；

更优选地，所述成纤维细胞为胎儿或成体成纤维细胞(如尾尖成纤维细胞)。

4.制备权利要求3所述的体细胞的方法，其包括：

(1)提供权利要求1所述的经修饰的单倍体胚胎干细胞，

(3)将所述第一重构胚胎培养发育成胎儿；

(4)从所述胎儿分离获得所述体细胞；

优选地，在步骤(3)中，通过使用四倍体囊胚，将所述第一重构胚胎培养发育成胎儿；

更优选地，所述方法包括：

1)提供权利要求1所述的经修饰的单倍体胚胎干细胞，

6)从所述胎儿分离获得所述体细胞；

优选地，所述***母体子宫为哺乳动物(优选非人哺乳动物)***母体子宫；

更优选地，所述***母体子宫为小鼠、羊、牛、猪或猴子母体子宫；

或者优选地，所述四倍体囊胚是通过电融合或化学融合方法获得的。

5.权利要求3所述的体细胞或权利要求4所述的方法获得的体细胞用于核移植的用途。

6.一种体细胞核移植的方法，其利用供体体细胞进行核移植，其中，所述供体体细胞如权利要求3所限定；

优选地，所述方法包括：

B-1)激活所述第三重构胚胎；

或者，所述方法包括：

B-2)激活所述第四重构胚胎。

7.权利要求1所述的经修饰的单倍体胚胎干细胞或者权利要求3所述的体细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与体细胞核移植有关的疾病；

优选地，所述与体细胞核移植有关的疾病为大胎综合征；

优选地，所述与体细胞核移植有关的疾病为大胎盘和/或大胎儿；

优选地，所述与体细胞核移植有关的疾病为妊娠期糖尿病哺乳动物新生胎儿出生体重超重；

优选地，所述大胎综合征为哺乳动物(优选非人哺乳动物)大胎综合征；

优选地，所述哺乳动物为小鼠、羊、牛、猪或猴子。

8.一种治疗与体细胞核移植有关的疾病的方法，其包括：利用供体体细胞进行核移植，其中，所述供体体细胞如权利要求3所限定；

优选地，所述与体细胞核移植有关的疾病为大胎综合征；

优选地，所述哺乳动物为小鼠、羊、牛、猪或猴子；

优选地，所述方法包括：

B-1)激活所述第三重构胚胎；

或者，所述方法包括：

B-2)激活所述第四重构胚胎。

9.一种动物，其中，所述动物被单等位敲除了选自下列的基因：Slc38a2、Slc38a4、Sfmbt2、Etv6、Platr4、Gramd1b、Slc38a1、Gab1、Mbnl2、Smoc1、Bmp7、Rbms1、Fam198b、Sh3gl3、Hunk、Jade1、E2f3、Tle3、Runx1、Epas1、Bbx、Enc1、Inhbb、Sox21、Otx2、Rbp2，以及其任何组合；

任选地，所述动物中另外的H19和IG被单等位敲除，并且任选地，另外的Rasgrf1被单等位敲除；

优选地，所述动物被单等位敲除了选自下列的基因：Sfmbt2、Jade1、Gab1、Smoc1，以及其任何组合；

更优选地，所述动物中，Sfmbt2被单等位敲除，并且任选地，选自下列的基因被单等位敲除：Jade1、Gab1、Smoc1，以及其任何组合；

最优选地，所述动物中，选自下列的基因或基因组合被单等位敲除：

仅敲除Sfmbt2，

或者，Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1被同时敲除；

或者优选地，所述动物为哺乳动物(优选非人哺乳动物)；

更优选地，所述哺乳动物为小鼠、羊、牛、猪或猴子。

10.制备权利要求9所述的动物的方法，其包括：

将权利要求7所述的方法获得的激活后的所述第三重构胚胎或所述第四重构胚胎进行培养；