CN113800647A - 粘质沙雷氏菌株在还原蓝rsn蒽醌染料脱色降解中的应用 - Google Patents

粘质沙雷氏菌株在还原蓝rsn蒽醌染料脱色降解中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株粘质沙雷氏菌，菌种名称：Serratia marcescens WY31；保藏编号：CCTCC AB 2019319。其16S rRNA序列如SEQ ID N0.1所示，本发明所涉及的新型菌株，提供了粘质沙雷氏菌在蒽醌染料还原蓝RSN脱色降解中的应用，并提供了脱色降解最佳条件参数，提供了蒽醌染料还原蓝RSN微生物脱色降解、绿色环保的应用方法，其在确定出的最佳条件下对蒽醌染料还原蓝RSN有较高降解率。

Description

粘质沙雷氏菌株在还原蓝RSN蒽醌染料脱色降解中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及一株粘质沙雷氏菌及其在蒽醌染料还原蓝RSN脱色降解中的应用。
背景技术
我国每年大约有8～15吨染料废水排放到水环境中[1]，染料通常有毒，若口服摄入或吸入，以及接触皮肤或眼睛，会使皮肤致敏以及致癌性等。同时，染料废水进入生态***，会干扰光传播，抑制水生生物光合作用，破坏生态***的微生物群落结构。大多数染料都具有生物毒性和致畸致癌性,而且在自然环境中极难降解, 一些蒽醌型染料的分散染料中(一些有蒽醌结构的分散染料中)，常含有 1个或多个伯胺，能***DNA螺旋线的相邻碱基对之间破坏原有结构，因此具有癌诱变性。对人类和其他生物的健康构成极大的威胁。因此，染料废水的综合治理是目前亟待解决的问题。
蒽醌染料是偶氮染料之后使用次数最多的纺织染料，由于化学结构复杂，难以处理，给环境带来巨大的威胁。蒽醌类染料是一类分子结构中含蒽醌基的染料通称，其品种主要有还原蓝RSN、中性艳蓝GL、酸性蒽醌蓝、活性艳蓝X-BR、分散蓝2BLN等，其是继偶氮染料的第二大类纺织染料。
目前染料废水处理方法如物理吸附法，部分吸附剂昂贵，膜过滤方法，成本高且膜易堵塞污染，絮凝法会产生大量浓缩污泥；化学电化学处理法产生额外有害物质，高电费，去除效果差，氧化法昂贵，需要催化剂，不稳定。染料去除化学方法，需要特定的设备并且需要高电能来为处理设备或反应器提供动力。还需要消耗大量的化学试剂且会产生二次污染。染料的微生物降解由于其成本低，绿色环保，可持续发展，实用性强，前景广阔而被认为是化学-物理方法的可行替代品，一直受到国内外的关注。但迄今为止，人们对蒽醌染料的生物降解过程还知之甚少。研究染料的微生物降解与修复具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一株粘质沙雷氏菌及其在蒽醌染料还原蓝RSN脱色降解中的应用，为微生物在印染废水处理中的应用提供优良资源。
具体内容如下：
一株粘质沙雷氏菌，该菌株命名为粘质沙雷氏菌Serratia marcescens WY31，保藏编号为CCTCC AB 2019319，保藏日期为2019年3月19日，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
进一步地，该粘质沙雷氏菌呈革兰氏阴性，含有如SEQ ID N0.1所示的基因序列。
还公开了粘质沙雷氏菌Serratia marcescens WY31在蒽醌染料还原蓝RSN脱色降解中的应用。
进一步地，该应用至少包括如下步骤：(1)将粘质沙雷氏菌Serratia marcescensWY31的种子液接种至含有VB RSN蒽醌染料的培养基中；(2)外加营养源并混匀； (3)在一定的初始接种量OD600、NH4Cl浓度、葡萄糖浓度、pH值、温度以及Mn2+浓度条件下培养进行脱色降解。
进一步地，该应用外加营养源为淀粉或葡萄糖。
进一步地，该应用中葡萄糖浓度选择在0-1.00g/L之间，温度选择在20-40℃之间。
进一步地，该应用中葡萄糖含量0.324g/L，温度为30.675℃。
进一步地，该应用中初始接种量OD600为0.06、NH4Cl浓度为0.5g/L、葡萄糖浓度为0.3g/L、pH值为7、温度为30℃、Mn2+浓度为100mM。
本发明的有益效果：
1、染料的微生物降解成本低，绿色环保，可持续发展，实用性强。
2、本发明所得高效脱色粘质沙雷氏菌株处理染料废水，在最佳条件下脱色率可高达90.17％，对蒽醌染料还原蓝RSN有较高降解率，脱色效果好，降解速度快，适用于苛刻的实际印染废水处理***。
附图说明
图1为蒽醌染料还原蓝RSN脱色菌群的群落结构图；
图2为粘氏沙雷菌WY31的LB培养平板基中的菌落形态示意图；
图3为粘氏沙雷菌WY31革兰氏染色后光学显微镜下细胞形态示意图；
图4为粘氏沙雷菌WY31的16S rRNA电泳图；
图5为粘氏沙雷菌WY31的***发育树；
图6为不同外加碳源条件下WY31对还原蓝RSN脱色的影响；
图7为本发明所述初始OD600对脱色率的影响
图8为本发明所述葡萄糖浓度对脱色率的影响
图9为本发明所述氯化铵浓度对脱色率的影响
图10为本发明所述pH对脱色率的影响
图11为本发明所述温度对脱色率的影响
图12为本发明所述Mn2+浓度对脱色率的影响
图13为本发明所述葡萄糖和温度交互作用对脱色率的影响的三维曲面图和等高线图
具体实施方式
本发明中涉及的培养基及溶液如下：
1、LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH＝7.0，固体培养基中添加1.5％琼脂。
2、无机盐培养基(ISM)：0.20g/L KH2PO4,0.80g/L Na2HPO4，0.02g/L MnSO4·7H2O，0.01g/LFeSO4·7H2O，0.20g/LMgSO4·7H2O，0.02g/LCaCl2，0.50g/L NH4Cl，2mL微量盐溶液，pH 7.0。
3、微量盐溶液：4mg/LMoO3，28mg/LZnSO4·7H2O，0.02mg/L CuSO4·5H2O， 4mg/LH3BO3，4mg/L MnSO4·5H2O，4mg/L CoCl2·6H2O，pH＝7.0，超纯水定容至 1000mL。用于培养菌株时，按需求加入染料和营养源。
4、碳源母液：2g碳源(葡萄糖、淀粉、蛋白胨、酵母膏、尿素、乳糖和蔗糖)，超纯水定容至100mL，终浓度为20g/L，待全部溶解后，高温高压灭菌。
5、ISMG培养基为ISM+0.1g/L葡萄糖。
实施例一：粘氏沙雷菌的获得
1、菌株的获得
(1)污泥样品采集来自咸阳际华新三零印染有限公司废水处理站集水井以及氧化池。取污泥5.0g(或者10g)放入适量无菌水中，用玻璃珠充分振荡打散污泥，得到接种微生物母液。取母液1mL接种至LB培养基中，于30℃，180rpm 摇床中富集培养3d，以1％接种量(v/v)转接至新鲜的ISM+还原蓝RSN(20mg/L) 以及ISM+葡萄糖(0.1g/L)+还原蓝RSN(20mg/L)两种培养基中，采用梯度浓度压力驯化法，连续传代培养，依次提高染料浓度(20、40、60、80、100、 120、150、180、200、220和250mg/L)。用紫外分光光度法检测脱色率，从而获得脱色降解菌群。
(2)利用高通量测序技术测定菌群中微生物群落组成，分析脱色降解菌中群落结构，发现沙雷氏属Serratia是该群落结构中的优势菌属之一。蒽醌染料还原蓝 RSN脱色菌群的群落结构，如图1所示。
(3)将还原蓝RSN降解菌群在LB固体培养基上进行梯度稀释涂布，至于 30℃恒温培养箱，倒置培养，待平板上长出菌落(菌落分明不易太大)时，挑取纯培养菌株于LB液体培养基中，30℃，180rpm摇床培养，待菌液混浊，接种量2％(v/v)转接于5mL ISM+50mg/L还原蓝RSN中，72h后观察颜色变化，从而筛选出染料脱色菌纯培养菌株。部分LB菌液以体积1:1菌液和30％甘油(高温高压灭菌)比例于-20℃保存菌种。
实施例二：粘氏沙雷菌的鉴定
(1)形态观察
观察菌株的平板培养菌落形态，如图2所示。该菌在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上25～35℃培养1d均可大量生长，菌落在LB平板上呈淡黄色菌落，边缘整齐，不透明，菌落凸起，表面光滑。
在光学显微镜下观察菌体形态，如图3所示，菌体为杆状。使用革兰氏染色液对菌株进行革兰氏染色，该菌株为革兰氏阴性菌。
(2)分子鉴定
将热碱法预处理的WY31菌液作模板，用通用引物27F/1492R进行PCR扩增，得到1,500bp左右的片段，如图4。将目的条带正确样品的PCR产物委托公司进行测序，获取菌株WY31的16S rRNA基因序列数据。
将菌株WY31的16S rRNA基因序列在NCBI中进行Nucleotide Blast比对分析，结果显示菌株WY31与Serratia属亲缘关系最近，其中与粘质沙雷氏菌Serratia marcescens种属等菌株的16S rRNA序列相似性达100％。根据比对结果用MEGA 5.0软件计算进化距离，选用Neighbor-Joining法构建***发育树，如图5所示。
将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏名称为： S.marcescensWY31。保藏编号：CCTCC AB 2019319。下文简称菌株WY31。所述菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID N0.1所示。
实施例三：粘质沙雷氏菌Serratia marcescens WY31在蒽醌染料还原蓝RSN 脱色降解中的应用
(1)将粘质沙雷氏菌Serratia marcescens WY31的种子液接种至含有VB RSN 蒽醌染料的培养基中；
(2)外加营养源并混匀；
(3)在一定的初始接种量OD600、NH4Cl浓度、葡萄糖浓度、pH值、温度以及 Mn2+浓度条件下培养进行脱色降解。
实施例四：不同营养源对菌株WY31脱色还原蓝RSN效果的影响
使用实验室常用的7种营养源(葡萄糖、尿素、酵母膏、蛋白胨、蔗糖、乳糖和淀粉)，配置其浓度为10g/L的母液，115℃、30min高温高压灭菌，备用。以初始OD600为0.06接种至含不同营养源(终浓度为0.1g/L)的100mL ISM (含60mg/L VB RSN)培养基中，每隔4h定时取样，以检测其对脱色效果的影响。结果如图6所示，淀粉和葡萄糖作为营养源在36h时均有68％以上的脱色，到72h脱色率均达到80％以上，其次是胰蛋白胨作为营养源在72h超过78％的染料被去除，还有酵母提取物和蔗糖作为营养源在36h达到60％以上的脱色，而乳糖作为营养源，在前期脱色效果缓慢，在48h脱色率达到60％，尿素作为营养源脱色效果最差。
实施例五：菌株WY31在蒽醌染料还原蓝RSN脱色降解应用中的条件优化
探究菌株在还原蓝RSN脱色过程中不同碳源对其脱色效果的影响，选择最佳碳源。染料脱色条件优化实验包括单因素实验、Plackett-Burman实验及响应面实验，单因素实验主要考察初始OD600、NH4Cl浓度、葡萄糖浓度、pH值、温度以及Mn2+含量六个因素的影响，通过实验确定各个因素的最佳水平，实验结果分别如图7～12所示。单因素最佳水平为初始OD600为0.06、NH4Cl浓度为0.5g/L、葡萄糖浓度为0.3g/L、pH值为7、温度为30℃、Mn2+浓度为100mM。
在此基础上进行Plackett-Burman实验。来筛选对染料还原蓝RSN脱色影响显著的主效应因子，并通过PB设计的因素分析确定显著因子的水平。所述Plackett-Burman实验显著性影响因素为葡萄糖含量和温度。且此两个因素之间交互影响明显。
主要因素确定的Plackett-Burman实验
利用Design Expert 7.0软件，选择5个影响因素2个浓度进行PB优化实验设计，具体实验设计矩阵和实验结果见表5-1。
表5-1 PB实验设计和实验结果
Figure RE-GDA0003051557580000061
利用软件对实验结果进行显著性分析，获得表5-2。由表5-2可以得出，温度和葡萄糖p值分别为0.0091和0.0032，表明两者具有显著的影响，对脱色率影响最大。而其他因素包括NH4Cl浓度、Mn2+浓度和pH在选取范围内对脱色率影响不大。
表5-2 PB实验结果的显著性分析
Figure RE-GDA0003051557580000062
表5-3可以看出，该一阶模型多项系数R2＝0.8635，说明该模型拟合性相对较好。然而，预测复相关系数R2为0.4542，与校正决定系数0.7498有所差异，说明模块或数据存在较大的块效应和问题。精密度是有效信号与噪声的比值，大于4.0时即视为合理，本实验精密度为7.365，说明该模型可用来进行响应值预测。
表5-3 PB实验二次模型方差分析
Figure RE-GDA0003051557580000071
最后通过Central Composite Design(CCD)实验确定所筛选主效应因子的最佳操作参数。其中葡糖糖浓度和温度影响WY31脱色率的交互作用的三维图和等高线图如图13所示。菌株WY331脱色降解蒽醌染料还原蓝RSN实验最佳条件为葡萄糖含量0.324g/L，温度为30.675℃，最佳脱色率为91.849％。
显著影响因子的CCD实验优化和结果分析
根据PB实验以及最陡爬坡实验的结果，选择两因素两水平进行CCD实验，实验设计因素-水平见表5-4。
表5-4 CCD设计的因素水平
Figure RE-GDA0003051557580000072
根据响应面法规则，设计实验矩阵并进行实验，每组3个平行，实验结果取均值，实验设计和结果见表5-5。
表5-5 CCD实验设计和实验结果
Figure RE-GDA0003051557580000073
Figure RE-GDA0003051557580000081
使用Design Expert 7.0进行数据拟合，得到该模型实际因素回归方程(3)：
Y＝-167.37122+68.53219*A+16.17544*B-0.053419*AB-103.16506*A2-0.26335*B2 (3)
对该回归方程进行方差分析和相关系数分析，ANOVA分析结果见表5-6。模型中F值为23.40，Prob(P)>F值为0.0003(<0.05)，说明该模型具有显著性，其中B，A2，B2为模型显著项，而A，AB项对脱色效果的曲面效应不显著。
表5-6 CCD实验二次模型方差分析1和显著性检验
Figure RE-GDA0003051557580000082
对于响应值Y来说，其值越大说明脱色率越高，因此可以在优化标准上将Y项选择Maximine，upper设为150，软件将给出最优结果的Solutions。该模型得到最优结果只有1 个，即葡萄糖含量为0.324g/L，温度为30.675℃，最佳脱色率为91.849％。为检验响应面法 所得结果的可靠性，采用上述优化脱色条件进行脱色实验，考虑到实际操作的便利，将脱色 过程条件修正为：温度30℃，葡萄糖浓度0.3g/L，72h后测得实际脱色率为90.17％，与模型 预测的91.849％相比，仅相差1.679％，与理论值基本吻合，说明模型选择具有实用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Figure RE-GDA0003051557580000091
Figure RE-GDA0003051557580000101

Claims (8)

1.一株粘质沙雷氏菌，其特征在于，该菌株命名为粘质沙雷氏菌Serratia marcescensWY31，保藏编号为CCTCC AB 2019319，保藏日期为2019年3月19日，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
2.根据权利要求1所述的粘质沙雷氏菌，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌呈革兰氏阴性，含有如SEQ ID N0.1所示的基因序列。
3.粘质沙雷氏菌Serratia marcescens WY31在蒽醌染料还原蓝RSN脱色降解中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：至少包括如下步骤：(1)将粘质沙雷氏菌Serratia marcescens WY31的种子液接种至含有VB RSN蒽醌染料的培养基中；(2)外加营养源并混匀；(3)在一定的初始接种量OD600、NH4Cl浓度、葡萄糖浓度、pH值、温度以及Mn2+浓度条件下培养进行脱色降解。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：外加营养源为淀粉或葡萄糖。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：葡萄糖浓度选择在0-1.00g/L之间，温度选择在20-40℃之间。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：葡萄糖含量0.324g/L，温度为30.675℃。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：初始接种量OD600为0.06、NH4Cl浓度为0.5g/L、葡萄糖浓度为0.3g/L、pH值为7、温度为30℃、Mn2+浓度为100mM。
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