CN113795596A - 用于检测淋病奈瑟氏球菌的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

描述了用于快速检测生物样品或非生物样品中NG菌毛蛋白转化蛋白(Piv_Ng)基因的存在或不存在的方法。所述方法可包括进行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，提供了靶向所述NG Piv_Ng基因的引物、探针以及被设计用于检测淋病奈瑟氏球菌(NG)的试剂盒。

Description

用于检测淋病奈瑟氏球菌的组合物和方法

技术领域

本公开涉及分子诊断领域，并且更具体地涉及淋病奈瑟氏球菌(NeisseriaGonorroheae)的检测。

背景技术

淋病奈瑟氏球菌(NG)也称为淋菌或***，是Albert Neisser在1879年分离的一种革兰氏阴性双球菌。NG是淋病的病原体，是一种细胞色素氧化酶阳性、非运动性、非孢子形成革兰氏阴性双球菌。它会引起性传播的泌尿生殖器感染淋病以及其他形式的***疾病，包括播散性***血症、脓毒性关节炎和***新生儿眼炎。淋病奈瑟氏球菌会感染生殖道的粘膜，包括女性的子宫颈、子宫和输卵管以及女性和男性的尿道。淋病奈瑟氏球菌还可感染口腔、喉咙、眼睛和直肠的粘膜。

淋病是一种非常常见的传染病。CDC估计美国每年大约有820,000例新增***感染，其中一半以上的感染被检测到并被报告给疾病控制和预防中心(CDC)。CDC估计其中570,000例是15-24岁的年轻人。2017年，向CDC报告了555,608例淋病。

淋病通过与被感染伴侣的***、***、口腔或***发生性接触而传播。传播或获得淋病不一定要***。淋病也可在分娩期间从母亲到婴儿进行围产期传播。如果患有淋病并接受治疗的人与感染淋病的人发生性接触，则他们可能被再次感染。

淋病是第二大最常报告的传染病。NG感染的临床表现很多。许多患有淋病的男性没有症状。如果有症状，男性尿道感染的体征和症状包括排尿困难或者有白色、黄色或绿色的尿道分泌物，这通常在感染后1至14天出现。在尿道感染并发***的情况下，患有淋病的男性也可能主诉睾丸或阴囊疼痛。

在女性中，感染的主要部位是子宫颈内膜。沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)(CT)、***毛滴虫(Trichomonas vaginalis)和***病的症状合并发生率很高；许多女性仍然没有症状，因此不寻求医疗护理。即使当女性有症状时，症状通常也非常轻微和非特异性，以至于被误认为是膀胱或***感染。女性的最初症状和体征包括排尿困难、***分泌物增加或两次月经之间出现***出血。无论症状是否存在或严重程度如何，患有淋病的女性都有因感染而出现严重并发症的风险。

男性和女性的其他***感染部位是咽部、结膜，在较氢程度上，该疾病本身表现为播散性***感染。咽部感染可引起喉咙痛，但通常没有症状。被感染母亲的婴儿可能患上结膜炎。

建议对所有25岁以下性活跃的女性和感染风险增加的大龄女性(例如，有新的***、不止一个***、有同***的***或患有性传播感染(STI)的***的大龄女性)每年进行淋病奈瑟氏球菌感染筛查。

如果不进行治疗，淋病也会扩散到血液中并引起播散性***感染(DGI)。DGI通常以关节炎、腱鞘炎和/或皮炎为特征。这种情况可能危及生命。未治疗的淋病可增加人获得或传播HIV(引起AIDS的病毒)的风险。

泌尿生殖器淋病可通过使用核酸扩增测试(NAAT)测试尿、尿道样本(对于男性)或者子宫颈内或***样本(对于女性)来诊断。因此，本领域需要一种更好和更完善的方法来特异性检测NG。

发明内容

本公开中的某些实施方案涉及用于例如通过单个试管中的实时聚合酶链反应进行NG的多重检测来快速检测生物样品或非生物样品中NG的存在或不存在的方法。实施方案包括检测NG的方法，这些方法包括进行至少一个循环步骤，该循环步骤可包括扩增步骤和杂交步骤。此外，实施方案包括被设计用于在单管中检测NG的引物、探针和试剂盒。所述检测方法被设计成利用区分其他奈瑟氏菌种的潜力靶向淋病奈瑟氏球菌基因组中的特定基因。

提供了一种用于检测样品中的淋病奈瑟氏球菌(NG)的方法，该方法包括进行扩增步骤，该扩增步骤包括使样品与一组被设计成靶向特定NG基因的引物接触以在样品中存在NG时产生扩增产物；进行杂交步骤，该杂交步骤包括使扩增产物与靶NG基因的一种或多种可检测探针接触；以及检测扩增产物的存在或不存在，其中扩增产物的存在指示样品中存在NG，并且其中扩增产物的不存在指示样品中不存在NG；其中靶NG基因是菌毛蛋白转化蛋白(Piv_Ng)基因。

在一个方面，提供了一种检测样品中的NG的方法，该方法包括进行扩增步骤，该扩增步骤包括使样品与一组Piv_Ng基因引物接触以在样品中存在NG核酸的情况下产生扩增产物；进行杂交步骤，该杂交步骤包括使扩增产物与一种或多种可检测Piv_Ng基因探针接触；以及检测扩增产物的存在或不存在，其中扩增产物的存在指示样品中存在NG，并且其中扩增产物的不存在指示样品中不存在NG；其中该组Piv_Ng基因引物包含第一引物和第二引物，该第一引物包含SEQ ID NO：1的第一寡核苷酸序列或其互补序列或者由该序列组成，该第二引物包含SEQ ID NO：2的第二寡核苷酸序列或其互补序列或者由该序列组成；并且其中一种或多种可检测Piv_Ng基因探针包含SEQ ID NO：3的第三寡核苷酸序列或其互补序列或者由该序列组成。在某些实施方案中，检测NG的方法还包括使样品与一组用于扩增和检测NGDR9基因序列的引物和探针接触，所述引物和探针在U.S.7,476,736(其全文以引用方式并入本文)中公开。

在一些实施方案中，杂交步骤包括使扩增产物与用供体荧光部分和相应的受体部分标记的可检测NG Piv_Ng基因探针接触；并且检测步骤包括检测探针的供体荧光部分与受体部分之间荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在指示样品中存在或不存在NG。在一些实施方案中，重复扩增和杂交步骤。在本文中，重复次数取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多的扩增和杂交步骤来扩增足以进行检测的靶序列。在一些实施方案中，重复扩增和杂交步骤至少约20次，但可重复多达至少25、30、40、50、60次或甚至100次。此外，可在每个扩增和杂交步骤期间或之后、在每隔一个扩增和杂交步骤期间或之后、在特定扩增和杂交步骤期间或之后或者在特定扩增和杂交步骤期间或之后检测扩增产物的存在或不存在，其中如果存在，预期有足够的扩增产物用于检测。在一些实施方案中，扩增步骤使用具有5′至3′核酸酶活性的聚合酶。在一些实施方案中，供体荧光部分和相应的受体部分在探针上彼此相距不超过8-20个核苷酸。在一些实施方案中，受体部分是猝灭剂。在一些实施方案中，寡核苷酸包含选自SEQ ID NO：1-3的核苷酸的序列或其互补序列或者由该序列组成，并且具有100个或更少的核苷酸、50个或更少的核苷酸、40个或更少的核苷酸或者30个或更少的核苷酸。在一些实施方案中，第一和第二NG Piv_Ng基因引物和可检测NG Piv_Ng基因探针具有40个或更少的核苷酸(例如，35个或更少的核苷酸、30个或更少的核苷酸等)。

在另一个实施方案中，本公开提供了一种寡核苷酸，该寡核苷酸包括与SEQ IDNO：1-3中的一个或其互补序列具有至少70％序列一致性(例如，至少75％、80％、85％、90％或95％等)的核酸，该寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。一般来讲，在这些实施方案中，这些寡核苷酸可以是引物核酸、探针核酸等。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸，例如以相对于未经修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。在一些实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸选自N⁶-苄基-dA、N4-苄基-dC、N⁶-对叔丁基-苄基-dA和N⁴-对叔丁基-苄基-dC。任选地，寡核苷酸包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包括至少一种保守修饰的变异。特定核酸序列的“保守修饰的变异”或简称为“保守变异”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的序列。本领域技术人员将认识到，在编码的序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小部分的氨基酸(通常小于5％，更通常小于4％、2％或1％)的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变异”，其中这些改变导致缺失氨基酸、添加氨基酸或用化学上类似的氨基酸取代氨基酸。在一些实施方案中，第一和第二靶NG基因引物和可检测靶NG基因探针中的至少一者包含至少一个经修饰的核苷酸。

在一些实施方案中，扩增(扩增步骤)可采用具有5′至3′核酸酶活性的聚合酶。因此，供体荧光部分和受体部分(例如猝灭剂)沿着探针的长度可彼此相距不超过5至20个核苷酸(例如8个或10个)。另一方面，可检测探针包括允许二级结构形成的核酸序列。这种二级结构形成通常会导致第一荧光部分与第二荧光部分之间的空间接近。根据该方法，探针上的第二荧光部分可以是猝灭剂。

本公开提供了用于检测来自个体的生物样品中的淋病奈瑟氏球菌(NG)的存在或不存在的方法。此类方法通常包括进行至少一个循环步骤，该循环步骤包括扩增步骤和染料结合步骤。通常，扩增步骤包括使样品与被设计成靶向特定NG基因的多对引物接触，以在样品中存在靶NG基因核酸分子时产生一种或多种靶NG基因扩增产物，并且染料结合步骤包括使靶NG基因扩增产物与双链DNA结合染料接触。在一个实施方案中，靶NG基因是NG Piv_Ng基因。此类方法还包括检测双链DNA结合染料与扩增产物结合的存在或不存在，其中结合的存在指示样品中存在NG，并且其中结合的不存在指示样品中不存在NG。代表性双链DNA结合染料是溴化乙锭。另外，此类方法还可包括测定靶NG基因扩增产物与双链DNA结合染料之间的解链温度，其中解链温度证实NG的存在或不存在。在某些实施方案中，检测来自个体的生物样品中NG的存在或不存在的方法还包括用一组用于扩增NGDR9基因序列的引物进行扩增。

又一方面，提供了一种用于检测NG Piv_Ng基因的试剂盒。该试剂盒可包括一组或多组特异性扩增NG Piv_Ng基因的引物和一种或多种特异性检测NG Piv_Ng基因扩增产物的可检测探针。在一个实施方案中，该试剂盒还包含一组或多组用于扩增和检测NGDR9基因序列的引物和探针。

具体地，上文结合根据本发明的方法公开的寡核苷酸引物和探针适于包含在根据本发明的试剂盒中。在本文中，提供了一种用于检测NG的Piv_Ng基因的试剂盒，该试剂盒包含第一引物和第二引物，该第一引物包含SEQ ID NO：1的第一寡核苷酸序列或其互补序列或者由该序列组成，该第二引物包含SEQ ID NO：2的第二寡核苷酸序列或其互补序列或者由该序列组成；以及荧光可检测地标记的探针，该荧光可检测地标记的探针包含SEQ ID NO：3的第三寡核苷酸序列或其互补序列或者由该序列组成，该荧光可检测地标记的探针被配置为与由第一引物和第二引物生成的扩增子杂交。在一个方面，该试剂盒可包括已经用供体和相应的受体部分(例如，另一种荧光部分或黑暗猝灭剂)标记的探针，或者可包括用于标记探针的荧光部分。该试剂盒还可包括三磷酸核苷、核酸聚合酶和核酸聚合酶的功能所需的缓冲液中的至少一种。该试剂盒还可包括使用引物、探针和荧光部分来检测样品中NG的存在或不存在的包装说明书和说明。在一些实施方案中，第三可检测地标记的寡核苷酸序列包含供体荧光部分和相应的受体部分。在一些实施方案中，受体部分是猝灭剂。在一些实施方案中，第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸中的至少一者包含至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸选自N⁶-苄基-dA、N⁴-苄基-dC、N⁶-对叔丁基-苄基-dA和N⁴-对叔丁基-苄基-dC。在一些实施方案中，第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸。

另一方面，提供了组合物，所述组合物包含如上文所公开的一组用于扩增靶NG基因的寡核苷酸引物。在一些实施方案中，该一组NG Piv_Ng基因引物组包含第一引物和第二引物，该第一引物包含SEQ ID NO：1的第一寡核苷酸序列或其互补序列或者由该序列组成，该第二引物包含SEQ ID NO：2的第二寡核苷酸序列或其互补序列或者由该序列组成。在某些实施方案中，该组合物还包含可检测NG Piv_Ng基因探针，该探针包含SEQ ID NO：3的第三寡核苷酸序列或其互补序列或者由该序列组成。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。尽管可在本主题的实践或测试中使用与本文所述的方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而不旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文合并于本文。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。

本发明的一个或多个实施方案的细节在附图和以下描述中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将从附图和具体实施方式以及从权利要求中显而易见。

附图说明

图1示出了由NG Piv_Ng引物和探针生成的实时PCR实验的PCR生长曲线，其中来自菌株#2949的基因组淋病奈瑟氏球菌DNA模板的浓度以每个PCR反应30,000个(NG-2949-Neat)、3,000个(NG-2949-DF10-D1)、300个(NG-2949-DF10-D2)、30个(NG-2949-DF10-D3)和3个(NG-2949-DF10-D4)基因组当量浓度(ge/PCR)存在。

具体实施方式

通过核酸扩增诊断NG感染提供了一种快速且准确地检测细菌感染的方法。本文描述了用于检测样品中NG的实时测定。提供了用于检测NG的引物和探针，以及包含此类引物和探针的制品或试剂盒。与其他方法相比，实时PCR检测NG的灵敏度更高，以及实时PCR具有改进的特征，包括样品容纳和扩增产物的实时检测，使该技术在临床实验室中用于NG感染的常规诊断变得可行。

本公开包括寡核苷酸引物和荧光标记的水解探针，它们与NG基因组的特定基因座杂交以使用

扩增和检测技术特异性鉴定NG。对NG进行靶向选择需要对公共序列数据库进行全面搜索，以及对可能区分最近邻居脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitides)和乳糖奈瑟氏菌(N.Lactamica)的NG靶标进行文献搜索。在靶向选择过程中分析了来自公共序列数据库的多个靶标，但许多靶标显示出与其他奈瑟氏菌种的交叉反应性。此外，公共数据库中的序列由于来自多拷贝靶标的“批量”序列数据而变得复杂。作为分析的结果，选择的靶NG基因是NG菌毛蛋白转化蛋白(Piv_Ng)基因(GenBank登录号U65994.1，残基3603-4577)。

所公开的方法可包括进行至少一个循环步骤，该循环步骤包括使用一对或多对引物从样品扩增核酸分子基因靶标的一个或多个部分。如本文所用的“引物”是指在与NG中的靶基因特异性退火并在适当条件下从其启动DNA合成从而产生相应扩增产物的寡核苷酸引物。所讨论的引物中的每一种与相应靶核酸分子内或邻近的靶标退火，使得每种扩增产物的至少一部分含有对应于靶标的核酸序列。如果样品中存在靶NG基因核酸中的一种或多种，则产生一种或多种扩增产物，因此靶NG基因扩增产物中的一种或多种的存在指示样品中存在NG。扩增产物应含有与靶NG基因的一种或多种可检测探针互补的核酸序列。如本文所用的“探针”是指与编码靶NG基因的核酸序列特异性退火的寡核苷酸探针。每个循环步骤包括扩增步骤、杂交步骤和检测步骤，其中使样品与一种或多种可检测探针接触以检测样品中NG的存在或不存在。

如本文所用，术语“扩增”是指合成与模板核酸分子的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性，在低于引物解链温度的温度下使引物与模板核酸退火，以及从引物酶促延伸以生成扩增产物。扩增通常需要存在三磷酸脱氧核糖核苷、DNA聚合酶(例如

Taq)以及用于优化聚合酶活性的适当缓冲液和/或辅因子(例如MgCl₂和/或KCl)。

如本文所用的术语“引物”是本领域技术人员已知的，是指能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发"DNA合成的寡聚化合物，主要是指寡核苷酸，但也指经修饰的寡核苷酸，即例如寡核苷酸的3′-端提供游离3′-OH基团，另外的“核苷酸”可通过模板依赖性DNA聚合酶附接到该基团，从而建立3′至5′磷酸二酯键，由此使用三磷酸脱氧核苷并由此释放焦磷酸根。因此，除了可能的预期功能之外，“引物”、“寡核苷酸”或“探针”之间没有根本区别。

术语“杂交”是指一种或多种探针与扩增产物的退火。杂交条件通常包括低于探针解链温度但避免探针非特异性杂交的温度。

术语“5′至3′核酸酶活性”是指核酸聚合酶的通常与核酸链合成相关的活性，由此从核酸链的5′端去除核苷酸。

术语“热稳定聚合酶”是指热稳定的聚合酶，即该酶催化与模板互补的引物延伸产物的形成，并且在经受升高的温度持续实现双链模板核酸变性所需的时间时不会不可逆地变性。一般来讲，合成在每个引物的3′端起始，并且沿着模板链在5′至3′方向上进行。已经从黄栖热菌(Thermus flavus)、红栖热菌(T.ruber)、嗜热栖热菌(T.thermophilus)、水生栖热菌(T.aquaticus)、乳栖热菌(T.lacteus)、红色栖热菌(T.rubens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)分离热稳定聚合酶。然而，非热稳定的聚合酶也可用于PCR测定中，条件是补充该酶。

术语“其互补序列”是指与给定核酸长度相同并且完全互补的核酸。

当关于核酸使用时，术语“延伸”或“延长”是指将另外的核苷酸(或其他类似分子)掺入核酸中。例如，核酸任选地通过核苷酸掺入生物催化剂(诸如通常在核酸的3′末端添加核苷酸的聚合酶)延伸。

在两个或更多个核酸序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对以获得最大对应性(例如，如使用技术人员可用的序列比较算法中的一种或通过视觉检查所测量的)时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同核苷酸。适于测定序列同一性百分比和序列相似性的示例性算法是在例如以下文献中描述的BLAST程序：Altschul等人(1990)“Basic local alignment search tool”J.Mol.Biol.215：403-410；Gish等人(1993)“Identification of protein codingregions by database similarity search”Nature Genet.3：266-272；Madden等人(1996)“Applications of network BLAST server”Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul等人(1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database searchprograms”Nucleic Acids Res.25：3389-3402；以及zhang等人(1997)“PowerBLAST：A newnetwork BLAST application for interactive or automated sequence analysis andannotation”Genome Res.7：649-656，这些文献各自以引用方式并入本文。

在寡核苷酸的上下文中，“经修饰的核苷酸”是指其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸被为寡核苷酸提供所需性质的不同核苷酸替换的改变。可在本文所述的寡核苷酸中被取代的示例性经修饰的核苷酸包括例如C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2，6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基-dA、C7-炔丙基氨基-dG、7-脱氮-2-脱氧黄苷、吡唑并嘧啶类似物、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2′-O-甲基核糖-U、2′-O-甲基核糖-C、N4-乙基-dC、N⁶-甲基-dA、N⁶-苄基-dA、N4-苄基-dC、N⁶-对叔丁基-苄基-dA、N4-对叔丁基-苄基-dC等。可在寡核苷酸中被取代的许多其他经修饰的核苷酸在本文中提及或在本领域中另外已知。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸取代相对于相应的未经修饰的寡核苷酸的解链温度修饰寡核苷酸的解链温度(Tm)。为了进一步说明，在一些实施方案中，某些经修饰的核苷酸取代可减少非特异性核酸扩增(例如，最小化引物二聚体形成等)，增加预期的靶扩增子的产量等。这些类型的核酸修饰的示例在例如美国专利号6,001,611(通过引用并入本文)中描述。

NG的检测

本公开提供了通过扩增例如NG Piv_Ng基因核酸序列的一部分来检测NG的方法。基因的核酸序列是可公开获得的(例如，GenBank登录号U65994.1残基3603-4577，SEQ ID NO：4)。具体地，通过本公开的实施方案提供了用于扩增和检测特定NG核酸分子靶标的引物和探针。

为了检测NG，提供了扩增NG Piv_Ng基因的引物和探针。除了本文例举的那些核酸之外的核酸也可用于检测样品中的NG。例如，本领域技术人员可使用常规方法来评价功能性变体的特异性和/或灵敏度。代表性功能变体可包括例如本文所公开的靶NG基因核酸中的一个或多个缺失、***和/或取代。

更具体地，寡核苷酸的实施方案各自包括具有选自SEQ ID NO：1-3、其基本上相同的变体的序列的核酸，其中该变体与SEQ ID NO：1-3中的一者或SEQ ID NO：1-3和变体的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性。

表I：Piv_Ng引物和探针

在一个实施方案中，使用上述引物和探针组以便检测怀疑含有NG的生物样品中的NG。引物和探针组可包含对NG Piv_Ng基因的核酸序列具有特异性的引物和探针或者由这些引物和探针组成，这些引物和探针包含SEQ ID NO：1-3的核酸序列或者由这些核酸序列组成。在另一个实施方案中，NG Piv_Ng基因的引物和探针包含SEQ ID NO：1-3的任何引物和探针的功能活性变体或者由该功能活性变体组成。在又一个实施方案中，检测生物样品中的NG还包括提供对NGDR9基因序列(SEQ ID NO：5)具有特异性的引物和探针，这些引物和探针在U.S.7,476,736(其全文通过引用并入本文)中公开。

可通过在所公开的方法中使用引物和/或探针来鉴定SEQ ID NO：1-3的任何引物和/或探针的功能活性变体。SEQ ID NO：1-3中任一者的引物和/或探针的功能活性变体涉及与SEQ ID NO：1-3的相应序列相比在所描述的方法或试剂盒中提供相似或更高特异性和灵敏度的引物和/或探针。

变体可例如由于一个或多个核苷酸添加、缺失或取代(诸如SEQ IDNO：1-3的相应序列的5′端和/或3′端的一个或多个核苷酸添加、缺失或取代)而与SEQ ID NO：1-3的序列不同。如上所述，引物(和/或探针)可以是经化学修饰的，即引物和/或探针可包含经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。探针(或引物)则是经修饰的寡核苷酸。“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)与天然“核苷酸”的不同之处在于一些修饰，但仍由碱基或碱基样化合物、戊呋喃糖基糖或戊呋喃糖基糖样化合物、磷酸部分或磷酸样部分或它们的组合组成。例如，可将“标记”附接到“核苷酸”的碱基部分，由此获得“经修饰的核苷酸”。“核苷酸”中的天然碱基也可被例如7-脱氮嘌呤替换，由此也获得“经修饰的核苷酸”。术语“经修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换使用。“经修饰的核苷”(或“核苷类似物”)与天然核苷的不同之处在于以如上文针对“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)概述的方式进行的一些修饰。

可使用例如计算机程序诸如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.，Cascade，Colo.)来设计扩增编码靶NG Piv_Ng基因的核酸分子的寡核苷酸，包括经修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物。当设计用作扩增引物的寡核苷酸时，重要特征包括但不限于适当大小的扩增产物以便于检测(例如，通过电泳)、一对引物的成员的相似解链温度以及每个引物的长度(即，引物需要足够长以与序列特异性退火并启动合成，但不能太长以至于在寡核苷酸合成过程中保真度降低)。通常，寡核苷酸引物的长度为8至50个核苷酸(例如，长度为8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48个或50个核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸引物的长度为40个或更少的核苷酸。

除了一组引物之外，这些方法可使用一种或多种探针以便检测NG的存在或不存在。术语“探针”是指通过设计或选择含有特定核苷酸序列的合成或生物产生的核酸(DNA或RNA)，所述特定核苷酸序列允许它们在限定的预定严格性下与“靶核酸”(在本发明的情况下与靶NG基因核酸)特异性(即，优先)杂交。“探针”可被称为“检测探针”，意指其检测靶核酸。

在一些实施方案中，所描述的NG Piv_Ng基因探针可用至少一种荧光标记进行标记。在一个实施方案中，NG Piv_Ng基因探针可用供体荧光部分(例如荧光染料)和相应的受体部分(例如猝灭剂)标记。在一个实施方案中，探针包含荧光部分或由其组成，并且核酸序列包含SEQ ID NO：3或由其组成。

设计用作探针的寡核苷酸可以类似于引物设计的方式进行。实施方案可使用单个探针或一对探针来检测扩增产物。根据实施方案，所用的探针可包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。与引物一样，探针通常具有相似的解链温度，并且每个探针的长度必须足以发生序列特异性杂交，但不能太长以至于在合成过程中保真度降低。寡核苷酸探针的长度通常为15至40(例如，16、18、20、21、22、23、24或25)个核苷酸。

构建体可包括各自含有NG Piv_Ng基因引物和探针核酸分子中的一种的载体。构建体可用作例如对照模板核酸分子。适用的载体是市售的和/或通过本领域常规的重组核酸技术方法产生的。NG Piv_Ng基因核酸分子可例如通过化学合成、从CA直接克隆或通过PCR扩增获得。

除了NG Piv_Ng基因核酸分子(例如，含有SEQ ID NO：1-3中的一个或多个序列的核酸分子)外，适用于所述方法的构建体通常还包括编码用于选择所需构建体和/或转化体的选择标记(例如，抗生素抗性基因)的序列以及复制起点。载体***的选择通常取决于若干因素，包括但不限于宿主细胞的选择、复制效率、选择性、诱导性和回收的容易性。

含有靶NG基因核酸分子的构建体可在宿主细胞中繁殖。如本文所用，术语宿主细胞意在包括原核生物和真核生物，诸如酵母、植物和动物细胞。原核宿主可包括大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括酵母(诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris))、哺乳动物细胞(诸如COS细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)、昆虫细胞和植物细胞(诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum))。可使用本领域普通技术人员公知的任何技术将构建体引入宿主细胞中。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热激、脂质转染、显微注射和病毒介导的核酸转移是将核酸引入宿主细胞中的常用方法。另外，可将裸DNA直接递送到细胞(参见例如美国专利号5,580,859和5,589,466)。

聚合酶链反应(PCR)

美国美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规的PCR技术。PCR通常采用与所选核酸模板(例如DNA或RNA)结合的两种寡核苷酸引物。在一些实施方案中有用的引物包括能够作为所描述的靶NG基因核酸序列内核酸合成起始点的寡核苷酸。引物可通过常规方法从限制性消化物中纯化，或其可合成产生。引物优选地是单链的，以获得最大的扩增效率，但引物可以是双链的。首先使双链引物变性(即对其进行处理)以分离链。一种使双链核酸变性的方法是通过加热。

如果模板核酸是双链的，则必须在其可用作PCR中的模板前分离两条链。链分离可通过任何合适的变性方法完成，包括物理、化学或酶促方式。一种分离核酸链的方法涉及加热核酸直到其大部分变性(例如，大于50％、60％、70％、80％、90％或95％变性)。使模板核酸变性所需的加热条件将取决于例如缓冲盐浓度以及被变性的核酸的长度和核苷酸组成，但通常在约90℃至约105℃的范围内持续一段时间，这取决于反应的特征诸如温度和核酸长度。变性通常进行约30秒至4分钟(例如，1分钟至2分钟30秒，或1.5分钟)。

如果通过加热使双链模板核酸变性，则使反应混合物冷却至促进每个引物与所描述的靶NG基因核酸分子上的靶序列退火的温度。用于退火的温度通常为约35℃至约65℃(例如，约40℃至约60℃；约45℃至约50℃)。退火时间可为约10秒至约1分钟(例如，约20秒至约50秒；约30秒至约40秒)。然后将反应混合物调节至促进或优化聚合酶活性的温度，即足以从退火的引物发生延伸以生成与模板核酸互补的产物的温度。温度应足以从与核酸模板退火的每个引物合成延伸产物，但不应高到使延伸产物从其互补模板变性(例如，用于延伸的温度通常在约40℃至约80℃的范围内(例如，约50℃至约70℃；约60℃))。延伸时间可为约10秒至约5分钟(例如，约30秒至约4分钟；约1分钟至约3分钟；约1分钟30秒至约2分钟)。

PCR分析可采用核酸诸如RNA或DNA(cDNA)。模板核酸不需要纯化；其可以是复杂混合物的一小部分，诸如人类细胞中包含的核酸。核酸分子可通过常规技术从生物样品中提取，诸如Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Applications(Persing等人(编)，1993，American Society for Microbiology，Washington D.C.)中所描述的那些技术。核酸可从许多来源获得，诸如质粒或天然来源，包括细菌、酵母、原生动物病毒、细胞器或高等生物，诸如植物或动物。

寡核苷酸引物与PCR试剂在诱导引物延伸的反应条件下混合。例如，链延伸反应通常包括50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3)、15mMMgCl₂、0.001％(w/v)明胶、0.5-1.0μg原变性模板DNA、50pmol每种寡核苷酸引物、2.5U Taq聚合酶和10％DMSO。反应通常包含150至320μM dATP、dCTP、dTTP、dGTP中的每一种或者其一种或多种类似物。

新合成的链形成可用于后续反应步骤的双链分子。可根据需要重复多次链分离、退火和延伸的步骤，以产生所需数量的对应于靶核酸分子的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和三磷酸核苷的量。优选地重复至少一次循环步骤(即变性、退火和延伸)。为了用于检测，循环步骤的次数将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多的循环步骤来扩增足以进行检测的靶序列。通常，重复循环步骤至少约20次，但可重复多达40、60次或甚至100次。

荧光共振能量转移(FRET)

FRET技术(参见例如美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)基于这样的概念：当供体荧光部分和相应的受体荧光部分位于彼此相距一定距离内时，两个荧光部分之间会发生能量转移，该能量转移可被可视化或以其他方式检测和/或定量。当供体被合适波长的光辐射激发时，供体通常将能量转移到受体。受体通常以不同波长的光辐射形式重新发射转移的能量。在某些***中，非荧光能量可通过包括基本上非荧光供体部分的生物分子在供体与受体部分之间转移(参见例如美国专利号7,741,467)。

在一个示例中，寡核苷酸探针可含有供体荧光部分和相应的猝灭剂，该猝灭剂可以是或不是荧光的，并且以不同于光的形式耗散转移的能量。当探针完整时，能量转移通常发生在供体与受体部分之间，使得来自供体荧光部分的荧光发射被受体部分猝灭。在聚合酶链反应的延伸步骤期间，与扩增产物结合的探针被例如Taq聚合酶的5′至3′核酸酶活性裂解，使得供体荧光部分的荧光发射不再被猝灭。用于此目的的示例性探针在例如美国专利号5,210,015、5,994,056和6,171,785中描述。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的黑暗猝灭剂包括BlackHole Quenchers^TM(BHQ)(Biosearch Technologies，Inc.，Novato，Cal.)、Iowa Black^TM(Integrated DNA Tech.，Inc.，Coralville，Iowa)、BlackBerry^TM Quencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.，Dexter，Mich.)。

在另一个示例中，两个寡核苷酸探针(每个含有荧光部分)可在由寡核苷酸探针与靶核酸序列的互补性决定的特定位置与扩增产物杂交。当寡核苷酸探针与扩增产物核酸在适当位置杂交时，生成FRET信号。杂交温度可在约35℃至约65℃的范围内，持续约10秒至约1分钟。

可使用例如光子计数落射荧光显微镜***(包含适当的分色镜和用于监测特定范围的荧光发射的滤光器)、光子计数光电倍增器***或荧光计来进行荧光分析。可利用氩离子激光器、高强度汞(Hg)弧光灯、光纤光源或其他经适当过滤以在所需范围内激发的高强度光源来进行激发以启动能量转移或允许直接检测荧光团。

如本文关于供体和相应的受体部分所用，“相应的”是指具有与供体荧光部分的发射光谱重叠的吸收光谱的受体荧光部分或黑暗猝灭剂。受体荧光部分的发射光谱的最大波长应比供体荧光部分的激发光谱的最大波长大至少100nm。因此，在它们之间可产生有效的非辐射能量转移。

通常针对以下项选择荧光供体和相应的受体部分：(a)高效率的Forster能量转移；(b)较大的最终Stokes位移(＞100nm)；(c)尽可能将发射偏移到可见光谱的红色部分(＞600nm)；以及(d)将发射偏移到比在供体激发波长下激发所产生的Raman水荧光发射高的波长。例如，可选择以下供体荧光部分：其在激光线附近具有其激发最大值(例如，氦-镉442nm或氩488nm)，具有高消光系数、高量子产率，并且其荧光发射与相应的受体荧光部分的激发光谱良好重叠。可选择以下相应的受体荧光部分：其具有高消光系数、高量子产率，其发射与供体荧光部分的发射良好重叠，并且在可见光谱的红色部分(＞600nm)中发射。

在FRET技术中可与各种受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、Lucifer Yellow、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、Lucifer Yellow VS、4-乙酰氨基-4′-异硫基-氰酰二苯乙烯基-2，2′-二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4′-异硫基氰酰苯基)-4-甲基香豆素、1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯和4-乙酰氨基-4′-异硫基氰酰二苯乙烯基-2，2′-二磺酸衍生物。取决于所使用的供体荧光部分，代表性受体荧光部分包括LC Red640、LC Red705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺若丹明B磺酰氯、四甲基若丹明异硫氰酸盐、若丹明x异硫氰酸盐、赤藓红异硫氰酸盐、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸盐或镧系元素离子(例如铕或铽)的其他螯合物。供体和受体荧光部分可例如从Molecular Probes(Junction City，Oreg.)或SigmaChemical Co.(St.Louis，Mo.)获得。

供体和受体荧光部分可经由接头臂附接到合适的探针寡核苷酸。每个接头臂的长度很重要，因为接头臂将影响供体与受体荧光部分之间的距离。接头臂的长度可为从核苷酸碱基到荧光部分的距离(以埃

表示)。一般来讲，接头臂为约

至约

接头臂可以是WO 84/03285中所述的种类。WO 84/03285还公开用于将接头臂附接到特定核苷酸碱基以及用于将荧光部分附接到接头臂的方法。

受体荧光部分(诸如LC Red 640)可与含有氨基接头的寡核苷酸(例如，可从ABI(Foster City，Calif.)或Glen Research(Sterling，VA)获得的C6-氨基亚磷酰胺)组合，以产生例如LC Red 640标记的寡核苷酸。经常使用的将供体荧光部分(诸如荧光素)偶联到寡核苷酸的接头包括硫脲接头(FITC-衍生的，例如来自Glen Research或ChemGene(Ashland，Mass.)的荧光素-CPG′)、酰胺接头(荧光素-NHS-酯衍生的，诸如来自BioGenex(San Ramon，Calif.)的CX-荧光素-CPG)或需要在寡核苷酸合成后偶联荧光素-NHS-酯的3′-氨基-CPG。

NG的检测

本公开提供了用于检测生物样品或非生物样品中NG的存在或不存在的方法。所提供的方法避免了样品污染、假阴性和假阳性的问题。这些方法包括进行至少一个循环步骤和FRET检测步骤，该循环步骤包括使用一对或多对引物从样品扩增靶核酸分子的一部分。优选地在热循环仪中进行多个循环步骤。所述方法可使用检测NG的存在的引物和探针进行，并且检测到靶NG基因指示样品中存在NG。

如本文所述，可使用利用FRET技术的标记的杂交探针来检测扩增产物。一种FRET形式利用

技术来检测扩增产物的存在或不存在，因此检测CA的存在或不存在。

技术利用一种单链杂交探针，该探针用例如一种荧光染料和一种猝灭剂标记，该猝灭剂可以是或不是荧光的。当用合适波长的光激发第一荧光部分时，吸收的能量根据FRET原理转移到第二荧光部分或黑暗猝灭剂。第二部分通常是猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针与靶DNA(即，扩增产物)结合并在随后的延伸阶段期间被例如Taq聚合酶的5′至3′核酸酶活性降解。因此，荧光部分和猝灭剂部分变得彼此空间上分离。因此，在不存在猝灭剂的情况下激发第一荧光部分后，可检测到来自第一荧光部分的荧光发射。举例来说，ABI

7700序列检测***(Applied Biosystems)使用

技术，并且适合于进行本文所述的用于检测样品中NG的存在或不存在的方法。

也可使用与FRET结合的分子信标来使用实时PCR方法检测扩增产物的存在。分子信标技术使用用第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分一般是猝灭剂，并且荧光标记通常位于探针的每个端部。分子信标技术使用具有允许形成二级结构(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。作为在探针内形成二级结构的结果，当探针在溶液中时，两个荧光部分空间接近。在与靶核酸(即，扩增产物)杂交后，探针的二级结构被破坏并且荧光部分变得彼此分离，使得在用合适波长的光激发后，可检测到第一荧光部分的发射。

另一种常见形式的FRET技术利用两种杂交探针。每种探针可用不同的荧光部分标记，并且通常被设计成在靶DNA分子(例如，扩增产物)中彼此非常接近地杂交。供体荧光部分(例如荧光素)由

仪器的光源在470nm下激发。在FRET期间，荧光素将其能量转移到受体荧光部分，诸如

-Red 640(LC Red 640)或

-Red705(LC Red 705)。然后，受体荧光部分发射较长波长的光，该光被

仪器的光学检测体系检测到。只有当荧光部分直接局部接近，并且当供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时，有效的FRET才发生。发射信号的强度可与原始靶DNA分子的数量(例如，CA基因组的数目)相关。如果靶核酸发生扩增并产生扩增产物，则杂交步骤产生基于探针对成员之间的FRET的可检测信号。

通常，FRET的存在指示样品中存在NG，并且FRET的不存在指示样品中不存在NG。然而，标本采集不足、运输延迟、运输条件不当或使用某些采集拭子(藻酸钙或铝杆)都是会影响测试结果的成功和/或准确性的条件。使用本文所公开的方法，在例如45个循环步骤内检测FRET指示NG感染。

可用于实践所述方法的代表性生物样品包括但不限于呼吸道标本、粪便标本、血液标本、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤和软组织感染物。生物样品的收集和储存方法是本领域技术人员已知的。可对生物样品进行处理(例如，通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒)以释放NG核酸，或者在一些情况下，可使生物样品直接与PCR反应组分和合适的寡核苷酸接触。

解链曲线分析是可包括在循环曲线中的附加步骤。解链曲线分析基于DNA在称为解链温度(Tm)的特征温度下解链的事实，该解链温度被定义为一半DNA双链体分离成单链时的温度。DNA的解链温度主要取决于其核苷酸组成。因此，富含G和C核苷酸的DNA分子具有丰富的A和T核苷酸的DNA分子具有更高的Tm。通过检测信号丢失时的温度，可确定探针的解链温度。类似地，通过检测生成信号时的温度，可确定探针的退火温度。来自扩增产物的探针的解链温度可证实样品中存在或不存在NG。

在每个热循环仪运行中，也可循环对照样品。阳性对照样品可使用例如对照引物和对照探针扩增靶核酸对照模板(除了所描述的靶基因扩增产物之外)。阳性对照样品也可扩增例如含有靶核酸分子的质粒构建体。这种质粒对照可在内部扩增(例如，在样品内)或在与患者样品并行的单独样品运行中使用与用于检测预期靶标相同的引物和探针扩增。此类对照是扩增、杂交和/或FRET反应的成功或失败的指标。每个热循环仪运行还可包括例如缺乏靶模板DNA的阴性对照。阴性对照可测量污染。这确保了***和试剂不会产生假阳性信号。因此，对照反应可以容易地确定例如引物以序列特异性退火并启动延伸的能力，以及探针以序列特异性杂交并发生FRET的能力。

在一个实施方案中，所述方法包括避免污染的步骤。例如，在美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述了利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶促方法，以减少或消除一个热循环仪运行与下一个之间的污染。

可使用与FRET技术结合的常规PCR方法来实践所述方法。在一个实施方案中，使用

仪器。以下专利申请描述了如

技术中使用的实时PCR：WO 97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。

可使用PC工作站操作，并且可利用Windows NT操作***。当机器将毛细管按顺序定位在光学单元上时，获得来自样品的信号。软件可在每次测量后立即实时显示荧光信号。荧光采集时间为10-100毫秒(msec)。在每个循环步骤之后，可连续更新所有样品的荧光与循环数的定量显示。可存储所生成的数据以进行进一步分析。

作为FRET的替代方案，可使用双链DNA结合染料诸如荧光DNA结合染料(例如

Green或

Gold(分子探针))来检测扩增产物。在与双链核酸相互作用时，此类荧光DNA结合染料在用合适波长的光激发后发射荧光信号。还可使用双链DNA结合染料，诸如核酸嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时，通常进行解链曲线分析以证实扩增产物的存在。

应当理解，本公开的实施方案不受一种或多种市售仪器的配置的限制。

制品/试剂盒

本公开的实施方案还提供了用于检测NG的制品、组合物或试剂盒。制品可包括用于检测靶NG基因的引物和探针，以及合适的包装材料。组合物可包括用于扩增靶NG基因的引物。在某些实施方案中，组合物还可包含用于检测靶NG基因的探针。用于检测NG的代表性引物和探针能够与靶核酸分子杂交。另外，试剂盒还可包括DNA固定、杂交和检测所需的适当包装的试剂和材料，诸如固体支持物、缓冲液、酶和DNA标准品。本文公开了设计引物和探针的方法，并且提供了扩增靶核酸分子并与之杂交的引物和探针的代表性示例。

制品还可包括用于标记探针的一个或多个荧光部分，或者，另选地，与试剂盒一起提供的探针可被标记。例如，制品可包括用于标记探针的供体和/或受体荧光部分。上文提供了合适的FRET供体荧光部分和相应的受体荧光部分的示例。

制品还可包含包装说明书或包装标签，其上具有使用引物和探针来检测样品中的NG的说明。制品和组合物可另外包括用于实施本文所公开的方法的试剂(例如，缓冲液、聚合酶、辅因子或防止污染的试剂)。此类试剂可专用于本文所述的市售仪器中的一种。

本公开的实施方案将在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例

提供以下实施例、表和附图以帮助理解主题，该主题的真实范围在所附权利要求中阐述。应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可对所阐述的程序进行修改。

实施例1

对NG进行靶向选择是对公共序列数据库进行全面搜索以及对可能区分最近邻居脑膜炎奈瑟氏菌和乳糖奈瑟氏菌的NG靶标进行文献搜索的结果。所选择的NG靶标利用菌毛蛋白转化蛋白(Piv_NG)基因靶标，并且是每个基因组7个拷贝。Piv_NG区含有可影响探针杂交的序列变体，然而这些变体在序列数据库综述中不包含7个拷贝中的多于三个。

使用

4800***或

6800/8800***平台(Roche MolecularSystems，Inc.，Pleasanton，CA)进行NG的实时PCR检测。扩增试剂的最终浓度如下所示：

表II PCR扩增试剂

下表示出了用于PCR扩增反应的典型温度曲线：

表III PCR温度曲线

Pre-PCR程序包括初始变性以及在55℃、60℃和65℃下温育，以对RNA模板进行逆转录。在三种温度下温育同时具有以下有利效果：在较低温度下，轻微错配的靶序列(诸如生物体的遗传变体)也被转录，而在较高温度下，RNA二级结构的形成受到抑制，从而使转录更有效。将PCR循环分成两次测量，其中两次测量应用一步设置(结合退火和延伸)。55℃下的前5个循环允许通过预扩增轻微错配的靶序列来增加包容性，而第二次测量的45个循环通过使用58℃的退火/延伸温度提供了增加的特异性。

使用上述条件进行Piv_NG基因的扩增和检测。针对来自菌株#2949的基因组NG DNA(以每个PCR反应30,000、3,000和300、30和3个基因组当量浓度(ge/PCR)的浓度存在)使用SEQ ID NO：1-2的寡核苷酸引物和SEQ ID NO：3的寡核苷酸探针的实验结果在图1中示出。每个测定一式两份地进行，并且在NG菌株#2949的10倍稀释液之间显示出大致3.3个循环的信号差异。

实施例2

使用14个NG菌株来评估SEQ ID NO：1-3的引物/探针组合的包容性。用手动Qiagen试剂盒提取样品并通过nanodrop定量。在所有菌株中，在3.0e2个ge/PCR检测到NG(表IV)。该组中每个稀释水平的所得Ct值的范围比较宽泛，这可能是由于核酸定量的nanodrop读数不准确。

表IV：NG包容性数据Ct值

实施例3

对于NG排他性，测试了一组18株共生奈瑟氏菌种(表V)。通过手动Qiagen试剂盒纯化样品并通过nanodrop定量。在3.0e4个基因组拷贝/PCR没有观察到交叉反应性(数据未示出)。

表V：NG排他性组

菌株#	物种
		6305	浅黄奈瑟氏菌(Neisseria flavescens)
6318	脱氮奈瑟氏菌(N.denitrificans)
		10231	脑膜炎奈瑟氏菌血清群D(N.meningitidis ser D)
838	多糖奈瑟氏菌(N.polysaccharea)
		6339	深黄奈瑟氏菌(N.perflava)
836	黄奈瑟氏菌(N.flava)
		1927	干燥奈瑟氏菌(N.sicca)
6313	乳糖奈瑟氏菌(N.lactamica)
		6322	长奈瑟氏菌(N.elongata)
2631	微黄奈瑟氏菌(N.subflava)
		348	脑膜炎奈瑟氏菌血清群C(N.meningitidis ser C)
349	脑膜炎奈瑟氏菌血清群Y(N.meningitidis ser Y)
		6336	粘膜奈瑟氏菌(N.mucosa)
33926	猴奈瑟氏菌(N.macacae)
		577	样品*577*
839	干燥奈瑟氏菌(N.sicca)
		10230	魏氏奈瑟氏菌(N.weaveri)
6317	灰色奈瑟氏菌(N.cinerea)

虽然为了清楚和理解的目的已经相当详细地描述了上述发，但是本领域技术人员通过阅读本公开将清楚，在不脱离本发明的真实范围的情况下，可在形式和细节上进行各种改变。例如，可以各种组合使用上述所有技术和装置。本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文档全文以引用方式并入以用于所有目的，其程度如同每项单独的出版物、专利、专利申请和/或其他文档被单独地指示通过引用并入以用于所有目的。

非正式的序列表

SEQ ID NO 1：R6_1483F_TBBC正向引物

CGCAGCATACGCGC

SEQ ID NO 2：R6_1483R_TBB反向引物

ATGGCTTTGATGATTTGCGC

SEQ ID NO 3：R6_1483_P探针

TCATCACGCGGCAAAAGATGAAGAAGCGG

SEQ ID NO 4：PivNG基因序列(GenBank登录号U65994.1，残基3603-4577)

SEQ ID NO 5：NGDR9基因序列

Claims (17)

1.一种检测样品中的淋病奈瑟氏球菌(NG)的方法，所述方法包括：

进行扩增步骤，所述扩增步骤包括使所述样品与一组NG Piv_Ng基因引物接触以在所述样品中存在NG Piv_Ng核酸的情况下产生扩增产物；

-进行杂交步骤，所述杂交步骤包括使所述扩增产物与一种或多种可检测NG Piv_Ng基因探针接触；以及

-检测所述扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示所述样品中存在NG，并且其中所述扩增产物的不存在指示所述样品中不存在NG；

其中所述一组NG Piv_Ng基因引物组包含第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQID NO：1的第一寡核苷酸序列或其互补序列，所述第二引物包含SEQ ID NO：2的第二寡核苷酸序列或其互补序列；并且

其中所述一种或多种可检测NG Piv_Ng基因探针包含SEQ ID NO：3的第三寡核苷酸序列或其互补序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中：

所述杂交步骤包括使所述扩增产物与用供体荧光部分和相应的受体部分标记的所述可检测NG Piv_Ng基因探针接触；并且

所述检测步骤包括检测所述探针的所述供体荧光部分与所述受体部分之间荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在指示所述样品中存在或不存在NG。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述扩增步骤采用具有5′至3′核酸酶活性的聚合酶。

4.如权利要求2至3中任一项所述的方法，其中所述供体荧光部分和所述相应的受体部分在所述探针上彼此相距不超过8-20个核苷酸。

5.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述受体部分是猝灭剂。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自包含至少一个经修饰的核苷酸。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述至少一个经修饰的核苷酸选自N⁶-苄基-dA、N⁴-苄基-dC、N⁶-对叔丁基-苄基-dA和N4-对叔丁基-苄基-dC。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其还包括使所述样品与一组用于扩增和检测NGDR9基因序列的引物和探针接触的步骤。

9.一种用于检测淋病奈瑟氏球菌(NG)的核酸的试剂盒，其包括：

-第一引物，所述第一引物包含SEQ ID NO：1的第一寡核苷酸序列或其互补序列；

-第二引物，所述第二引物包含SEQ ID NO：2的第二寡核苷酸序列或其互补序列；以及

-荧光可检测地标记的探针，所述荧光可检测地标记的探针包含SEQ ID NO：3的第三寡核苷酸序列或其互补序列，所述可检测地标记的探针被配置为与由所述第一引物和所述第二引物生成的扩增子杂交。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其中第三可检测地标记的寡核苷酸序列包含供体荧光部分和相应的受体部分。

11.如权利要求10所述的试剂盒，其中所述受体部分是猝灭剂。

12.如权利要求9至11中任一项所述的试剂盒，其还包括三磷酸核苷、核酸聚合酶和所述核酸聚合酶的功能所需的缓冲液中的至少一种。

13.如权利要求9至12中任一项所述的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸、所述第二寡核苷酸和所述第三寡核苷酸中的至少一者包含至少一个经修饰的核苷酸。

14.如权利要求9至13中任一项所述的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸、所述第二寡核苷酸和所述第三寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸。

15.如权利要求9至14中任一项所述的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自包含至少一个经修饰的核苷酸。

16.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述至少一个经修饰的核苷酸选自N⁶-苄基-dA、N⁴-苄基-dC、N⁶-对叔丁基-苄基-dA和N⁴-对叔丁基-苄基-dC。

17.如权利要求9至16中任一项所述的试剂盒，其还包括一组用于扩增和检测NGDR9基因序列的引物和探针。

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