CN113790946A - 用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒 - Google Patents
用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113790946A CN113790946A CN202111343940.7A CN202111343940A CN113790946A CN 113790946 A CN113790946 A CN 113790946A CN 202111343940 A CN202111343940 A CN 202111343940A CN 113790946 A CN113790946 A CN 113790946A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ethanol
- solution
- tumor
- hematoxylin
- staining
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 76
- 238000010186 staining Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims description 29
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 261
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 142
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 76
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 claims abstract description 48
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 45
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 41
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 33
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims abstract description 21
- GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J potassium aluminium sulfate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims abstract description 20
- 229940103272 aluminum potassium sulfate Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims abstract description 18
- NALMPLUMOWIVJC-UHFFFAOYSA-N n,n,4-trimethylbenzeneamine oxide Chemical compound CC1=CC=C([N+](C)(C)[O-])C=C1 NALMPLUMOWIVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 229940032753 sodium iodate Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 235000015281 sodium iodate Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 239000011697 sodium iodate Substances 0.000 claims abstract description 15
- SEACYXSIPDVVMV-UHFFFAOYSA-L eosin Y Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C([O-])=C(Br)C=C21 SEACYXSIPDVVMV-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 10
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 87
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 80
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 19
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 14
- 238000012549 training Methods 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 239000008096 xylene Substances 0.000 claims description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 9
- 238000013527 convolutional neural network Methods 0.000 claims description 8
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 8
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 10
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 34
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 18
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 8
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 8
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 7
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 5
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- MCSXGCZMEPXKIW-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-4-[(4-methyl-2-nitrophenyl)diazenyl]-N-(3-nitrophenyl)naphthalene-2-carboxamide Chemical group Cc1ccc(N=Nc2c(O)c(cc3ccccc23)C(=O)Nc2cccc(c2)[N+]([O-])=O)c(c1)[N+]([O-])=O MCSXGCZMEPXKIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000981 basic dye Substances 0.000 description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000011496 digital image analysis Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000012736 patent blue V Nutrition 0.000 description 2
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004791 biological behavior Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010409 ironing Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
- G01N2001/302—Stain compositions
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒,包括苏木素染液、伊红染液和分化液,其中,每升苏木素染液含有以下组分:苏木素1.9~4.0 g,硫酸铝钾15~25 g,碘酸钠3.5~4.5 g,甘油180~220 mL,乙醇5~15 mL,其余为水;每升伊红染液中含有以下组分:曙红Y 7.5~12.5 g,乙醇900~980 mL,其余为水;每升分化液中含有以下组分:乙醇650~800 mL,HCl 0.35~0.55 g,其余为水。该配方的染色试剂具有着色力强、颜色鲜艳、对比鲜明、色彩均匀、可长期保存的特点,可满足数字病理扫描分析***的更高要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞间质染色试剂盒,尤其涉及一种用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒。
背景技术
肿瘤间质由癌症相关的成纤维细胞、内皮细胞、淀粉样细胞、周细胞、淋巴细胞和细胞外基质组成。在肿瘤的生长过程中,肿瘤微环境起到了重要的作用。成纤维细胞、内皮细胞、炎症细胞、周皮细胞及细胞外基质等肿瘤间质都对肿瘤的生物学行为(生长、浸润、转移等)起到了决定性的作用。
肿瘤间质比(tumor-stroma ratio,TSR)即肿瘤组织内肿瘤细胞与***分的比例,既往多项研究表明:TSR是乳腺癌、***及食管癌等多种恶性肿瘤患者预后的独立预测因素。
目前研究中对肿瘤间质比的评估主要是对术后病理切片进行染色,然后通过有经验的病理学家人工计算TSR值。其中苏木素-伊红(HE)染色由于易操作、低成本而成为常用的染色方法。其是依据组织或细胞的不同成分对碱性染料(苏木素)和酸性染料(伊红)的亲和力不同及染色性质不一样的原理进行染色的,由酸性物质组成的细胞核等被苏木素染成鲜明的蓝紫色,而含有碱性物质的细胞浆、肌纤维、胶原纤维等各种不同成分又呈现出深浅不同的红色。但是通过人工计算TSR值会使结果具有非常大的不确定性和不可重复性,目前多以10%为取值区间,而40%~60%范围内的TSR计算是评估的难点,采用数字化图像分析设备会大大地提高TSR评估的准确性。
现有的苏木素染色液通常是用Harris配方或Drill配方配制而成,但是Harris配方配制的染色液只有在刚配制完成时染色效果较好,放置时间长了容易产生沉淀并逐渐失去染色效果,Drill配方相对不易产生沉淀,但是在对颜色鲜艳度、对比度、准确度要求更高的数字化图像分析中效果不佳。
因此,设计专用于数字化图像分析设备的HE染色试剂盒以便使实验流程更方便、准确、快捷成为一种趋势。
发明内容
为实现上述目的,本发明提供了一种用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒,包括苏木素染液、伊红染液和分化液;其中,
每升苏木素染液含有以下组分:苏木素 1.9~4.0 g,硫酸铝钾 15~25 g,碘酸钠3.5~4.5 g,甘油180~220 mL,乙醇 5~15 mL,其余为水;
每升伊红染液中含有以下组分:曙红Y 7.5~12.5 g,乙醇 900~980 mL,其余为水;
每升分化液中含有以下组分:乙醇 650~800 mL,HCl 8~17 mmol,其余为水。
优选地,每升苏木素染液中苏木素的含量为2.2~3.6 g。
优选地,每升苏木素染液中硫酸铝钾的含量为18~22 g。
优选地,每升苏木素染液中碘酸钠的含量为3.8~4.2 g。
优选地,每升伊红染液中曙红Y的含量为8.0~12.0 g。
优选地,每升分化液中乙醇的含量为650~750 mL。
可选地,所述苏木素染液中还含有冰醋酸。
可选地,所述伊红染液中还含有冰醋酸。
进一步,本发明中的苏木素染液无需用棕色试剂瓶避光保存,在本发明的一种优选实施方式中,苏木素染液、伊红染液和分化液均用常规的白色或乳白色试剂瓶储存。
优选地,所述试剂盒中苏木素染液、伊红染液和分化液的储量均相等。
由于医院病理切片染色数量较大,因此本试剂盒在设计包装规格时既要考虑拿取方便,又要考虑尽可能地满足样本数量,病理科浸泡切片的染缸一般可同时用于5片病理切片,需要50 mL的试剂,即每份切片样本需要10 mL试剂,所以本试剂盒中的各试剂可采用对应10份、15份、20份、25份或30份病理切片的试剂量为一包装,相应地,各试剂瓶内所储的试剂量优选为110~150 mL、160~200 mL、210~250 mL、260~300 mL或310~350 mL。
优选地,本发明的试剂盒保存温度为10~30℃,保存有效期为6~24个月。
进一步,本发明的试剂盒还包括封固剂;优选地,所述封固剂为Eukit。
进一步,本发明的试剂盒还包括无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、二甲苯中的任意一种或多种;优选地,前述各试剂的储量为苏木素染液的两倍。
进一步,本发明的试剂盒还包括盖玻片和/或载玻片。
进一步,本发明所述试剂盒还包括使用说明书。
进一步,本发明提供了苏木素染液的配制方法,该方法包括步骤:
1)用无水乙醇溶解苏木素;
2)用水溶解硫酸铝钾;
3)将步骤1)获得的苏木素的乙醇溶液与步骤2)获得的硫酸铝钾的水溶液以及碘酸钠混合;
4)将甘油加入步骤2)获得的硫酸铝钾水溶液中或步骤3)获得的混合溶液中。
优选地,步骤2)可加热促进溶解,加热温度优选为80~90℃。
在本发明的一种实施方式中,步骤3)和4)是将碘酸钠加入步骤2)获得的硫酸铝钾的水溶液中,再往其中加入步骤1)获得的苏木素的乙醇溶液,最后加入甘油,然后混匀。
在本发明的另一种实施方式中,步骤3)和4)是将甘油加入步骤2)获得硫酸铝钾水溶液中,然后往其中加入步骤1)获得的苏木素的乙醇溶液,再混匀。
优选地,所述配制方法还包括在混合溶液中加入冰醋酸。
进一步,本发明提供了伊红染液的配制方法,所述伊红染液直接用乙醇溶液溶解曙红Y制得,所述乙醇溶液可以为98%乙醇、95%乙醇、92%乙醇、90%乙醇中的任意一种。
在另一些实施方式中,所述伊红染液由含有冰醋酸的水溶解后再加入乙醇或乙醇溶液,所述乙醇溶液可以为98%乙醇、95%乙醇、92%乙醇、90%乙醇中的任意一种。
进一步,本发明提供了分化液的配制方法,即按计算的量将浓盐酸滴入乙醇溶液中,所述乙醇溶液可以为80%乙醇、75%乙醇、70%乙醇、65%乙醇中的任意一种。
进一步,本发明还提供了所述试剂盒用于数字病理扫描分析***时的细胞间质染色方法,该方法包括步骤:
i)脱蜡:用二甲苯浸泡脱蜡,然后依次用无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、水浸泡洗涤;
ii)染色:依次用苏木素染液浸泡染色,用分化液浸泡分化,用流水冲洗,用80%乙醇浸泡,用伊红染液浸泡染色;
iii)脱水:依次用80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇浸泡脱水;
iv)透明:用二甲苯浸泡使其透明;
v)封固:用封固剂封固。
优选地,步骤i)中用二甲苯浸泡次数为两次以上,浸泡的时间优选为12~16分钟,更优选为13~15分钟。
优选地,步骤i)中依次用无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、水浸泡的时间为2~5分钟,更优选为2~3分钟。
优选地,步骤ii)中用苏木素染液浸泡染色的时间为10~18分钟,更优选为12~16分钟。
优选地,步骤ii)中用苏木素染液浸泡染色后,用流水冲洗1~2分钟后再用分化液分化。
优选地,步骤ii)中用分化液浸泡分化的时间为小于10秒,使切片褪色至淡蓝红色。
优选地,步骤ii)中用流水冲洗的时间为5~15分钟,使组织呈鲜蓝色或天蓝色。
优选地,步骤ii)中用80%乙醇浸泡的时间为小于10秒。
优选地,步骤ii)中用伊红染液浸泡染色的时间为0.5~2分钟。
优选地,步骤iii)中用80%乙醇浸泡脱水的时间为小于1分钟。
优选地,步骤iii)中用95%乙醇浸泡脱水的次数为两次以上,浸泡的时间为1~2分钟。
优选地,步骤iii)中用乙醇浸泡脱水的次数为两次以上,浸泡的时间为2~4分钟。
优选地,步骤iv)中用二甲苯浸泡透明的次数为两次以上,浸泡的时间为2~4分钟。
在本发明的描述中,乙醇溶液的百分比浓度均是指无水乙醇在乙醇溶液中的体积百分占比。
本发明采用苏木素-伊红(HE)对组织切片进行细胞间质染色,苏木素-伊红染色液主要依据组织或细胞的不同成分对碱性染料(苏木素)和酸性染料(伊红)的亲和力不同及染色性质不一样,因此细胞或组织切片经苏木素-伊红染色液染色后,主要由酸性物质组成的细胞核等被苏木素染成鲜明的蓝紫色,而含有碱性物质的细胞浆、肌纤维、胶原纤维等各种不同成分又呈现出深浅不同的红色。如肌肉纤维为深红色,红细胞为橙红色,钙为深蓝色,粘蛋白为灰蓝色。但上述的这些颜色差异非常细微,通过肉眼很难准确识别并定量,因此,在数字病理扫描分析***的帮助下可以实现肿瘤细胞间质的精确定量,并计算肿瘤组织中肿瘤细胞与***分的比例,可用于肿瘤预后评估和治疗药物筛选。
上述颜色名称只是举例说明颜色差异,并非绝对颜色,在实际情况中结果可能会有主观或客观上的误差,但这不影响通过色差结合形态来区分细胞核、细胞质、细胞间质各组分的技术原理。
进一步,本发明所述数字病理扫描分析***通过细胞间质与肿瘤细胞被染色后的色差以及形态学上的不同对细胞间质在肿瘤区域组织中的占比进行计算,最后通过肿瘤间质比的数值来评估肿瘤患者的预后以及筛选合适的治疗药物。
进一步,本发明提供了用所述试剂盒进行肿瘤间质比数字病理扫描分析的方法,包括步骤:
A)肿瘤切片苏木素-伊红染色;
B)切片数字病理扫描;
C)选取肿瘤区域;
D)图像处理和分析,计算得到肿瘤间质比。
优选地,步骤B)中所述切片数字病理扫描的倍率为40倍,分辨率为每像素0.15~0.30 µm。
在本发明的一些实施方式中,步骤C)中所述选取肿瘤区域为人工选取。在本发明的另一些实施方式中,该选取为由分析***自动选取。在本发明的又一些实施方式中,该选取为分析***自动选取结合人工辅助选取。
优选地,步骤C)选取的肿瘤区域应符合:所有边界处均存在肿瘤细胞,不选择不含肿瘤细胞的周围基质组织。
优选地,步骤D)中所述图像处理的过程包括:白平衡校正、强度标准化、颜色归一化、提取色彩通道、将苏木素染色的图像与苏木素-伊红染色的图像分开进行滤波和阈值处理、合并处理结果。
进一步,步骤D)即为肿瘤间质比分析步骤,它是通过数字病理扫描分析***中已建立的肿瘤间质比分析模型来实施的,所述肿瘤间质比分析模型的建立方法为:
a)选取图像中的肿瘤区域,然后对获得的肿瘤区域图像进行肿瘤与间质的标注,将标注后的图像组成训练集;
b)用训练集训练选定的卷积神经网络形成肿瘤间质比分析模型。
在本发明的一些实施方式中,步骤a)中所述肿瘤与间质的标注为人工标注;在本发明的另一些实施方式中,该标注为分析***自动标注;在本发明的又一些实施方式中,该标注为分析***自动标注结合人工辅助标注。其中,分析***自动标注也是由经训练的卷积神经网络形成的肿瘤间质比分析模型进行标注的。
在本发明的一个优选实施例中,先由经训练的卷积神经网络形成的模型对肿瘤区域进行自动标注,然后再由人工进行核对和校正,核对和校正后的经标注的肿瘤区域图像再重新加入训练集中对模型进行再训练,使之趋于完善。该方法也同样适用于前述选取肿瘤区域的分析***自动选取。
进一步,所述肿瘤间质比是指所选取的肿瘤区域中的间质成分所占的比例。
优选地,计算得到的肿瘤间质比与预后评估之间的关系为:间质比小于或等于50%的为低间质比,大于50%的为高间质比,高间质比为预后较差。
本发明的用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒采用了苏木素-伊红染色体系对细胞间质进行对比染色,由于数字病理扫描分析***对染色的准确性、对比度和色彩均匀度都有更高的要求,用普通配方的染色液往往达不到理想的效果,根据本发明的配方制得的苏木素染液、伊红染液、分化液具有着色力强、颜色鲜艳、对比鲜明的特点,且其中的苏木素染液相比于传统苏木素染液具有更稳定、不易结晶、保存时间更长的优点。传统的苏木素-伊红染液的染色效果受温度影响较大,而本发明的染色液在10~30℃的温度范围内效果稳定,且几乎没有色差。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是染色后的切片组织图像,其中细胞核被染为蓝色或黑色,细胞质被染为粉红色或紫粉色,肌肉纤维被染为深红色,钙被染为深蓝色,粘蛋白被染为灰蓝色;
图2是用低间质比样本所展示的分析过程中的三张图像,A为分析前的肿瘤组织区域染色图像,B为分析过程中肿瘤组织区域的处理图像,C为分析后肿瘤组织区域的结果图像;
图3是用高间质比样本所展示的分析过程中的三张图像,A为分析前的肿瘤组织区域染色图像,B为分析过程中肿瘤组织区域的处理图像,C为分析后肿瘤组织区域的结果图像;
图4是数字病理扫描分析***分析方法的原理流程图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明作进一步地说明,应理解这些实施例仅作为例证的目的,不用于限制本发明的保护范围。
实施例1
用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒,包括苏木素染液、伊红染液和分化液,其中,每升苏木素染液含有:苏木素 1.9 g、硫酸铝钾 18 g、碘酸钠 3.5 g、甘油200 mL、乙醇 5 mL,其余为水;每升伊红染液中含有:曙红Y 7.5 g、乙醇 900 mL,其余为水;每升分化液中含有以下组分:乙醇 650 mL、HCl 8 mmol,其余为水。本试剂盒在10℃~30℃保存,有效期18个月。
苏木素染液的配制方法为:
1)配制苏木素醇溶液:用5 mL无水乙醇溶解1.9 g苏木素;
2)配制混合水溶液:用蒸馏水充分溶解18 g硫酸铝钾,然后加入200 mL甘油、3.5g碘酸钠;
3)将苏木素醇溶液加入混合水溶液中,然后加水至1000 mL,振荡混匀,即得苏木素染液。
伊红染液的配制方法为:
用90%乙醇1000 mL直接溶解7.5 g的曙红Y制得伊红染液。
分化液的配制方法为:
将0.67 mL浓盐酸(浓度为12 M)滴入1000 mL 65%乙醇中。
实施例2
用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒,包括苏木素染液、伊红染液和分化液,其中,每升苏木素染液含有:苏木素 4.0 g、硫酸铝钾 25 g、碘酸钠 4.5 g、甘油220 mL、乙醇 15 mL,其余为水;每升伊红染液中含有:曙红Y 12.5 g、乙醇 950 mL,其余为水;每升分化液中含有以下组分:乙醇 700 mL、HCl 17 mmol,其余为水。本试剂盒在10℃~30℃保存,有效期18个月。
苏木素染液的配制方法为:
1)配制苏木素醇溶液:用15 mL无水乙醇溶解4.0 g苏木素;
2)配制混合水溶液:用蒸馏水充分溶解25 g硫酸铝钾,可适当加热帮助溶解,加热的温度在80~90℃,然后加入4.5 g碘酸钠,混匀;
3)将苏木素醇溶液加入混合水溶液中,然后加入220 mL甘油,加水至1000 mL,振荡混匀,即得苏木素染液。
伊红染液的配制方法为:
用95%乙醇1000 mL直接溶解12.5 g的曙红Y制得伊红染液。
分化液的配制方法为:
将1.42 mL浓盐酸(浓度为12 M)滴入1000 mL 70%乙醇中。
实施例3
用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒,包括苏木素染液、伊红染液和分化液,其中,每升苏木素染液含有:苏木素 2.2 g、硫酸铝钾 15 g、碘酸钠 3.8 g、甘油180 mL、乙醇 10 mL,其余为水;每升伊红染液中含有:曙红Y 8.0 g、乙醇 980 mL,其余为水;每升分化液中含有以下组分:乙醇 750 mL、HCl 10 mmol,其余为水。本试剂盒在10℃~30℃保存,有效期18个月。
苏木素染液的配制方法为:
1)配制苏木素醇溶液:用5 mL无水乙醇溶解1.1 g苏木素;
2)配制混合水溶液:用蒸馏水充分溶解7.5 g硫酸铝钾,然后加入90 mL甘油、1.9g碘酸钠;
3)将苏木素醇溶液加入混合水溶液中,加入一滴冰醋酸,然后加水至500 mL,振荡混匀,即得苏木素染液。
伊红染液的配制方法为:
用98%乙醇500 mL直接溶解4.0 g的曙红Y制得伊红染液,加入两滴冰醋酸。
分化液的配制方法为:
将0.42 mL浓盐酸(浓度为12 M)滴入500 mL 75%乙醇中。
实施例4
用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒,包括苏木素染液、伊红染液和分化液,其中,每升苏木素染液含有:苏木素 3.6 g、硫酸铝钾 22 g、碘酸钠 4.2 g、甘油200 mL、乙醇 12 mL,其余为水;每升伊红染液中含有:曙红Y 12.0 g、乙醇 980 mL,其余为水;每升分化液中含有以下组分:乙醇 700 mL、HCl 14 mmol,其余为水。本试剂盒在10℃~30℃保存,有效期18个月。
苏木素染液的配制方法为:
1)配制苏木素醇溶液:用6 mL无水乙醇溶解1.8 g苏木素;
2)配制混合水溶液:用蒸馏水充分溶解11 g硫酸铝钾,可适当加热帮助溶解,加热的温度在80~90℃,然后加入2.1 g碘酸钠,混匀;
3)将苏木素醇溶液加入混合水溶液中,然后加入100 mL甘油和一滴冰醋酸,加水至500 mL,振荡混匀,即得苏木素染液。
伊红染液的配制方法为:
用98%乙醇500 mL直接溶解6.0 g的曙红Y制得伊红染液,加入一滴冰醋酸。
分化液的配制方法为:
将0.58 mL浓盐酸(浓度为12 M)滴入500 mL 70%乙醇中。
实施例5 石蜡切片的制作
1.1 将手术取下的肿瘤组织块浸于固定液中使组织、细胞的蛋白质变性凝固,以防止细胞死后的自溶或细菌的分解,从而保持细胞本来的形态结构。
1.2 在由低浓度到高浓度的酒精中浸泡进行脱水,逐渐脱去组织块中的水份,再将组织块置于二甲苯中透明。
1.3 将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中,放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋:将已浸透石蜡的组织块放入已溶化的石蜡中,冷却凝固成块。
1.4 将包埋好的蜡块固定于切片机上,切成薄片,厚度为4~6 μm,放到热水中烫平,再贴到载玻片上,放入恒温箱中烘干或在加热装置上烤干。
实施例6 细胞间质苏木素-伊红染色过程及结果
使用实施例1-4中配制的用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒,分别于10℃、25℃、30℃温度下,对连续肿瘤病理切片进行染色,其步骤如下所述。
一、脱蜡
1.1 烘干或烤完的切片依次放入二甲苯Ⅰ(脱蜡1缸)、二甲苯Ⅱ(脱蜡2缸)中脱蜡15分钟。脱蜡时间长短取决于石蜡是不是彻底溶解,气温低可延长时间,气温高可适当缩短时间。
1.2 依次放入无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇中各2分钟。
1.3 放入水中2~3分钟,洗去乙醇。
二、染色
2.1 放入苏木素中浸染15分钟,流水冲洗1~2分钟。
2.2 在分化液中分化5秒,使切片褪色至淡蓝红色。分化的作用是使细胞浆蓝色脱去,而细胞核更加清晰、鲜丽。分化不足时,胞浆带蓝,胞核过染;分化过度时,胞核太淡,难以辨认,可再退回苏木素染液,延长一定时间。
2.3 流水冲洗10分钟,使组织呈鲜蓝色或天蓝色(蓝化)。
2.4 把载玻片先放入80%乙醇中浸泡5秒钟,再在伊红溶液中浸染1分钟,无需水洗。
三、脱水
3.1 80%乙醇中脱水30秒,如在乙醇中褪色很快时,可返回伊红液中复染。
3.2 95%乙醇I、II中脱水,分别为1分钟、2分钟。
3.3 无水乙醇 I、无水乙醇 II 各2分钟。
四、透明
4.1 二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中透明各2分钟。
五、封固
5.1 用Eukit封固。
六、扫描分析
将染色后的组织载玻片置于数字病理扫描分析***显微镜下,用40倍的倍率进行扫描,分辨率为每像素0.23 µm;由病理学家选取肿瘤区域,选取所有边界处均存在肿瘤细胞的区域,不选择不含肿瘤细胞的周围基质组织;然后由分析***进行图像处理、间质比分析,计算得到肿瘤间质比。
七、结果
图1所示为染色后的切片组织图像,其中细胞核被染为蓝色或黑色,细胞质被染为粉红色或紫粉色,肌肉纤维被染为深红色,钙被染为深蓝色,粘蛋白被染为灰蓝色。
图2和图3所示为间质比分析过程中的三张图像,A为分析前的肿瘤组织区域染色图像,B为分析过程中肿瘤组织区域的处理图像,C为分析后肿瘤组织区域的结果图像。A图像中可见前述具有细微颜色差别的各种组织成分,B图像是经过分析软件处理后呈现的分类图,其中深灰色(原红色)为肿瘤细胞,浅灰色(原绿色)为间质,黑色(原蓝色)为空白,C是分析完成后将间质的颜色变浅使其与肿瘤细胞形成较大色差后的可视图。最后根据上面划分出来的肿瘤与间质,由软件自动计算肿瘤间质比,从图2中可以看出该图像为低间质比图像,其间质比数值为18%,从图3中可以看出该图像为高间质比图像,其间质比数值为65%。
用实施例1-4的试剂盒分别在10℃、25℃和30℃对同一样本的连续切片进行染色,然后用数字病理扫描分析***进行间质比分析,得到的结果为:同一试剂盒在三个温度下,以及不同试剂盒在同一温度下,计算得到的间质比数值均相同(间质占所选肿瘤区域面积的比值保留两位小数),可见本发明试剂盒在10~30℃的范围内结果稳定。
实施例7 数字病理扫描分析***的分析过程
本实施例所述的扫描分析方法的原理流程如图4所示,其包括步骤:肿瘤切片苏木素-伊红染色;切片数字病理扫描;选取肿瘤区域;图像处理和分析,计算得到肿瘤间质比。
其中,选取肿瘤区域由病理学家用软件在扫描的图像中完成,选取所有边界处均存在肿瘤细胞的区域,不选择不含肿瘤细胞的周围基质组织。在某些情况下也可由分析***自动完成,该分析***在建立时即可对选定的卷积神经网络进行选取肿瘤区域的训练。
其中,图像处理和分析由已建立的肿瘤间质比分析模型来完成,该模型的建立方法为:选取图像中的肿瘤区域,然后对获得的肿瘤区域图像进行肿瘤与间质的标注,将标注后的图像组成训练集;用训练集训练选定的卷积神经网络形成肿瘤间质比分析模型。在模型建立的初始阶段,由病理学家对肿瘤区域进行选取以及肿瘤与间质的标注,将标注后的图像组成训练集来训练选定的卷积神经网络,当初步的卷积神经网络已训练完成(如训练集为50张图像),则用初步完成训练的模型对另外的图像进行标注(或可包括选取),然后再由病理学家进行核对和校正,之后该图像也加入训练集中对初步模型进行再训练(如增加20张图像,训练集变为70张图像),不断地重复这个过程,使模型趋于完善。最后获得成熟的肿瘤间质比分析模型。
计算得到的肿瘤间质比与预后评估之间的关系为:间质比小于或等于50%的为低间质比,大于50%的为高间质比,高间质比为预后较差。计算得到的肿瘤间质比数值与原有的人工计算结果相比误差明显缩小,准确度也更高,速度更是大幅提高。对于每天有数以百计病理切片待诊断的医院病理科来说大大提高了工作效率。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒,其特征在于,包括苏木素染液、伊红染液和分化液;其中,
每升苏木素染液含有以下组分:苏木素 1.9~4.0 g,硫酸铝钾 15~25 g,碘酸钠 3.5~4.5 g,甘油180~220 mL,乙醇 5~15 mL,其余为水;
每升伊红染液中含有以下组分:曙红Y 7.5~12.5 g,乙醇 900~980 mL,其余为水;
每升分化液中含有以下组分:乙醇 650~800 mL,HCl 8~17 mmol,其余为水。
2.如权利要求1所述的用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒,其特征在于,所述试剂盒保存温度为10~30℃,保存有效期为6~24个月。
3.如权利要求1所述的用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒,其特征在于,还包括封固剂。
4.如权利要求1所述的用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒,其特征在于,还包括无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、二甲苯中的任意一种或多种。
5.如权利要求1所述的用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒,其特征在于,所述苏木素染液的配制方法包括步骤:
1)用无水乙醇溶解苏木素;
2)用水溶解硫酸铝钾;
3)将步骤1)获得的苏木素的乙醇溶液与步骤2)获得的硫酸铝钾的水溶液以及碘酸钠混合;
4)将甘油加入步骤2)获得的硫酸铝钾水溶液中或步骤3)获得的混合溶液中。
6.如权利要求1所述的用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒,其特征在于,所述伊红染液直接用乙醇溶液溶解曙红Y制得。
7.如权利要求1所述的用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒,其特征在于,所述分化液由按计算的量将浓盐酸滴入乙醇溶液中制得。
8.用权利要求1-7中任一项所述的染色试剂盒对用于数字病理扫描分析***的病理切片进行细胞间质染色的方法,其特征在于,包括步骤:
i)脱蜡:用二甲苯浸泡脱蜡,然后依次用无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、水浸泡洗涤;
ii)染色:依次用苏木素染液浸泡染色,用分化液浸泡分化,用流水冲洗,用80%乙醇浸泡,用伊红染液浸泡染色;
iii)脱水:依次用80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇浸泡脱水;
iv)透明:用二甲苯浸泡使其透明;
v)封固:用封固剂封固。
9.用权利要求1-7任一项所述的染色试剂盒对肿瘤切片进行肿瘤间质比数字病理扫描分析的方法,其特征在于,包括步骤:
A)肿瘤切片苏木素-伊红染色;
B)切片数字病理扫描;
C)选取肿瘤区域;
D)图像处理和分析,计算得到肿瘤间质比。
10.如权利要求9所述的肿瘤间质比数字病理扫描分析的方法,其特征在于,通过数字病理扫描分析***中已建立的肿瘤间质比分析模型来进行分析,所述肿瘤间质比分析模型的建立方法为:
a)选取图像中的肿瘤区域,然后对获得的肿瘤区域图像进行肿瘤与间质的标注,将标注后的图像组成训练集;
b)用训练集训练选定的卷积神经网络形成肿瘤间质比分析模型。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111343940.7A CN113790946A (zh) | 2021-11-14 | 2021-11-14 | 用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111343940.7A CN113790946A (zh) | 2021-11-14 | 2021-11-14 | 用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113790946A true CN113790946A (zh) | 2021-12-14 |
Family
ID=78955243
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111343940.7A Pending CN113790946A (zh) | 2021-11-14 | 2021-11-14 | 用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113790946A (zh) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110621974A (zh) * | 2017-05-10 | 2019-12-27 | 文塔纳医疗***公司 | 利用pH调节的稳定的两部分苏木精溶液 |
CN111507992A (zh) * | 2020-04-21 | 2020-08-07 | 南通大学 | 一种基于内外应力的低分化腺体分割方法 |
CN111815624A (zh) * | 2020-07-28 | 2020-10-23 | 复旦大学附属华山医院 | 基于图像处理算法的肿瘤间质比判定方法及*** |
CN111863202A (zh) * | 2020-07-16 | 2020-10-30 | 梅傲科技(广州)有限公司 | 一种数字病理图像扫描分析*** |
CN111967465A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-11-20 | 广州金域医学检验中心有限公司 | 肿瘤细胞含量评估方法、***、计算机设备及存储介质 |
CN113496768A (zh) * | 2020-03-20 | 2021-10-12 | 梅傲科技(广州)有限公司 | 基于病理组织的二联综合肿瘤分析***和应用 |
-
2021
- 2021-11-14 CN CN202111343940.7A patent/CN113790946A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110621974A (zh) * | 2017-05-10 | 2019-12-27 | 文塔纳医疗***公司 | 利用pH调节的稳定的两部分苏木精溶液 |
CN113496768A (zh) * | 2020-03-20 | 2021-10-12 | 梅傲科技(广州)有限公司 | 基于病理组织的二联综合肿瘤分析***和应用 |
CN111507992A (zh) * | 2020-04-21 | 2020-08-07 | 南通大学 | 一种基于内外应力的低分化腺体分割方法 |
CN111967465A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-11-20 | 广州金域医学检验中心有限公司 | 肿瘤细胞含量评估方法、***、计算机设备及存储介质 |
CN111863202A (zh) * | 2020-07-16 | 2020-10-30 | 梅傲科技(广州)有限公司 | 一种数字病理图像扫描分析*** |
CN111815624A (zh) * | 2020-07-28 | 2020-10-23 | 复旦大学附属华山医院 | 基于图像处理算法的肿瘤间质比判定方法及*** |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
单宏杰 等: "肿瘤间质比在乳腺癌预后评估中的价值研究", 《蚌埠医学院学报》 * |
曹谊林: "《组织工程学理论与实践》", 31 December 2004, 上海科学技术出版社 * |
蔡浩 等: "肿瘤间质比在恶性肿瘤预后评估中的应用研究进展", 《山东医药》 * |
蔡贤磊 等: "肿瘤间质比对肿瘤预后的评价作用", 《国际肿瘤学杂志》 * |
酸菜: "ImageJ高效图片分析技巧", 《HTTPS://ZHUANLAN.ZHIHU.COM/P/142112664》 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112132843B (zh) | 基于无监督深度学习的苏木精-伊红染色病理图像分割方法 | |
US9041792B2 (en) | Generation of a multicolour image of an unstained biological specimen | |
JP5822425B2 (ja) | 顕微鏡像用に試料を染色する方法 | |
CN107064019B (zh) | 用于无染色病理切片高光谱图像采集及分割的装置及方法 | |
CN106645153A (zh) | 一种细胞病理切片快速染色检测方法 | |
CN103076288B (zh) | 一种基于计算机视觉的鱼肉自动分级装置和方法 | |
CN106644656A (zh) | 苏木素‑伊红一步染色法 | |
CN112014192A (zh) | 一种用于黔北麻羊卵巢组织石蜡切片的he染色方法 | |
CN112326961A (zh) | 一种非小细胞肺癌中pd-l1阳性肿瘤细胞比例的分析方法和存储设备 | |
CN109374373A (zh) | 一种苹果果实石蜡切片快速制作方法 | |
CN106706643B (zh) | 一种肝癌对比切片检测方法 | |
WO2023035728A1 (zh) | 一种基于免疫组化生成训练数据的方法和存储设备 | |
CN108918518B (zh) | 普通光学、荧光和扫描电子显微镜对同一细胞形态的观察方法 | |
CN114937032A (zh) | 基于染色分离的病理切片颜色相关质量评估方法 | |
CN113790946A (zh) | 用于数字病理扫描分析***的细胞间质染色试剂盒 | |
CN105131647A (zh) | 一种用于生物he染色的染料组合物、应用及其使用方法 | |
CN114034691A (zh) | 陈皮的鉴别分级方法 | |
CN102203657B (zh) | 制备经过处理的虚拟分析图像的步骤 | |
CN108332989A (zh) | 一种高淀粉含量谷物籽粒剖析及内部结构观察的方法 | |
WO2016123868A1 (zh) | 液态滴加式或涂抹式病理质控品的制备方法及其应用 | |
CN112362594B (zh) | 一种基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法 | |
CN105606824B (zh) | 晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞Her‑2基因的检测方法 | |
CN109856386B (zh) | 一种免疫组化图像处理方法 | |
CN110553889A (zh) | 自动染色机He染色工艺 | |
CN107084984A (zh) | 一种肌纤维细胞参数的图像测量方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |