CN113789366B - CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器，包括包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶和sgRNA‑Cas蛋白复合体；包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶中的DNA水凝胶包含特定的核苷酸序列的DNA链；sgRNA‑Cas蛋白复合体由Cas蛋白和与其对应sgRNA复合组成，sgRNA的部分核苷酸序列与待测目标物的靶标DNA的核苷酸序列互补。该DNA水凝胶比色传感器，引入包埋了金属有机框架材料的DNA水凝胶作为信号放大，无需对待测目标进行扩增或富集，灵敏度高，准确度高。还公开了该DNA水凝胶比色传感器的制备方法和应用，操作简单，耗时短，成本低廉，灵敏度高，检测结果准确。

Description

CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器及其对非核酸目标物——微囊藻毒素-LR的检测。
背景技术
CRISPR/Cas***由簇状规则间隔短回文重复序列（Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）和CRISPR关联蛋白（CRISPRassociated，Cas）组成，是一种古生菌和细菌的适应性免疫***。由于其因其独特的精准识别能力，CRISPR/Cas***不仅用于基因组编辑，还在被应用于生物传感领域。尽管基于CRISPR/Cas***的生物传感策略已经取得了很好的进展和效果，如DETECTR和SHERLOCK，但是目前已建立的一系列基于CRISPR/Cas***传感器存在以下局限性：（1）大多是将核酸扩增技术与CRISPR/Cas***进行整合，这极大的增加了操作的专业性要求以及检测成本；（2）尽管基于CRISPR/Cas***传感器逐渐被用于非核酸目标物检测，但CRISPR/Cas传感器在超灵敏检测生物毒素、蛋白、生物代谢物等非核酸目标物的潜力还有待发掘。
微囊藻毒素(MCs)是由铜绿微囊藻、水华藻、鱼腥藻和念珠藻等蓝藻产生的次级代谢物，在蓝藻生长的各个阶段均可生成，是淡水中分布最广泛的蓝藻毒素之一；其中微囊藻毒素-LR（MC-LR）出现频率最高，含量最为丰富（约占天然水体中MCs总浓度的 99.8%），毒性最强。MC-LR能够强烈抑制蛋白磷酸酶的活性，影响miRNA的表达，损害肾脏、皮肤和生殖***。研究表明其对实验室小白鼠的半数致死剂量为50 μg/kg。世界卫生组织规定生活饮用水卫生标准MC-LR浓度限值为1.0 μg/L，我国的《地表水环境质量标准》及《生活饮用水卫生标准》也沿用了此标准。因此，发展MC-LR的准确检测技术对维护地表水环境及保护人类健康具有重要意义。传统的MC-LR实验室检测方法包括高效液相色谱、酶联免疫吸附法和液相色谱串联质谱等。尽管这些方法具有敏感性和准确性，但大多数方法需要复杂的操作程序和复杂的仪器。最近开发的以颜色变化作为信号输出的比色传感由于其简单、便携、易操作的优点在MC-LR检测应用研究中引起了国内外学者的高度重视。但比色传感器通常灵敏度低，检出限高，无法实现对低浓度MC-LR的检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种灵敏、准确的CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器及其制备方法，以及该CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器在检测非核酸目标物中的应用，如MC-LR的检测。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器，包括包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶和sgRNA-Cas蛋白复合体；
所述包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶由金属有机框架材料与DNA水凝胶复合组成，且所述DNA水凝胶包含以下核苷酸序列的DNA链：
oligo X：5’-Acrydite-TTTTTTTTTTCACAGATGAGTATC-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；
oligo Y ：5’-Acrydite-TTTTTTTTTCTTGTCTCCCGAGAT-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示
Linker：5’-GATACTCATCTGTGATTTTTTTTTTTTATCTCGGGAGACAAG-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述sgRNA-Cas蛋白复合体由Cas蛋白与其对应的sgRNA复合组成，所述sgRNA的部分核苷酸序列与待测目标物本身含有的靶标DNA或用于识别适配待测目标物的功能性核酸链的核苷酸序列互补。所述靶标DNA的核苷酸序列为任一单链DNA序列，其中37-50 个碱基与sgRNA的核苷酸序列互补。
上述的CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器，优选的，在包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶中，所含金属有机框架材料的终浓度为1-5 mg/mL，所含DNA水凝胶的用量为10-20 μL；在sgRNA-Cas蛋白复合体溶液中，所含Cas蛋白的终浓度为0.01-0.05 mg/mL，所含sgRNA的终浓度为0.1-0.5 μmol/L。
优选的，所述金属有机框架材料包括Cu-TCPP(Fe)、Zn-TCPP(Fe)、Co-TCPP(Fe)、Cd-TCPP、Zn-TCPP、Cu-TCPP、UiO-66和PCN-222中的任意一种或多种，所述Cas蛋白为Cas14a蛋白或Cas12a蛋白；所述用于识别适配待测目标物的功能性核酸链为适配体，如MC-LR适配体。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器的制备方法，包括如下步骤：
（1）将修饰有丙烯酰胺基的DNA链oligo X和oligo Y分别加入丙烯酰胺，混合后真空排气，再加入过硫酸铵和四甲基乙二胺，真空反应后，分别得到高分子的聚丙烯酰胺Ps-X和Ps-Y；将所述高分子的聚丙烯酰胺Ps-X和Ps-Y与Linker、金属有机框架材料混合后，加热反应，冷却后形成凝胶；
（2）制备sgRNA-Cas蛋白复合体。
上述的制备方法，优选的，所述步骤（1）中，所述oligo X和oligo Y的终浓度各为30-50μmol/L，所述丙烯酰胺的终浓度为1.5-3 wt%，所述真空排气10-15 min，所述过硫酸铵的终浓度为0.05-1.4 wt%，所述四甲基乙二胺的终浓度为0.5-2.8 wt%，所述真空反应的条件为：37 ℃真空反应10-30 min；
所述Ps-X、Ps-Y、Linker和金属有机框架材料的体积比为2-4:2-4:1-3:1-3，所述Linker的浓度为30-50 μmol/L，所述金属有机框架材料的浓度为1-5 mg/mL，加热反应的条件为：65 ℃反应5-15 min，冷却至20-30 ℃保持15-30 min后即形成凝胶。
优选的，所述步骤（2）的具体操作过程如下：在1×Cleavage Buffer中加入终浓度为0.01-0.05 mg/mL的Cas蛋白溶液和终浓度为0.1-0.5 μmol/L的sgRNA溶液，混匀后于37℃静置孵育10-15 min，即得到sgRNA-Cas蛋白复合体溶液。
基于一个总的发明构思，本发明还提供上述CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器在检测非核酸目标物——MC-LR中的应用。
上述的应用，优选的，所述应用的方法包括如下步骤：将所述包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶、sgRNA-Cas蛋白复合体、cDNA-MC-LR适配体复合体以及待测样品溶液混合，加入H2O2和TMB后在室温下静置反应，使用紫外可见分光光度计测定反应体系的吸收光谱，完成对MC-LR的检测；
所述cDNA-MC-LR适配体复合体中，MC-LR适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，互补链cDNA的部分核苷酸序列与所述MC-LR适配体上含有的任意一段核苷酸序列存在15-25个碱基互补，互补链cDNA的另一部分核苷酸序列与所述sgRNA的核苷酸序列存在37-50个碱基互补。
更优选的，所述cDNA-MC-LR适配体复合体具体操作过程如下：在1×BindingBuffer中加入终浓度为80-120 nmol/L的MC-LR适配体溶液和终浓度为80-120 nmol/L的互补链cDNA溶液，95 ℃变性5 min后，于25 ℃反应20-40 min，即得到cDNA-MC-LR适配体复合体溶液。
更优选的，所述互补链cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述sgRNA-Cas蛋白复合体中，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，Cas蛋白为Cas14a蛋白。
更优选的，所述包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶、sgRNA-Cas蛋白复合体、cDNA-MC-LR适配体复合体和待测样品溶液的体积比为10-20：3-5：3-5：3-5；所述振荡孵育的条件为：30-40 ℃振荡孵育2-6 h；所述H2O2的浓度为15-30 mmol/L；所述TMB的浓度为5-15 mmol/L；所述静置反应的时间为5~20 min，使用紫外可见分光光度计测定反应体系在450~750 nm范围内的吸收光谱。
本发明的技术原理如下（见图1所示）：
首先，设计两条5’端修饰了丙烯酰胺基的DNA序列（oligo X和oligo Y），经聚合反应形成Ps-X和Ps-Y作为合成DNA水凝胶的骨架。根据碱基互补配对原则，设计Linker的5’和3’端分别与oligo X和oligo Y部分互补，因此Linker可以连接Ps-X和Ps-Y的形成DNA水凝胶；将具有过氧化物酶活性的金属有机框架材料（如Cu-TCPP(Fe)）通过物理包埋的方法包埋在DNA水凝胶内部，最终合成包埋了金属有机框架材料的DNA水凝胶。
当有靶标DNA 链存在时，靶标DNA链与sgRNA-Cas蛋白复合体结合从而激活Cas蛋白切割活性，进而切割DNA水凝胶中DNA链的单链部分，使水凝胶结构被破坏释放出包埋在其内部的金属有机框架材料（如Cu-TCPP(Fe)），释放出来的金属有机框架材料可以催化H2O2氧化TMB使体系由无色变为蓝色。当靶标DNA 越多，颜色越蓝，通过紫外可见分光光度计可对靶标DNA进行定量检测。
此外，当本发明的CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器用于检测MC-LR时，由于MC-LR与适配体之间具有更高的亲和力，可以利用适配体/MC-LR/cDNA之间的竞争反应。当有MC-LR存在时，MC-LR将cDNA从适配体上竞争下来；设计MC-LR适配体的cDNA，将其作为激活Cas蛋白切割活性的激活分子，激活Cas蛋白的切割水凝胶中单链DNA活性，从而破坏水凝胶结构释放金属有机框架材料，进而催化H2O2氧化TMB，通过颜色变化和吸光度实现对MC-LR的测定。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器，设计了5’端修饰了丙烯酰胺基的DNA序列（oligo X和oligo Y），根据碱基互补配对原则形成DNA水凝胶，再将具有过氧化物酶活性的金属有机框架材料包埋在DNA水凝胶内部，实现检测信号放大，无需对待测目标进行扩增或富集，灵敏度高，准确度高。
2、本发明的CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器，以颜色变化作为信号输出，所需仪器设备简单，检测成本低。
3、本发明的CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器，既能够定量核酸目标物；在引入适配体等功能性核酸链后，又能够检测非核酸目标物，如MC-LR。
4、本发明的制备方法，操作简单，成本低廉，绿色环保。
5、本发明的应用，操作过程简单，耗时短，成本低廉，灵敏度高，检测结果准确。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本检测方法的原理设计图（a.核酸目标物识别原理；b.非核酸目标物识别原理；c.切割与显色过程）；
图2是Cu-TCPP(Fe)的透射电镜图(A-C)；
图3是Cu-TCPP(Fe)的元素分布图(D-I)；
图4是Cu-TCPP(Fe)催化H2O2使TMB显色的能力（A是各实验组的显色结果，B是各实验组的吸光度曲线）；
图5是包埋Cu-TCPP(Fe)的DNA水凝胶成品图(A)、CRISPR/Cas切割DNA水凝胶后体系的颜色变化(B)与吸收光谱图(C)；
图6是CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器检测MC-LR原理验证（A是各实验组的显色结果，B是各实验组的吸光度曲线）。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器，包括包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶、sgRNA-Cas蛋白复合体及其靶标DNA，其中：
包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶由Cu-TCPP(Fe)与DNA水凝胶复合组成，DNA水凝胶包含SEQ ID NO：1-3所示核苷酸序列的DNA链；
sgRNA-Cas蛋白复合体由Cas14a蛋白和sgRNA复合组成，sgRNA的核苷酸序列如SEQID NO：4所示。
该CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器的制备方法，包括如下步骤：
1、Cu-TCPP(Fe)的制备（可参考文献Ultrathin 2D Metal-Organic FrameworkNanosheets），具体步骤如下：
将2.4 mg Cu(NO3)2·3H2O（0.01 mmol）、10 μL三氟乙酸（1.0 M）和10.0 mg聚乙烯吡咯烷酮溶于12 mL DMF和乙醇（V:V=3:1）的混合物中。将4.4 mg TCPP(Fe)（0.005 mmol）溶解于4 mL DMF和乙醇（V:V=3:1）混合溶液在搅拌状态下滴加到上述混合溶液中。然后，将溶液超声处理10 min，置于反应釜中加热至80 ℃并保持15 h。所得深棕色产品用乙醇洗涤两次，并在8000 rpm下离心10 min收集。最后，将所得Cu-TCPP(Fe)置于60 ℃下干燥，干燥后用乙醇分散。得到的Cu-TCPP(Fe)的透射电镜图见图2，元素分布图见图3所示，Cu-TCPP(Fe)呈超薄的片层结构，C、N、Cu、Fe元素分布均匀。
2、验证Cu-TCPP(Fe)过氧化物模拟酶活性，进行如下试验：
准备5支1.5 mL离心管，在1号管中加入终浓度为0.667 mmol/L的TMB溶液；在2号管中加入终浓度分别为1.33 mmol/L 的H2O2和0.667 mmol/L的TMB溶液；在3号管中加入终浓度分别为56 μg/mL的Cu-TCPP(Fe)和1.33 mmol/L 的H2O2溶液；在4号管中加入终浓度分别为56 μg/mL的Cu-TCPP(Fe)和0.667 mmol/L的TMB溶液；在5号管中加入终浓度分别为56μg/mL的Cu-TCPP(Fe)、1.33 mmol/L 的H2O2和0.667 mmol/L的TMB溶液；置于室温下反应10min后，于紫外可见分光光度计测定450 nm~750 nm波长范围内的吸收光谱。Cu-TCPP(Fe)的过氧化物模拟酶活性结果如图4所示，只有当Cu-TCPP(Fe)、H2O2和TMB三者同时存在时，体系才会有明显的颜色变化，说明Cu-TCPP(Fe)能催化H2O2氧化TMB使其由无色变为蓝色，因而Cu-TCPP(Fe)具有过氧化物模拟酶活性。
3、包埋Cu-TCPP(Fe)的DNA水凝胶制备与切割：
（1）聚丙烯酰胺-DNA复合物的合成：将修饰有丙烯酰胺基的oligo X和oligo Y（终浓度各为54 μmol/L）分别加入终浓度为2 wt%的丙烯酰胺，混合后，真空排气15 min，再加入终浓度为0.05 wt%的过硫酸铵和0.5 wt%的四甲基乙二胺，37 ℃真空反应20 min，即可得到高分子的聚丙烯酰胺Ps-X和Ps-Y。
（2）包埋Cu-TCPP(Fe)的DNA水凝胶的制备：分别将3 μL上述合成Ps-X，Ps-Y、2 μLLinker(50 μmol/L)和2 μL Cu-TCPP(Fe) (4 mg/mL)，混合后，于65 ℃反应5 min，冷却至25 ℃保持20 min，形成凝胶。
合成DNA水凝胶所使用的DNA序列具体信息见表1。合成的DNA水凝胶的成品见图5A所示，可以看到其呈明显的凝胶形态，当用移液枪吸取时，观察到黏性。
表1：DNA水凝胶合成中所用到的DNA序列
Figure 570828DEST_PATH_IMAGE001
4、sgRNA-Cas蛋白复合体溶液的合成与CRISPR/Cas切割DNA水凝胶显色验证：
在1×Cleavage Buffer中加入终浓度为0.03 mg/mL的Cas14a蛋白和终浓度为0.3μmol/L的sgRNA（核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示），混匀后于37℃静置孵育15 min，得到sgRNA-Cas蛋白复合体溶液。
将得到的sgRNA-Cas蛋白复合体溶液与终浓度为30 nmol/L的靶标DNA（本例中以cDNA作为靶标DNA模型，cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示）及上述得到的DNA水凝胶混合，于37 ℃振荡孵育4 h后（反应体系的具体信息如下表2所示），依次加入10 μL H2O2 (20mmol/L)和10 μL TMB (10 mmol/L)，在室温下静置反应10 min后，使用紫外可见分光光度计测定体系在450~750 nm范围内的吸收光谱。同时设立对照组，对照组除了未加sgRNA-Cas蛋白复合体溶液与cDNA外，其他均与实验组相同操作。
CRISPR/Cas切割DNA水凝胶显色结果如图5B-C所示，对照组只观察到较浅的蓝色，说明DNA水凝胶能够较好的包埋Cu-TCPP(Fe)从而使其不能催化H2O2氧化TMB发生颜色变化；而经CRISPR/Cas切割的DNA水凝胶观察到明显的深蓝色，说明CRISPR/Cas被cDNA激活从而切割DNA水凝胶使其结构被破坏，释放出Cu-TCPP(Fe)，进而催化H2O2氧化TMB呈蓝色。
表2：CRISPR/Cas14a切割 DNA水凝胶体系
Figure 691230DEST_PATH_IMAGE002
实施例2：
实施例1的CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器在检测MC-LR中的应用，包括利用CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器检测MC-LR的方法与原理验证：
1、cDNA-MC-LR适配体复合体溶液的制备：
在1×Bing Buffer中加入终浓度为100 nmol/L的MC-LR适配体溶液和终浓度为100 nmol/L的cDNA溶液，95℃变性5 min后，冷却至25℃保持30 min，形成cDNA-MC-LR适配体复合体溶液。MC-LR适配体和cDNA序列的具体序列如表3所示。
表3：MC-LR适配体和cDNA的序列信息
Figure 674230DEST_PATH_IMAGE003
2、MC-LR适配体/MC-LR/cDNA的竞争反应：
在上述，cDNA-MC-LR适配体复合体溶液中，加入终浓度为10 ng/mL的MC-LR标准溶液，混匀后在25℃反应30 min，得到竞争反应液。
3、竞争反应体系协同CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器检测MC-LR
准备5支离心管：在1号管中只加入10 μL如实施例1所述制备的DNA水凝胶；在2号管中加入10 μL如实施例1所述制备的DNA水凝胶和3 μL上述制备的cDNA-MC-LR适配体复合体溶液；在3号管中加入10 μL如实施例1所述制备的DNA水凝胶和3 μL如实施例1所述制备的sgRNA-Cas14a蛋白复合体溶液；在4号管中加入10 μL如实施例1所述制备的DNA水凝胶、3μL如实施例1所述制备的sgRNA-Cas14a蛋白复合体溶液和3 μL上述制备的cDNA-MC-LR适配体复合体液；在5号管中加入10 μL如实施例1所述制备的DNA水凝胶、10 μL如实施例1所述制备的sgRNA-Cas14a蛋白复合体溶液、3 μL上述制备的cDNA-MC-LR适配体复合体溶液和3μL上述制备的竞争反应液。
将上述5支离心管于37 ℃振荡孵育4 h后，于5支离心管中均加入10 μL 的H2O2(20 mmol/L)和10 μLTMB (10 mmol/L)，在室温下静置反应5~10 min后，使用紫外可见分光光度计测定体系在450~750 nm范围内的吸收光谱。
结果如图6所示，单独的DNA水凝胶（1号）在加入H2O2和TMB后，未见明显的颜色及吸光度变化，说明DNA水凝胶结构较为稳定；在DNA水凝胶中加入cDNA-MC-LR适配体复合体液（2号）后，颜色及吸光度未见明显的变化，说明cDNA-MC-LR适配体复合体液不能破坏DNA水凝胶结构；在DNA水凝胶中单独加入sgRNA-Cas14a蛋白复合体溶液（3号），或cDNA-MC-LR适配体复合体液和sgRNA-Cas14a蛋白复合体溶液（4号）后，体系的吸光度略有上升，说明DNA水凝胶被轻度破坏；但当在DNA水凝胶中加入cDNA-MC-LR适配体复合体液、sgRNA-Cas14a蛋白复合体溶液和MC-LR标准溶液（5号）后，体系发生明显的颜色变化，吸光度也明显增加，这是由于MC-LR的加入，可以将cDNA-MC-LR适配体复合体上的cDNA竞争下来，游离的cDNA进而激活sgRNA-Cas14a蛋白复合体切割DNA水凝胶使其结构被破坏，说明CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器可以用于MC-LR的检测。
序列表
<110> 中南大学
<120> CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器及其制备方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttttttttt cacagatgag tatc 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttttttttc ttgtctcccg agat 24
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatactcatc tgtgattttt tttttttatc tcgggagaca ag 42
<210> 4
<211> 227
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cttcactgat aaagtggaga accgcttcac caaaagctgt cccttagggg attagaactt 60
gagtgaaggt gggctgcttg catcagccta atgtcgagaa gtgctttctt cggaaagtaa 120
ccctcgaaac aaattcattt ttcctctcca attctgcaca agaaagttgc agaacccgaa 180
tagacgaatg aaggaatgca acccacctca ttatgcccca tccaata 227
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggcgccaaac aggaccacca tgacaattac ccataccacc tcattatgcc ccatctccgc 60
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttttatatt ggatggggca taatgaggtg gatttttaat g 41

Claims (10)

1.一种CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器，其特征在于，包括包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶和sgRNA-Cas蛋白复合体；
所述包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶由金属有机框架材料与DNA水凝胶复合组成，且所述DNA水凝胶包含以下核苷酸序列的DNA链：
oligo X：5’-Acrydite-TTTTTTTTTTCACAGATGAGTATC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
oligo Y：5’-Acrydite-TTTTTTTTTCTTGTCTCCCGAGAT-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
Linker：5’-GATACTCATCTGTGATTTTTTTTTTTTATCTCGGGAGACAAG-3’，其核苷酸序列如SEQID NO：3所示；
所述sgRNA-Cas蛋白复合体由Cas蛋白与其对应的sgRNA复合组成，所述sgRNA的部分核苷酸序列与待测目标物本身含有的靶标DNA或用于识别适配待测目标物的功能性核酸链的核苷酸序列互补；
所述金属有机框架材料为Cu-TCPP(Fe)，所述Cas蛋白为Cas14a。
2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器，其特征在于，在包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶中，所含金属有机框架材料的终浓度为1-5 mg/mL，所含DNA水凝胶的用量为10-20 μL；在sgRNA-Cas蛋白复合体溶液中，所含Cas蛋白的终浓度为0.01-0.05 mg/mL，所含sgRNA的终浓度为0.1-0.5 μmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器，其特征在于，所述用于识别适配待测目标物的功能性核酸链为适配体。
4.一种如权利要求1-3中任一项所述CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将修饰有丙烯酰胺基的DNA链oligo X和oligo Y分别加入丙烯酰胺，混合后真空排气，再加入过硫酸铵和四甲基乙二胺，真空反应后，分别得到高分子的聚丙烯酰胺Ps-X和Ps-Y；将所述高分子的聚丙烯酰胺Ps-X和Ps-Y与Linker、金属有机框架材料混合后，加热反应，冷却后形成凝胶；
（2）制备sgRNA-Cas蛋白复合体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述oligo X和oligoY的终浓度各为30-50 μmol/L，所述丙烯酰胺的终浓度为1.5-3 wt%，所述真空排气10-15min，所述过硫酸铵的终浓度为0.05-1.5 wt%，所述四甲基乙二胺的终浓度为0.5-2.8 wt%，所述真空反应的条件为：37 ℃真空反应10-30 min；
所述Ps-X、Ps-Y、Linker和金属有机框架材料的体积比为2-4:2-4:1-3:1-3，所述Linker的浓度为30-50 μmol/L，所述金属有机框架材料的浓度为1-5 mg/mL，加热反应的条件为：65 ℃反应5-15 min，冷却至20-30 ℃保持15-30 min后即形成凝胶。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）的具体操作过程如下：在1×Cleavage Buffer中加入终浓度为0.01-0.05 mg/mL的Cas蛋白溶液和终浓度为0.1-0.5μmol/L的sgRNA溶液，混匀后于37℃静置孵育10-15 min，即得到sgRNA-Cas蛋白复合体溶液。
7.一种如权利要求1-3中任一项所述或由权利要求4-6中任一项所述制备方法制备得到的CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器在检测非核酸目标物——MC-LR中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括如下步骤：将所述包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶、sgRNA-Cas蛋白复合体、cDNA-MC-LR适配体复合体以及待测样品溶液混合，进行振荡孵育后，加入H2O2和TMB后在室温下静置反应，使用紫外可见分光光度计测定反应体系的吸收光谱，完成对MC-LR的检测；
所述cDNA-MC-LR适配体复合体中，MC-LR适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，互补链cDNA的部分核苷酸序列与所述MC-LR适配体上含有的任意一段核苷酸序列存在15-25个碱基互补，互补链cDNA的另一部分核苷酸序列与所述sgRNA的核苷酸序列存在37-50个碱基互补。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述互补链cDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示；所述sgRNA-Cas蛋白复合体中，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，Cas蛋白为Cas14a蛋白。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶、sgRNA-Cas蛋白复合体、cDNA-MC-LR适配体复合体和待测样品溶液的体积比为10-20：3-5：3-5：3-5；所述振荡孵育的条件为：30-40 ℃振荡孵育2-6 h；所述H2O2的浓度为15-30mmol/L；所述TMB的浓度为5-15 mmol/L；所述静置反应的时间为5~20 min，使用紫外可见分光光度计测定反应体系在450~750 nm范围内的吸收光谱。
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