CN113785202A - 新病理标志物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新病理标志物的鉴定,用于通过所述标志物的检测和定量来诊断或监测非酒精性肝脂肪变性(NAFLD)进展的新方法,以及能够实施所述方法的设备。
Description
技术领域
本发明涉及新病理标志物的鉴定、用于通过所述标志物的检测和定量(量化)来诊断或监测非酒精性肝脂肪变性NAFLD和/或NASH进展的新方法,以及能够实施所述方法的设备。
背景技术
非酒精性肝脂肪变性,也由首字母缩略词NAFLD(Non-Alcoholic Fatty LiverDisease)表示,表现为一系列肝脏组织学改变,其特征为在没有大量饮酒和肝病的继发性原因的情况下肝细胞内脂肪的过度积累(脂肪变性,包括>5%的细胞甘油三酯积累)。
NAFLD目前是西方世界成年人肝细胞溶解指标改变的主要原因,并且令人担忧的是,在儿童和青少年中也是如此。Bugianesi和Marietti 2016中报告的更新数据(RecentiProg Med 2016;107:360-368)表明成年人群中NAFLD的全球患病率如何达到25%,以及在NAFLD个体中,通过肝活检诊断出的NASH(非酒精性肝脂肪变性)的全球患病率如何达到20%至50%。这里报道的百分比在处于风险中的患者(例如在肥胖和/或患有2型糖尿病的患者)中急剧上升。
最引人注目的流行病学数据涉及儿科人群,其中肥胖症和代谢综合征在全球范围内呈逐渐增加的趋势,目前在欧洲也有明显表现,估计与美国记录的类似,从2007年到2010年记录的数据发现,NAFLD的患病率为约7%,是不到20年前记录的值的三倍。
虽然简单的脂肪变性进展为肝硬化的风险可以忽略不计,但很大比例(10-15%)的NAFLD受试者表现出坏死性炎症和气球样变性的组织学方面,这是最严重的肝脏疾病非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的特征,后者可演变为纤维化、肝硬化和相关并发症,包括肝癌(HCC)。
作为一种复杂的多因素病理,非酒精性肝脂肪变性的严重性和发病受遗传和环境因素影响。其经常显示其本身与诸如代谢综合征和2型糖尿病等病理有关,但也在综合征的发生、发展和与其相关并发症中起作用。鉴于NAFLD患病率的增加与富裕国家的饮食和社会变化有关,因为这种病理学具有潜在的重大临床意义,例如,在不可忽视数量的病例中,该病理学也可能演变为非酒精性肝脂肪变性(肝硬化和HCC的原因),所以能够及早正确地鉴定高风险受试者,以便能够在肝脏和肝脏外(心血管)水平调查和预测可能影响预后的并发症的发生显然很重要。
事实上,除了肝损伤之外,患有NAFLD的个体的发病率和死亡率的主要原因是这些个体中出现的心血管并发症比一般人群中出现的要多,不管是否存在2型糖尿病和其它危险因素。
正如2016年Bugianesi和Marietti报道的那样,由于NASH诊断目前的条件是进行肝活检,因此近年来科学界的努力旨在寻找可大规模应用的肝损伤的非侵入性标志物和相关基因多态性的非侵入性标志物,以便正确解决筛查计划、后续行动和治疗尝试。
用于无创诊断的手段的鉴定能够及时诊断,即使在通常不会进行肝活检的受试者中也是如此,因为对该器官的活检通常仅在出现严重症状使得其必不可少时才进行。此外,无创诊断还可以连续监测对患者进行的治疗性治疗的有效性。其实也应该考虑到,超声引导下的肝活检是一项昂贵的检查,其应该在医院进行,并且费用从2000美元到7000美元或更多。肝活检后致命性出血的死亡率为0.13%至0.33%,但在凝血功能改变的受试者中可能更高。
因此,目前非常需要找出NAFLD诊断标志物以实现准确且快速的诊断,而无需对肝脏进行活检干预,因此由于诊断方法的无创性,能够扩大人群中疾病的诊断。
发明内容
本发明的作者已经发现Plin2蛋白是循环细胞中非酒精性肝脂肪变性(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的有效标志物,令人惊讶地发现,在肝细胞中测量的所述标志物的表达程度与在同一个体的白细胞中、特别是外周血多形核细胞和单核细胞中测量的表达程度强正相关。此外,本发明的作者还发现血细胞和肝细胞中Plin2蛋白的表达程度与NAFLD的NAS评分以及NASH的严重性成比例,因此患有NAFLD的患者中Plin2浓度越高,NAS评分就越高,并且患有NASH的患者中Plin2浓度越高,疾病的严重性就越大(NAS评分和NASH严重性根据文献和本说明书定义)。
因此,本发明的作者设计了一种对个体的血液样品或从所述样品提取的白细胞进行NAFLD和/或NASH诊断的方法,其中,如果所述样品中的Plin2浓度大于在取自健康个体的一个或多个对照样品中测量的浓度,则NAFLD和/或NASH的诊断需被视为已确定。
凭借所述表达与疾病严重性之间的相关性,Plin2表达程度的测量还可有利地用于监测治疗的有效性,由此,在开始监测治疗有效性的时刻t0进行的个体的Plin2血液浓度的测量的比较能够通过将在所述测量中获得的值与在时刻tn进行的一个或多个后续测量中获得的值进行比较来评估所述治疗有效性,其中n是大于0的整数,并且其中所述时刻彼此逐渐在后(之后或接着)并且全部在t0之后,因为Plin2浓度随时间的降低指示治疗有效性。随时间恒定的值表明疾病得到控制,而所述值随时间增加表明治疗无效。
此外,如上所述的在后时间的测量也能够在没有药理学治疗的情况下监测疾病的进程,例如在患者的饮食和生活习惯改变、药物或减肥手术之后。
因此,本发明有利地能够在不需要肝活检的情况下进行NAFLD或NASH的诊断和/或监测,具有明显和显然的医学和经济优势。此外,根据本发明的诊断和/或监测的简单性能够显著扩大可以对其进行分析的个体数量,也能够容易地对儿童进行测试,并且此外还能够检查通常不会进行肝活检的整个患者群体针对NAFLD或NASH的健康状况。此外,根据本发明的分析还能够对群体进行筛查。
此外,鉴于患有NAFLD和NASH的患者中心血管损伤的频率更高,这被证明与其它危险因素的存在或不存在无关,所以疾病的早期诊断能够对所述患者中的心血管***进行预防性监测。
本发明的作者还发现,如上所述的Plin2蛋白浓度值与NAS评分相关,并且还与NASH的严重性等级相关,后者在文献中基于在活检样品中观察到的组织学参数定义为轻度、中度和严重。因此,本发明还涉及基于本文定义的所述患者的生物样品中的Plin2蛋白浓度值来定义患有所述病理的患者的NASH的严重性等级的方法、计算机程序和设备。
本发明的作者还惊奇地发现,相同生物样品中Pnpla3和Rab14蛋白表达的值能够诊断肝纤维化的存在及其严重性。
本发明的方法也可以用能够进行上述测量(测定)并且任选地处理获得的数据的简单设备来执行。
因此,本发明的目的是:
一种用于诊断非酒精性肝脂肪变性(NAFLD)和/或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法,包括步骤:
a.测量个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.将a点中获得的值与健康个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值进行比较,
c.当a中测量的值大于b中测量的值时,诊断为NAFLD和/或NASH;
一种用于诊断NAFLD或NASH的方法,包括步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.测量来自患有NAFLD的患者和健康患者的血液样品的群体中Plin2蛋白的浓度值,并鉴定患有NAFLD的患者与健康患者之间所述浓度的截断值C0,并且测量来自患有NASH的患者和健康患者的血液样品的群体中Plin2蛋白的浓度值,并鉴定患有NASH的患者与健康患者之间所述浓度的截断值C1,
c.将a点中获得的值与b点中获得的截断值进行比较,
d.当a中获得的值大于或等于所述值C0且小于所述值C1时诊断为NAFLD,或当a中获得的值大于或等于所述值C1时诊断为NASH;
一种用于诊断患有NAFLD或NASH的患者的NAS的方法,包括步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.测量来自患有NAFLD或NASH的患者和健康患者的血液样品的群体中Plin2蛋白的浓度值,其中,在包含来自患有NAFLD的患者的样品的所述群体中,基于肝细胞中脂肪变性的百分比(百分数)、气球样肝细胞的发生、小叶炎症的存在和汇管区炎症的存在,将NAS值在所述患者中在组织学上定义为NAS 1、NAS 2和NAS 3,并且鉴定:
健康患者与患有NAS 1的NAFLD的患者之间所述浓度的截断值C2;
患有NAS 1的NAFLD的患者与患有NAS 2的NAFLD的患者之间所述浓度的截断值C3;和
患有NAS 2的NAFLD的患者与患有NAS 3的NASH的患者之间所述浓度的截断值C4;
c.将a点中获得的值与b点中获得的截断值进行比较,
d.将所述NAS程度诊断为:
当a中获得的值大于或等于所述截断值C2且小于或等于所述截断值C3时,NAS 1,
当a中获得的值大于所述值C2且小于或等于所述截断值C4时,NAS 2,
当a中获得的值大于所述值C4时,NAS 3;
一种用于诊断NASH的严重性等级的方法,包括步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.测量来自患有NASH的患者和健康患者的血液样品的群体中Plin2蛋白的浓度值,其中,在包含来自患有NASH的患者的样品的所述群体中,基于肝细胞中脂肪变性的百分比、气球样肝细胞的发生、小叶炎症的存在和汇管区炎症的存在,将病理学的严重性等级在所述患者中在组织学上定义为轻度、中度或严重,并且鉴定:
健康患者与患有轻度NASH的患者之间所述浓度的截断值C5;
患有轻度NASH的患者与患有中度NASH的患者之间所述浓度的截断值C6;和
患有中度NASH的患者与患有严重NASH的患者之间所述浓度的截断值C7,
c.将a点中获得的值与b点中获得的截断值进行比较,
d.将NASH的严重性等级诊断为
当a中获得的值大于所述值C5且小于所述值C6时,轻度,
当a中获得的值大于所述值C6且小于所述值C7时,中度,并且
当a中获得的值大于所述值C7时,严重;
一种用于诊断NAFLD或NASH的方法,包括步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,其中所述值使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Plin2并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量,
b.将a点中获得的值与以平均荧光强度(MFI)表示的等于2.7MFI的所述浓度的截断值和等于1.0MFI的所述浓度的截断值进行比较,
d.当a中获得的值大于或等于1.0MFI且小于或等于2.7MFI时诊断为NAFLD,或当a中获得的值大于2.7MFI时诊断为NASH;
一种用于诊断患有NAFLD或NASH的患者的NAS的方法,包括步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,其中所述值使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Plin2并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量,
c.将a点中获得的值与以平均荧光强度(MFI)表示的等于1.0MFI、1.4MFI和2.7MFI的所述浓度的截断值进行比较,
d.当a中获得的值大于或等于1.0MFI的截断值且小于或等于1.4MFI的截断值时诊断为NAS等于1;当a中获得的值大于1.4MFI的截断值时诊断为NAS等于2;或当a中获得的值大于2.7MFI的截断值时诊断为NAS等于3;
一种用于诊断NASH的严重性等级的方法,包括步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,其中所述值使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Plin2并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量,
c.将a点中获得的值与以平均荧光强度(MFI)表示的等于2.7MFI、4MFI和6.3MFI的所述浓度的截断值进行比较,
d.当a中获得的值大于2.7MFI的截断值且小于或等于4MFI的截断值时诊断为轻度形式的NASH,当a中获得的值大于4MFI的截断值且小于或等于6.3MFI的值时诊断为中度形式的NASH,并且当a中获得的值大于6.3MFI时诊断为严重形式的NASH;
所述方法还包括步骤:在诊断NASH的a点中测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Pnpla3和Rab14蛋白的浓度值,相对于来自健康患者和任选来自组织学上已限定肝纤维化等级的患者的血液样品中的其浓度值进行比较,以用于肝纤维化的诊断;
一种用于监测患者中NAFLD或NASH的治疗性治疗的有效性的方法,包括步骤:
a.在开始进行所述监测的时刻t0测量患有NAFLD或NASH的个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.在一个或多个时刻tn测量患有NAFLD或NASH的个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,其中n是大于0的整数,并且在其中每个tn对应于t0之后的时刻,其中
一个或多个所述时刻tn中Plin2蛋白浓度的降低指示所述治疗性治疗的有效性;
一种用于监测患者中NAFLD或NASH的进展的方法,包括步骤:
a.在开始进行所述监测的时刻t0测量患有NAFLD或NASH的个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.在一个或多个时刻tn测量患有NAFLD或NASH的个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,其中n是大于0的整数,并且在其中每个tn对应于t0之后的时刻,其中
一个或多个所述时刻tn中Plin2蛋白浓度的降低指示NAFLD或NASH的改善,而一个或多个所述时刻tn中Plin2蛋白浓度的升高指示NAFLD或NASH的恶化;
易于实施所述方法的计算机程序;
以及一种用于自动测量血液样品中Plin2蛋白浓度值的设备,一般包括:
来自血液样品的PBMC的分离装置;
所述PBMC的细胞质中Plin2蛋白浓度的测量装置,和
连接到所述分离装置和测量装置的控制单元,其以如下方式被编程为:
根据预定的操作参数根据自动模式控制和同步它们的驱动,和
将所述PBMC的细胞质中Plin2蛋白浓度的数据与Plin2蛋白浓度的参考数据进行自动比较。
术语表
用于本发明目的的术语白细胞具有文献中公知的含义并且包括不同的细胞类型:粒细胞(或多形核细胞),其细分为嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞;淋巴细胞;单核细胞。
出于本发明的目的,术语Plin2表示由位于9p22.1的人基因ADFP编码的人蛋白质脂肪分化相关蛋白,也称为ADFP、ADRP或脂滴包被蛋白2。
NAFLD非酒精性肝脂肪变性
NASH非酒精性脂肪性肝炎
Pnpla3是指人Pnpla3蛋白,也称为脂肪营养蛋白(adiponutrin)、ADPN、酰基甘油O-酰基转移酶、C22orf20、IPLA2epsilon、DJ796117.1、IPLA(2)epsilon、IPLA2-epsilon。
Rab14是指人Rab14蛋白,也称为Ras相关蛋白Rab-14。
附图说明
图1:小图A:单核细胞和肝细胞中的脂滴(浅灰色点):可见较大且染色较弱的细胞核。小图B显示了单核细胞和肝脏中Plin2的蛋白质印迹。β肌动蛋白显示在单核细胞中检测到的蛋白质量与在肝细胞中检测到的蛋白质量是相似程度。
图2报告了同一受试者的肝脏切片和单核细胞中的ORO染色。
图3报告了单核细胞和肝脏中通过蛋白质印迹测量Plin2的差异(Y轴)和平均值(X轴)的Bland Altman图。两条虚线表示置信限制。两种测量获得的值之间的差异在Y轴上报告,而平均值在Y轴上报告。虚线报告了两种测量之间95%的置信界限(限制)。该图表明所有点都在置信限制内,这表明肝脏和外周血细胞中Plin2表达之间存在直接相关性。
图4:根据本发明的设备的优选实施方案的示例性框图。
图5:根据本发明的设备的另一优选实施方案的使用示例图。
图6:根据本发明的设备的另一优选实施方案的使用示例图。
图7:平均Plin2(MFI)水平与NAS阶段之间的相关性,X轴上的自变量是Plin2调节值,而因变量是NAS阶段。
图8:Plin2 NASH归一化的重要性。
图9:Pnpla3和Rab14纤维化归一化的重要性。
图10:Plin2纤维化归一化的重要性。
具体实施方式
本发明的作者惊奇地发现Plin2蛋白是NAFLD和NASH标志物,血细胞(白细胞)中的蛋白质浓度与肝细胞中所述蛋白质的表达相关,并且其浓度与NAS评分并且还与NASH疾病的严重性等级成比例。因此,本发明的作者发现,在不需要求助于肝活检的情况下通过分析血液样品,可以使用Plin2蛋白浓度的测量来进行NAFLD或NASH的诊断,将其严重性等级诊断为如文献中所定义的轻度、中度或严重,或监测NAFLD或NASH的治疗性治疗的有效性,或还监测NAFLD或NASH随时间的进程。
因此,本发明提供了一种用于诊断非酒精性肝脂肪变性(NAFLD)和/或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法,包括以下步骤:
a.测量个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.将a点中获得的值与健康个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值进行比较,
c.当a中测量的值大于b中测量的值时,诊断为NAFLD和/或NASH。
在一个实施方案中,在步骤a中使用血液样品,其可以通过本领域技术人员已知的技术处理以从中分离出白细胞。
因此,该方法在测量样品中Plin2蛋白浓度之前可以包括对血液样品进行处理以分离出其中包含的白细胞的步骤。在一个实施方案中,该方法可以包括从待分析的血液样品或从其分离的白细胞中分离多形核细胞和/或单核细胞的步骤。
可以使用当前用于从血液样品中分离白细胞的文献中已知的任何方案。
仅作为示例,可以如下从血液样品中分离多形核细胞:将血液收集到含有EDTA(终浓度4mM)的试管中以防止其凝固。然后,建立一个或多个不连续Percoll梯度(由已用聚乙烯吡咯烷酮(PVR)包覆的直径为15-30nm的胶态二氧化硅颗粒组成(水中23%w/w)),将15ml62%Percoll放置在试管中,并在带有细导管的注射器的帮助下,在其下方轻轻分层15ml75%Percoll,避免两种悬浮液混合。
然后,使8-10ml的血液在上述梯度上分层;试管在20℃下离心总共25分钟,其中以200rpm离心10分钟,然后以400rpm离心15分钟。因此,基于密度和尺寸的血液图形元素的分离:红细胞和大部分嗜酸性粒细胞沉淀在试管底部;多形核细胞沉淀在两个Percoll悬浮液之间的界面处;淋巴细胞位于62%Percoll和血浆之间。
丢弃血浆和淋巴细胞后,用玻璃巴斯德吸管收集含有多形核细胞的带,收集在试管中,通过在20℃下以250rpm离心7分钟在HEPES/BSA中洗涤。为了丢弃可能存在的红细胞,对如此获得的底层进行快速裂解处理,将其重新悬浮到3份低渗溶液中。搅拌约15秒后,通过添加7份等渗溶液来恢复介质等渗。
在20℃下以250rpm进一步洗涤7分钟后,将细胞沉淀重新悬浮并保持在已知的HEPES/BSA体积中直至使用。中性粒细胞浓度通过使用电子粒子计数器或在光学显微镜下使用血细胞计数器测定。
仅举例来说,可以通过以下技术从血液样品中分离多种单核细胞类型:通过使用针对表面细胞标志物的单克隆抗体的微生物表达的CD特异性重组Fab片段。此外,商业试剂盒可用于此目的,例如,FABianTM的IBA GmbHTM CD14分离试剂盒。
Plin2蛋白浓度的测量可以根据本领域技术人员可用的任何方法进行,仅作为示例,在本文所述的方法中,测量可以通过蛋白质印迹、或细胞荧光法、或ELISA、或免疫荧光或定量PCR、酶联免疫斑点测定)或局部表面等离子体共振纤维尖端探针***,或通过使用为下文描述的所述测量而制备的设备来进行。所有上述方法对于本领域的技术人员来说都是已知的,他们知道需要对哪个样品进行分析以及应该对哪种蛋白质进行定量,可以选择他/她认为最合适的方案并使用市场上最合适的试剂。根据本说明书进行样品内Plin2检测和定量所需的所有试剂都是已知的并且可在市场上获得,因此一旦知道本发明的方法,本领域技术人员不需要特别的发明。
举例来说,对上面列出的技术进行了总结,并指出了本领域技术人员对于它们中的每一个通常使用的步骤。
蛋白质印迹能够监测细胞中的蛋白质表达,从而通过三个过程确定特定抗原的存在、量和分子量:
1)蛋白质提取及用量;
2)通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行蛋白质分离;3)蛋白质印迹:将从凝胶中分离的蛋白质转移到硝酸纤维素分析(印迹);将膜暴露于针对目标蛋白质的抗体(一抗);将膜暴露于针对用作一抗的抗体物质的抗体(二抗),并使用化学发光方法(ECL)进行膜显色。
4)图像密度分析。
细胞荧光法是允许检测、鉴定和计数特定细胞或其中包含的蛋白质的一种实验室技术。
细胞荧光法技术设想了多个阶段:
将细胞样品悬浮在流体中,
在测试之前,并且根据待分析的细胞,用能够区分细胞亚型的特定染料处理样品。这种染料(荧光染料)与针对特定细胞区域或标志物抗原的单克隆抗体结合。
将含有被标记细胞的样品引入称为细胞荧光计的仪器中。
在该仪器中,将含有细胞的流体引导到流动室,然后通过非常窄的孔,从而产生其中细胞一个接一个被组织成排的流。使细胞流置于检测器前面,检测器以非常高的速率(每秒数百到数千个细胞)分析流中存在的每个细胞。
细胞荧光计包含一个或多个激光器和能够鉴定对每个细胞独特的一些特征的多个检测器。每个激光撞击存在于流中的细胞,为它们中的每一个根据其特征产生特征性散射。这些特征可以是物理的(细胞尺寸和复杂性),或可以取决于激光拦截染料(荧光染料)产生的信号。这些信息的组合为样品中存在的每个细胞生成了特征性谱。多个检测器(或一个检测器)检测到的信号被放大(通过光电倍增管)并发送到计算机。在这里,其被转换成数字格式并在计算机上显示或被打印。
数据以图表的形式提供。
ELISA(酶联免疫吸附测定)是一种广泛使用的技术,其基于酶与抗体或抗原的化学缀合。这些酶的活性很容易监测,并允许准确定量缀合复合物的浓度。根据所使用的具体方法,ELISA可用于定量抗原或抗体。
通过特异性抗体识别抗原(Immuno)。
分析物(抗原或抗体)吸附在***(吸附剂)表面。
被(第二)酶联抗体识别的抗原/抗体,能够产生其产物被染色的反应。
定量PCR或实时PCR是用于通过测量荧光团发出的荧光来定量核酸(在这种情况下是编码Plin2蛋白的mRNA)的技术。该技术在单个反应中将扩增与定量关联起来。在实时PCR反应中,荧光以与PCR产物的积累成比例增加。本领域技术人员在设计适合进行RT-PCR的探针时完全没有问题,因为编码Plin2蛋白的基因和DNA在文献中是已知的。PBMC样品中的酶联免疫斑点(ELISPOT)分析是基于将细胞在96-孔板中孵育确定的一段时间,该96-孔板已经通过用对在孵育期间产生的所研究细胞因子具有高亲和力的单克隆抗体的吸附进行功能化(涂覆)。在酶的显色底物存在下,抗参比蛋白生物素化抗体和抗生物素酶联二抗的组合能够通过斑点的形成(染料堆积)检测由于反应产物沉淀而在特定区域内产生的蛋白质。所述技术可应用于细胞裂解后的PBMC含量。表面等离子体被用来提高各种光谱测量(包括荧光、拉曼散射和二次谐波产生)的表面灵敏度。然而,在它们最简单的形式中,SPR反射可用于检测蛋白质等中的分子吸收。从技术上讲,测量最小反射角(最大吸收)。
文献中已知的适用于定量如上定义的血液或细胞样品中的Plin2浓度的任何分析技术均可用于本发明的任何方法中。
此外,根据本发明的设备可以设计为通过一种或多种上述检测技术在目标样品中进行Plin2蛋白定量。
在特定实施方案中,可以使用合适的荧光染料标记的Plin2蛋白特异性(即,仅与Plin2蛋白结合)的抗体(或如上定义的其衍生物或片段)作为蛋白质标志物通过细胞荧光法进行测量。
在一个实施方案中,荧光染料可以是通过市售细胞荧光测定仪可检测的任一种荧光染料,例如具有以下特征的荧光染料:
在一个实施方案中,可以使用Alexa Fluor 488荧光染料(Invitrogen),其通常用作FITC或Cy2的替代品,具有以下技术特征。
荧光强度和平均荧光强度(MFI)值的分析可以通过公众可获得的合适软件计算,并通过使用市场上可获得的细胞荧光计进行评估。
因此,根据一个实施方案,所用的荧光染料可以是具有上述技术特征的AlexaFluor 488、细胞荧光计FC 500(Beckman Coulter,Brea,CA),并且可以使用Kaluza软件(Beckman Coulter,Brea,CA)对本申请提交时所述产品的技术特征进行数据分析。
无论如何,通过比较性分析在使用其它荧光染料和其它设备和软件计算的以MFI表示的截断值,本领域的技术人员会知道如何调整通过使用Alexa Fluor 488荧光染料或具有上表中报告的特征的荧光染料,使用细胞荧光计FC 500(Beckman Coulter,Brea,CA)或具有类似技术特征的细胞荧光计和Kaluza软件(Beckman Coulter,Brea,CA)计算的,本文提供的以MFI表示的截断值。
MFI是简单的算术平均值。
根据本发明,细胞荧光计可以优选地具有上述细胞荧光计的技术特征,如在本申请提交时公众可获得的。
上述步骤的所有实施方案均适用于本说明书中提供的任何方法。
在一个实施方案中,本发明涉及一种用于诊断NAFLD或NASH的方法,包括以下步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.测量来自患有NAFLD的患者和健康患者的血液样品的群体中Plin2蛋白的浓度值,并鉴定患有NAFLD的患者与健康患者之间所述浓度的截断值C0,并且测量来自患有NASH的患者和健康患者的血液样品的群体中Plin2蛋白的浓度值,并鉴定患有NASH的患者与健康患者之间所述浓度的截断值C1,
c.将a点中获得的值与b点中获得的截断值进行比较,
d.当a中获得的值大于或等于所述值C0且小于所述值C1时诊断为NAFLD,或当a中获得的值大于或等于所述值C1时诊断为NASH。
本发明还涉及一种用于诊断患有NAFLD或NASH的患者的NAS评分的方法,包括以下步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.测量来自患有NAFLD或NASH的患者和健康患者的血液样品的群体中Plin2蛋白的浓度值,其中,在包含来自患有NAFLD的患者的样品的所述群体中,基于肝细胞中脂肪变性的百分比、气球样肝细胞的发生、小叶炎症的存在和汇管区炎症的存在,将NAS评分值在所述患者中在组织学上定义为NAS 1、NAS 2和NAS 3,并且鉴定:
健康患者与患有NAS评分1的NAFLD的患者之间所述浓度的截断值C2;
患有NAS 1的NAFLD的患者与患有NAS评分2的NAFLD的患者之间所述浓度的截断值C3;和
患有NAS 2的NAFLD的患者与患有NAS评分3的NASH的患者之间所述浓度的截断值C4;
c.将a点中获得的值与b点中获得的截断值进行比较,
d.将所述NAS评分诊断为:
当a中获得的值大于或等于所述截断值C2且小于或等于所述截断值C3时,NAS评分1,
当a中获得的值大于所述值C2且小于或等于所述截断值C4时,NAS评分2,
当a中获得的值大于所述值C4时,NAS评分3。
根据本发明的NAS评分如文献中所定义,并且通常根据以下参数分配:
本发明还涉及一种用于诊断NASH的严重性等级的方法,包括以下步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.测量来自患有NASH的患者和健康患者的血液样品的群体中Plin2蛋白的浓度值,其中,在包含来自患有NASH的患者的样品的所述群体中,基于肝细胞中脂肪变性的百分比、气球样肝细胞的发生、小叶炎症的存在和汇管区炎症的存在,将病理学的严重性等级在所述患者中在组织学上定义为轻度、中度或严重,并且鉴定:
健康患者与患有轻度NASH的患者之间所述浓度的截断值C5;
患有轻度NASH的患者与患有中度NASH的患者之间所述浓度的截断值C6;和
患有中度NASH的患者与患有严重NASH的患者之间所述浓度的截断值C7,
c.将a点中获得的值与b点中获得的截断值进行比较,
d.将NASH的严重性等级诊断为:
当a中获得的值大于所述值C5且小于所述值C6时,轻度,
当a中获得的值大于所述值C6且小于所述值C7时,中度,并且
当a中获得的值大于所述值C7时,严重。
因此,根据本说明书的Plin2浓度的截断值为:
患有NAFLD的患者与健康患者之间的截断值C0,
患有NASH的患者与健康患者之间的截断值C1,
健康患者与患有NAS 1的NAFLD的患者之间的截断值C2,
患有NAS 1的NAFLD的患者与患有NAS 2的NAFLD的患者之间的截断值C3,
患有NAS 2的NAFLD的患者与患有NAS 3的NASH的患者之间的截断值C4,
健康患者与患有轻度NASH的患者之间的截断值C5,
患有轻度NASH的患者与患有中度NASH的患者之间的截断值C6,
患有中度NASH的患者与患有严重NASH的患者之间的截断值C7。
根据本发明的疾病严重性形式的定义是在根据NAFLD活动评分(NAS)(KleinerDE,Brunt EM,Van Natta M,Behling C,Contos MJ,Cummings OW,等人.Design andvalidation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liverdisease.HEPATOLOGY 2005;41:1313-1321.)的组织学分析的基础上在文献中常用的定义。其为广泛使用并被世界各地的肝病学会证实的组织学评分,其基于肝活检中脂肪变性、小叶和汇管区炎症以及气球样肝细胞变性(“气球样”)的存在;每种组分可以是等级1(轻度)、2(中度)和3(严重)。
事实上,本发明的作者惊奇地发现,来自已知NASH严重性等级的患者的所分析血液样品中Plin2蛋白的浓度值与所述等级相关,并且Plin2蛋白浓度的增加与该病理的严重性成正比。
在优选的实施方案中,上述方法通过使用细胞荧光技术来进行,以使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Plin2并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体来评估Plin2蛋白表达,并且所述截断值以平均荧光强度(MFI)表示。
在更优选的实施方案中,其通过使用上述荧光染料、软件和设备,或者还有如在下文和权利要求中所定义的本发明主题的上述荧光染料和软件及设备来进行。根据文献和根据本发明,NASH坏死性炎症等级根据肝细胞脂肪变性、气球样和紊乱以及(小叶内和汇管区)炎症的等级(上表)分为等级1(轻度)、等级2(中度)和等级3(重度)。
本发明的作者已经证明(参见实施例部分)可以计算适用于上述方法的特定截断值(在本文中用荧光染料、软件和如下文定义的设备以MFI表示)。
因此,本发明的目的还在于:
一种用于诊断NAFLD或NASH的方法,包括以下步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,其中所述值使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Plin2并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量,
b.将a点中获得的值与以平均荧光强度(MFI)表示的等于2.7MFI的所述浓度的截断值和等于1.0MFI的所述浓度的截断值进行比较,
d.当a中获得的值大于或等于1.0MFI且小于或等于2.7MFI时诊断为NAFLD,或当a中获得的值大于2.7MFI时诊断为NASH。
一种用于诊断患有NAFLD或NASH的患者的NAS评分的方法,包括以下步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,其中所述值使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Plin2并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量,
c.将a点中获得的值与以平均荧光强度(MFI)表示的等于1.0MFI、1.4MFI和2.7MFI的所述浓度的截断值进行比较,
d.当a中获得的值大于或等于1.0MFI的截断值且小于或等于1.4MFI的截断值时诊断为NAS评分1;当a中获得的值大于1.4MFI的截断值时诊断为NAS评分2;或当a中获得的值大于2.7MFI的截断值时诊断为NAS评分3;以及
一种用于诊断NASH的严重性等级的方法,包括以下步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,其中所述值使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Plin2并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量,
c.将a点中获得的值与以平均荧光强度(MFI)表示的等于2.7MFI、4MFI和6.3MFI的所述浓度的截断值进行比较,
d.当a中获得的值大于2.7MFI的截断值且小于或等于4MFI的截断值时诊断为轻度形式的NASH,当a中获得的值大于4MFI的截断值且小于或等于6.3MFI的值时诊断为中度形式的NASH,并且当a中获得的值大于6.3MFI时诊断为严重形式的NASH。
这样的方法是使用Alexa Fluor 488荧光染料,或具有上表中报告的特征的荧光染料,使用FC 500细胞荧光计(Beckman Coulter,Brea,CA)和Kaluza软件(BeckmanCoulter,Brea,CA)的一个实施方案。同样,可以通过使用Plin2蛋白的不同检测和定量***来定义不同的截断值C0-C7。
如上所述,作者还惊奇地发现,在诊断NASH的a点中对血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Pnpla3和Rab14蛋白浓度的评估能够确定肝纤维化是否存在及其严重性等级。
在本发明中,为了定义肝纤维化,使用文献(Kleiner DE,Brunt EM,Van Natta M,Behling C,Contos MJ,Cummings OW,等人.Design and validation of a histologicalscoring system for nonalcoholic fatty liver disease.HEPATOLOGY 2005;41:1313-1321)中使用的相同定义,基于用于在纤维化位置和扩展的基础上进行分阶段的评分***:阶段1,区域3窦周纤维化;阶段2,具有上述阶段1的汇管区纤维化;阶段3,除了阶段2以外的桥接纤维化;和阶段4,肝硬化。NASH临床研究网络(NASH CRN)随后将阶段1细分为3类:阶段1A,区域3中的轻度窦周纤维化;阶段1B,区域3中的中度窦周纤维化;和阶段1C,仅汇管区/汇管区周纤维化。在儿童或严重肥胖的患者中偶尔观察到阶段1C纤维化。
组织学改变 | 纤维化阶段(SAF F) |
无纤维化 | 0 |
窦周或汇管区周纤维化 | 1 |
窦周或汇管区周纤维化 | 2 |
桥接纤维化 | 3 |
肝硬化 | 4 |
因此,本发明还提供了适用于上述方法的进一步步骤,其中,一旦从患者的血液样品诊断为NASH,也可以从所述患者的相同样品或另外的血液样品诊断纤维化的存在或不存在及其病理阶段。纤维化阶段诊断的步骤也可以在如本说明书和权利要求中定义的患有NASH的患者的血液样品上进行,其中NASH的诊断已经用不同于本发明描述和要求保护的方法进行。
因此,在本文所述的任何实施方案中,步骤e也可以被步骤e’代替:测量诊断患有NASH的患者的血液样品中或从血液样品提取的白细胞样品中Pnpla3和Rab14蛋白的浓度值,并且因此步骤g可以被步骤g’代替:将在e’点获得的值与在f点获得的截断值进行比较。
因此,本发明的目的是用于诊断单一NASH和/或其严重性的任一种方法,其进一步包括以下步骤:
e.在诊断NASH的a点中测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Pnpla3和Rab14蛋白的浓度值,
f.测量来自患有肝纤维化的患者和健康患者的血液样品的群体中Pnpla3和Rab14蛋白的浓度值,并鉴定患有肝纤维化的患者与健康患者之间所述浓度的截断值C8,
g.将e点中获得的值与f点中获得的截断值进行比较,
h.当e点中获得的值大于所述值C8时诊断为肝纤维化;或
包括步骤e'、f、g'和h的用于诊断肝纤维化的方法。
本发明的目的还在于用于诊断单一NASH和/或其严重性的任一种方法,其进一步包括以下步骤:
e.在诊断NASH的a点中测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Pnpla3和Rab14蛋白的蛋白质浓度值,
f.测量来自健康患者和患有肝纤维化的患者的血液样品的群体中Pnpla3和Rab14蛋白的浓度值,其中基于肝纤维化的位置和扩展,将所述病理学的严重性等级在组织学上定义为阶段1、阶段2或阶段3,并且鉴定:
健康患者与患有阶段1肝纤维化的患者之间所述浓度的截断值C9;
患有阶段1肝纤维化的患者与患有阶段2肝纤维化的患者之间所述浓度的截断值C10;和
患有阶段2肝纤维化的患者与患有阶段3肝纤维化的患者之间所述浓度的截断值C11,
g.将e点中获得的值与f点中获得的截断值进行比较,
h.将肝纤维化的阶段诊断为:
当e点中获得的值大于或等于所述值C9且小于所述值C10时,阶段1,
当e点中获得的值大于或等于所述值C10且小于或等于所述值C11时,阶段2,和
当e点中获得的值大于所述值C11时,阶段3;或
包括步骤e'、f、g'和h'的用于诊断肝纤维化阶段的方法,其中对上述步骤h的e点的所有引用都更改为对e'点的引用,并进行了必要的修改。
本发明的目的还在于用于在来自被诊断患有NASH的患者的血液样品或淋巴细胞上诊断肝纤维化的方法和诊断肝纤维化的阶段的方法,包括上述步骤,其中步骤e和g被步骤e'和g'代替。
综上所述,本文定义的Pnpla3和Rab14浓度的截断值是:
患有肝纤维化的患者与健康患者之间的截断值C8,
健康患者与患有阶段1肝纤维化的患者之间的截断值C9,
患有阶段1肝纤维化与患有阶段2肝纤维化的患者之间的截断值C10,
患有阶段1肝纤维化与患有阶段3肝纤维化的患者之间的截断值C11。
上述蛋白质的浓度值可以通过蛋白质印迹、或细胞荧光法、或ELISA、或定量PCR来测量。
在具体的实施方案中,其可以使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Pnpla3并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体以及特异性结合Rab14并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量,并且所述截断值以平均荧光强度(MFI)表示。
如上所述,Pnpla3和Rab14蛋白的浓度值可以通过使用为计算Plin2浓度值而描述的所有实施方案和设备来计算,例如具有以下特征的荧光染料:
因此,根据一个实施方案,所用的荧光染料可以是具有上述技术特征的AlexaFluor 488、细胞荧光计FC 500(Beckman Coulter,Brea,CA),并且可以使用Kaluza软件(Beckman Coulter,Brea,CA)对本申请提交时公众可获得的所述产品的技术特征进行数据分析。
本发明的作者已经证明(参见实施例部分)可以计算适用于上述方法的特定截断值(在本文中用荧光染料、软件和如下文定义的设备以MFI表示)。
因此,本发明的目的还在于用于诊断单一NASH和/或其严重性的任一种方法,其进一步包括以下步骤:
e.在诊断NASH的a点中测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Pnpla3和Rab14蛋白的浓度值,其中所述值使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Pnpla3并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体和特异性结合Rab14并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量,
g.将e点中获得的值与以平均荧光强度(MFI)表示的大于或等于1.24MFI的截断值进行比较,
h.当在e点中获得的值大于或等于1.24MFI时诊断为肝纤维化,
以及用于诊断单一NASH和/或其严重性的任一种方法,其进一步包括以下步骤:
e.在诊断NASH的a点中测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Pnpla3和Rab14蛋白的浓度值,其中所述值使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Pnpla3并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体和特异性结合Rab14并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量,并且所述截断值以平均荧光强度(MFI)表示,
g.将a点中获得的值与以平均荧光强度(MFI)表示的等于1.24MFI、2.3MFI和3.10MFI的所述浓度的截断值进行比较,
h.当e点中获得的值大于或等于1.24MFI且小于2.4MFI时诊断为轻度阶段1肝纤维化,当e点中获得的值大于或等于2.4MFI且小于3.10MFI时诊断为阶段2纤维化,并且当e点中获得的值大于或等于3.10MFI时诊断为阶段3肝纤维化。
同样在这种情况下,本发明的目的还在于用于在来自被诊断患有NASH的患者的血液样品或淋巴细胞上诊断肝纤维化的方法和诊断肝纤维化的阶段的方法,其包括上述步骤,其中步骤e和g被步骤e'和g'和h’代替,其中对上述步骤h的e点的所有引用都更改为对e'点的引用,并进行了必要的修改。
上述报告值是通过使用Alexa Fluor 488荧光染料或具有上表中报告的特征的荧光染料,使用细胞荧光计FC 500(Beckman Coulter,Brea,CA)和Kaluza软件(BeckmanCoulter,Brea,CA)定义的。显然,可以通过使用不同的检测***指定其它的截断值。
无论如何,通过比较性分析在使用其它荧光染料和其它设备和软件计算的截断值,本领域的技术人员会知道如何调整通过使用Alexa Fluor 488荧光染料或具有上表中报告的特征的荧光染料,使用细胞荧光计FC 500(Beckman Coulter,Brea,CA)和Kaluza软件(Beckman Coulter,Brea,CA)计算的本文提供的以MFI表示的截断值。
此外,本发明提供了一种用于监测患者中NAFLD或NASH的治疗性治疗的有效性的方法,包括以下步骤:
a.在开始进行所述监测的时刻t0测量患有NAFLD或NASH的个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.在一个或多个时刻tn测量患有NAFLD或NASH的个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,其中n是大于0的整数,并且在其中每个tn对应于t0之后的时刻,其中
一个或多个所述时刻tn中Plin2蛋白浓度的降低指示所述治疗性治疗的有效性。
在上述监测方法的执行中,时间t0是监测开始的时间,其可以对应于治疗开始之前的时刻,或者即使治疗已经开始,可以是监测开始的时刻。
时刻tn是随着n的值的增加彼此跟随(接着)的时刻,并且在时刻t0之后。
因此,时刻t0是开始监测的时刻,并且血液样品中Plin2的浓度值被认为是开始评估治疗有效性时的值。然后在t0之后并且在从1向所述时间tn前进中彼此跟随(接着)的时间重复浓度的测量,其中n是大于0的整数,其中时刻t1在时刻t2之前,时刻t2在时刻t3之前,依此类推。
在t0之后的时间中分析的患者血液样品中的Plin2浓度相对于在t0测量的值的可检测的显著降低指示治疗性治疗在改善NAFLD或NASH中的有效性。值随时间保持恒定指示治疗性治疗在阻止NAFLD或NASH进展中的有效性,并且值随时间相对于在t0测量的值增加指示治疗性治疗无效。
在某些情况下,在进行药物治疗之前,建议患者改变饮食习惯和生活方式。在这些情况下,随着时间的推移监测疾病的进展可能是有用的,以查看例如饮食习惯和生活方式的改变是否对疾病产生积极影响。
不管评估或不评估可能的治疗有效性,总之监测测疾病的进程可能是治疗医师感兴趣的。因此,本发明的目的还在于一种用于监测患者中NAFLD或NASH随时间的进展的方法,包括以下步骤:
a.在开始进行所述监测的时刻t0测量患有NAFLD或NASH的个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.在一个或多个时刻tn测量患有NAFLD或NASH的个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,其中n是大于0的整数,并且在其中每个tn对应于t0之后的时刻,其中
一个或多个所述时刻tn中Plin2蛋白浓度的降低指示NAFLD或NASH的改善,而一个或多个所述时刻tn中Plin2蛋白浓度的升高指示NAFLD或NASH的恶化,而随时间值保持恒定指示疾病停滞的情况。
在用于监测治疗性治疗的方法的解释中对时刻t0和tn的描述适用于一般的监测方法。
针对诊断方法描述的所有实施方案也适用于下文描述的监测方法。
通常,虽然血液样品也可以从器官等收集,但在执行本文所述的方法时,优选使用外周血。
特别地,在本文所述方法的实施中,优选对从所述外周血分离的白细胞,更具体地对多形核细胞和/或单核细胞进行Plin2、Pnpla3、Rab14浓度的测量。
在患有肝脂肪变性的患者的血液样品中使用Pnpla3和Rab14浓度值作为标志物监测肝脂肪变性的治疗有效性或进展时,可以进行上述对于NAFLD或NASH监测有效性和疾病进展的相同方法,并进行必要的修改。
本发明还提供了一种用于自动测量从个体采集的血液样品中的Plin2蛋白浓度值和/或Pnpla3和/或Rab14浓度值的设备,通常包括:
来自血液样品的PBMC的分离装置;
所述PBMC的细胞质中Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白浓度的测量装置,和
将获得的测量值与比较值相关联的装置,该比较值可以是从健康个体获得的值和/或先前获得的来自同一个体的血液样品的PBMC的细胞质中Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白的一个或多个浓度值。
如上所述,根据本发明的设备可以被实施以通过上述检测技术中的一种或多种对取自个体的血液样品中的Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白进行测量。
根据所选择的用于PBMC分离和裂解的技术,上述装置将根据各种变体实施,其中一些将在下文中描述。例如,在使用选择性结合PBMC或单核细胞的组分的分离形式的情况下,该设备可包括:
-易于接收血液样品的收集室;
-包括在所述收集室中的混合装置,其被配置为将所述血液样品与易于与所述样品中存在的多形核细胞(PBMC)结合的组分混合,并且在必要时与抗凝物质混合;
-移动装置,其被配置为向通过所述混合装置获得的混合物施加机械振动和/或旋转应力并将所述混合物输送到过滤装置;
-所述过滤装置,其被配置为保留与所述多形核细胞(PBMC)结合的所述组分并允许所述混合物的其余部分被洗脱;
-所述多形核细胞(PBMC)与其结合的组分的分离装置,其被配置为有利于所述多形核细胞(PBMC)与所述组分之间的分离;
-通过所述分离装置分离的多形核细胞(PBMC)的处理装置,其被配置为以允许Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白在当存在时与对所述蛋白特异性的试剂结合的方式,其中所述试剂在一个或多个预定波长处发荧光;
-至少一个辐射源,其被配置为以使得所述试剂发射荧光的方式发射预定波长的辐射,例如以光波的形式;
-用于获取辐照样品的图像的装置;
-控制单元(7),其连接到所有所述装置和所述辐射源(12),被编程以根据预定操作参数根据自动模式控制和同步它们的致动,其中所述控制单元被进一步配置为处理所述图像以定量所述样品中存在的Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白浓度。
所述控制单元进一步被配置为将所述测量浓度与Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白浓度的一个或多个参考数据进行比较,这些参考数据从对健康受试者的血液样品和/或对在不同时刻收集的同一个体的血液样品进行的测量获得。
在一个实施方案中,关于Plin2蛋白,例如,Plin2蛋白浓度的所述参考数据是与健康受试者相关的数据,并且其中所述控制单元7被进一步编程,如果从样品分析中获得的Plin2蛋白浓度的数据大于Plin2蛋白浓度的所述参考数据,则检测到非酒精性肝脂肪变性(NAFLD)病症。
类似于上文所描述的,Pnpla3和Rab14蛋白的浓度可用于检测肝纤维化病症并任选地评估其严重性。根据另外的实施方案,Plin2蛋白浓度的所述参考数据是与同一患者相关并且在检测所述血液样品的时刻(tn)之前的时刻(t0)检测到的数据,并且其中所述控制单元7被进一步编程以检测疾病随时间的进程。
例如,如果从样品分析中获得的Plin2蛋白浓度的数据大于参考数据,则检测到NAFLD的改善;如果从样品分析获得的Plin2蛋白浓度的数据小于参考数据,则检测到NAFLD的恶化,而如果从样品分析获得的Plin2蛋白浓度的数据等于参考数据,则检测到疾病停滞。
优选地,当两个数据之间的差异为约0至约5%时,从样品分析获得的Plin2蛋白浓度的数据被认为等于参考数据。
该设备的第一和第二优选实施方案通过图4和5中的实例进行说明。
根据一个实施方案,将优选地已经与抗凝剂混合的血液样品引入到设备内部的收集室3中。优选地,设备1可以包括穿刺装置2,其易于刺穿从其中采集所述血液样品的个体的皮肤。例如,穿刺装置2可以适合于在指尖刺穿患者的皮肤。所述穿刺装置特别地包括至少以尖端结束的突出元件,例如针。穿刺装置2承载在设备1的外表面上,并且可以被配置和铰接为以使得在非使用状态下呈现最小防碍的构型,其中尖头元件面向设备1的外表面,以及使用构型,其中尖头元件面向与设备1的外表面相反的方向的方式。在一个优选实施方案中,穿刺装置2可以包括多个具有微米量级尺寸的针,也称为“微针”。有用的是,微针可以相对于彼此放置以形成适于从患者身上采集血液样品的尖头元件矩阵。如此排列的微针允许进行多次皮肤穿刺,以便于提取血液样品。
当根据本说明书的设备直接包括用于获得血液样品的穿刺装置2时,血液样品一旦获得后聚集在上述装置2处,然后通过合适的流体连接装置或用于输送的装置4输送到设备1内部的收集室3中。这种输送可以通过血液样品抽吸进行。特别地,抽吸由用于输送的装置4执行,其在穿刺装置2处具有相应的吸嘴。特别地,用于输送的装置4可以是硅胶隔膜泵或真空微型泵类型。优选地,隔膜泵可以具有以下尺寸:
-高度等于0.6mm;
-宽度等于5mm;
-长度等于5mm。
因此,隔膜泵足够小以易于移动,并且设备几乎不笨重、重量轻且易于携带。
用于输送的装置4还可包括收集管或套管,例如橡胶导管,其中样品可与抗凝剂接触。
或者,通过本文所述的设备独立提取的样品可直接进入收集室,优选在用抗凝剂处理后。
在一个替代实施方案中,样品在与抗凝剂接触之前被引入或输送到收集室3中。
优选地,设备1配备有从血液样品的多形核细胞(PBMC)的分离装置14、5、6、19。
根据本发明,分离装置14、5、6、19可以包括混合装置14,其优选地***至收集室3中,被配置为将所述血液样品与易于分离PBMC的一种组分或组分组混合(在本文中也定义为“PBMC的分离装置”)。例如,所述组分组可包含易于与存在于所述样品中的多形核细胞(PBMC)结合的组分,并且在必要时(即,当所述血液样品尚未用抗凝剂处理时)与抗凝物质结合。
设备1还可包括第一s1贮器和/或第二s2贮器,其中分别容纳有抗凝剂和能够结合多形核细胞的组分,每个贮器s1、s2优选地设有各自的递送装置15。
此外,分离装置14、5、6、19可以包括如下所述的移动装置5和过滤装置6。
由于混合,PBMC与上述组分结合。获得的混合物经受机械振动和/或旋转应力,其通过优选地包含在收集室3中的专用移动装置5的作用进行。特别地,移动装置5可以由至少一个旋转和/或振动输送带实现,在其上如此获得的混合物被输送。
装置5对混合物的应力或搅拌进行预定的持续时间,该持续时间可为5至20分钟、5至15分钟,例如等于约10分钟的时间。持续时间可以例如通过优选连接到同一移动装置5的计时器T来测量。随后,优选地通过同一移动装置5将混合物输送到过滤装置6,更优选地在移动装置5通过输送带实施时。
根据优选的变型实施方案,过滤装置6可以整合到移动装置5中,例如以过滤性输送带的形式。换句话说,输送带的操作表面(其上放置待输送的混合物)可以由过滤材料制成。过滤装置6被配置为保留与PBMC结合的组分并使混合物的剩余部分洗脱,实际上导致与上述组分结合的PBMC的分离。为此,过滤装置6(属于易于分离PBMC的组分组)具有预定截面的转运口,例如以防止转运与PBMC结合的组分,而是允许转运混合物的其余部分。
过滤装置的截断值的选择可以由本领域的技术人员根据与PBMC结合的组分的尺寸容易地进行。无论如何,过滤器截断值应该以这样的方式选择,使得洗脱未与上述组分结合的各种血液样品细胞和组分并保留组分-PBMC复合物。在一个实施方案中,当使用与PBMC特异性抗-抗原抗体缀合的微珠时,过滤装置将具有基于珠粒直径选择的截断值。例如,对于直径为约30μm的珠粒,过滤装置将具有截断值以保留与细胞结合的珠粒并洗脱所有具有更低直径的那些。希望使用市场上已有的试剂,过滤装置6可以通过市场上现有的型技术来实现。
有用的是,分离装置14、5、6、19可以包括多形核细胞(PBMC)与它们所结合的组分的分开装置19,其被配置为有利于所述多形核细胞(PBMC)与所述组分之间的分开。
有利地,分开装置19可以是过滤膜或缓冲液类型。
将保留在过滤装置6上的组分-PBMC化合物用用于分离唯一PBMC的装置或分开装置19处理。PBMC与它们所结合的组分的分离或分开可以例如使用倾向于有利于破坏PBMC与它们所结合的组分之间的键的特定缓冲液(分离缓冲液)进行,因此设备可以包括用于PBMC与它们所结合的组分分离的合适溶液的递送装置。
如此分离的PBMC由收集装置9输送至分析室11,收集装置9包括例如管或导管。所述分析室11优选包括用于暴露PBMC细胞质的装置,例如用于细胞膜的裂解缓冲液。根据一个变型实施方案,直接在收集室3中进行细胞质暴露。
作为本文所描述的替代方案,为了在血液样品中获得PBMC分离,易于分离PBMC的组分组可以包括允许对PBMC具有排斥作用并因此分离它们的微机电***或微滤聚对二甲苯膜。所述膜可具有高达至36mm2的过滤表面和约7%-15%的孔隙率,具有临界尺寸(大小)减小到几微米的不同几何形状(例如圆形、椭圆形和矩形)的孔。同样,可以通过镍电镀技术或通过纸或塑料材料片的过滤来分离血液样品中的PBMC。
在分离PBMC后,对这些进行处理以测量Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白浓度,利用使蛋白存在在一个或多个预定波长处可见且可量化的装置,例如染料缀合的、特别是荧光染料缀合的检测***。这可以通过处理装置16获得,处理装置16优选地包含在分析室11中并且被配置为进行Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白与表现出所述特性的组分或信号组分的结合。在一个实施方案中,PBMC样品用细胞质Plin2裂解的缓冲液处理,优选与结合至在预定波长下发荧光的试剂(例如荧光二抗,例如Alexa488)的抗Plin2单克隆抗体反应。因此,荧光二抗与Plin2缔合。设备1可以进一步包括其中容纳抗体的第三贮器s3,其配备有所述抗体的相应递送装置15。此外,设备1包括安置在分析室11中的光谱仪。优选地,光谱仪配备有一个辐射源12和用于获取图像的装置13,两者例如安置在分析室11(或收集室3)内,面向用于经分离和处理的PBMC的沉积表面。源12在所述沉积表面发射辐射,所述辐射具有预定波长,以使得荧光染料缀合的抗体可见(或呈现特定颜色)的方式,因此以能够通过目视检查挑出Plin2方式。在一个实施方案中,辐射源12被配置为发射波长为340nm至780nm的辐射。优选地,辐射源可以发射波长为488nm的辐射。源12可以包括激光显微荧光计或市场上可获得的其它类似设备。
有利地,光谱仪11可以具有以下尺寸:
-高度为15mm至25mm,优选等于20.1mm;
-宽度为7mm至18mm,优选等于12.5mm;
-深度为5mm至15mm,优选等于10.1mm。
因此,光谱仪11的负担是合理的并且设备1将易于携带。
本领域技术人员基于文献中的简单信息将知道检测目标荧光染料所需的波长。无论如何,该装置可以被制造成能够发射多种波长并因此能够检测多种染料,因此不会因此将所述装置与特定的具体荧光染料结合。
一旦辐射源12被激活,用于获取图像的装置13***作以获取经照射样品的图像,其中Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白是可检测的,并且最重要的是可以被定量(量化)。
设备1优选地包括控制单元7,其连接到所有上述装置和部件,被编程以根据预定操作参数根据自动模式控制和同步它们的致动。所述操作参数可以包括上述装置/部件中的每一个的激活持续时间,以及血液样品压力和/或抽吸速率、其输送速率、从相应贮器s1、s2、s3递送的抗凝剂/PBMC的分离组分/荧光试剂/抗Plin2抗体的量,和/或辐射源的波长。同样,控制单元7可以包括或连接到接口装置8,其被配置为允许用户控制设备1的激活和/或修改/选择上述操作参数。所述接口装置8可以包括设备1的至少一个开机按钮。
此外,控制单元7可以包括图像处理微处理器,其被编程为鉴定Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14的存在并定量由装置13获取的图像中的蛋白质。同样,微处理器可以被编程为量化在获取的图像中检测到的Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白浓度并输出所述数据。输出数据可以传输到外部电子设备,例如通过包含在设备1本身中的有线或无线连接装置,或者传输到可以集成在上述接口装置8中的显示装置,例如,包括显示器。
本发明的设备1,特别是控制单元7的微处理器,可以进一步优选地被编程用于将通过分析由装置13获取的图像而获得的Plin2蛋白浓度的数据与Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白浓度的参考数据进行自动比较,该参考数据可以是与健康受试者相关的Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14(为简单起见,下文中为参考数据)。在这种情况下,设备具有专门的诊断功能。
上述参考数据也可以存储在存储模块中,例如包含在中央单元7中并连接到微处理器,其中还可以存储对其进行分析的由设备本身对同一患者先前检测的Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白浓度的数据,以便跟踪疾病的演变或评估治疗性治疗的有效性。
特别地,接口装置可以被配置为显示其中示出了作为时间函数检测的Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14浓度值的模式的图表。
此外,接口装置8可以被配置为根据通过分析获得的Plin2蛋白和/或Pnpla3和/或Rab14浓度的数据与参考数据的比较结果,自动显示根据预定颜色代码的视觉信号,和/或再现声学信号。
例如,参考Plin2蛋白;当对疾病进展进行监测时,如果从样品分析中获得的Plin2蛋白浓度的数据小于参考数据,则检测到NAFLD的改善,这可以对应于绿灯的开启。相反,如果从样品分析中获得的Plin2蛋白浓度的数据大于参考数据,则检测到NAFLD的恶化,这可以对应于红灯的开启和/或声学警报的再现。同样,如果从样品分析中获得的Plin2蛋白浓度的数据等于参考数据,则检测到疾病停滞,这可以对应于黄灯的开启。
在诊断用途的情况下,可以使用类似的***。
此外,通过相同的接口装置8可以修改和/或选择不同的参考数据,和/或修改光/声信号显示/自动再现设置。
优选地,设备1被实施为便携的,以允许也在相对于医院或医疗中心分布的地点中测量Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白浓度。特别地,设备1可以包括允许其独立的自身供电装置,例如可充电电池和/或光伏或风能再充电设备。
设计的设备具有许多与各种部件的尺寸相关,特别是与穿刺装置2、光谱仪和泵4的尺寸相关的优点。如此尺寸的所述部件的组合允许便携式装置1易于携带和使用,重量轻并且减少负担。
将理解根据所描述的便携式设备是如何能够被理解为适合于,除了Plin2蛋白质浓度的测量之外,还允许测量血清/血浆或PBMC中其它蛋白类型的浓度,具有在本领域技术人员能力范围内的适当的适应性和必要的修改。
在这点上,设备1可以包括连接单元,优选地“***式”单元,其被配置为使设备适应其它生物标志物。
根据一个替代实施方案,设备可以包括在它们之间分开的多个分析室11,每个室被配置为测量血液样品中不同蛋白质的浓度,所述蛋白质选自以下:Plin2、Pnpla3和Rab14。
因此,该设备是多用途的,能够确定不同蛋白质的浓度,并因此允许如前文所述确定不同病理的发生和等级。
优选地,该设备可以包括选择装置,所述选择装置可操作地连接到控制单元7并且被配置为将血液样品发送到基于待确定的蛋白质浓度选择的正确分析室11。选择装置可以由控制单元7控制,后者被配置为发送包含关于待确定的蛋白质浓度的信息的输入数据。根据上述输入数据,选择装置将血液样品转移到某个分析室11中。
有利地,设备可以包括至少一个处理单元,所述处理单元被配置为根据下文报道的一个或多个实例来实现计算机程序。
有用的是,处理单元可以操作地连接到控制单元7。因此,设备可以使用在分析室11中检测到的数据来实施下文描述的计算机程序。
本发明的设备可以用合适的计算机程序来实施,例如,如下文根据预期用途和人们希望在本文描述和本文要求保护的那些中执行的方法限定的。
因此,本发明的目的是以下列出的计算机程序:
用于诊断待分析个体中的NAFLD或NASH的计算机程序,其包含指令列表,当指令列表在电子计算机上执行时,被提供所述待分析个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的第一浓度值以及如本说明书所限定的蛋白质浓度的第二值C0和第三值C1,执行以下步骤:
将所述第一值与所述第二值和第三值进行比较,和
当所述第一值大于或等于所述值C0且小于所述值C1时诊断为NAFLD,或当所述血液样品中的所述第一值大于或等于所述值C1时诊断为NASH。
用于诊断待分析个体中的NAS评分的计算机程序,其包含指令列表,当指令列表在电子计算机上执行时,被提供所述待分析个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的第一浓度值、如本说明书所限定的Plin2蛋白浓度的第二值C3、第三值C4和第四值C5,执行以下步骤:
将所述第一值与所述第二值、第三值、第四值进行比较,并且将NAS评分诊断为:
当所述第一值大于或等于所述截断值C2且小于或等于所述截断值C3时,NAS评分1,
当所述第一值大于所述值C2且小于或等于所述截断值C4时,NAS评分2,
当所述第一值大于所述值C4时,NAS评分3。
用于诊断待分析个体中的NASH严重性的计算机程序,其包含指令列表,当指令列表在电子计算机上执行时,被提供所述待分析个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的第一浓度值、如本说明书所限定的Plin2蛋白浓度的第二值C5、第三值C6、第四值C7,执行以下步骤:
将所述第一值与所述第二值、第三值、第四值进行比较并且将NASH的严重性等级诊断为:
当所述第一值大于所述值C5且小于所述值C6时,轻度,
当所述第一值大于所述值C6且小于所述值C7时,中度,并且
当所述第一值大于所述值C7时,严重。
用于诊断待分析个体中的肝纤维化的计算机程序,其包含指令列表,当指令列表在电子计算机上执行时,被提供所述待分析个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Pnpla3和Rab14蛋白的第一浓度值以及如权利要求11所限定的Pnpla3和Rab14蛋白的第二浓度值C8,执行以下步骤:
将所述第一值与所述第二值进行比较,和
当所述第一值大于C8时诊断为肝纤维化。
用于诊断用于诊断待分析个体中肝纤维化的阶段的计算机程序,其包含指令列表,当指令列表在电子计算机上执行时,被提供所述待分析个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Pnpla3和Rab14蛋白的第一浓度值,如本说明书所限定的Pnpla3和Rab14蛋白浓度的第二值C9、第三值C10和第四值C11,执行以下步骤:
将所述第一值与所述第二值、第三值、第四值进行比较并且将纤维化评分阶段诊断为:
当所述第一值大于或等于所述值C9且小于所述值C10时,阶段1,
当所述第一值大于或等于所述值C10且小于或等于所述值C11时,阶段2,和
当所述第一值大于所述值C11时,阶段3。
或者,上述用于诊断NAFLD、NAS评分、NASH、NASH的严重性等级的计算机程序可以包括用于诊断肝纤维化和/或肝纤维化阶段的上述两个指令列表之一。
本发明的目的还在于一种用于监测患者中NAFLD或NASH的治疗性治疗的有效性的计算机程序,其包含指令列表,当指令列表在电子计算机上执行时,被提供时刻t0时所述患者的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的第一浓度值和t0之后的时刻时所述患者的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的第二浓度值,执行以下步骤:
将所述第一值与所述第二值进行比较,并且
如果所述第二值小于所述第一值,则检测到所述治疗性治疗的有效性;
以及一种用于监测患者中NAFLD或NASH的进展的计算机程序,其包含指令列表,当指令列表在电子计算机上执行时,被提供时刻t0时所述患者的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的第一浓度值和t0之后的时刻时所述患者的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的第二浓度值,执行以下步骤:
将所述第一值与所述第二值进行比较,并且
如果所述第二值小于所述第一值,则检测到NAFLD或NASH的改善,
如果所述第二值大于所述第一值,则检测到NAFLD或NASH的恶化,
如果所述第二值近似等于所述第一值,则检测到NAFLD或NASH的停滞。
本发明的目的是在上述和要求保护的任何实施方案中的设备,还包括至少一个处理单元,所述处理单元被配置为实现根据一个或多个上述实例的计算机程序。
有用的是,处理单元可以可操作地连接到控制单元7。因此,设备可以使用在分析室11中检测到的数据来实施上述计算机程序。
本发明的目的还在于使用上述任一实施方案中的设备来实施本发明的方法目的。
最后,本发明的目的是一种用于治疗患有NAFLD的患者的治疗方法,对所述患者进行本文所述的监测。
实施例
方法
19名患有NAFLD的男女肥胖受试者(10名女性和9名男性,平均年龄为38.5±1.9岁,BMI为36.79±4.43kg/m2)被纳入并接受了减肥手术。在入组时夜间禁食12小时后,收集外周静脉血并添加EDTA。患者签署了对研究和手术干预的知情同意书。
收集所有受试者的既往病历。还进行了包括身高、体重和人体测量在内的客观检查。体重指数(BMI)是体重(kg)除以身高(m2)计算的。收集了使用药物的详细列表。
排除标准是:(1)经常和/或过量饮酒(女性>20g酒精/天,男性>30g酒精/天);(2)继发于医源性胃肠道或免疫缺陷(HIV感染)疾病的NAFLD的临床证据;(3)非NAFLD肝脏疾病的临床证据,包括乙型或丙型肝炎,或血色素沉着症,(4)威尔逊病,(5)糖原增多症,(6)α-1抗胰蛋白酶缺乏症,(7)自身免疫性肝炎,(8)胆汁淤积性肝病,(9)存在相关的心血管、胃肠道或呼吸***疾病,或任何激素紊乱,(10)失代偿性肝病的临床证据(Child-Pugh评分>7分),(11)正在滥用麻醉品,(12)相关全身性疾病(13)妊娠。
在手术过程中获得肝活检。
所有受试者均接受口服葡萄糖耐量试验(OGTT),并在0、30、60、90、120、150和180分钟时进行收集,以测量血液胰岛素和糖水平(血糖)。胰岛素敏感性被测量为OGIS(口服葡萄糖胰岛素敏感性(Oral Glucose Insulin Sensitivity)的首字母缩写词),这是一种能够从OGTT计算胰岛素敏感性的方法。OGIS产生的指数类似于使用夹钳获得的胰岛素敏感性指数(Mari A,Pacini G,Brazzale AR,Ahrén R.Comparative evaluation of simpleinsulin sensitivity methods based on the oral glucose tolerancetest.Diabetologia 2005;48:748-751)。
肝脏组织学
将置于***下的肝活检碎片用60%异丙醇彻底清洗,然后异丙醇蒸发。添加油红O(Oil Red O,ORO)溶液10分钟,然后取出,将样品用水洗涤4次。去除油红O后,将这些碎片在100%异丙醇中孵育。单核细胞也进行相同的ORO染色。
然后在装有适当滤光器的LSM 510共聚焦显微镜下观察样品。
此外,将手术期间获得的一部分活检材料安装在储存载玻片上,由固定在10%***中的碎片包埋在石蜡块中并用苏木精和伊红染色制备的,以评估脂肪变性百分比。载玻片读数由肝脏解剖病理学家专家在盲条件下进行。
Brunt分类(Brunt EM,Janney CG,Di Bisceglie AM,等人.Nonalcoholicsteatohepatitis:a proposal for grading and staging the histologicallesions.Am J Gastroenterol.1999;94:2467–2474)用于评估组织学评分和NAFLD/NASH(非酒精性脂肪性肝炎)阶段。具体而言,脂肪变性根据小叶中的脂肪定义为以下评分:0,无(<1%);1,1%-25%;2,26%-50%;3,51%-75%;和4>75%。炎症接受以下评分:1,轻度(淋巴细胞在汇管区内和小叶中分离(散布)或聚集成小结构);2,中度(如等级1,另外具有更大的汇管区和小叶浸润);和3,严重(与等级2相同,另外具有更严重炎症)。纤维化阶段为:0,不存在;1,在小叶中心细胞周时;2,在汇管区周和细胞周时;3,桥接纤维化;4,肝硬化。
单核细胞分离
通过在Ficoll-Hypaque(GE Healthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ)上的标准梯度离心从全血获得PBMC。然后洗涤PBMC,并通过Pan单核细胞分离试剂盒分离单核细胞。
肝细胞分离
将肝活检碎片切碎并在HBSS中洗涤以去除血迹。然后将组织转移到含有EGTA缓冲液(HBSS,0.5mM EGTA,0.5%BSA)的50ml试管中,并在保持37℃的水浴中以100rpm搅拌10分钟。然后将组织放入消化缓冲液(HBSS,0.05%胶原酶IV,0.5%不含脂肪酸的BSA,10mMCaCl2)中,并在保持37℃的水浴中以100rpm搅拌10分钟。收集上清液并通过100μm孔过滤器过滤,将细胞悬浮液在4℃下以80rpm离心5分钟,弃去上清液。
脂滴染色
将分离的单核细胞和肝细胞与4%***孵育20分钟,并用尼罗红(100ng/mL)染色。细胞核用DAPI染色。
用Spinning Disk共聚焦显微镜;Crest X-Light Confocal Imager(Germany)拍摄照片,并且用MetaMorph Microscopy Automation&Image Analysis Software(Molecular Device)分析图像。
Plin2测量
将单核细胞和肝活检在含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中匀浆化。匀浆在4℃下以13.000rpm离心30分钟。蛋白质含量用Bradford Protein Assay(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)测量。蛋白质裂解物(30μg)在10%SDS-PAGE上分离并转移到PVDF膜上。膜与抗Plin2抗体(LS-BIO,Seattle,WA)和抗β肌动蛋白一起孵育过夜。使用Chemidoc XRS Image***和Image Lab 5.0软件(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)进行定性定量分析。所有数据都相对于β肌动蛋白水平(8H10D10)进行归一化。
统计
当没有另外说明时,数据表示为平均值±SD。Spearman相关性用于衡量两个变量的相关程度。两种方法之间的一致性通过Bland-Altman图来衡量。Bland-Altman结果显示了使用两种方法(单核细胞和肝脏中的Plin2水平)获得的差异和平均值。两种方法之间差异的标准偏差(SD)是SD偏差。一致性限制测量为平均偏差,即两种测量方法之间差异的平均值±1.96的SD偏差。
通过神经网络分析研究了方法的灵敏度和特异性。神经网络分析参数报告如下:使用了2个输入层:单核细胞中的Plin2和受试者的年龄。仅1个隐藏层,包含6个单位和双曲(正切)激活函数。输出层是因变量,即NAS水平。激活函数:Softmax,误差函数:交叉熵(Cross-Entropy)。
神经网络分析提供ROC(受试者操作特征)曲线的曲线下面积(AUC)。ROC曲线在X轴上具有灵敏度,在Y轴上具有假阳性的数量(1-特异性)。AUC最接近1时,测试的预测值最好。采用SPSS 13版进行统计分析。
结果
肝脂肪变性的等级通过肝活检和如上定义的NAFLD活动评分(NAS)进行评估,组织学方法定义NAFLD等级,所有检查患者的脂肪变性等级平均值为2.42±1.17,受试者表现出1至4的脂肪变性等级。
为了证明在单核细胞中也发生异位脂肪积累,使用尼罗红对肝活检和单核细胞进行染色(图1,小图A)。在单核细胞中,脂质聚集成更大的液滴。
单核细胞中的Plin2表达与肝脏中的Plin2表达呈强正相关(R=0.84P<0.0001)。通过蛋白质印迹进行的Plin2蛋白表达的实例报告在图1的小图B中。
相反,图2报告了同一受试者的肝脏切片和单核细胞中的ORO染色。
肝脏中的Plin2水平与肝脂肪变性的等级良好相关(R=0.91,P<0.001),单核细胞中的Plin2水平与肝脂肪变性的等级良好相关(R=0.89,P<0.001)。
图3报告了比较两种方法(即单核细胞和肝脏中的Plin2水平)的Bland-Altman图。两种测量获得的值之间的差异在Y轴上报告,而平均值在Y轴上。虚线报告了两种测量之间95%的置信界限。该图表明所有点都在置信界限内,意味着本发明的方法是有效的。
还发现通过细胞荧光法在单核细胞中测量的以中值荧光强度(MFI,图4)表示的Plin2水平与通过蛋白质印迹测量的Plin2水平之间存在良好的相关性(R=0.92;P<0.0001)。
PBMC中的Plin2水平(MFI)为48.88±5.80(SEM),表明与单核细胞中的水平42.90±5.77(SEM)具有极好的相关性(R=0.98,P=0.0004)。
作为非酒精性肝脂肪变性严重性与Plin2水平相关性的证据,发现肝脏和单核细胞中的Plin2水平与以OGIS表示的胰岛素敏感性呈负相关,单核细胞的回归方程为
OGIS=-44.59*Plin2+411.3
其中R2为0.91,并且P<0.0001
OGIS是口服葡萄糖胰岛素敏感性指数的首字母缩写,测量单位ml x min-1 x m-2。Plin2通过蛋白质印迹以与β-肌动蛋白参考蛋白相关的单位测量。
对患者的分析
91名受试者接受了疑似NASH的肝活检,而接受选择性胆囊切除术且体重指数正常且肝脏超声检查阴性的21受试者(对照组)在手术期间接受了肝核心活检。年龄为18至67岁,女性占55%,男性占45%。
组织学检查突出了NAFLD活动评分(NAS)的各个阶段。
通过细胞荧光法分析的循环单核细胞中的Plin2水平用于预测NAS。
在对照中,一些的NAS=0,其它的NAS=1。
细胞荧光法
针对Plin2的单克隆抗体获自LS-BIO(Seattle,WA),荧光团结合的第二单克隆抗体AlexaFluor 488来自Life Technology(Carlsbad,CA),抗CD14-ECD抗体来自BeckmanCoulter(Brea CA)。
通过使用用于鉴定所有多形核细胞中的单核细胞群的抗CD14-ECD抗体鉴定单核细胞。单核细胞通过如下文报告的标准技术进行固定和透化。
将1份固定/透化浓缩液与3份固定/透化稀释剂混合。将细胞沉淀(2x106个细胞)重新悬浮在300μL的1X透化缓冲液中,并在+4℃下孵育45分钟。用1X磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,离心,然后将细胞重新悬浮在100μL的1X PBS中。将悬浮细胞分到2个试管(每个50μL)中。
·试管1:悬浮细胞用IgG抗体Alexa Fluor 488(1:2000)在室内环境和黑暗中染色20分钟。该试管为阴性对照。
试管2:悬浮细胞用抗-Plin2(50μl中的1μl)染色,然后用IgG抗体Alexa Fluor488和抗CD14-ECD抗体(50μl中的4μl)在室内环境和黑暗中染色20分钟。
将其洗涤、离心并重新悬浮在500μL的1X PBS中,然后进行细胞荧光分析。
因此,使用抗Plin2的单克隆抗体和结合抗Plin2抗体的与荧光团结合的二抗(AlexaFluor488)对单核细胞进行Plin2染色。
用于细胞荧光法的仪器是FC 500(Beckman Coulter,Brea,CA),数据用Kaluza软件(Beckman Coulter,Brea,CA)进行分析。
Plin2检测通过荧光示踪剂获得,该荧光示踪剂产生信号,该信号由细胞荧光计光电二极管拾取,并转化为平均荧光强度(MFI)。
MFI与识别且结合细胞抗原(在本文情况下为Plin2)的抗体数量成比例,从而实现蛋白质定量(Mizrahi O.,Shalom E.I.,Baniyash M.,Klieger Y.Quantitative flowcytometry:concerns and recommendations in clinic and research.Cytometry BClin Cytom.2017)。
在组织学上,NAFLD被定义为脂肪变性影响超过5%的肝细胞,而NASH则被定义为除脂肪变性外还存在任何等级的肝细胞气球样变性和小叶炎症浸润,而无论其数量如何。NAFLD活动评分(NAS)由肝组织的脂肪变性、肝细胞气球样变性和小叶炎症浸润的组合产生。从下表中可以看出,由单组分的总和产生的最高评分为8。
(Kleiner D.E.,Brunt E.M.,Van Natta M.,Behlinh C.,Contos M.J.,CummingsO.W.,Ferrell L.D.,Liu Y.-C.,Torbenson M.S.,Unalp-Arida A.,Yeh M.,McCulloughA.J.,Sanyal A.J.for the Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical ResearchNetwork.Design and validation of a histological scoring system fornonalcoholic fatty liver disease.Hepatology 41:1313-1321,2005)
不同NAS阶段的Plin2(平均荧光强度[MFI])水平报告在下表中:
如下文所述,平均Plin2水平(MFI)与NAS阶段之间的相关性非常好。
X轴上的自变量是Plin2的平均值,而因变量是NAS阶段(图7)。
自变量是平均值_Plin2
R2极高(0,985),具有P<0.0001显著性,表明用于预测NASH组织学阶段的模型(即NAS)非常好。
ANOVA
自变量是平均值_Plin2
通过神经网络分析研究了Plin2预测各种NAS阶段的能力。
神经网络分析参数在下文报道。使用了2个输入层:单核细胞中的Plin2和受试者的年龄。仅1个隐藏层,包含6个单位和双曲(正切)激活函数。输出层是因变量,即NAS层。激活函数:Softmax,误差函数:交叉熵。
网络信息
a.排除偏差单位
该设计预测的不正确的NAS值在训练期间仅为6.3%的病例,并且在0.05秒测试期间为11.35%的病例,如下文报告的。
模型概况
因变量:NAS
a.误差计算基于测试样品
数据表明,受试者操作特征(ROC)的曲线下面积(AUC)非常高,范围从最小值0.974到最大值1。
所有阶段以很高的灵敏度和特异性可预测。
ROC分析的曲线下面积
在模型中Plin2变量的重要性在下文中报告,并且为68.3%,但当归一化后达到100%,而模型中使用的第二个变量(即年龄)的重要性为31.7%,并且当归一化后为46.3%。
自变量重要性
(参见图8)
对重复推断(即多重比较)进行调整的多重比较分析证明了不同NAS阶段之间差异的高显著性,见下表。
ANOVA
单核细胞Plin2
多重比较
因变量:单核细胞Plin2
*.平均差在0.05水平显著
总之,单核细胞中的Plin2可高度预测NASH严重性阶段(即NAS评分),并能够用外周血检查代替活检等侵入性检查。
纤维化
通常在单核细胞中的含Patatin样磷脂酶结构域蛋白3(Pnpla3)(Sigma AldrichSAB1401851)和Ras相关蛋白Rab-14(Sigma Aldrich R0656)的含量通过细胞荧光法通过肝脏和单核细胞分离的组织学检查在总共132名受试者中进行测定。
如下,SAF纤维化的F0到F4的每个阶段的平均值(MFI)(Bedossa P,Poitou C,Veyrie N,Bouillot JL,Basdevant A,Paradis V,等人.Histopathological algorithmand scoring system for evaluation of liver lesions in morbidly obesepatients.Hepatology 2012;56:1751–1759)。
ANOVA
然后使用单核细胞Pnpla3和单核细胞Rab14作为自变量,NAS作为因变量,并且存在或不存在糖尿病作为协变量(二元变量,是=1,否=0)进行神经网络分析以计算ROC曲线的AUC。这些变量用于神经网络的输入层。仅1个隐藏层,具有8个单位,激活函数是hyperbole。模型的输出为纤维化等级(SAF F),激活函数为softmax,误差函数为交叉熵。
病例进展概况
网络信息
a.排除偏差单位
因变量:SAF F
a.误差计算基于测试样品
在模型训练期间,错误百分比为14.3%,并且在测试期间为0%测试,所用时间为0.05分钟。
ROC分析的曲线下面积(AUC)报告在下表中:
ROC AUC
因此,阶段0(即无纤维化)预测为100%,阶段1为95%,阶段2为100%,并且阶段3为95.5%。
在模型中自变量(单核细胞Pnpla3和单核细胞Rab14)的重要性:单核细胞Pnpla3的重要性为62%,但当归一化后为100%;单核细胞Rab14的重要性为29.7%,归一化后达到47.9%;并且糖尿病的存在或不存在的重要性为0.84%,归一化后为13.5%。
自变量重要性
(参见图9)
因此,使用Pnpla3和Rab14能够提供非常准确的纤维化信息。
然而,单独的Plin2也给出了纤维化的良好指示。
病例进展概况
网络信息
a.排除偏差单位
因变量:SAF F
a.误差计算基于测试样品
不正确预测的百分比在训练期间为:14.3%,并且在测试期间为:20%。
下文报道的用于定义纤维化的Plin2的ROC AUC:对于纤维化的阶段0为98.9%,阶段1为94%,阶段2为97%,阶段3为98.8%,阶段4为100%。
曲线下面积
在诊断纤维化中单核细胞中Pin2的重要性为49.2%,并且在归一化后为96.8%,糖尿病存在或不存在的重要性为50.8%,并且归一化后为100%,如表和图10报告的。
自变量重要性
ANOVA
单核细胞Plin2
多重比较
因变量:单核细胞Plin2
*.平均差在0.05水平显著
Claims (45)
1.一种用于诊断非酒精性肝脂肪变性(NAFLD)和/或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法,包括步骤:
a.测量个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.将a点中获得的值与健康个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值进行比较,
c.当a中测量的值大于b中测量的值时,诊断为NAFLD和/或NASH。
2.一种用于诊断NAFLD或NASH的方法,包括步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.测量来自患有NAFLD的患者和健康患者的血液样品的群体中Plin2蛋白的浓度值,并鉴定患有NAFLD的患者与健康患者之间所述浓度的截断值C0,并且测量来自患有NASH的患者和健康患者的血液样品的群体中Plin2蛋白的浓度值,并鉴定患有NASH的患者与健康患者之间所述浓度的截断值C1,
c.将a点中获得的值与b点中获得的截断值进行比较,
d.当a中获得的值大于或等于所述值C0且小于所述值C1时诊断为NAFLD,或当a中获得的值大于或等于所述值C1时诊断为NASH。
3.一种用于诊断患有NAFLD或NASH的患者的NAS评分的方法,包括步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.测量来自患有NAFLD或NASH的患者和健康患者的血液样品的群体中Plin2蛋白的浓度值,其中,在包含来自患有NAFLD的患者的样品的所述群体中,基于肝细胞中脂肪变性的百分比、气球样肝细胞的发生、小叶炎症的存在和汇管区炎症的存在,将NAS评分值在所述患者中在组织学上定义为NAS1、NAS2和NAS3,并且鉴定:
健康患者与患有NAS评分1的NAFLD的患者之间所述浓度的截断值C2;
患有NAS1的NAFLD的患者与患有NAS评分2的NAFLD的患者之间所述浓度的截断值C3;和
患有NAS2的NAFLD的患者与患有NAS评分3的NASH的患者之间所述浓度的截断值C4;
c.将a点中获得的值与b点中获得的截断值进行比较,
d.将所述NAS评分诊断为:
当a中获得的值大于或等于所述截断值C2且小于或等于所述截断值C3时,NAS评分1,
当a中获得的值大于所述值C2且小于或等于所述截断值C4时,NAS评分2,
当a中获得的值大于所述值C4时,NAS评分3。
4.一种用于诊断NASH的严重性等级的方法,包括步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.测量来自患有NASH的患者和健康患者的血液样品的群体中Plin2蛋白的浓度值,其中,在包含来自患有NASH的患者的样品的所述群体中,基于肝细胞中脂肪变性的百分比、气球样肝细胞的发生、小叶炎症的存在和汇管区炎症的存在,将病理学的严重性等级在所述患者中在组织学上定义为轻度、中度或严重,并且鉴定:
健康患者与患有轻度NASH的患者之间所述浓度的截断值C5;
患有轻度NASH的患者与患有中度NASH的患者之间所述浓度的截断值C6;和
患有中度NASH的患者与患有严重NASH的患者之间所述浓度的截断值C7,
c.将a点中获得的值与b点中获得的截断值进行比较,
d.将NASH的严重性等级诊断为:
当a中获得的值大于所述值C5且小于所述值C6时,轻度,
当a中获得的值大于所述值C6且小于所述值C7时,中度,并且
当a中获得的值大于所述值C7时,严重。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述Plin2蛋白的所述浓度值通过蛋白质印迹、或细胞荧光法、或ELISA、或定量PCR来测量。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述Plin2蛋白的所述浓度值使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Plin2并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量,并且所述截断值以平均荧光强度(MFI)表示。
7.用于诊断NAFLD或NASH的方法,包括步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,其中所述值使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Plin2并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量,
b.将a点中获得的值与以平均荧光强度(MFI)表示的等于2.7MFI的所述浓度的截断值和等于1.0MFI的所述浓度的截断值进行比较,
d.当a中获得的值大于或等于1.0MFI且小于或等于2.7MFI时诊断为NAFLD,或当a中获得的值大于2.7MFI时诊断为NASH。
8.一种用于诊断患有NAFLD或NASH的患者的NAS评分的方法,包括步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,其中所述值使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Plin2并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量,
c.将a点中获得的值与以平均荧光强度(MFI)表示的等于1.0MFI、1.4MFI和2.7MFI的所述浓度的截断值进行比较,
d.当a中获得的值大于或等于1.0MFI的截断值且小于或等于1.4MFI的截断值时诊断为NAS评分1;当a中获得的值大于1.4MFI的截断值时诊断为NAS评分2;或当a中获得的值大于2.7MFI的截断值时诊断为NAS评分3。
9.一种用于诊断NASH的严重性等级的方法,包括步骤:
a.测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,其中所述值使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Plin2并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量,
c.将a点中获得的值与以平均荧光强度(MFI)表示的等于2.7MFI、4MFI和6.3MFI的所述浓度的截断值进行比较,
d.当a中获得的值大于2.7MFI的截断值且小于或等于4MFI的截断值时诊断为轻度形式的NASH,当a中获得的值大于4MFI的截断值且小于或等于6.3MFI的值时诊断为中度形式的NASH,并且当a中获得的值大于6.3MFI时诊断为严重形式的NASH。
11.根据权利要求2至10中任一项所述的方法,还包括步骤:
e.在诊断NASH的a点中测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Pnpla3和Rab14蛋白的浓度值,
f.测量来自患有肝纤维化的患者和健康患者的血液样品的群体中Pnpla3和Rab14蛋白的浓度值,并鉴定患有肝纤维化的患者与健康患者之间所述浓度的截断值C8,
g.将e点中获得的值与f点中获得的截断值进行比较,
h.当e点中获得的值大于所述值C8时诊断为肝纤维化。
12.根据权利要求2至11中任一项所述的方法,还包括步骤:
e.在诊断NASH的a点中测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Pnpla3和Rab14蛋白的蛋白质浓度值,
f.测量来自健康患者和患有肝纤维化的患者的血液样品的群体中Pnpla3和Rab14蛋白的浓度值,其中基于肝纤维化的位置和扩展,将所述病理学的严重性等级在组织学上定义为阶段1、阶段2或阶段3,并且鉴定:
健康患者与患有阶段1肝纤维化的患者之间所述浓度的截断值C9;
患有阶段1肝纤维化的患者与患有阶段2肝纤维化的患者之间所述浓度的截断值C10;和
患有阶段2肝纤维化的患者与患有阶段3肝纤维化的患者之间所述浓度的截断值C11,
g.将e点中获得的值与f点中获得的截断值进行比较,
h.将肝纤维化的阶段诊断为:
当e点中获得的值大于或等于所述值C9且小于所述值C10时,阶段1,
当e点中获得的值大于或等于所述值C10且小于或等于所述值C11时,阶段2,和
当e点中获得的值大于所述值C11时,阶段3。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的方法,其中Pnpla3和Rab14蛋白的所述浓度值通过蛋白质印迹、或细胞荧光法、或ELISA、或定量PCR来测量。
14.根据权利要求13所述的方法,其中Pnpla3和Rab14蛋白的所述浓度值使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Pnpla3并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体和特异性结合Rab14并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量。
15.根据权利要求2至14中任一项所述的方法,还包括步骤:
e.在诊断NASH的a点中测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Pnpla3和Rab14蛋白的浓度值,其中所述值使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Pnpla3并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体和特异性结合Rab14并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量,
g.将e点中获得的值与以平均荧光强度(MFI)表示的大于或等于1.24MFI的截断值进行比较,
h.当在e点中获得的值大于或等于1.24MFI时诊断为肝纤维化。
16.根据权利要求2至14中任一项所述的方法,还包括步骤:
e.在诊断NASH的a点中测量血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Pnpla3和Rab14蛋白的浓度值,其中所述值使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Pnpla3并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体和特异性结合Rab14并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量,并且所述截断值以平均荧光强度(MFI)表示,
g.将a点中获得的值与以平均荧光强度(MFI)表示的等于1.24MFI、2.3MFI和3.10MFI的所述浓度的截断值进行比较,
h.当e点中获得的值大于或等于1.24MFI且小于2.4MFI时诊断为轻度阶段1肝纤维化,当e点中获得的值大于或等于2.4MFI且小于3.10MFI时诊断为阶段2纤维化,并且当e点中获得的值大于或等于3.10MFI时诊断为阶段3肝纤维化。
18.一种用于监测患者中NAFLD或NASH的治疗性治疗的有效性的方法,包括步骤:
a.在开始进行所述监测的时刻t0测量患有NAFLD或NASH的个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.在一个或多个时刻tn测量患有NAFLD或NASH的个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,其中n是大于0的整数,并且在其中每个tn对应于t0之后的时刻,其中
一个或多个所述时刻tn中Plin2蛋白浓度的降低指示所述治疗性治疗的有效性。
19.一种用于监测患者中NAFLD或NASH的进展的方法,包括步骤:
a.在开始进行所述监测的时刻t0测量患有NAFLD或NASH的个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,
b.在一个或多个时刻tn测量患有NAFLD或NASH的个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的浓度值,其中n是大于0的整数,并且在其中每个tn对应于t0之后的时刻,其中
一个或多个所述时刻tn中Plin2蛋白浓度的降低指示NAFLD或NASH的改善,而一个或多个所述时刻tn中Plin2蛋白浓度的升高指示NAFLD或NASH的恶化。
20.根据权利要求18或19中任一项所述的方法,其中所述Plin2蛋白的所述浓度值通过蛋白质印迹、或细胞荧光法、或ELISA、或定量PCR来测量。
21.根据权利要求19所述的方法,其中所述Plin2蛋白的所述浓度值使用用合适的荧光染料标记的特异性结合Plin2并且不结合其它蛋白质的单克隆抗体通过细胞荧光法测量。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法,其中所述血液样品是外周血液样品。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法,其中所述白细胞是多形核细胞和/或单核细胞。
25.一种用于诊断待分析个体中的NAFLD和/或NASH的计算机程序,包含指令列表,当所述指令列表在电子计算机上执行时,被提供所述待分析个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的第一浓度值和健康个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的第二浓度值,执行以下步骤:
将所述第一值与所述第二值进行比较,和
当所述第一值大于所述第二值时,诊断为NAFLD和/或NASH。
26.一种用于诊断待分析个体中的NAFLD或NASH的计算机程序,包含指令列表,当所述指令列表在电子计算机上执行时,被提供所述待分析个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的第一浓度值和如权利要求2所限定的蛋白质浓度的第二值C0和第三值C1,执行以下步骤:
将所述第一值与所述第二值和所述第三值进行比较,和
当所述第一值大于或等于所述值C0且小于所述值C1时诊断为NAFLD,或当所述血液样品中的所述第一值大于或等于所述值C1时诊断为NASH。
27.一种用于诊断待分析个体中的NAS评分的计算机程序,包含指令列表,当所述指令列表在电子计算机上执行时,被提供所述待分析个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的第一浓度值、如权利要求3所限定的Plin2蛋白浓度的第二值C3、第三值C4和第四值C5,执行以下步骤:
将所述第一值与所述第二值、所述第三值、所述第四值进行比较,并且将NAS评分诊断为:
当所述第一值大于或等于所述截断值C2且小于或等于所述截断值C3时,NAS评分1,
当所述第一值大于所述值C2且小于或等于所述截断值C4时,NAS评分2,
当所述第一值大于所述值C4时,NAS评分3。
28.一种用于诊断待分析个体中的NASH严重性的计算机程序,包含指令列表,当所述指令列表在电子计算机上执行时,被提供所述待分析个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的第一浓度值、如权利要求4所限定的Plin2蛋白浓度的第二值C5、第三值C6、第四值C7,执行以下步骤:
将所述第一值与所述第二值、所述第三值、所述第四值进行比较,并且将NASH的严重性等级诊断为:
当所述第一值大于所述值C5且小于所述值C6时,轻度,
当所述第一值大于所述值C6且小于所述值C7时,中度,并且
当所述第一值大于所述值C7时,严重。
29.一种用于诊断待分析个体中的肝纤维化的计算机程序,包含指令列表,当所述指令列表在电子计算机上执行时,被提供所述待分析个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Pnpla3和Rab14蛋白的第一浓度值,和如权利要求11所限定的Pnpla3和Rab14蛋白的第二浓度值C8,执行以下步骤:
将所述第一值与所述第二值进行比较,和
当所述第一值大于C8时诊断为肝纤维化。
30.一种用于诊断待分析个体中肝纤维化的阶段的计算机程序,包含指令列表,当所述指令列表在电子计算机上执行时,被提供所述待分析个体的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Pnpla3和Rab14蛋白的第一浓度值,如权利要求12所限定的Pnpla3和Rab14蛋白浓度的第二值C9、第三值C10和第四值C11,执行以下步骤:
将所述第一值与所述第二值、所述第三值、所述第四值进行比较,并且将纤维化评分阶段诊断为:
当所述第一值大于或等于所述值C9且小于所述值C10时,阶段1,
当所述第一值大于或等于所述值C10且小于或等于所述值C11时,阶段2,和
当所述第一值大于所述值C11时,阶段3。
31.一种用于监测患者中NAFLD或NASH的治疗性治疗的有效性的计算机程序,包含指令列表,当所述指令列表在电子计算机上执行时,被提供时刻t0时所述患者的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的第一浓度值和t0之后的时刻时所述患者的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的第二浓度值,执行以下步骤:
将所述第一值与所述第二值进行比较,并且
如果所述第二值小于所述第一值,则检测到所述治疗性治疗的有效性。
32.一种用于监测患者中NAFLD或NASH的进展的计算机程序,包含指令列表,当所述指令列表在电子计算机上执行时,被提供时刻t0时所述患者的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的第一浓度值和t0之后的时刻时所述患者的血液样品中或从所述血液样品提取的白细胞样品中Plin2蛋白的第二浓度值,执行以下步骤:
将所述第一值与所述第二值进行比较,并且
如果所述第二值小于所述第一值,则检测到NAFLD或NASH的改善,
如果所述第二值大于所述第一值,则检测到NAFLD或NASH的恶化,
如果所述第二值近似等于所述第一值,则检测到NAFLD或NASH的停滞。
33.一种用于自动测量患者血液样品中Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白浓度的设备(10),包括:
-穿刺装置(2),其易于刺穿待采集所述血液样品的个体的皮肤;
-血液样品中多形核细胞(PBMC)的分离装置(14、5、6、19),其至少包括所述多形核细胞(PBMC)与其结合的组分的分开装置(19),所述分开装置(19)被配置为有利于使所述多形核细胞(PBMC)与所述组分分开,所述分开装置(19)为过滤膜或缓冲液类型;
-包括至少一个光谱仪的至少一个分析室(11)和所述多形核细胞(PBMC)的细胞质中Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白浓度的测量装置(16、12、13),其中的一个光谱仪(12、13),所述测量装置(16、12、13)包括
-通过所述分离装置(14、5、6、19)分离的所述多形核细胞(PBMC)的处理装置(16),被配置为以允许Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白在存在时与所述蛋白的特异性试剂结合的方式,其中所述试剂在一个或多个预定波长处发荧光或具有特定颜色;
-至少一个光谱仪(12、13),其配备有:
一个辐射源(12),被配置为在所述经分离和处理的多形核细胞(PBMC)处以预定波长发射辐射,以所述试剂发射荧光或呈现所述特定颜色的方式;
用于获取被所述辐射源(12)照射的样品的图像的装置(13);和
连接到所述分离装置(14、5、6、19)和测量装置(16、12、13)的控制单元(7),其被编程为:
根据预定操作参数根据自动模式控制和同步所述分离装置(14、5、6、19)和测量装置(16、12、13)的致动,和
将在所述多形核细胞(PBMC)的细胞质中测量的Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白的浓度数据与Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白浓度的至少一个参考数据进行自动比较。
34.根据前一权利要求所述的设备(10),其中Plin2蛋白浓度的所述参考数据是与同一患者相关并在其中检测所述血液样品的时刻(tn)之前的时刻(t0)检测到的数据,并且其中所述控制单元(7)被进一步编程为检测到:
-如果从样品分析中获得的Plin2蛋白浓度的数据小于Plin2蛋白浓度的所述参考数据,则NAFLD或NASH改善,
-如果从样品分析中获得的Plin2蛋白浓度的数据大于Plin2蛋白浓度的所述参考数据,则非酒精性肝脂肪变性(NAFLD)或NASH恶化,
-如果从样品分析中获得的Plin2蛋白浓度的数据等于Plin2蛋白浓度的所述参考数据,则NAFLD或NASH停滞。
35.根据权利要求33或34所述的设备(10),其中Plin2蛋白浓度的所述参考数据是与健康受试者相关的数据,并且其中所述控制单元(7)被进一步编程为,如果从样品分析中获得的Plin2蛋白浓度的数据大于Plin2蛋白浓度的所述参考数据,则检测到非酒精性肝脂肪变性(NAFLD)或NASH病症。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的设备(10),其中所述控制单元(7)连接到所有所述装置和所述辐射源(12),并且被编程以根据预定操作参数根据自动模式来控制和同步它们的致动,并且还被配置为:
处理由所述装置(13)获取的图像,所述装置(13)以确定存在于所述血液样品中的Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白的浓度数据的方式获取图像,和
将所述Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白浓度数据与Plin2和/或Pnpla3和/或Rab14蛋白的所述参考数据进行自动比较。
37.根据权利要求33至36中任一项所述的设备(10),其中来自血液样品的多形核细胞(PBMC)的所述分离装置(14、5、6、19)包括:
-混合装置(14),其被配置为将所述血液样品与易于与所述样品中存在的多形核细胞(PBMC)结合的组分混合,并且在必要时与抗凝物质混合;
-移动装置(5),其被配置为向由所述混合装置(14)获得的混合物施加机械振动和/或旋转应力并将所述混合物输送到过滤装置(6);
-所述过滤装置(6),其被配置为保留与所述多形核细胞(PBMC)结合的所述组分并允许所述混合物的其余部分被洗脱。
38.根据权利要求37所述的设备(10),其中所述移动装置(5)和所述过滤装置(6)被集成并实施为过滤性输送带。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的设备(10),其中所述辐射源(12)能够以340nm至780nm的波长发射辐射。
40.根据权利要求33至39中任一项所述的设备(10),还包括用于将所述血液样品输送到收集室(3)的输送装置(4),所述输送装置(4)与所述穿刺装置(2)和所述收集室(3)流体连接,所述输送装置(4)是隔膜泵型。
41.根据权利要求40所述的设备(10),其中所述隔膜泵具有以下尺寸:
-高度等于0.6mm;
-宽度等于5mm;
-长度等于5mm。
42.根据权利要求33至41中任一项所述的设备(10),其中所述光谱仪具有以下尺寸:
-高度为15mm至25mm,优选等于20.1mm;
-宽度为7mm至18mm,优选等于12.5mm;
-深度为5mm至15mm,优选等于10.1mm。
43.根据权利要求33至42中任一项所述的设备(10),还包括至少一个处理单元,其被配置为实施根据权利要求25至33中的一项或多项所述的计算机程序。
44.根据权利要求43所述的设备(10),其中所述处理单元可操作地连接到所述控制单元(7)。
45.根据权利要求32至44中任一项所述的设备(10)用于实施根据权利要求1至24中任一项所述的方法的用途。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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