CN113785053B - 酶活性提高的逆转录酶及其应用 - Google Patents

酶活性提高的逆转录酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种逆转录酶及其应用。该逆转录酶与野生型的M‑MLV逆转录酶相比，具有R450H等突变位点。该逆转录酶具有提高的聚合酶活性、提高的热稳定性和降低的RNase H活性。

Description

酶活性提高的逆转录酶及其应用
技术领域
本发明涉及酶工程领域，具体涉及一种酶活性提高的逆转录酶及其应用，尤其涉及一种聚合活性提高、热稳定性提高和RNaseH活性降低的逆转录酶。
背景技术
逆转录酶(Reverse transcriptase，RT)是一种存在于病毒中的DNA聚合酶，负责病毒基因组的复制，具有RNA和DNA依赖的DNA聚合酶活性和RNase H活性。利用逆转录酶将mRNA转化为cDNA是研究表达基因的重要步骤。该酶主要有三类：禽髓母细胞病毒(avianmyeloblastosis virus，AMV)来源的逆转录酶、莫洛尼小鼠白血病病毒(Moloney murineleukaemia virus，M-MLV)来源的逆转录酶，以及人体免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiency Virus，HIV)来源的逆转录酶，其中前两种逆转录酶因具有较高的催化活性和相对高的保真度而被广泛应用于cDNA的合成。AMV RT与MMLV RT比较，前者的反应温度较后者高3℃-5℃，然而前者具有较强的RNase H活性，该活性会导致合成中的cDNA链3’-OH末端的RNA模板的断裂，从而影响全长cDNA的合成。
获得高质量的逆转录酶，需要进一步研究和改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种酶活性提高、稳定性提高以及RNase H活性降低的逆转录酶，使得所提供的逆转录酶具有高聚合活性、高热稳定性及低RNase H活性。
在逆转录酶所参与的逆转录反应中，提高反应温度可以解开RNA模板的二级结构，并降低引物与模板的非特异性结合。然而逆转录酶为常温酶，高温易变性失活，因此提高逆转录酶的耐热性不仅可以有效地合成cDNA，而且有利于酶的储存、包装和运输。同时，逆转录酶有两个活性：DNA聚合酶活性和RNase H活性。RNase H活性会缩短合成的cDNA长度，降低逆转录的效率，而且去除RNase H活性可以显著地增强逆转录活性的热稳定性。因此，通过对缺少RNase H活性的M-MLV来源的逆转录酶进行研究，获得高稳定性和高聚合活性的逆转录酶，应用于逆转录反应中，具有重要的意义。
为此，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种逆转录酶，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述逆转录酶具有下列突变中的至少一种：R450H，E286K-E302K-W313F-D524A-D583G，T306K-D583G，E562K-D583N，W313F-D524G-D583N，T306K-D524A，E302K-D524A，E302K-L435R-D524A，L435G-D524A，E302K-L435R-D524A-E562Q，E302K-L435G-D524A，D524G-R450H，W313F-D524A,W313F-E562K-D583N，D583N-E562Q，E286K-E302K-W313F-T330P-D524A-D583G，D524G-D583N-R450H，E302R-W313F-L435G，W313F-L435G。
本发明所提供的逆转录酶相较于野生型的逆转录酶，具有提高的聚合活性、提高的热稳定性和降低的RNase H活性，可以用于低模板起始量的逆转录反应以及单细胞测序中的cDNA文库的构建。
在本发明的一些实施例中，以上所述逆转录酶可以进一步附加如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述逆转录酶具有提高的聚合酶活性和降低的RNaseH活性。
在本发明的一些实施例中，所述逆转录酶的聚合酶活性相较于未突变的M-MLV逆转录酶活性至少提高了1-4倍。
在本发明的一些实施例中，所述突变体的RNaseH酶活性相较于未突变的M-MLV逆转录酶活性降低了30％-80％。
在本发明的一些实施例中，所述逆转录酶在加热至50摄氏度达30分钟后可保持逆转录酶活性不变。
在本发明的一些实施例中，所述逆转录酶在加热至42摄氏度达30分钟后可保持逆转录酶活性不变。
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的逆转录酶。
根据本发明的第三方面，本申请提供了一种构建体，包含本发明第二方面所述的分离的核酸分子。
在本发明的一些实施例中，所述构建体为质粒。
在本发明的一些实施例中，所述分离的核酸分子可操作地连接启动子。
在本发明的一些实施例中，所述启动子选自下列中的一种：λ-PL启动子、tac启动子、trp启动子、araBAD启动子、T7启动子和trc启动子。
根据本发明的第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含有本发明第三方面所述的构建体。用来表达目的基因或者核酸分子的宿主细胞可以是原核细胞。在至少一些实施例中，利用原核细胞表达本发明的逆转录酶，例如大肠杆菌(Escherichiacoli)。
根据本发明的第五方面，本发明提供了一种逆转录酶的生成方法，所述逆转录酶为本发明第一方面所述的逆转录酶，所述生产方法包括：培养宿主细胞，所述宿主细胞为本发明第四方面所述的宿主细胞；对所述宿主细胞进行诱导处理，使得所述宿主细胞表达所述逆转录酶；分离获得所述逆转录酶。
在本发明的一些实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
根据本发明的第六方面，本发明提供了一种试剂盒，包括本发明第一方面所述的逆转录酶。应用含有逆转录酶的试剂盒可以提高逆转录反应的效率。
在本发明的一些实施例中，以上所述的试剂盒可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述试剂盒还包括下列中的至少一种：一种或多种核苷酸，一种或多种DNA聚合酶，一种或多种缓冲液、一种或多种引物、一种或多种终止剂。
在本发明的一些实施例中，所述终止剂为双脱氧核苷酸。
根据本发明的第七方面，本发明提供了一种用于逆转录核酸分子的方法，所述方法包括：将至少一种核酸模板与至少一种逆转录酶混合，得到混合物，所述逆转录酶为本发明第一方面所述的逆转录酶；将所述混合物进行逆转录反应，以便获得与所述至少一种核酸模板全部或者部分互补的第一核酸分子。
根据本发明的实施例，以上所述的用于逆转录核酸分子的方法可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述第一核酸分子为cDNA分子。
在本发明的一些实施例中，所述核酸模板为mRNA。
在本发明的一些实施例中，所述核酸模板的最低含量为10pg。
在本发明的一些实施例中，所述方法进一步包括：将所述第一核酸分子进行PCR反应，以便获得与所述第一核酸分子全部或者部分互补的第二核酸分子。
根据本发明的第八方面，本发明提供了一种用于扩增核酸分子的方法，包括：将至少一种核酸模板与至少一种逆转录酶进行第一混合反应，获得反应产物，所述至少一种逆转录酶为本发明第一方面所述的逆转录酶；将所述反应产物与至少一种DNA聚合酶进行第二混合反应，以便获得与所述至少一种核酸模板全部或者部分互补的扩增后的核酸分子。“混合反应”是指将原料混合后，原料之间发生反应。
在本发明的一些实施例中，以上用于扩增核酸分子的方法进一步包括：对所述扩增后的核酸分子进行测序，确定所述扩增后的核酸分子的核苷酸序列。
根据本发明的第九方面，本发明提供了一种构建cDNA文库的方法，包括：提取待测生物样本中的RNA，获得所述待测生物样本的mRNA；基于所述生物样本的mRNA，利用本发明第七方面所述方法进行处理，获得cDNA分子；基于所述cDNA分子，扩增，建库，以便获得cDNA文库。
在本发明的一些实施例中，以上构建cDNA文库的方法可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述待测生物样本为动物组织、植物组织或者细菌。例如，可以对这些生物样本中的多细胞或者单细胞进行处理，获得RNA。
在本发明的一些实施例中，所述待测生物样中的总RNA含量最低为10pg。
在本发明的一些实施例中，所述待测生物样本选自土壤、粪便、血液、血清中的至少一种。不同生物来源的样本中含有多种抑制MMLV RT活性的抑制剂，如土壤和粪便中的腐植酸，血液中的血色素，血清中的各种血液抗凝剂如肝素和柠檬酸盐以及胍、硫氰酸酯、乙醇、甲酰胺、EDTA及植物酸性多糖等。因此提高该酶的抗抑制剂能力能够更加有效地扩展其应用范围。
在本发明的一些实施例中，所获得的cDNA的长度至少为2000bp。利用本发明所提供的逆转录酶，可以用于大片段mRNA的逆转录反应，从而获得长片段的cDNA。根据本发明的实施例，所获得的cDNA的长度可以为500bp以上、1000bp以上、2000bp以上、3000bp以上、4000bp以上、5000bp以上、6000bp以上、7000bp以上、8000bp以上、9000bp。
本申请所取得的有益效果为：本申请所提供的逆转录酶，热稳定性好、RNaseH活性低、聚合活性高，应用于逆转录反应过程中，可以实现复杂模板的扩增，以及全长cDNA的扩增，并且反应耐受温度提高，提高了扩增效率。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明的一个实施例提供的M-MLV RT表达载体示意图。
图2是根据本发明的一个实施例提供的野生型M-MLV RT及突变体粗酶液的热稳定性筛选结果图。
图3是根据本发明的一个实施例提供的野生型M-MLV RT及突变体纯酶液的热稳定性筛选结果图。
图4是根据本发明的一个实施例提供的野生型M-MLV RT及突变体粗酶液的聚合酶活性测定结果图。
图5是根据本发明的一个实施例提供的野生型M-MLV RT及突变体纯酶液的聚合酶活性测定结果图。
图6是根据本发明的一个实施例提供的野生型M-MLV RT及突变体实时荧光曲线图。
图7是根据本发明的一个实施例提供的野生型M-MLV RT及突变体粗酶液的RNaseH活性筛选测定结果图。
图8是根据本发明的一个实施例提供的野生型M-MLV RT及突变体纯酶液的RNaseH活性筛选测定结果图。
图9是根据本发明的一个实施例提供的野生型M-MLV RT及突变体合成的cDNA的长度和产量结果图。
图10是根据本发明的一个实施例提供的不同逆转录酶的灵敏度结果图。
图11是根据本发明的一个实施例提供的M-MLV RT突变体在常规RNA-seq中cDNA产量和片段分布图。
图12是根据本发明的一个实施例提供的M-MLV RT单细胞加C尾功能结果图。
图13是根据本发明的一个实施例提供的M-MLV RT突变体cDNA产量和片段分布图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
为了更方便理解，下面对本文中的术语进行解释和说明，本领域技术人员应该理解的是，这些解释和说明并不应该理解为对本发明保护范围的限制。
在本文中，术语“逆转录酶”是指表现出逆转录酶活性的蛋白质、多肽或者多肽片段。
术语“逆转录酶活性”、“逆转录活性”或者“逆转录”，指RNA为模板，借助于酶合成DNA链的能力。
术语“突变”或者“突变体”、“突变型”等，指相较于野生型DNA序列或者野生型的氨基酸序列，具有一个或者多个突变。当然这种突变可以发生在核酸水平上或者在氨基酸水平上。
在本文中，当表示突变位点时，依照本领域通常的表述方式，即为“突变前氨基酸缩写+位点+突变后氨基酸缩写”，例如“R450H”，其中“R”代表突变前的氨基酸，“450”为相应的突变位点，“H”代表突变后的氨基酸。其中“R”和“H”均是采用本领域通用的单个字母缩写代表氨基酸。当表述组合突变时，两个突变之间用“-”连接，例如突变位点“T306K-D583G”代表相较于野生型，在第306个氨基酸和第583个氨基酸同时发生了突变。
本发明提供了逆转录酶、包含这些逆转录酶的组合物。本发明提供了包含一种或多种(例如两种、三种、四种、八种、十种、十五种等)具有本发明逆转录酶活性的多肽、用于逆转录核酸分子的组合物。这些组合物除了包含这些逆转录酶之外，还可以包含一种多种核苷酸、一种或多种缓冲液、一种或多种DNA聚合酶。本发明的组合物还可以包含一种或多种寡核氨酸引物。
本发明所提供的逆转录酶与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，具有下列突变中的至少一种：R450H，E286K-E302K-W313F-D524A-D583G，T306K-D583G，E562K-D583N，W313F-D524G-D583N，T306K-D524A，E302K-D524A，E302K-L435R-D524A，L435G-D524A，E302K-L435R-D524A-E562Q，E302K-L435G-D524A，D524G-R450H，W313F-D524A,W313F-E562K-D583N，D583N-E562Q，E286K-E302K-W313F-T330P-D524A-D583G，D524G-D583N-R450H，E302R-W313F-L435G，W313F-L435G。
在本发明的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述逆转录酶具有R450H突变。
在本发明的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述逆转录酶具有E286K-E302K-W313F-D524A-D583G突变。
在本发明的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述逆转录酶具有T306K-D583G突变。
在本发明的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述逆转录酶具有E562K-D583N突变。
在本发明的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述逆转录酶具有W313F-D524G-D583N突变。
在本发明的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述逆转录酶具有T306K-D524A突变。
在本申请的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述逆转录酶具有E302K-D524A突变。
在本申请的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，所述逆转录酶具有E302K-L435R-D524A突变。
在本申请的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，所述逆转录酶具有L435G-D524A突变。
在本申请的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，所述逆转录酶具有E302K-L435R-D524A-E562Q突变。
在本申请的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，所述逆转录酶具有E302K-L435G-D524A突变。
在本申请的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，所述逆转录酶具有D524G-R450H突变。
在本申请的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，所述逆转录酶具有W313F-D524A突变。
在本发明的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，所述逆转录酶具有W313F-E562K-D583N突变。
在本发明的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，所述逆转录酶具有D583N-E562Q突变。
在本发明的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述逆转录酶具有E286K-E302K-W313F-T330P-D524A-D583G突变。
在本发明的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述逆转录酶具有D524G-D583N-R450H突变。
在本发明的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述逆转录酶具有E302R-W313F-L435G突变。
在本发明的一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述逆转录酶具有W313F-L435G突变。
本发明所提供的逆转录酶对于生物样品中存在的酶抑制剂具有抗性。这些生物样品例如可以是血液、粪便、动物组织、植物组织、细菌、汗液、泪液、尘土、唾液、尿液和胆液等。这些抑制剂可以是腐殖酸、肝素、乙醇、胆盐、富里酸、金属离子、十二烷基硫酸钠、EDTA、胍盐、甲酰胺、焦磷酸钠和亚精胺。在对这些生物样品或者含有这些抑制剂的样品进行逆转录处理时，本发明所提供的逆转录酶至少可以展现出10％的逆转录酶活性。更具体地说，相较于不含有抑制剂的样品，在抑制剂存在的情况下，本发明所提供的逆转录酶能够展现出10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％甚至是90％的逆转录酶活性。
本发明还提供了一种试剂盒。本发明提供的试剂盒可以用于生成、扩增核酸分子(单链或者双链)或者用于测序。本申请所提供的试剂盒包括可装载载体，例如盒子或者硬质盒等等。这些可装载载体中装有一种或多种容器，例如小瓶、管子等。在这些容器中可以装有本申请所提供的一种或多种逆转录酶。另外，除了逆转录酶之外，还可以在相同或者不同的容器中装置一种或者多种DNA聚合酶，一种或者多种适用于核酸合成的缓冲液、和一种或多种核苷酸。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 M-MLV RT野生型及其突变体表达载体构建
1、M-MLV RT野生型表达载体构建
根据NCBI数据库中获得莫洛尼小鼠白血病病毒(Moloney murine leukaemiavirus，M-MLV)来源的逆转录酶的核酸序列。而由于该核酸序列中存在大肠杆菌难以识别的密码子，所以该核酸序列中大肠杆菌难以识别的密码子改为大肠杆菌中常用的密码子，使得基因更利于在大肠杆菌中表达，获得优化处理后的序列。然后将优化处理后的核酸序列导入到表达质粒中，获得表达载体。
其中，野生型M-MLV RT的核酸序列(经过优化处理后的)(SEQ ID NO:1)如下：
ATGCTGAACATCGAGGACGAACACCGTCTGCACGAGACCAGCAAGGAACCGGACGTGAGCCTGGGTAGCACCTGGCTGAGCGATTTCCCGCAGGCGTGGGCGGAGACCGGTGGCATGGGTCTGGCGGTGCGTCAAGCGCCGCTGATCATTCCGCTGAAGGCGACCAGCACCCCGGTTAGCATCAAACAGTACCCGATGAGCCAAGAAGCGCGTCTGGGTATCAAACCGCACATTCAGCGTCTGCTGGACCAAGGCATTCTGGTTCCGTGCCAAAGCCCGTGGAACACCCCGCTGCTGCCGGTGAAGAAACCGGGCACCAACGACTATCGTCCGGTTCAGGATCTGCGTGAGGTGAACAAGCGTGTTGAAGATATCCACCCGACCGTGCCGAACCCGTACAACCTGCTGAGCGGTCTGCCGCCGAGCCATCAGTGGTATACCGTTCTGGACCTGAAAGATGCGTTCTTTTGCCTGCGTCTGCATCCGACCAGCCAGCCGCTGTTTGCGTTTGAGTGGCGTGACCCGGAAATGGGTATTAGCGGTCAGCTGACCTGGACCCGTCTGCCGCAAGGCTTCAAGAACAGCCCGACCCTGTTTGACGAGGCGCTGCACCGTGACCTGGCGGATTTTCGTATCCAGCACCCGGATCTGATTCTGCTGCAATACGTGGACGATCTGCTGCTGGCGGCGACCAGCGAACTGGATTGCCAGCAAGGTACCCGTGCGCTGCTGCAGACCCTGGGTAACCTGGGCTATCGTGCGAGCGCGAAGAAAGCGCAAATCTGCCAGAAGCAAGTGAAATACCTGGGTTATCTGCTGAAAGAGGGTCAGCGTTGGCTGACCGAGGCGCGTAAGGAAACCGTTATGGGTCAGCCGACCCCGAAAACCCCGCGTCAACTGCGTGAGTTCCTGGGTACCGCGGGCTTTTGCCGTCTGTGGATTCCGGGTTTTGCGGAAATGGCGGCGCCGCTGTACCCGCTGACCAAAACCGGTACCCTGTTTAACTGGGGCCCGGACCAGCAAAAGGCGTATCAGGAAATTAAACAAGCGCTGCTGACCGCGCCGGCGCTGGGTCTGCCGGACCTGACCAAGCCGTTCGAGCTGTTTGTGGATGAAAAGCAGGGTTACGCGAAAGGCGTTCTGACCCAAAAACTGGGTCCGTGGCGTCGTCCGGTGGCGTATCTGAGCAAGAAACTGGACCCGGTTGCGGCGGGTTGGCCGCCATGCCTGCGTATGGTGGCGGCGATCGCGGTTCTGACCAAGGATGCGGGTAAACTGACCATGGGTCAGCCGCTGGTGATTCTGGCGCCGCACGCGGTGGAGGCGCTGGTTAAACAACCGCCGGATCGTTGGCTGAGCAACGCGCGTATGACCCACTACCAGGCGCTGCTGCTGGACACCGATCGTGTTCAATTTGGTCCGGTGGTTGCGCTGAACCCGGCGACCCTGCTGCCGCTGCCGGAGGAAGGTCTGCAGCACAACTGCCTGGACATTCTGGCGGAGGCGCATGGTACCCGTCCGGACCTGACCGATCAACCGCTGCCGGACGCGGATCACACCTGGTATACCGATGGTAGCAGCCTGCTGCAGGAAGGTCAGCGTAAAGCGGGTGCGGCGGTGACCACCGAGACCGAAGTTATCTGGGCGAAGGCGCTGCCGGCGGGTACCAGCGCGCAGCGTGCGGAGCTGATTGCGCTGACCCAAGCGCTGAAGATGGCGGAAGGCAAGAAACTGAACGTTTACACCGACAGCCGTTATGCGTTCGCGACCGCGCACATCCACGGCGAGATTTACCGTCGTCGTGGTCTGCTGACCAGCGAGGGCAAGGAAATCAAGAACAAGGATGAAATCCTGGCGCTGCTGAAGGCGCTGTTTCTGCCGAAACGTCTGAGCATCATTCACTGCCCGGGTCACCAGAAAGGTCACAGCGCGGAGGCGCGTGGTAACCGTATGGCGGACCAAGCGGCGCGTAAAGCGGCGATCACCGAAACCCCGGATACCAGCACCCTGCTGATT
野生型M-MLV RT的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)如下所示：
MLNIEDEHRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFDEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGTAGFCRLWIPGFAEMAAPLYPLTKTGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLLI
将野生型m-mlv rt基因序列(SEQ ID NO:1)***表达质粒pET22b(+)的NdeI和EcoRI酶切位点之间，该载体在m-mlv rt序列的C端带有6个His以利于蛋白的纯化。将该表达载体命名为pET-MRT，如图1所示。
2、M-MLV RT突变体表达载体的构建
对可能有利于提高逆转录酶热稳定性及降低其RNase H活性突变位点等设计正反向突变引物对，以pET-MRT为模板，使用Pfu DNA聚合酶(EP0501，ThermoFisher)进行定点突变PCR，分别获得相应的M-MLV RT突变体表达载体。其中针对不同突变位点可以设计不同的正反向引物，进行定点突变。方法如下：
(1)按照下述反应体系和反应条件进行定点突变：
表1构建M-MLV RT突变表达载体的PCR反应体系
反应组分 体积(μl)
10×Pfu缓冲液(含有MgSO4) 2.5
2.5mM dNTPs 2
10μM正向引物 0.7
10μM反向引物 0.7
pfu DNA聚合酶 0.5
50ng/μl模板(pET-MRT) 1
H2O 17.6
表2构建M-MLV RT突变表达载体的PCR反应条件
(2)反应结束后，加入1μl DpnI于37℃消化2h；
(3)取5μl消化后的产物进行E.coli DH5α感受态细胞转化；
(4)从平板上挑取单克隆于含有氨苄抗生素LB培养基中37℃，200rpm振荡培养。(5)提取质粒，测序比对分析获得正确突变的克隆。
所构建的突变体如下：
表3 M-MLV RT逆转录酶突变信息
实施例2.M-MLV RT逆转录酶及其突变体表达及纯化
1、野生型M-MLV RT逆转录酶及其突变体小量诱导表达及纯化获得粗酶
野生型M-MLV RT逆转录酶及其突变体均通过pET22b的启动子启动表达，并且均在C-端融合有6个His标签，纯化时可利用His标签进行Ni柱亲和纯化，分别获得相应的粗酶液。方法如下：
(1)野生型及突变体质粒进行BL21感受态细胞(购自全式金生物科技有限公司)转化；
(2)然后挑取单菌落于10ml含氨苄抗性(100μg/ml)的LB培养基中，37℃，200rpm/min，振荡培养至OD600≈0.6；
(3)再加入诱导剂IPTG(终浓度为0.5mM)，18℃，200rpm/min诱导过夜；
(4)在12000rpm/min下离心5min，收集诱导后的菌液沉淀；
(5)使用M-MLV RT重悬液(含有20mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM Imidazole，5％Glycerol，pH 7.5，于25℃孵育)重悬，并加入1％的10mg/ml溶菌酶及1％PMSF和0.5％的TritonX-100；在冰水浴条件下进行超声破菌，超声条件为：变幅杆直径φ10，功率35％，超声2s，间歇3s，超声5min；
(6)将破碎后的菌液在12000rpm、4℃下离心10min，收集上清；
将上步准备好的MMLV RT粗酶上清液进行Ni亲和纯化，主要步骤为：填料与粗酶液孵育结合；重悬液清洗未结合Ni的杂蛋白；利用洗脱液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，260mMImidazole，5％Glycerol,pH 7.5)在25℃下洗脱目的蛋白，获得粗酶液。
纯化后得到的目的蛋白A280测定浓度，并调整至相同浓度，用于后续筛选实验。
2、野生型M-MLV RT逆转录酶及其突变体大量诱导表达及纯化获得纯酶
野生型M-MLV RT逆转录酶及其突变体均通过pET22b的启动子启动表达，并且均在C-端融合有6个His标签，纯化时可利用His标签进行Ni柱亲和纯化，分别获得相应的纯酶。
(1)野生型及突变体质粒进行BL21感受态细胞(购自全式金生物科技有限公司)转化；
(2)然后挑取单菌落于5ml含氨苄抗性(100μg/ml)LB培养基中，37℃，200rpm/min，过夜培养。次日按1:100的比例进行稀释，分别转接于新鲜的1500ml含氨苄抗性(100μg/ml)的LB培养基中，37℃，200rpm/min，振荡培养至OD600≈0.6；
(3)再加入诱导剂IPTG(终浓度为0.5mM)，18℃，200rpm/min诱导过夜；
(4)8000rpm/min离心10min，收集诱导后的菌液沉淀；
(5)使用M-MLV RT重悬液(含有20mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM Imidazole，5％Glycerol,pH 7.5，于25℃孵育)重悬，并加入1％的10mg/ml溶菌酶及1％PMSF和0.5％的TritonX-100；在冰水浴条件下进行超声破菌，超声条件为：变幅杆直径φ10，功率35％，超声2s，间歇3s，超声30min；
(6)将破碎后的菌液12000rpm、4℃下离心30min，收集上清；
将上步准备好的样品利用AKTA蛋白纯化***进行亲和纯化，将经亲和纯化得到的样品用M-MLV RT稀释液(20mM Tris-HCl,5％Glycerol,pH7.5)进行3.33倍稀释。然后进行阴离子交换层析，获得纯化后的目的蛋白，即为纯酶液。
纯化后得到的目的蛋白经过透析、储存，用于后续的测定及分析。
实施例3野生型M-MLV RT逆转录酶及其突变体的热稳定性筛选及分析
M-MLV RT为常温酶，野生型M-MLV RT的T50(10分钟活性降低为初始活性的50％的温度)，在底物不存在时为44℃，底物存在时为47℃。本发明通过试剂盒对野生型M-MLV RT以及突变体进行热稳定测定。同时，通过比较突变体酶在不同温度下聚合产物量，对比突变体和野生型M-MLV RT的活性保存率，进而筛选热稳定性较野生型稳定的突变体。
分别对野生型M-MLV RT逆转录酶及其突变体的粗酶液和纯酶液进行热稳定性测定。热稳定性测试过程中使用检测试剂盒：Protein Thermal ShiftTM Dye Kit(购自Thermal)。具体检测原理为：随着温度上升，蛋白质结构发生变化，疏水结构域暴露，与荧光染料结合产生荧光，通过qPCR仪实时检测温度(Melt Curve)与荧光值之间的变体，比较野生型的M-MLV RT逆转录酶及其突变体的Tm值，从而判断其稳定性。
使用96孔板按照上述试剂盒操作配制反应体系，具体反应体系如下：
表4 M-MLV RT逆转录酶热稳定性筛选反应体系
备注：上表中M-MLV RT逆转录酶酶液(0.3mg/ml)是指在实施例2中纯化得到的酶液进行一定倍数稀释后得到的浓度在0.3mg/ml的待测试酶液，Dye是使用无菌水将试剂盒中的染料(1000x)稀释到8x，检测使用96孔板。
加样完成后，置于StepOneTM qPCR仪中进行Melt Curve，具体Melt curve反应条件完全参照试剂盒说明设置。
再使用Protein Thermal ShiftTM software v1.0软件分析野生型M-MLV RT逆转录酶及突变体具体Tm值，其结果见表5以及图2和图3。
表5野生型M-MLV RT逆转录酶及突变体粗酶液热稳定性筛选结果
其中，图2所示为野生型M-MLV RT逆转录酶及突变体粗酶液的热稳定性测定结果图，图3所示为野生型M-MLV RT逆转录酶及突变体纯酶液的热稳定性测定结果图。表5所示出的结果对应图2所示结果。图2中黑色箭头区域代表各检测样本的热稳定性提高。综合粗酶液和纯酶液的热稳定性测定结果，粗酶液中个别突变体的热稳定测定结果与纯酶液有出入，不受理论限制，可能是由于酶液的纯度不同所造成的差异。粗酶液由于纯度不高，其热稳定性测定结果可以帮助去掉部分效果不佳的位点。
实施例4野生型M-MLV RT逆转录酶及其突变体的聚合活性测定及分析
M-MLV RT逆转录酶为常温酶，随着温度的升高，其聚合活性会随之降低。因此，相同反应温度下，通过对突变体与野生型M-MLV RT聚合产物量进行比较，可以筛选出活性较好的突变体。
以poly(rA)为模板，oligo(dT)为引物，利用逆转录酶聚合生成poly(rA):(dT)的杂合链。分别在不同的反应温度条件下进行聚合反应，通过Qubit dsDNA HS kit(Invitrogen)检测产物浓度。通过对比突变体和野生型M-MLV RT逆转录酶及其突变体，组合突变体和单点突变体产物量，筛选活性较好的突变体。
表6聚合反应体系
分别在37℃、42℃和50℃反应30分钟；然后利用1ul 0.5M EDTA终止反应。获得的产物浓度如图4和图5所示，以及与WT活性比之如表7。
表7 M-MLV RT突变体粗酶液聚合酶活性
编号 42℃30min 50℃30min 编号 42℃30min 50℃30min
RT-1 0.88 1.14 RT-24 1.14 1.21
RT-2 0.87 0.97 RT-25 1.26 1.52
RT-3 0.96 1.03 RT-26 0.95 0.97
RT-4 0.84 1.19 RT-27 0.95 1.09
RT-5 1.01 0.78 RT-28 0.95 1.04
RT-6 0.87 1.13 RT-29 0.96 1.21
RT-7 0.80 0.91 RT-30 1.05 1.16
RT-8 0.72 0.93 RT-31 0.95 0.98
RT-9 0.94 1.02 RT-32 0.84 1.09
RT-10 1.04 1.15 RT-33 0.96 1.18
RT-11 1.06 1.38 RT-34 0.81 1.05
RT-12 0.94 1.26 RT-35 1.00 1.14
RT-13 0.88 1.02 RT-36 0.96 1.18
RT-14 1.15 1.23 RT-37 1.01 1.22
RT-15 0.94 1.06 RT-38 1.06 1.07
RT-16 0.91 1.37 RT-39 1.26 1.33
RT-17 1.05 1.65 RT-40 1.02 1.44
RT-18 1.03 1.32 RT-41 1.29 1.85
RT-19 1.01 1.34 RT-42 1.08 2.02
RT-20 1.02 1.09 RT-43 1.11 1.53
RT-21 1.06 0.97 RT-44 1.15 1.65
RT-22 0.97 1.22 WT 1 1
RT-23 1.08 1.40 SSII 1.16 1.24
其中图4为M-MLV RT逆转录酶及其突变体粗酶液在不同温度下的聚合酶活性，同时在表7中示出了M-MLV RT逆转录酶及其突变体粗酶液在42℃和50℃条件下的产物浓度。图5为部分M-MLV RT逆转录酶及其突变体纯酶液的聚合酶活性结果图，同时表8为部分M-MLV RT逆转录酶及其突变体纯酶液产物浓度。表7中所示出的粗酶液在不同温度下的产物浓度，可能存在一些偏差。不受理论限制，这些偏差可能是由于粗酶液纯度不高，粗酶液中杂质存在所带来的。粗酶液的结果可以作为纯酶液结果表征的重要参考。
表8 M-MLV RT突变体纯酶液聚合酶活性
编号 ΔcDNA，ng/ul 编号 ΔcDNA，ng/ul
RT-1 12.01 RT-33 29.04
RT-3 25.74 RT-35 21.24
RT-5 23.94 RT-40 20.74
RT-6 17.34 RT-41 21.14
RT-17 18.2 RT-43 19.24
RT-25 22.74 SSII 22.54
RT-28 17.11 WT 6.19
实施例5 M-MLV RT逆转录酶及其突变体的RNase H活性筛选及分析
M-MLV RT逆转录酶具有RNase H活性，能够降解DNA/RNA杂合链中的RNA。根据荧光能量共振转移原理，荧光-淬灭基团对在淬灭基团被转移到与荧光基团能量共振距离之外时，通常能提供较低的背景信号和灵敏的荧光强度的改变；当M-MLV RT逆转录酶具备RNaseH活性时，会降解杂合链中的RNA链(其3’端存在淬灭基团BHQ2)，会引起杂合链中DNA单链中5’端荧光基团cy3荧光值的明显升高。因此可以筛选出荧光值低于野生型M-MLV RT的突变即为RNaseH活性降低的突变体。
M-MLV RT逆转录酶及其突变体经过纯化后得到质检合格的纯酶液，进行RNase H活性测定。
活性测定体系中所用荧光标记底物分别为DNA单链：
Poly(dT)30
5’-cy3TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，
RNA单链：Poly(rA)30
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA -3’-BHQ2，
长度为30-mer，DNA单链5’端带有cy3荧光基团，RNA单链3’端带有BHQ2淬灭基团，先将RNA与DNA单链进行退火形成杂合链，经酶标仪测试，其合适的激发波长和发射波长分别确定为540nm和570nm。
实验过程：退火合成DNA/RNA杂合链，底物Poly(dT)30、Poly(rA)30浓度分别为10μM，按照1:1比例80℃退火5min中，自然降至室温。
M-MLV RT逆转录酶及其突变体RNase H活性测定的反应体系如下表8：
表8 M-MLV RT逆转录酶酶液RNase H活性测定体系
备注：上表中M-MLV RT逆转录酶酶液(0.3mg/ml)是指在实施例2中纯化得到的酶液进行一定倍数稀释后得到的浓度在0.3mg/ml的待测试酶液，Dye是使用无菌水将试剂盒中的染料(1000x)稀释到8x，检测时使用的为384孔板(Corning black,clear bottom384plates)，加样操作必须保证在冰上快速进行。
加样完成后，置于BioTek酶标仪上进行检测，检测在37℃进行。检测程序应保证在加样操作进行前便设置完成(包括需要选好384孔板中的对应加样孔位)，程序具体设置为：开始动力学(检测前振板30秒；每min记录一次数据)，检测总时间30min，激发波长540nm，发射波长570nm。
检测结束后，进行M-MLV RT及其突变体RNase H活性的分析比较及筛选。在检测完成时，将会导出横坐标为时间轴、纵坐标为荧光值的信号变化曲线趋势图和相应的具体数据表格(见附图6、图7和图8)。
其中图6显示的是实时荧光曲线图。中间曲线代表的是野生型逆转录酶，位于中间曲线下方的突变体的RNase H活性低于野生型。图7是粗酶液RNase H活性筛选结果图。其中黑色箭头区域代表相较于野生型逆转录酶，突变体的RNase H活性降低。图8是纯酶液RNaseH活性验证结果图。
从实施例3～实施例5，通过不同的实验对突变体的酶活性进行了验证，综合不同实验验证的结果，在针对单点突变所形成的突变体，仅保留了R450H突变体；在多点突变所形成的突变体中，保留了酶活性效果明显高于野生型M-MLV逆转录酶的突变体。综合起来，最终选择了R450H，E286K-E302K-W313F-D524A-D583G，T306K-D583G，E562K-D583N，W313F-D524G-D583N，T306K-D524A，E302K-D524A，E302K-L435R-D524A，L435G-D524A，E302K-L435R-D524A-E562Q，E302K-L435G-D524A，D524G-R450H，W313F-D524A,W313F-E562K-D583N，D583N-E562Q，E286K-E302K-W313F-T330P-D524A-D583G，D524G-D583N-R450H，E302R-W313F-L435G，W313F-L435G。
实施例6 M-MLV RT逆转录酶及其突变体的cDNA长度检测及分析
将通过活性、RNase H活性、热稳定性筛选的M-MLV RT逆转录酶突变体(RT3、RT5、RT6、RT33、RT40、RT41、RT43，其中RT3、RT5和RT6作为已有位点报道的效果较佳位点，可作为对照)与商品ssII同时转录1ug RNA Marker(0.5k-9k)，转录体系和反应条件如下表9，将cDNA产物进行1％碱性琼脂糖凝胶电泳检测(见附图9)。
表9逆转录酶转录反应体系及条件
图9显示的是利用不同的逆转录酶所获得的cDNA产物的凝胶电泳图，从图9可以看出，所获得的cDNA的长度在0.5～9kbp之间。结果显示RT33、RT40、RT41、RT43均能够合成9k的片段。
实施例7 M-MLV RT逆转录酶及其突变体的灵敏度检测及分析
将通过活性、RNase H活性、热稳定性筛选的M-MLV RT逆转录酶突变体(RT3、RT6、RT33、RT40、RT41、RT43)与商品ssII同时分别转录10pg、100pg、1ng、10ng Hela total RNA，反应体系和条件参照表9，将反应产物cDNA使用SYBR Green Ex Taq premix qPCR B2M基因，以RNA投入量的对数为横坐标，Ct值为纵坐标绘制曲线，计算各逆转录酶的效率，比较逆转录酶的灵敏度(见附图10)。
图10中每张曲线图中的曲线对应总RNA的浓度从左到右分别为10ng、1ng、100pg、10pg，每个总RNA测定两次平行实验(以RT3为例，在附图上已经标出)。从图10可以看出，RT33、RT43、RT3以及商品ssII的灵敏度为10pg total RNA。
实施例8 M-MLV RT逆转录酶及其突变体在常规RNA-seq中的应用测试及分析
将通过活性、RNase H活性、热稳定性筛选的M-MLV RT逆转录酶突变体(RT3、RT5、RT6、RT33、RT40、RT41、RT43)与商品ssII同时进行RNA-seq建库测试，其中逆转录酶用于RNA的反转录过程，将合成的cDNA按照MGI Easy mRNA文库制备试剂盒V2.0使用说明书的记载，经过末端修复加接头、PCR富集、环化等过程构建文库，上机测序。通过Aglient 2100仪器检测并比较cDNA PCR产物的产量和片段分布来分析逆转录酶合成cDNA的产量和片段分布(见附图11和表10)，并通过文库的上机测序结果进行逆转录酶突变体的转录性能(见附图9)。
表10 M-MLV RT突变体上机测序结果
表10中，Project clean reads ratio代表：过滤掉含adapter的reads、低质量的reads、N含量太高的reads后的可用reads。第一个Total Mapping ratio代表：基因组比对情况。第二个Total Mapping Ratio代表：基因集比对情况。Total Gene number代表：基因或者transcript检出数。Superman和Pearson代表：qPCR相关性。
其中图11显示了不同突变体在常规RNA-seq中cDNA产量和片段分布图。结果显示，RT3、RT5、RT6、RT33、RT40、R43与商品酶在常规RNA-seq中cDNA的产量相当，片段分布在240bp左右。
结果显示RT40、RT43突变体文库上机效果略好于商品酶ssII，RT33突变体文库的上机效果与商品酶ssII相当。
实施例9 M-MLV RT逆转录酶及其突变体在单细胞RNA-seq中的应用测试及分析
MMLV RT已广泛用于单细胞测序的cDNA建库。该过程利用此酶的末端转移(TdT)活性，即在新生成的cDNA互补链平端的3’端额外加上几个碱基，以便与加入的模板转换寡核苷酸(template-switching oligonucleotide,TSO)的3’端互补。然而，该特性与保真性为负相关，如何协调两者关系达到最佳需进一步研究。
1、单细胞RNA-seq应用中测试逆转录酶加C尾功能
参照文献Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2,SimonePicelli etal.,Nature Protocols 9,171-181(2014)中所记载的方法进行单细胞RNA测序，采用如下表11的体系和反应条件，检测逆转录酶单细胞中加C尾功能
表11加C尾反应体系和反应条件
2、单细胞RNA-seq建库测试
采用上述体系和原理进行RNA文库的构建，其中突变体cDNA产量和片段分布结果见图12。
结果显示，RT43、RT41、RT3、RT5、RT6、RT33均具有加C尾的功能，其中RT6加C尾的功能弱于商品酶ssII，其他突变体加C尾功能与ssII相当。图13的结果显示在单细胞RNA-seq中，逆转录酶RT33、RT5、RT43转录的cDNA长度普遍在2k，且产量比商品酶ssII略高。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 酶活性提高的逆转录酶及其应用
<130> PIDC3183959P
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2016
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型M-MLV RT
<400> 1
atgctgaaca tcgaggacga acaccgtctg cacgagacca gcaaggaacc ggacgtgagc 60
ctgggtagca cctggctgag cgatttcccg caggcgtggg cggagaccgg tggcatgggt 120
ctggcggtgc gtcaagcgcc gctgatcatt ccgctgaagg cgaccagcac cccggttagc 180
atcaaacagt acccgatgag ccaagaagcg cgtctgggta tcaaaccgca cattcagcgt 240
ctgctggacc aaggcattct ggttccgtgc caaagcccgt ggaacacccc gctgctgccg 300
gtgaagaaac cgggcaccaa cgactatcgt ccggttcagg atctgcgtga ggtgaacaag 360
cgtgttgaag atatccaccc gaccgtgccg aacccgtaca acctgctgag cggtctgccg 420
ccgagccatc agtggtatac cgttctggac ctgaaagatg cgttcttttg cctgcgtctg 480
catccgacca gccagccgct gtttgcgttt gagtggcgtg acccggaaat gggtattagc 540
ggtcagctga cctggacccg tctgccgcaa ggcttcaaga acagcccgac cctgtttgac 600
gaggcgctgc accgtgacct ggcggatttt cgtatccagc acccggatct gattctgctg 660
caatacgtgg acgatctgct gctggcggcg accagcgaac tggattgcca gcaaggtacc 720
cgtgcgctgc tgcagaccct gggtaacctg ggctatcgtg cgagcgcgaa gaaagcgcaa 780
atctgccaga agcaagtgaa atacctgggt tatctgctga aagagggtca gcgttggctg 840
accgaggcgc gtaaggaaac cgttatgggt cagccgaccc cgaaaacccc gcgtcaactg 900
cgtgagttcc tgggtaccgc gggcttttgc cgtctgtgga ttccgggttt tgcggaaatg 960
gcggcgccgc tgtacccgct gaccaaaacc ggtaccctgt ttaactgggg cccggaccag 1020
caaaaggcgt atcaggaaat taaacaagcg ctgctgaccg cgccggcgct gggtctgccg 1080
gacctgacca agccgttcga gctgtttgtg gatgaaaagc agggttacgc gaaaggcgtt 1140
ctgacccaaa aactgggtcc gtggcgtcgt ccggtggcgt atctgagcaa gaaactggac 1200
ccggttgcgg cgggttggcc gccatgcctg cgtatggtgg cggcgatcgc ggttctgacc 1260
aaggatgcgg gtaaactgac catgggtcag ccgctggtga ttctggcgcc gcacgcggtg 1320
gaggcgctgg ttaaacaacc gccggatcgt tggctgagca acgcgcgtat gacccactac 1380
caggcgctgc tgctggacac cgatcgtgtt caatttggtc cggtggttgc gctgaacccg 1440
gcgaccctgc tgccgctgcc ggaggaaggt ctgcagcaca actgcctgga cattctggcg 1500
gaggcgcatg gtacccgtcc ggacctgacc gatcaaccgc tgccggacgc ggatcacacc 1560
tggtataccg atggtagcag cctgctgcag gaaggtcagc gtaaagcggg tgcggcggtg 1620
accaccgaga ccgaagttat ctgggcgaag gcgctgccgg cgggtaccag cgcgcagcgt 1680
gcggagctga ttgcgctgac ccaagcgctg aagatggcgg aaggcaagaa actgaacgtt 1740
tacaccgaca gccgttatgc gttcgcgacc gcgcacatcc acggcgagat ttaccgtcgt 1800
cgtggtctgc tgaccagcga gggcaaggaa atcaagaaca aggatgaaat cctggcgctg 1860
ctgaaggcgc tgtttctgcc gaaacgtctg agcatcattc actgcccggg tcaccagaaa 1920
ggtcacagcg cggaggcgcg tggtaaccgt atggcggacc aagcggcgcg taaagcggcg 1980
atcaccgaaa ccccggatac cagcaccctg ctgatt 2016
<210> 2
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型M-MLV RT
<400> 2
Met Leu Asn Ile Glu Asp Glu His Arg Leu His Glu Thr Ser Lys Glu
1 5 10 15
Pro Asp Val Ser Leu Gly Ser Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gln Ala
20 25 30
Trp Ala Glu Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gln Ala Pro Leu
35 40 45
Ile Ile Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln Tyr
50 55 60
Pro Met Ser Gln Glu Ala Arg Leu Gly Ile Lys Pro His Ile Gln Arg
65 70 75 80
Leu Leu Asp Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn Thr
85 90 95
Pro Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val
100 105 110
Gln Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro Thr
115 120 125
Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His Gln
130 135 140
Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu
145 150 155 160
His Pro Thr Ser Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Glu
165 170 175
Met Gly Ile Ser Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly Phe
180 185 190
Lys Asn Ser Pro Thr Leu Phe Asp Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala
195 200 205
Asp Phe Arg Ile Gln His Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Val Asp
210 215 220
Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly Thr
225 230 235 240
Arg Ala Leu Leu Gln Thr Leu Gly Asn Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala
245 250 255
Lys Lys Ala Gln Ile Cys Gln Lys Gln Val Lys Tyr Leu Gly Tyr Leu
260 265 270
Leu Lys Glu Gly Gln Arg Trp Leu Thr Glu Ala Arg Lys Glu Thr Val
275 280 285
Met Gly Gln Pro Thr Pro Lys Thr Pro Arg Gln Leu Arg Glu Phe Leu
290 295 300
Gly Thr Ala Gly Phe Cys Arg Leu Trp Ile Pro Gly Phe Ala Glu Met
305 310 315 320
Ala Ala Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Thr Gly Thr Leu Phe Asn Trp
325 330 335
Gly Pro Asp Gln Gln Lys Ala Tyr Gln Glu Ile Lys Gln Ala Leu Leu
340 345 350
Thr Ala Pro Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Thr Lys Pro Phe Glu Leu
355 360 365
Phe Val Asp Glu Lys Gln Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gln Lys
370 375 380
Leu Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu Asp
385 390 395 400
Pro Val Ala Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala Ile
405 410 415
Ala Val Leu Thr Lys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Met Gly Gln Pro Leu
420 425 430
Val Ile Leu Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gln Pro Pro
435 440 445
Asp Arg Trp Leu Ser Asn Ala Arg Met Thr His Tyr Gln Ala Leu Leu
450 455 460
Leu Asp Thr Asp Arg Val Gln Phe Gly Pro Val Val Ala Leu Asn Pro
465 470 475 480
Ala Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Glu Gly Leu Gln His Asn Cys Leu
485 490 495
Asp Ile Leu Ala Glu Ala His Gly Thr Arg Pro Asp Leu Thr Asp Gln
500 505 510
Pro Leu Pro Asp Ala Asp His Thr Trp Tyr Thr Asp Gly Ser Ser Leu
515 520 525
Leu Gln Glu Gly Gln Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu Thr
530 535 540
Glu Val Ile Trp Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gln Arg
545 550 555 560
Ala Glu Leu Ile Ala Leu Thr Gln Ala Leu Lys Met Ala Glu Gly Lys
565 570 575
Lys Leu Asn Val Tyr Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala His
580 585 590
Ile His Gly Glu Ile Tyr Arg Arg Arg Gly Leu Leu Thr Ser Glu Gly
595 600 605
Lys Glu Ile Lys Asn Lys Asp Glu Ile Leu Ala Leu Leu Lys Ala Leu
610 615 620
Phe Leu Pro Lys Arg Leu Ser Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln Lys
625 630 635 640
Gly His Ser Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gln Ala Ala
645 650 655
Arg Lys Ala Ala Ile Thr Glu Thr Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu Ile
660 665 670

Claims (24)

1.一种逆转录酶，其特征在于，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述逆转录酶的突变类型为D524G-R450H或D524G-D583N-R450H。
2.一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1所述的逆转录酶。
3.一种构建体，其特征在于，包含权利要求2所述的分离的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的构建体，其特征在于，所述构建体为质粒。
5.根据权利要求3所述的构建体，其特征在于，所述分离的核酸分子可操作地连接启动子。
6.根据权利要求5所述的构建体，其特征在于，所述启动子选自下列中的一种：λ-PL启动子、tac启动子、trp启动子、araBAD启动子、T7启动子和trc启动子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含有权利要求3~6中任一项所述的构建体。
8.权利要求1所述逆转录酶的生产方法，其特征在于，包括：
培养宿主细胞，所述宿主细胞为权利要求7所述的宿主细胞；
对所述宿主细胞进行诱导处理，使得所述宿主细胞表达所述逆转录酶；
分离获得所述逆转录酶。
9.根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的逆转录酶。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，还包括下列中的至少一种：
一种或多种核苷酸，一种或多种DNA聚合酶，一种或多种缓冲液、一种或多种引物、一种或多种终止剂。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述终止剂为双脱氧核苷酸。
13.一种用于逆转录核酸分子的方法，其特征在于，所述方法包括：
将至少一种核酸模板与至少一种逆转录酶混合，得到混合物，所述逆转录酶为权利要求1所述的逆转录酶；
将所述混合物进行逆转录反应，以便获得与所述至少一种核酸模板全部或者部分互补的第一核酸分子。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第一核酸分子为cDNA分子。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述核酸模板为mRNA。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述核酸模板的最低含量为10pg。
17.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：
将所述第一核酸分子进行PCR反应，以便获得与所述第一核酸分子全部或者部分互补的第二核酸分子。
18.一种用于扩增核酸分子的方法，其特征在于，包括：
将至少一种核酸模板与至少一种逆转录酶进行第一混合反应，获得反应产物，所述至少一种逆转录酶为权利要求1所述的逆转录酶；
将所述反应产物与至少一种DNA聚合酶进行第二混合反应，以便获得与所述至少一种核酸模板全部或者部分互补的扩增后的核酸分子。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，进一步包括：对所述扩增后的核酸分子进行测序，确定所述扩增后的核酸分子的核苷酸序列。
20.一种构建cDNA文库的方法，其特征在于，包括：
提取待测生物样本中的RNA，获得所述待测生物样本的mRNA；
基于所述待测生物样本的mRNA，利用权利要求13所述的方法进行处理，获得cDNA分子；
基于所述cDNA分子，扩增，建库，以便获得cDNA文库。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述待测生物样本为动物组织、植物组织或者细菌。
22.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述待测生物样中的总RNA含量最低为10pg。
23.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述待测生物样本选自土壤、粪便、血液中的至少一种。
24.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所获得的cDNA的长度至少为2000bp。
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