CN113768932A - 一种治疗双打击淋巴瘤的药物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗双打击淋巴瘤的药物及其应用，所述治疗双打击淋巴瘤的药物包括安罗替尼。本发明创造性地发现安罗替尼可以作为治疗双打击淋巴瘤的药物进行使用，其对多株双打击淋巴瘤细胞的增殖具有抑制作用，能够诱导多株双打击淋巴瘤细胞凋亡并呈浓度及时间依赖性。同时还能下调VEGFR2、PDGFRb、FGFR1蛋白的磷酸化水平，降低c‑MYC、BCL‑2蛋白的表达水平，并抑制其主要功能通路PI3K/Akt的激活。本发明为研究双打击淋巴瘤的治疗策略提供了理论依据，为制备新的治疗双打击淋巴瘤的药物提供了一个嵌入点。

Description

一种治疗双打击淋巴瘤的药物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种安罗替尼的药物新用途，具体涉及一种治疗双打击淋巴瘤的药物及其应用。

背景技术

弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，约占NHL病例的25％。BCL2、BCL6和MYC是DLBCL中最常见的突变基因。双重打击淋巴瘤(Double-hitlymphomas,DHL)是一组伴有MYC和BCL2或BCL6同时发生染色体易位的高级别B细胞淋巴瘤，以BCL2和MYC基因易位最常见，占所有DHL的62％左右。2008年世界卫生组织(WHO)分类将DHL归为形态学、免疫表型等方面特征介于弥漫大B细胞淋巴瘤(BLBCL)和伯基特淋巴瘤(BL)之间的不能分类的B细胞淋巴瘤(BCLU)。尽管DHL发病率低，仅占B细胞淋巴瘤2％左右，但其临床行为具有高度侵袭性，化疗效果差，因此加强对DHL的认识对淋巴瘤的诊断与治疗起重要作用。DHL对传统化疗不敏感，无论是加强方案或含利妥昔单抗方案，效果均不理想，中位总生存期为0.2-1.5年。发病率低，缺乏国内外大型临床研究，目前尚无标准治疗方案，治疗方案包括CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、***)、R-CHOP(利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星、***)、R-Hyper CVAD(利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星、***)、高剂量化疗联合造血干细胞移植、姑息治疗等，何种化疗方案更佳，仍有争议。

目前临床的治疗方案对DHL并没有太大的作用。因此，开发出一种能够有效治疗DHL的策略是非常有意义的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种安罗替尼的药物新用途，具体提供一种治疗双打击淋巴瘤的药物及其应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种治疗双打击淋巴瘤的药物，所述治疗双打击淋巴瘤的药物包括安罗替尼。

安罗替尼(Anlotinib)是一种应用于实体瘤治疗的抗肿瘤血管生成药物，国内II、III期临床试验结果表明安罗替尼对多种实体瘤，包括NSCLC、肾透明细胞癌、结肠癌等，均具有良好临床有效性，而关于安罗替尼对淋巴瘤尤其是双打击淋巴瘤的研究尚未见相关报道。本领域技术人员公知，淋巴瘤是一种区别于实体瘤的肿瘤类型，是起源于淋巴造血***可累及***，骨髓，肝脾及全身组织器官的一组高度异质性恶性肿瘤，病理亚型多达数十种。而双打击淋巴瘤(double-hit lymphoma,DHL)更为特殊，其是一类通过FISH技术检测同时伴有MYC和BCL2或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤，其病理介于活化B细胞大细胞淋巴瘤和生发中心大细胞淋巴瘤。DHL呈高度侵袭性，常表现为高Ki-67指数、中枢神经***及结外侵犯，对常规化疗方案不敏感，患者中位OS一般不超过1.5年，缓解期短，易复发，复发后中位OS仅8.6个月，预后极差。即使应用强化疗或自体造血干细胞移植方案，也不能明显改善患者预后，是淋巴瘤治疗领域的难点。理论上，Bcl-2抑制剂和负调控c-MYC转录的BET抑制剂等靶向药物应具有较好的疗效，但目前研究显示Bcl-2抑制剂和BET抑制剂对DHL疗效并不理想，进一步研究表明，MYC基因是“undruggle”的原癌基因，直接抑制MYC基因的药物如BET抑制剂容易发生耐药问题。

本领域技术人员公知，新生血管生成与实体瘤发生发展发挥不可或缺的作用，近年来许多前沿临床前研究表明抗血管生成药物对多种恶性淋巴瘤有一定体内外抗肿瘤作用。但由于淋巴瘤的高度的遗传以及克隆异质性，抗血管治疗并不对所有淋巴瘤均有效。研究进展目前局限于低侵袭性淋巴瘤如霍奇金淋巴瘤，且对于惰性淋巴瘤患者仍达不到治愈的效果，只能延长生存期，对于高侵袭性淋巴瘤等效果并不理想，无法进入常规一线治疗。一项关于VEGF单抗联合或不联合R-CHOP方案治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤研究显示，加用VEGF单抗患者PFS并无明显延长，而毒副作用增加。

本发明创造性地发现安罗替尼可以作为治疗双打击淋巴瘤的药物进行使用，其对多株双打击淋巴瘤细胞(LR,MCA,Will2,TMD-8,DB)的增殖具有抑制作用，能够诱导多株双打击淋巴瘤细胞凋亡并呈浓度及时间依赖性。同时还能下调VEGFR2、PDGFRb、FGFR1蛋白的磷酸化水平，降低c-MYC、BCL-2蛋白的表达水平，并抑制其主要功能通路PI3K/Akt的激活。本发明为研究双打击淋巴瘤的治疗策略提供了理论依据，为制备新的治疗双打击淋巴瘤的药物提供了一个嵌入点。

在本发明中，所述药物抑制双打击淋巴瘤细胞的增殖。

在本发明中，所述药物诱导双打击淋巴瘤细胞的凋亡。

在本发明中，所述药物下调VEGFR2、PDGFRb、FGFR1蛋白的磷酸化水平。

在本发明中，所述药物降低c-MYC、BCL-2蛋白的表达水平。

在本发明中，所述药物抑制PI3K/Akt通路的激活。

第二方面，本发明提供安罗替尼在制备治疗双打击淋巴瘤的药物中的应用。

第三方面，本发明提供安罗替尼在制备抑制双打击淋巴瘤细胞增殖的药物中的应用。

第四方面，本发明提供安罗替尼在制备诱导双打击淋巴瘤细胞凋亡的药物中的应用。

第五方面，本发明提供安罗替尼在制备抑制VEGFR2、PDGFRb、FGFR1蛋白磷酸化的药物中的应用。

第六方面，本发明提供安罗替尼在制备c-MYC、BCL-2蛋白抑制剂中的应用。

第七方面，本发明提供安罗替尼在制备PI3K/Akt通路抑制剂中的应用。

在本发明中，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的任意一种。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述辅料包括载体、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。所述至少两种的组合例如稀释剂和赋形剂的组合、粘合剂和润湿剂的组合、乳化剂和助溶剂的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明创造性地发现安罗替尼可以作为治疗双打击淋巴瘤的药物进行使用，其对多株双打击淋巴瘤细胞(LR,MCA,Will2,TMD-8,DB)的增殖具有抑制作用，能够诱导多株双打击淋巴瘤细胞凋亡并呈浓度及时间依赖性。同时还能下调VEGFR2、PDGFRb、FGFR1蛋白的磷酸化水平，降低c-MYC、BCL-2蛋白的表达水平，并抑制其主要功能通路PI3K/Akt的激活。本发明为研究双打击淋巴瘤的治疗策略提供了理论依据，为制备新的治疗双打击淋巴瘤的药物提供了一个嵌入点。

附图说明

图1是CCK8法检测48h处理时间下Anlotinib对多个DHL细胞株(LR,MCA,Will2,TMD-8,DB)增殖抑制的结果统计图；

图2是CCK8法检测72h处理时间下Anlotinib对多个DHL细胞株(LR,MCA,Will2,TMD-8,DB)增殖抑制的结果统计图；

图3是Anlotinib诱导DHL细胞凋亡的经典流式散点密度图；

图4是Anlotinib诱导DHL细胞凋亡的各组凋亡率统计柱状图；

图5是Anlotinib对DHL细胞株作用48h后各蛋白水平的WB法检测图；

图6是Anlotinib对DHL细胞株作用48h后PI3K/AKT通路活化情况的WB法检测图；

图7是qPCR法检测Anlotinib处理DHL细胞株后c-MYC的mRNA表达水平结果图；

图8是qPCR法检测Anlotinib处理DHL细胞株后Mcl-1的mRNA表达水平结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施本发明的过程、条件、试剂、试验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普通知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。各实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另有说明，本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的含义相同，但如有冲突，以包含定义的本说明书为准。

下述实施例中所使用的安罗替尼由正大天晴药业集团公司提供，生产批号为420044-201901，规格为100mg/支。

DHL细胞株(LR,MCA,Will2,TMD-8,DB)由美国杜克大学何旭华教授所赠。

实施例1

安罗替尼对DHL细胞株增殖抑制的评价

操作方法为：取对数生长期的DHL细胞株(LR,MCA,Will2,TMD-8,DB)以2×10⁴/孔分别接种于96孔板中，过夜，细胞生长状态良好后，加入含不同浓度的安罗替尼(0，1，2，4，8μM)的RPMI-1640完全培养基，分别培养48h和72h停止培养，并设置对照组。然后应用CCK8试剂盒检测细胞的增殖情况。结果如图1和图2所示。由图可知：安罗替尼处理48h及72h，DHL细胞活力随处理浓度增加而减少，并且各个细胞半数抑制率72h(3.776μM，2.965μM，3.546μM，1.353μM，3.663μM)比48h(5.784μM，8.213μM，3.305μM，1.693μM，7.486μM)均减少，提示安罗替尼对DHL细胞株的抗增殖作用呈时间及浓度依赖性。

实施例2

安罗替尼诱导DHL细胞株凋亡的评价

操作方法为：取对数生长期的DHL细胞株(LR,MCA,TMD-8)以2×10⁵/孔分别接种于24孔板中，过夜，细胞生长状态良好后，加入含不同浓度的安罗替尼(0，1，2，4，8μM)的RPMI-1640完全培养基，培养48h后停止培养，并设置对照组。然后应用Annexin V/PI试剂盒检测不同实验组细胞的凋亡情况。经典流式散点密度图如图3所示，各组凋亡率统计情况如图4所示，由图3和图4可知：经安罗替尼处理后，凋亡细胞(AnnexinV阳性)比例随药物浓度增加而增加，提示安罗替尼可诱导DHL细胞发生凋亡。

实施例3

安罗替尼对VEGFR2、PDGFRb、FGFR1蛋白磷酸化水平，以及对c-MYC、Bcl-2、Mcl-1、PARP表达的影响

操作方法为：取对数生长期的DHL细胞株(TMD-8)以5×10⁶/孔分别接种于10cm培养皿，加入含不同浓度的安罗替尼(0，1，2μM)的RPMI-1640培养基，培养48h后停止培养。然后提取蛋白用于western blot检测VEGFR2、PDGFRb、FGFR1蛋白磷酸化水平，c-MYC、Bcl-2、Mcl-1、PARP的表达，结果如图5所示，由图可知：药物处理后，DHL细胞的关于安罗替尼靶点如VEGFR2,PDGFRb，FGFR1蛋白的磷酸化水平随浓度增加均发生下调，凋亡标志蛋白PARP随药物浓度增加，下游的裂解条带亦逐渐增强，印证上述安罗替尼对DHL细胞的抗肿瘤及诱导凋亡作用。此外，关于DHL特征的生存依赖蛋白c-MYC，Bcl-2等在蛋白水平亦明显下降。

实施例4

安罗替尼对PI3K/AKT通路的活化情况

操作方法为：取对数生长期的DHL细胞株(TMD-8)以5×10⁶/孔分别接种于10cm培养皿，加入含不同浓度的安罗替尼(0，1，2μM)的RPMI-1640完全培养基，培养48h后停止培养。然后提取蛋白用于western blot检测PI3K/AKT通路磷酸化水平，结果如图6所示，由图可知：药物处理后，c-MYC上游调控通路PI3K及AKT蛋白其磷酸化水平随处理浓度增加均明显下降，而本底蛋白无明显变化。PI3K/AKT下游的FOXO3a转录因子以及其靶基因Bim并未发生明显变化，提示安罗替尼能抑制DHL细胞株PI3K/AKT通路的活化且并不依赖于FOXO3a。

实施例5

安罗替尼对c-MYC和Mcl-1的mRNA表达水平的影响

操作方法为：取对数生长期的DHL细胞株(LR,MCA,TMD-8)以5×10⁵/孔分别接种于6孔板中，过夜，细胞生长状态良好后，加入含不同浓度的安罗替尼(0，2，4μM)的RPMI-1640完全培养基，分别培养24h后停止培养。然后应用q-PCR法检测c-MYC和Mcl-1的mRNA表达水平。结果如图7和图8所示，由图可知：药物处理24h后，4μM组DHL细胞(LR,MCA,TMD-8)关于c-MYC的mRNA水平相对于未处理组均发生不同程度下降，提示安罗替尼能在转录水平下调c-MYC。而Bcl-2家族的Mcl-1的mRNA水平仅在TMD-8细胞中有显著上调，且TMD-8在DHL属于较为敏感细胞，因此可能为反应性增加。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种治疗双打击淋巴瘤的药物及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种治疗双打击淋巴瘤的药物，其特征在于，所述治疗双打击淋巴瘤的药物包括安罗替尼。

2.如权利要求1所述的药物，其特征在于，所述药物抑制双打击淋巴瘤细胞的增殖；

优选地，所述药物诱导双打击淋巴瘤细胞的凋亡。

3.如权利要求1或2所述的药物，其特征在于，所述药物下调VEGFR2、PDGFRb、FGFR1蛋白的磷酸化水平；

优选地，所述药物降低c-MYC、BCL-2蛋白的表达水平；

优选地，所述药物抑制PI3K/Akt通路的激活。

4.安罗替尼在制备治疗双打击淋巴瘤的药物中的应用。

5.安罗替尼在制备抑制双打击淋巴瘤细胞增殖的药物中的应用。

6.安罗替尼在制备诱导双打击淋巴瘤细胞凋亡的药物中的应用。

7.安罗替尼在制备抑制VEGFR2、PDGFRb、FGFR1蛋白磷酸化的药物中的应用。

8.安罗替尼在制备c-MYC、BCL-2蛋白抑制剂中的应用。

9.安罗替尼在制备PI3K/Akt通路抑制剂中的应用。

10.如权利要求4-9中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的任意一种；

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料；

优选地，所述辅料包括载体、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

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