CN113759003B - 一种基于uplc指纹图谱和化学计量法的甘草产地判别方法 - Google Patents

一种基于uplc指纹图谱和化学计量法的甘草产地判别方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于UPLC指纹图谱和化学计量法的甘草产地判别方法，采用UPLC建立了甘草不同产地、不同提取物的指纹图谱，并将指纹图谱与SA、HCA、PCA、OPLS‑DA等化学计量学方法相结合，筛选出对甘草质量评价有重要影响的特征标记化合物，然后采用UPLC/Q‑TOF‑MS对特征标记化合物进行鉴定，并对7个峰进行了定量测定。最后，利用判别分析法模拟甘草产地的判别函数方程，追踪药材产地。本发明方法不仅为甘草药材或其他相关食品药品的质量、提取方法及开发利用提供了有价值和潜在的参考，同时，也为甘草药材产地溯源及质量鉴定提供了参考和依据，通过判别函数方程即可快速、有效地鉴别甘草药材的产地，正判率高，适合推广应用。

Description

一种基于UPLC指纹图谱和化学计量法的甘草产地判别方法
技术领域
本发明涉及中药成分研究技术领域，具体涉及一种基于UPLC指纹图谱和化学计量法的甘草产地判别方法。
背景技术
道地药材，又称为地道药材，是优质中药材的代名词，是指药材质优效佳。道地药材是经过中医临床长期应用优选出来的，产在特定地域，与其他地区所产同种中药材相比，品质和疗效更好，且质量稳定，具有较高知名度的中药材，是传统的中医中药学中控制中药材质量的一项独特的综合判定标准。
甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)在我国是世界上记录和研究最早的国家，首载于东汉的《神农本草经》。已被传统医学用于多种用途，例如：益气补中、清热解毒、祛痰止血等功效。甘草在《本草纲目》草部中排位第一，是“解七十二毒”的调和药。不同产地的气候环境、土壤条件的变化可能导致甘草内在品质的差异。甘草主要分布于新疆、内蒙古、甘肃的河西走廊，陇西的周边，宁夏部分地区。生长于这些地区的甘草与其他地区所产同种甘草药材相比，品质和疗效更好，且质量稳定，具有较高知名度。然而市场上广泛存在以次充好、假冒伪劣的现象，不仅严重影响了甘草道地药材的声誉和品牌价值，更是有可能在用于治疗病情时危害人体健康。但目前还未有能有效鉴别甘草药材产地的快速分析方法。因此，急需研究一种能够鉴别甘草药材源产地的方法，判定药材是否为道地药材，并对其进行质量控制。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种基于UPLC指纹图谱和化学计量法的甘草产地判别方法，该方法为甘草药材产地溯源及质量鉴定提供了参考和依据，正判率高，适合推广应用。
本发明是通过以下技术方案实现：
一种基于UPLC指纹图谱和化学计量法的甘草产地判别方法，包括以下步骤：
(1)收集各产地的甘草药材，采用超高效液相色谱法建立甘草不同产地、不同提取物的指纹图谱；所述甘草药材采自新疆、甘肃和内蒙古；所述提取物为甘草醇提物和甘草水提物；
(2)利用相似性分析SA、层次聚类分析HCA、主成分分析PCA和正交偏最小二乘判别分析法OPLS-DA筛选特征标记化合物；
(3)采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱对特征标记化合物进行鉴定，并采用超高效液相色谱法进行定量分析；
(4)采用Wilk's lambda法进行逐步判别分析，得到甘草不同产地、不同提取物的判别函数方程，对甘草药材产地进行判别；
甘草不同产地醇提物的判别函数方程为：
Y新疆＝7.629S1+3.029S2-0.404S3+663.007S4+1765.007S5+0.537S6-82.594；
Y甘肃＝8.026S1+3.36S2-1.452S3+830.744S4+1857.135S5+0.619S6-95.093；
Y内蒙古＝7.646S1+3.706S2-0.489S3+649.922S4+1793.914S5+0.599S6-94.193；
其中，S1为芹糖甘草苷，S2为甘草苷，S3为芹糖异甘草苷，S4为甘草素，S5为刺甘草查尔酮，S6为甘草酸。
甘草不同产地水提物的判别函数方程为：
Y新疆＝3.783S1+2.731S2-0.137S3+2418.876S4-131.472S5+0.697S6-44.812；
Y甘肃＝3.698S1+3.163S2-1.26S3+3107.573S4-327.356S5+0.792S6-49.803；
Y内蒙古＝3.423S1+3.539S2-1.159S3+3713.539S4-500.921S5+0.957S6-58.480；
其中，S1为芹糖甘草苷，S2为甘草苷，S3为芹糖异甘草苷，S4为刺甘草查尔酮，S5为甘草查尔酮，S6为甘草酸。
优选的，步骤(1)中，所述甘草醇提物的制备方法为：精密称取甘草药材粉末，精密加入30-50倍量的60-80％乙醇，称定质量，超声提取20-40min，放冷后再次称定质量，加入60-80％乙醇补足失重，摇匀静置，经0.22μm的有机系滤膜过滤后，取续滤液即得。
优选的，步骤(1)中，所述甘草水提物的制备方法为：称取甘草药材，先加12-16倍量水煎煮1-2h，倒出提取液，再加6-10倍量水煎煮0.5-1h，将两次煎煮液合并稀释至每1mL含药量为0.025g，取稀释液过0.22μm水系滤膜，取续滤液即得。
优选的，步骤(1)和步骤(3)中，所述超高效液相色谱法中的色谱条件为：C18柱；检测波长254nm；以乙腈为流动相A和0.1％甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0–2min，80–75％B；2–4min，75–73％B；4–12min，73–60％B；12–18min，60–40％B；18–20min，40–80％B；20–25min，80％B；柱温30℃；流速为0.3ml/min，进样量为1μL。
优选的，步骤(3)中，所述质谱条件为：电喷雾电离(ESI)源，ESI源在正负极性同时工作，毛细管温度270℃，蒸发温度300℃；鞘层气体流量35μL/min，辅助气体流量5μL/min，全扫描分析，Q-TOF采集速率0.1s，质量范围在50到1200m/z之间。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明提供一种基于UPLC指纹图谱和化学计量学方法对甘草产地进行判别的方法。采用超高效液相色谱法(UPLC)建立了甘草不同产地、不同提取物的指纹图谱，并将指纹图谱与相似性评价***、HCA、PCA、OPLS-DA等化学计量学方法相结合，筛选出对甘草质量评价有重要影响的特征标记化合物，然后采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF-MS)对特征标记化合物进行鉴定，并对7个峰进行了定量测定。最后，利用判别分析法模拟甘草产地的判别函数方程，追踪药材产地。本发明方法不仅为甘草药材或其他相关食品药品的质量、提取方法及开发利用提供了有价值和潜在的参考，同时，也为甘草药材产地溯源及质量鉴定提供了参考和依据，通过判别函数方程即可快速、有效地鉴别甘草药材的产地，正判率高，适合推广应用。
附图说明
图1为13批甘草醇提物的指纹图谱图；
图2为13批甘草醇提物的共有峰图；
图3为13批甘草水提物的指纹图谱图；
图4为13批甘草水提物的共有峰图；
图5为13批甘草水提物的层次聚类分析树状图；
图6为13批甘草醇提物的层次聚类分析树状图；
图7为13批甘草醇提物主成分分析(PCA)得分图；
图8为13批甘草水提物主成分分析(PCA)得分图；
图9为13批甘草醇提物主成分分析(PCA)的负荷图；
图10为13批甘草水提物主成分分析(PCA)的负荷图；
图11为13批甘草醇提物的负荷S-plots图；
图12为13批甘草水提物的负荷S-plots图；
图13为芹糖甘草苷的质谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
1.药材收集及指纹图谱的建立
1.1试剂与药材
13批甘草药材分别采集于新疆、甘肃、内蒙古，将其分为三组：S1-S5为新疆地区药材，S6-S10为甘肃地区药材，S11-S13为内蒙古地区药材。
芹糖异甘草苷(批号：PRF7061501)、芹糖甘草苷(批号：PRF8022729)均购自于成都瑞普法科技开发有限公司，纯度＞98％；甘草苷(批号：111610-201607，纯度93.1％)、甘草酸(批号：110731-201619，纯度93％)均购自中国食品药品检定研究所；甘草素(批号：17022104，纯度99.07％)、甘草查尔酮B(批号：17032202，纯度99.74％)、刺甘草查尔酮(批号：17032203，纯度99.77％)均购自于中国标准物质网。乙腈(色谱纯，批号：LCC0S85)，乙醇(色谱纯，批号：LG40S76)，甲酸(分析纯，批号：20140208)；水为实验室净水***制备的超纯水(PALL USA)。
1.2对照品储备液的制备
精密称取甘草各化学标准品10.0mg，分别置于1mL容量瓶中，然后用70％乙醇分步稀释制备一系列混合参比溶液。所有溶液均在4℃下保存至需要分析。
1.3供试品溶液的制备
1.3.1甘草醇提物供试品溶液的制备
精密称取甘草药材粉末1.0g于50mL的具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇40mL，称定质量，超声提取30min，放冷后再次称定质量，加入70％乙醇补足失重，摇匀静置，经0.22μm的有机系滤膜过滤后，取续滤液即得甘草醇提物(LEE)。
1.3.2甘草水提物供试品溶液的制备
称取甘草药材50.0g，先加14倍量水煎煮2h，倒出提取液，再加8倍量水煎煮1h，将两次煎煮液合并稀释至每1mL含药量为0.025g。取稀释液过0.22μm水系滤膜，取续滤液即得甘草水提物(LWE)。
1.4超高效液相UPLC色谱条件
Waters-CORTECS C18柱(4.6×50m m，2.7μm)；检测波长254nm；以乙腈为流动相A和0.1％甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0–2min，80–75％B；2–4min，75–73％B；4–12min，73–60％B；12–18min，60–40％B；18–20min，40–80％B；20–25min，80％B；柱温30℃；流速为0.3ml/min，进样量为1μL。
1.5甘草UPLC指纹图谱的建立
为建立特征指纹图谱和综合指纹图谱，采用UPLC法对13批不同产地、不同提取方法的甘草根样品进行分析，并采用中药色谱指纹图谱相似度评价体系(2012A版)进行标准化。根据指纹图谱分析，从13批甘草药材的醇提取物样品(图1)中分离出25个共有峰(图2)，从水提物样品(图3)中分离出23个共有峰(图4)，这些峰具有高分辨率，作为参考色谱图。
2.筛选特征标记化合物
2.1相似性分析(SA)
采用国家药典委员会发布的专业软件《中药色谱指纹图谱相似度评价***》(2012A版)对新疆、甘肃、内蒙古13个批次甘草药材的醇提物(LEE)和水提物(LWE)进行相似度计算。13个LEE和LWE样品的相关系数分别见表1和表2。当相关系数接近1.0时，表示样本越具有完全相似性。相关系数较低，说明在确定甘草样品间的关系时，数学质量较差。因此，相似性的异质性表明，不同的提取工艺和多样性影响甘草样品的质量。
表1 13批甘草醇提物样品相似度评价结果
Figure BDA0002524391700000051
表2 13批甘草水提物样品相似度评价结果
Figure BDA0002524391700000052
Figure BDA0002524391700000061
结果表明，醇提物指纹图谱相似度大于0.84，水提物指纹图谱相似度较低(大于0.80)。从表1可以看出，S1与S3、S1与S4、S11与S7、S11与S9、S11与S10之间的相关性均高于甘草的其他产地。结果表明，S1和S11的峰3、峰4、峰6、峰14、峰20含量明显高于其它峰，可能影响LEE样品的质量。与此相反，S3与S6、S3与S8之间的相关性低于其他批次。S3的峰4、峰20含量明显低于S6、S8的峰。因此，峰3、4、6、14、20等特征峰对LEE指纹图谱的质量控制具有重要意义。
从表2可以看出，S4与S1、S4与S5、S11与S7之间的相关性也高于甘草的其他产地。结果表明，S4和S11的峰5、6、7、11、19含量明显高于其它峰，可能影响LWE样品的质量。相比之下，S3与S6、S3与S7、S3与S13之间的相关性低于其他批次。S3的峰6含量明显低于S6、S7和S13。因此，特征峰5、6、7、11、19对LWE指纹图谱的质量控制具有重要意义。
2.2层次聚类分析(HCA)
HCA是一种多元分析技术，可以根据样本的内部特征对样本进行分组。本发明采用SIMCA14.1软件进行HCA，通过层次距离和欧氏距离的平方计算相似度。样本之间的相关性程度取决于树中的距离，最短的距离表示关系的最高程度。因此，这些对象被视为同一组的属性。此图显示为一个树状图，用作解释样本簇之间最近距离的工具。通过对不同批次甘草样品的分类，筛选出一些具有统计学意义的质量评价指标。层次聚类分析结果表明，13批LWE样本被分为两大类，新疆产甘草被分为Ⅰ类，S1、S2为一组，S3、S4、S5为另一组。甘肃和内蒙古产甘草分为II组，S11和S13为一组，S6～S10和S12为一组(图5)。将LEE样本分为两大类，其中S1～S5为I类，S6～S13为II类。甘肃甘草S6、S7、S8、S9、S10为一组，内蒙古甘草S11、S12、S13为另一组(图6)。
2.3主成分分析(PCA)
主成分分析用于缓解多重共线性问题，并探讨自变量之间的关系。作为传统和典型的数据分析技术，它是许多指纹研究的主要组成部分。此外，还需要对甘草指纹图谱进行评价，以确定其是否能有效地对不同地区的样品进行分组，并在色谱图中识别出代表性的峰。因此，本发明利用SIMCA14.1软件中主成分分析(PCA)得到的多变量分析得分与负荷之间的相关性，来描述相似性评价软件选择的特征标记(LEE样本25个特征标记，LWE样本23个特征标记)与13批不同来源和不同提取方法的甘草样品之间的关系。在主成分分析中，大量数据被主成分得分(PCS)代替，PCS包含与原始数据相同的信息。通过计算甘草样品共有峰的平均中心相对峰面积生成主成分分析。第一主成分(PC1)包含数据中的最大方差，而第二主成分(PC2)表示PC1未解释的最大方差。根据LEE的主成分分析(PCA)得分图(图7)，PC1和PC2分别占原始观测值总变异的45.2％和29.7％，占总变异的75.1％。同样，在LWE的PCA得分图(图8)中，PC1和PC2分别占原始观测值总变异的67.8％和14.3％，占总变异的82.1％。
如LEE主成分分析得分图(图7)所示，根据样本来源，可分为三组。S2、S3和S5可以很容易地分成一组，S1位于S4附近，其化学成分相互关联。因此，S2、S3、S5、S1和S4倾向于根据其化学成分的相似性归为同一类。S8、S9、S10、S7和S6易于分组，它们的化学成分相互关联。同时，S11与S13相邻，因此，根据其化学成分的相似性，S12、S11和S13倾向于归为同一个簇。同样，得分图(图8)显示，13个LWE样本被分为三组。用PC2阳性值对S1和S2进行聚类分析，S3、S4和S5用PC1的负值进行聚类。因此，S1、S2、S3、S4和S5倾向于根据其化学成分的相似性归为同一类。而S6、S7、S11、S12、S13则被PC1阳性值聚类。根据PC2，S3、S4、S5和S8、S9、S10明显分离。S8、S9、S10用PC2的负值进行聚类。这些组也与HCA所描述的甘草起源之间的一些关系和地理差异的结果相一致。
图9和图10表明，主成分分析的负荷图对评价13批甘草样品的质量具有重要意义。负荷图显示了影响样本间差异的多变量，可见，这些共有峰对甘草的品质有影响。从LEE的负荷图(图9)来看，峰14、峰8、峰15、峰4和峰3对地理差异的质量影响最大。另外，峰6和峰20对质量评价也有影响。最后，根据统计数据筛选出7个主要化合物。同样，从LWE的负荷图(图10)来看，峰10、峰14、峰21、峰7和峰19对地理差异的质量影响最大。峰11和峰5对质量评价也有影响。最后，根据统计数据，从中筛选出7个主要化合物。相似度评价结果与HCA、PCA一致，可用于甘草指纹图谱的质量评价。
2.4正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)
正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)是一种提高解释能力的监督分类技术。从LEE负荷S-plots图(图11)来看，峰14、峰19、峰10对地理差异的质量影响最大；从LWE的负荷S-plots图(图12)来看，峰10、峰11对地理差异的质量影响最大。然而，LEE中的峰19、15、8和LWE中的峰21、14等不能提供表示未知化合物的紫外光谱的可分辨最大波长，这些峰为未知化合物的存在。最后，结合SA、HCA和PCA分析，明确了芹糖甘草苷，甘草苷，芹糖异甘草苷，刺甘草查尔酮，甘草酸，甘草素在LEE质量评价中的重要作用。与此类似，芹糖甘草苷，甘草苷，芹糖异甘草苷，刺甘草查尔酮，甘草查尔酮B，甘草酸在LWE的质量评价中也起着重要作用。
3.化学成分的鉴定及定量分析
3.1成分的鉴定
质谱检测器配有电喷雾电离(ESI)源。ESI源在正负极性同时工作。最佳质谱参数为：毛细管温度270℃，蒸发温度300℃；鞘层气体流量35μL/min，辅助气体流量5μL/min，全扫描分析，Q-TOF采集速率0.1s，质量范围在50到1200m/z之间。为了获得完整的分子碎裂模式，还进行了数据相关的采集。
一般来说，化合物可通过与对照品的保留时间、MS和MS/MS裂解模式的比较来鉴定。此外，本发明还利用一种新型的数据采集后处理软件UNIFI，实现了甘草化学成分的自动、快速、准确的定性分析。通过这些方法，从SA和HCA结果中筛选出未知的特征标记化合物(LEE中有25个特征标记，LWE中有23个特征标记)。这些特征标记化合物对甘草的质量评价有显著影响，突出了不同提取方法下甘草成分的差异。这些化合物的质谱特征和鉴定见表3和表4。
表3甘草醇提物特征性成分MS数据
Figure BDA0002524391700000081
Figure BDA0002524391700000091
表4甘草水提物特征性成分MS数据
Figure BDA0002524391700000092
Figure BDA0002524391700000101
以Violanthin(三色堇黄酮甙)和Liquiritin apioside(芹糖甘草苷)为例说明其片段离子鉴定。从图13可以看出，化合物的准确质量值(m/z 577.1563[m-H]-)和片段离子(m/z 415.1024[m-H-Glc]-)、分子量和化学式证明了三色堇黄酮甙的存在。此外，实验质量值与理论质量值之间的误差在允许范围内，显然，片段离子峰(m/z 415.1024)来自母体离子峰[m-H]+(577.1563)。此外，还有确切的质量数据(m/z 551.1757，[m+H]+)，(m/z549.1648，[m-H]-)和片段离子(m/z 257.0828)，这是一种已知化合物，名为芹糖甘草苷，因此，初步确定了峰3。
3.2定量分析
3.2.1线性关系
准确吸取“1.2”项下各对照品溶液适量，配制一系列连续稀释的混合对照品溶液。根据“1.5”项下的色谱条件记录峰面积。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归。各成分的标准曲线及相关信息见表5。
表5甘草中7种成分的标准曲线
Figure BDA0002524391700000111
3.2.2精度度、重复性、稳定性
精密度计算是取同一批甘草样品，按“1.3”项制备LWE和LEE，然后按“1.4”项色谱条件连续进样6次，测定LWE和LEE的指纹图谱。相对标准偏差(RSD)均小于3.0％，表明仪器精度达到要求。
对同批分别6个样品进行重复性计算，在相同条件下制备LWE和LEE，分别进样，记录色谱峰。取同一批甘草样品，按“1.3”项制备LWE和LEE，并按“1.4”项下色谱条件在0、2、4、8、12、24小时测定指纹图谱。RSD均小于3.0％，表明甘草样品溶液在24小时内稳定，结果总结见表6。
表6甘草中7种成分的精密度，重复性，稳定性
Figure BDA0002524391700000112
3.2.3定量研究
最后，选取6种具有统计显著性成分的化学成分分别作为LWE和LEE的主成分。该综合探索性分析方法适用于13批不同产地甘草的应用及提取方法的选择。同时，测定了7种特征化合物在不同提取方法下的含量(LEE和LWE中5种化学成分相同，1种化学成分互不相同同)，总结见表7和表8。不同产地样品提取物中6种化合物含量不一致，说明不同的栽培条件，如气候、不同产地的日照等，可能影响甘草的品质。此外，LEE和LWE中6种成分的含量也不一致，说明提取工艺对甘草有效成分的提取有显著影响。以新疆、内蒙古地区为例，三萜类成分含量明显高于甘肃地区，LEE特征成分含量明显高于LWE。此外，不同提取方法得到的甘草有效成分类型也存在差异，如甘草查尔酮B存在于LWE中而不存在于LEE中，说明不同提取方法对中药有效成分的溶出有明显影响。
表7不同产地13批甘草醇提物特征性成分的含量
Figure BDA0002524391700000121
表8不同产地13批甘草水提物特征性成分的含量
Figure BDA0002524391700000122
Figure BDA0002524391700000131
4.判别分析
判别分析是在分类确定的条件下，根据研究对象的各种特征值来确定其类型分类的多元统计分析方法。本研究建立了代表13个甘草样品的U＝{X1，X2，…，X13}结构域，选取刺甘草苷、甘草酸、芹糖甘草苷等7个特征峰的含量作为判别因子，形成13×7矩阵，如式(1)所示。
Xi＝(Xi1,Xi2,...,Xi7) (1)
式中：i为样本号；X为样本。
利用SPSS 22.0软件，采用Walk’s lambda法进行逐步判别分析，得到甘草产地判别函数。用回代估计方法评价判别函数的优缺点。最后，得到LEE的判别函数方程如下(S1：芹糖甘草苷，S2：甘草苷，S3：芹糖异甘草苷，S4：甘草素，S5：刺甘草查尔酮，S6：甘草酸)：
Y新疆＝7.629S1+3.029S2-0.404S3+663.007S4+1765.007S5+0.537S6-82.594；
Y甘肃＝8.026S1+3.36S2-1.452S3+830.744S4+1857.135S5+0.619S6-95.093；
Y内蒙古＝7.646S1+3.706S2-0.489S3+649.922S4+1793.914S5+0.599S6-94.193；
同样的，得到了甘草水提物LWE的判别函数方程如下(S1：芹糖甘草苷，S2：甘草苷，S3：芹糖异甘草苷，S4：刺甘草查尔酮，S5：甘草查尔酮B，S6：甘草酸)：
Y新疆＝3.783S1+2.731S2-0.137S3+2418.876S4-131.472S5+0.697S6-44.812；
Y甘肃＝3.698S1+3.163S2-1.26S3+3107.573S4-327.356S5+0.792S6-49.803；
Y内蒙古＝3.423S1+3.539S2-1.159S3+3713.539S4-500.921S5+0.957S6-58.480；
将筛选后各特征峰的含量带入函数方程，比较不同产地的函数方程的Y值，其中Y值最大的则该样品属于该方程所代表的源产地。通过回代估计方法的检验，我们对另外10批已知产地的甘草进行了检验，将LEE和LWE的产地判别分析与实际结果进行了比较，正确率分别为90％和80％(表9和表10)。这说明所建立的判别函数方程比较稳定，能够实现对甘草产地的预测和鉴别。
表9甘草醇提物判别函数方程效果评估
Figure BDA0002524391700000141
表10甘草水提物判别函数方程效果评估
Figure BDA0002524391700000142

Claims (4)

1.一种基于UPLC指纹图谱和化学计量法的甘草产地判别方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）收集各产地的甘草药材，采用超高效液相色谱法建立甘草不同产地、不同提取物的指纹图谱；所述甘草药材采自新疆、甘肃和内蒙古；所述提取物为甘草醇提物和甘草水提物；
（2）利用相似性分析SA、层次聚类分析HCA、主成分分析PCA和正交偏最小二乘判别分析法OPLS-DA筛选特征标记化合物；
（3）采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱对特征标记化合物进行鉴定，并采用超高效液相色谱法进行定量分析；
（4）采用Wilk's lambda法进行逐步判别分析，得到甘草不同产地、不同提取物的判别函数方程，对甘草药材产地进行判别；
甘草不同产地醇提物的判别函数方程为：
Y新疆=7.629S1+3.029S2-0.404S3+663.007S4+1765.007S5+0.537S6-82.594；
Y甘肃=8.026S1+3.36S2-1.452S3+830.744S4+1857.135S5+0.619S6-95.093；
Y内蒙古=7.646S1+3.706S2-0.489S3+649.922S4+1793.914S5+0.599S6-94.193；
其中，S1为芹糖甘草苷，S2为甘草苷，S3为芹糖异甘草苷，S4为甘草素，S5为刺甘草查尔酮，S6为甘草酸；
甘草不同产地水提物的判别函数方程为：
Y新疆=3.783S1+2.731S2-0.137S3+2418.876S4-131.472S5+0.697S6-44.812；
Y甘肃=3.698S1+3.163S2-1.26S3+3107.573S4-327.356S5+0.792S6-49.803 ；
Y内蒙古=3.423S1+3.539S2-1.159S3+3713.539S4-500.921S5+0.957S6-58.480 ；
其中，S1为芹糖甘草苷，S2为甘草苷，S3为芹糖异甘草苷，S4为刺甘草查尔酮，S5为甘草查尔酮B，S6为甘草酸；
步骤（1）和步骤（3）中，所述超高效液相色谱法中的色谱条件为：
Waters-CORTECS C18 柱，规格为4.6×50mm，2.7μm；检测波长254nm；以乙腈为流动相A和0.1%甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0–2 min，80–75%B；2–4 min，75–73%B；4–12 min，73–60%B；12–18 min，60–40%B；18–20 min，40–80%B；20–25min，80%B；柱温30℃；流速为0.3ml/min，进样量为1μL。
2.根据权利要求1所述的一种基于UPLC指纹图谱和化学计量法的甘草产地判别方法，其特征在于，步骤（1）中，所述甘草醇提物的制备方法为：
精密称取甘草药材粉末，精密加入30-50倍量的60-80%乙醇，称定质量，超声提取20-40min，放冷后再次称定质量，加入60-80%乙醇补足失重，摇匀静置，经0.22 μm的有机系滤膜过滤后，取续滤液即得。
3.根据权利要求1所述的一种基于UPLC指纹图谱和化学计量法的甘草产地判别方法，其特征在于，步骤（1）中，所述甘草水提物的制备方法为：
称取甘草药材，先加12-16倍量水煎煮1-2 h，倒出提取液，再加6-10倍量水煎煮0.5-1h，将两次煎煮液合并稀释至每1 mL含药量为0.025 g，取稀释液过0.22 μm水系滤膜，取续滤液即得。
4. 根据权利要求1所述的一种基于UPLC指纹图谱和化学计量法的甘草产地判别方法，其特征在于，步骤（3）中， 质谱条件为：电喷雾电离ESI源，ESI源在正负极性同时工作，毛细管温度270℃，蒸发温度300℃；鞘层气体流量35μL/min，辅助气体流量5μL/min，全扫描分析，Q-TOF采集速率0.1s，质量范围在50到1200 m/z之间。
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