CN113755352B - 发酵法生产血红素的酿酒酵母基因工程菌的构建与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了发酵法生产血红素的酿酒酵母基因工程菌的构建与应用。本发明提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB H1，保藏登记号为CGMCC No.21000。本发明还保护酿酒酵母TIB H1在生产血红素中的应用。本发明还保护一种生产血红素的方法，包括如下步骤：发酵培养酿酒酵母TIB H1。本发明为酿酒酵母高效生产血红素奠定了一定基础，对于血红素的工业生产具有产业价值。

Description

发酵法生产血红素的酿酒酵母基因工程菌的构建与应用
技术领域
本发明属于代谢工程技术领域，涉及发酵法生产血红素的酿酒酵母基因工程菌的构建与应用，具体应用所述基因工程菌生产血红素。
背景技术
血红素是包含原卟啉及环中配位二价铁离子的小分子物质，存在于大多数生物体中，如动植物和微生物。血红素作为原核细胞和真核细胞中肌红蛋白、血红蛋白的重要辅基基团，由Fe2+和原卟啉组成，在转运氧、清除活性氧和转移电子生成能量等方面发挥着重要作用。目前，血红素作为一种生物补铁剂在保健行业中得到了广泛的应用；在食品行业，添加富含血红素且结构稳定的肌红蛋白和血红蛋白，赋予了人造肉真实的颜色。然而，利用有机萃取或者酶解法从动物血液及植物组织中获取血红素及血红蛋白的方法，不仅耗时耗力、产量低并且对生态环境不利，无法大规模应用于人造肉商品化的生产。因此，构建细胞工厂以生产生物基血红素成为一大研究热点。
酿酒酵母作为现代分子和细胞生物学中常用的真核模式生物，不仅是重要的工业微生物，也是合成生物学最常用的底盘细胞之一，用于生物燃料、大宗化学品、医药和保健品原料等多元化产品的研发，具有巨大的市场潜力和社会经济效益。酿酒酵母作为细胞工厂具有很多的优势：首先，酿酒酵母能够避免人或动物来源的病原体的潜在风险，具有GRAS(general regarded as safe)认证；酵母能够执行翻译后修饰，包括蛋白末端修饰、折叠以及亚基组装；此外，酿酒酵母作为真核模式生物已开展了大量的研究，基因组及生理生化背景十分清晰，遗传操作技术成熟，外源适配性强。
发明内容
本发明的目的是提供发酵法生产血红素的酿酒酵母基因工程菌的构建与应用。
本发明提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB H1，已于2020年11月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21000。
本发明还保护酿酒酵母TIB H1在生产血红素中的应用。
本发明还保护一种生产血红素的方法，包括如下步骤：发酵培养酿酒酵母TIB H1。
所述发酵培养采用的培养基包括如下成分：尿嘧啶、FeSO4、谷氨酸、葡萄糖。
所述发酵培养采用的培养基包括如下成分：1-3g/L尿嘧啶、80-120μM FeSO4、0.5-1.5g/L谷氨酸、40-60g/L葡萄糖。
所述发酵培养采用的培养基包括如下成分：2g/L尿嘧啶、100μM FeSO4、1g/L谷氨酸、50g/L葡萄糖。
所述发酵培养采用的培养基包括如下成分：(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4、尿嘧啶、FeSO4、谷氨酸、葡萄糖。
所述发酵培养采用的培养基由如下成分组成：(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4、尿嘧啶、FeSO4、谷氨酸、葡萄糖，余量为水。
所述发酵培养采用的培养基由如下成分组成：5-10g/L(NH4)2SO4、10-20g/LKH2PO4、0.1-1g/L MgSO4·7H2O、1-3g/L尿嘧啶、80-120μM FeSO4、0.5-1.5g/L谷氨酸、40-60g/L葡萄糖，余量为水。
所述发酵培养采用的培养基由如下成分组成：7.5g/L(NH4)2SO4、14.4g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、2g/L尿嘧啶、100μM FeSO4、1g/L谷氨酸、50g/L葡萄糖，余量为水。
所述发酵培养采用的培养基简称发酵培养基。
所述发酵培养的条件具体可为：25-35℃、200-300rpm振荡培养36-60h。
所述发酵培养的条件具体可为：30℃、250rpm振荡培养48h。
所述发酵培养的初始OD600nm为0.4-0.6。
所述发酵培养的初始OD600nm为0.5。
所述发酵培养中，将种子液接种至发酵培养基中，然后开始培养。
所述种子液的制备方法具体如下：将酿酒酵母TIB H1接种至YPD种子培养基，30℃、250rpm振荡培养24h。
本发明还保护一种重组酿酒酵母，是在出发酿酒酵母中导入谷氨酰-t RNA合成酶(gltX)的编码基因、谷氨酰tRNA还原酶(hemA)的编码基因、谷氨酰-1-半醛转氨酶(hemL)的编码基因和卟胆原脱氨酶(HEM3)的编码基因得到的。
谷氨酰-t RNA合成酶的编码基因又称为gltX基因。
谷氨酰tRNA还原酶的编码基因又称为hemA基因。
谷氨酰-1-半醛转氨酶的编码基因又称为hemL基因。
卟胆原脱氨酶的编码基因又称为HEM3基因。
所述重组酿酒酵母中，gltX基因、hemA基因和hemL基因整合到酿酒酵母基因组DNA中。
gltX基因整合到酿酒酵母基因组的XI染色体的93963和93964位点之间。
hemA基因整合到酿酒酵母基因组的X染色体的195461和195462位点之间。
hemL基因整合到酿酒酵母基因组的XII染色体的796317和796318位点之间。
所述重组酿酒酵母的构建方法包括如下步骤：
(1)将pMEL10质粒和DNA分子Up1-PADH1-gltX-TCYC1-Down1导入酿酒酵母，培养，获得基因组DNA中整合了DNA分子Up1-PADH1-gltX-TCYC1-Down1的重组酵母菌株；
(2)将pROS10质粒、DNA分子Up2-PTEF1-hemA-TTEF1-Down2和DNA分子Up3-PENO2-hemL-TADH1-Down3导入步骤(1)得到的重组酵母菌株，培养，获得基因组DNA中整合了DNA分子Up2-PTEF1-hemA-TTEF1-Down2和DNA分子Up3-PENO2-hemL-TADH1-Down3的重组酵母菌株；
(3)将pRS426-hem3质粒导入步骤(2)得到的重组酵母菌株，得到目的重组酿酒酵母。
所述酿酒酵母具体可为酿酒酵母TIB H。
本发明还保护所述重组酿酒酵母在生产血红素中的应用。
本发明还保护一种生产血红素的方法，包括如下步骤：发酵培养所述重组酿酒酵母。
所述发酵培养采用的培养基包括如下成分：尿嘧啶、FeSO4、谷氨酸、葡萄糖。
所述发酵培养采用的培养基包括如下成分：1-3g/L尿嘧啶、80-120μM FeSO4、0.5-1.5g/L谷氨酸、40-60g/L葡萄糖。
所述发酵培养采用的培养基包括如下成分：2g/L尿嘧啶、100μM FeSO4、1g/L谷氨酸、50g/L葡萄糖。
所述发酵培养采用的培养基包括如下成分：(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4、尿嘧啶、FeSO4、谷氨酸、葡萄糖。
所述发酵培养采用的培养基由如下成分组成：(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4、尿嘧啶、FeSO4、谷氨酸、葡萄糖，余量为水。
所述发酵培养采用的培养基由如下成分组成：5-10g/L(NH4)2SO4、10-20g/LKH2PO4、0.1-1g/L MgSO4·7H2O、1-3g/L尿嘧啶、80-120μM FeSO4、0.5-1.5g/L谷氨酸、40-60g/L葡萄糖，余量为水。
所述发酵培养采用的培养基由如下成分组成：7.5g/L(NH4)2SO4、14.4g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、2g/L尿嘧啶、100μM FeSO4、1g/L谷氨酸、50g/L葡萄糖，余量为水。
所述发酵培养采用的培养基简称发酵培养基。
所述发酵培养的条件具体可为：25-35℃、200-300rpm振荡培养36-60h。
所述发酵培养的条件具体可为：30℃、250rpm振荡培养48h。
所述发酵培养的初始OD600nm为0.4-0.6。
所述发酵培养的初始OD600nm为0.5。
所述发酵培养中，将种子液接种至发酵培养基中，然后开始培养。
所述种子液的制备方法具体如下：将重组酿酒酵母接种至YPD种子培养基，30℃、250rpm振荡培养24h。
gltX基因如序列表的序列1中第625-2040位核苷酸所示。
hemA基因如序列表的序列2中第587-1843位核苷酸组成。
hemL基因如序列表的序列3中第805-2085位核苷酸组成。
HEM3基因如序列表的序列4中第2694-3677位核苷酸所示。
DNA分子Up1-PADH1-gltX-TCYC1-Down1，为双链DNA分子，如序列表的序列1所示。
DNA分子Up2-PTEF1-hemA-TTEF1-Down2，为双链DNA分子，如序列表的序列2所示。
DNA分子Up3-PENO2-hemL-TADH1-Down3，为双链DNA分子，如序列表的序列3所示。
pRS426-hem3质粒，为环形质粒(双链DNA环形质粒)，如序列表的序列4所示。
pMEL10质粒，为环形质粒(双链DNA环形质粒)，如序列表的序列5所示。
pROS10质粒，为环形质粒(双链DNA环形质粒)，如序列表的序列6所示。
本发明通过将谷氨酰-t RNA合成酶(gltX)、谷氨酰tRNA还原酶(hemA)和谷氨酰-1-半醛转氨酶(hemL)整合到酿酒酵母基因组中，并过表达卟胆原脱氨酶(HEM3)，构建得到了酿酒酵母工程菌TIB H1。进一步的，发明人将酿酒酵母工程菌TIB H1进行了专利程序的保藏。利用酿酒酵母工程菌TIB H1摇瓶发酵48h时，血红素产量达到0.596mg/L/OD。本发明为酿酒酵母高效生产血红素奠定了一定基础，对于血红素的工业生产具有产业价值。
附图说明
图1为实施例3中血红素产量的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。酿酒酵母TIBH，基因型为MATa ura3-52 can1Δ::cas9-natNT2 TRP1 LEU2 HIS3。SD合成培养基：北京泛基诺，产品目录号YGM003A-3。SD培养基：取8g SD合成培养基和20g葡萄糖，加蒸馏水定容至1L，121℃灭菌15min，灭菌后添加尿嘧啶并使其浓度为2g/L。URA3缺陷筛选培养基：取8g SD合成培养基、20g葡萄糖和20g琼脂，加蒸馏水定容至1L，121℃灭菌15min。5-FOA筛选培养基：取8g SD合成培养基、20g葡萄糖、1g 5-FOA和20g琼脂，加蒸馏水定容至1L，121℃灭菌15min，灭菌后添加尿嘧啶并使其浓度为2g/L。
实施例1、DNA分子和重组质粒的构建
DNA分子Up1-PADH1-gltX-TCYC1-Down1，为双链DNA分子，如序列表的序列1所示。序列1中，第1-207位核苷酸组成Up1(207bp)，第208-624位核苷酸组成启动子PADH1(417bp)，第625-2040位核苷酸组成gltX基因(1416bp)，第2041-2295位核苷酸组成终止子TCYC1(255bp)，第2296-2515位核苷酸组成Down1(220bp)。Up1为上游同源臂，Down1为下游同源臂。
DNA分子Up2-PTEF1-hemA-TTEF1-Down2，为双链DNA分子，如序列表的序列2所示。序列2中，第1-243位核苷酸组成Up2(243bp)，第244-586位核苷酸组成启动子PTEF1(343bp)，第587-1843位核苷酸组成hemA基因(1257bp)，第1844-2041位核苷酸组成终止子TTEF1(198bp)，第2042-2277为核苷酸组成Down2(236bp)。Up2为上游同源臂，Down2为下游同源臂。
DNA分子Up3-PENO2-hemL-TADH1-Down3，为双链DNA分子，如序列表的序列3所示。序列3中，第1-255位核苷酸组成Up3(255bp)，第256-804位核苷酸组成启动子PENO2(549bp)，第805-2085位核苷酸组成hemL基因(1281bp)，第2086-2250位核苷酸组成终止子TADH1(165bp)，第2251-2499位核苷酸组成Down3(249bp)。Up3为上游同源臂，Down3为下游同源臂。
pRS426-hem3质粒，为环形质粒(双链DNA环形质粒)，如序列表的序列4所示。序列4中，第2013-2693位核苷酸组成启动子TDH3(681bp)，第2694-3677位核苷酸组成HEM3基因(984bp)，第3678-3995位核苷酸组成终止子CYC1(318bp)。
pMEL10质粒，为环形质粒(双链DNA环形质粒)，如序列表的序列5所示。序列5中，第3587-3685位核苷酸编码一个sgRNA(编码靶序列结合区的核苷酸为“CTAATGTGTCCGCGTTTCTA”)。
pROS10质粒，为环形质粒(双链DNA环形质粒)，如序列表的序列6所示。序列6中，第3730-3828位核苷酸编码一个sgRNA(编码靶序列结合区的核苷酸为“CTCTCGAAGTGGTCACGTGC”)，第5218-5120位核苷酸编码另一个sgRNA(反向互补序列，编码靶序列结合区的核苷酸为“GGTATGTGCAGTTGATTCAC”)。
辅助质粒(pMEL10质粒和pROS10质粒)中均具有编码乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶(OMP脱羧酶)的基因，OMP脱羧酶可以将5-氟乳清酸(5-Fluoroorotic Acid，5-FOA)转化为对酵母细胞有毒的形式，从而使酵母细胞死亡。因此，在获得具有外源DNA分子的重组酵母后，5-FOA可用于进一步筛选，只有将外源DNA分子整合至基因组DNA且不携带辅助质粒的重组酵母可以正常生长。
gltX基因、hemA基因、hemL基因均来源于E.coli DH5α。
Up1、PADH1、TCYC1、Down1、Up2、PTEF1、TTEF1、Down2、Up3、PENO2、TADH1、Down3、启动子TDH3、HEM3基因、终止子CYC1均来源于酿酒酵母。
实施例2、重组酿酒酵母TIB H1工程菌株的构建和保藏
利用Frozen-EZ Yeast Transformation II KitTM试剂盒(Zymo公司，产品目录为T2001)，进行转化构建重组酿酒酵母。EZ1试剂、EZ2试剂和EZ3试剂均为试剂盒组件。
一、重组酿酒酵母TIB Ha工程菌株的构建
1、将酿酒酵母TIB H单菌落接种至2-3mL SD培养基，30℃、250rpm振荡培养24h。
2、完成步骤1后，将菌液接种至5mL SD培养基(体系初始OD600nm值≈0.2)，30℃、250rpm振荡培养至OD600nm值＝0.8-1.0。
3、完成步骤2后，3000rpm离心5min，弃上清；用30℃预热后的EZ1试剂重悬沉淀，然后转移到2mL EP管，3000rpm离心5min，弃上清；用30℃预热后的EZ2试剂重悬沉淀。
4、将50μL步骤3得到的悬液、1μg pMEL10质粒和1μg DNA分子Up1-PADH1-gltX-TCYC1-Down1轻轻混匀，然后加500μL EZ3试剂，用涡旋振荡器充分混匀，震荡20秒，然后30℃、100-150rpm振荡培养2-3h。
5、完成步骤4后，用涡旋振荡器混匀，取100μL菌液涂布平板(用以留存菌种)，剩余菌液3000rmp离心5min，收集沉淀。
6、用100μL无菌水重悬步骤5得到的沉淀，然后涂布URA3缺陷筛选培养基平板，30℃静置培养48h，然后通过PCR扩增和测序验证获得了导入DNA分子Up1-PADH1-gltX-TCYC1-Down1的重组酵母菌株。
7、将步骤6获得的重组酵母菌株在5-FOA筛选培养基平板中划线接种，30℃静止培养48h，能够正常生长的菌株即为重组酿酒酵母TIB Ha基因工程菌株，简称酿酒酵母TIBHa。
二、重组酿酒酵母TIB Hb工程菌株构建
1、将酿酒酵母TIB Ha单菌落接种至2-3mL SD培养基，30℃、250rpm振荡培养24h。
2、同步骤一的2。
3、同步骤一的3。
4、将50μL步骤3得到的悬液、1μg pROS10质粒、1μg DNA分子Up2-PTEF1-hemA-TTEF1-Down2和1μg DNA分子Up3-PENO2-hemL-TADH1-Down3轻轻混匀，然后加500μL EZ3试剂，用涡旋振荡器充分混匀，震荡20秒，然后30℃、100-150rpm振荡培养2-3h。
5、同步骤一的5。
6、用100μL无菌水重悬步骤5得到的沉淀，然后涂布URA3缺陷筛选培养基平板，30℃静置培养48h，然后通过PCR扩增和测序验证获得了导入DNA分子Up2-PTEF1-hemA-TTEF1-Down2和DNA分子Up3-PENO2-hemL-TADH1-Down3的重组酵母菌株。
7、将步骤6获得的重组酵母菌株在5-FOA筛选培养基平板中划线接种，30℃静止培养48h，能够正常生长的菌株即为重组酿酒酵母TIB Hb基因工程菌株，简称酿酒酵母TIBHb。
三、重组酿酒酵母TIB H1工程菌株构建
1、将酿酒酵母TIB Hb单菌落接种至2-3mL SD培养基，30℃、250rpm振荡培养24h。
2、同步骤一的2。
3、同步骤一的3。
4、将50μL步骤3得到的悬液和1μg pRS426-hem3质粒轻轻混匀，然后加500μL EZ3试剂，用涡旋振荡器充分混匀，震荡20秒，然后30℃、100-150rpm培养2-3h。
5、同步骤一的5。
6、用100μL无菌水重悬步骤5得到的沉淀，然后涂布URA3缺陷筛选培养基平板，30℃静置培养48h，然后挑选正常生长的重组菌株，然后通过PCR扩增和测序验证获得了具有HEM3基因的重组酵母菌株，即为重组酿酒酵母TIB H1基因工程菌株，简称酿酒酵母TIB H1。
四、酿酒酵母TIB H1的保藏
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB H1，已于2020年11月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21000。
实施例3、重组酿酒酵母发酵生产血红素
供试菌分别为：酿酒酵母TIB H、酿酒酵母TIB Ha、酿酒酵母TIB Hb或酿酒酵母TIBH1。
1、将供试菌单菌落接种至YPD种子培养基，30℃，250rpm振荡培养24h。
YPD种子培养基：取20g蛋白胨和10g酵母提取物，用适量蒸馏水溶解，121℃灭菌15min，然后添加无菌葡萄糖水溶液至1000ml；培养基中，葡萄糖浓度为20g/L。
2、将步骤1的菌液接种至发酵培养基(体系的初始OD600nm为0.5)，30℃、250rpm振荡培养48h。
发酵培养基：含7.5g/L(NH4)2SO4、14.4g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、2g/L尿嘧啶、100μM FeSO4、1g/L谷氨酸、50g/L葡萄糖，余量为水。
3、完成步骤2后，取n ml体系，检测每OD菌体细胞生产血红素的产量。
血红素检测方法：取n ml体系，离心收集细胞沉淀，得到细胞量为8OD600nm的细胞(细胞量的计量方式：如果体系OD值为2，那么取4ml体系，然后离心收集细胞沉淀，即为8OD600nm的细胞量)，用500μL 20mM草酸水溶液重悬，然后4℃静置16小时；然后加入500μl 70℃预热的2M草酸水溶液，混匀，取一半体积的混合物加入到琥珀管中95℃加热30min，另一半体积的混合物在室温下保持30min；两个混合物各取200μl上清液转移到黑色96孔板中，在λ＝400nm激发波长和λ＝600nm发射波长进行荧光值检测。总卟啉水平(结合血红素和游离卟啉)对应于加热样品，游离卟啉水平对应于非加热样品。卟啉浓度与荧光值之间标准曲线方程：荧光值＝71.223×卟啉浓度(mg/L)+58.049。血红素水平＝总卟啉水平-游离卟啉水平。血红素产量是根据血红素水平计算的，即每升完成步骤2的体系中的血红素量(mg)除以该升体系的细胞量(OD)。
血红素产量的结果见图1。酿酒酵母TIB H、酿酒酵母TIB Ha、酿酒酵母TIB Hb或酿酒酵母TIB H1的血红素产量依次为0.011mg/L/OD、0.044mg/L/OD、0.096mg/L/OD、0.596mg/L/OD，酿酒酵母TIB H1的血红素产量最高，比酿酒酵母TIB H提高了52倍。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
                         序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 发酵法生产血红素的酿酒酵母基因工程菌的构建与应用
<130> GNCYX210740
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2515
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agccatctaa ccatcatacc cccatacggt aacaaaacct cttctaagaa aagaagtctc 60
tgctcctccg ccatcttatt tttattcgct gcgcgcgttt attgtcgcat cgctagccag 120
caaaaagttg gttgcctttt tttacctaaa aaagacacat ctaactgatt agttttccgt 180
tttaggatat tgacgccaag cgtgcgtata ataggcgcat gcaacttctt ttcttttttt 240
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<210> 2
<211> 2277
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<211> 2499
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 1080
accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt 1140
atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 1200
cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 1260
tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 1320
tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 1380
gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 1440
agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 1500
aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 1560
gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac 1620
tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 1680
gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 1740
tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 1800
aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 1860
catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 1920
acaaataggg gttccgcgca ctcgagacta tatgtgaagg catggctatg gcacggcaga 1980
cattccgcca gatcatcaat aggcacgcgg ccgccctgat gcggtatttt ctccttacgc 2040
atctgtgcgg tatttcacac cgcatagggt aataactgat ataattaaat tgaagctcta 2100
atttgtgagt ttagtataca tgcatttact tataatacag ttttttagtt ttgctggccg 2160
catcttctca aatatgcttc ccagcctgct tttctgtaac gttcaccctc taccttagca 2220
tcccttccct ttgcaaatag tcctcttcca acaataataa tgtcagatcc tgtagagacc 2280
acatcatcca cggttctata ctgttgaccc aatgcgtctc ccttgtcatc taaacccaca 2340
ccgggtgtca taatcaacca atcgtaacct tcatctcttc cacccatgtc tctttgagca 2400
ataaagccga taacaaaatc tttgtcgctc ttcgcaatgt caacagtacc cttagtatat 2460
tctccagtag atagggagcc cttgcatgac aattctgcta acatcaaaag gcctctaggt 2520
tcctttgtta cttcttctgc cgcctgcttc aaaccgctaa caatacctgg gcccaccaca 2580
ccgtgtgcat tcgtaatgtc tgcccattct gctattctgt atacacccgc agagtactgc 2640
aatttgactg tattaccaat gtcagcaaat tttctgtctt cgaagagtaa aaaattgtac 2700
ttggcggata atgcctttag cggcttaact gtgccctcca tggaaaaatc agtcaagata 2760
tccacatgtg tttttagtaa acaaattttg ggacctaatg cttcaactaa ctccagtaat 2820
tccttggtgg tacgaacatc caatgaagca cacaagtttg tttgcttttc gtgcatgata 2880
ttaaatagct tggcagcaac aggactagga tgagtagcag cacgttcctt atatgtagct 2940
ttcgacatga tttatcttcg tttcctgcag gtttttgttc tgtgcagttg ggttaagaat 3000
actgggcaat ttcatgtttc ttcaacacta catatgcgta tatataccaa tctaagtctg 3060
tgctccttcc ttcgttcttc cttctgttcg gagattaccg aatcaaaaaa atttcaaaga 3120
aaccgaaatc aaaaaaaaga ataaaaaaaa aatgatgaat tgaattgaaa agctgtggta 3180
tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg 3240
ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa 3300
gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc 3360
gcgacagctg cacctttcga gaggacgatg cccgtgtcta aatgattcga ccagcctaag 3420
aatgttcaac ccctcactaa agggaacaaa agctggagct tctttgaaaa gataatgtat 3480
gattatgctt tcactcatat ttatacagaa acttgatgtt ttctttcgag tatatacaag 3540
gtgattacat gtacgtttga agtacaactc tagattttgt agtgccctct tgggctagcg 3600
gtaaaggtgc gcattttttc acaccctaca atgttctgtt caaaagattt tggtcaaacg 3660
ctgtagaagt gaaagttggt gcgcatgttt cggcgttcga aacttctccg cagtgaaaga 3720
taaatgatcc tctcgaagtg gtcacgtgcg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 3780
aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtggtgctt tttttgtttt 3840
ttatgtcttc gagtcatgta attagttatg tcacgcttac gttcacgccc tccacgcatt 3900
taagcataaa cacgcactat gccgttcttc tcatgtatat atatatacag gcaacacgca 3960
gatataggtg cgacgtgaac agtgagctgt atgtgcgcag ctcgcgttgc attttcggaa 4020
gcgctcgttt tcggaaacgc tttgaagttc ctattccgaa gttcctattc tgtagaaagt 4080
ataggaactt cagagcgctt ttgaaaacca aaagcgctct gaagacgcac tttcaaaaaa 4140
ccaaaaacgc accggactgt aacgagctac taaaatattg cgaataccgc ttccacaaac 4200
attgctcaaa agtatctctt tgctatatat ctctgtgcta tatccctata taacctaccc 4260
atccaccttt cgctccttga acttgcatct aaactcgacc tctacatttt ttatgtttat 4320
ctctagtatt actctttaga caaaaaaatt gtagtaagaa ctattcatag agtgaatcga 4380
aaacaatacg aaaatgtaaa catttcctat acgtagtata tagagacaaa atagaagaaa 4440
ccgttcataa ttttctgacc aatgaagaat catcaacgct atcactttct gttcacaaag 4500
tatgcgcaat ccacatcggt atagaatata atcggggatg cctttatctt gaaaaaatgc 4560
acccgcagct tcgctagtaa tcagtaaacg cgggaagtgg agtcaggctt tttttatgga 4620
agagaaaata gacaccaaag tagccttctt ctaaccttaa cggacctaca gtgcaaaaag 4680
ttatcaagag actgcattat agagcgcaca aaggagaaaa aaagtaatct aagatgcttt 4740
gttagaaaaa tagcgctctc gggatgcatt tttgtagaac aaaaaagaag tatagattct 4800
ttgttggtaa aatagcgctc tcgcgttgca tttctgttct gtaaaaatgc agctcagatt 4860
ctttgtttga aaaattagcg ctctcgcgtt gcatttttgt tttacaaaaa tgaagcacag 4920
attcttcgtt ggtaaaatag cgctttcgcg ttgcatttct gttctgtaaa aatgcagctc 4980
agattctttg tttgaaaaat tagcgctctc gcgttgcatt tttgttctac aaaatgaagc 5040
acagatgctt cgttggaggg cgtgaacgta agcgtgacat aactaattac atgactcgaa 5100
gacataaaaa acaaaaaaag caccaccgac tcggtgccac tttttcaagt tgataacgga 5160
ctagccttat tttaacttgc tatttctagc tctaaaacgt gaatcaactg cacataccga 5220
tcatttatct ttcactgcgg agaagtttcg aacgccgaaa catgcgcacc aactttcact 5280
tctacagcgt ttgaccaaaa tcttttgaac agaacattgt agggtgtgaa aaaatgcgca 5340
cctttaccgc tagcccaaga gggcactaca aaatctagag ttgtacttca aacgtacatg 5400
taatcacctt gtatatactc gaaagaaaac atcaagtttc tgtataaata tgagtgaaag 5460
cataatcata cattatcttt tcaaagaagc tccagctttt gttcccttta gtgagggtat 5520
tcacgtagac ggataggtat agccagacat cagcagcata cttcgggaac cgtaggc 5577

Claims (7)

1.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB H1，其保藏登记号为CGMCC No.21000。
2.权利要求1所述酿酒酵母TIB H1在生产血红素中的应用。
3.一种生产血红素的方法，包括如下步骤：发酵培养权利要求1所述酿酒酵母TIB H1。
4.重组酿酒酵母，是在出发酿酒酵母中导入导入谷氨酰-t RNA合成酶的编码基因、谷氨酰tRNA还原酶的编码基因、谷氨酰-1-半醛转氨酶的编码基因和卟胆原脱氨酶的编码基因得到的。
5.如权利要求4所述的重组酿酒酵母，其特征在于：谷氨酰-t RNA合成酶的编码基因、谷氨酰tRNA还原酶的编码基因、谷氨酰-1-半醛转氨酶的编码基因合到酿酒酵母基因组中。
6.权利要求4或5所述重组酿酒酵母在生产血红素中的应用。
7.一种生产血红素的方法，包括如下步骤：发酵培养权利要求4或5所述重组酿酒酵母。
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