CN113754780A - 靶向cldn18.2的嵌合抗原受体、其组合物及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及特异性结合CLDN18.2的单链抗体及包含所述单链抗体的嵌合抗原受体(CAR)。本发明还涉及表达所述CAR、或者共表达所述CAR和另外的生物活性分子(例如PD‑1抗体或mIL‑15)的经改造的免疫细胞，编码这种CAR或共表达分子的核酸分子以及制备所述经改造的免疫细胞的方法。本发明还涉及这些CAR和免疫细胞用于预防和/或治疗胃癌、胃腺癌和胰腺癌等癌症的用途以及预防和/或治疗胃癌、胃腺癌和胰腺癌等癌症的方法。

Description

靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体、其组合物及用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及特异性结合CLDN18.2的单链抗体及包含所述单链抗体的嵌合抗原受体(CAR)。本发明还涉及表达所述CAR、或者共表达所述CAR和另外的生物活性分子(例如PD-1抗体或mIL-15)的经改造的免疫细胞，编码这种CAR或共表达分子的核酸分子以及制备所述经改造的免疫细胞的方法。本发明还涉及这些CAR和免疫细胞用于预防和/或治疗胃癌、胃腺癌和胰腺癌等癌症的用途以及预防和/或治疗胃癌、胃腺癌和胰腺癌等癌症的方法。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)-T细胞是一种新兴的、具有显著的肿瘤治疗疗效的治疗手段，已成为肿瘤治疗历史上里程碑式的成就。2017年，FDA批准了两款针对CD-19的CAR-T细胞治疗，两款CAR-T在B淋巴细胞瘤上有着显著的疗效。它通过从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养，转导特定的外源基因，体外扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到***的目的。然而，90％的癌症是实体瘤，更多种类的实体瘤以及更多的肿瘤表面特异性靶点抗原需要进一步确认。CAR-T治疗实体瘤难点之一为肿瘤特异性抗原，否则容易出现“脱靶”等一系列问题，因此寻找一种特异性肿瘤抗原至关重要。
Claudin蛋白质家族由Shorichiro Tsukita等1998年发现，其是细胞紧密连接的组成部分，他们建立一个控制细胞间分子流动的细胞屏障，介导细胞与细胞之间紧密连接的蛋白,不同亚型的Claudin蛋白表达于不同的组织,与不同类型的癌症有关，Claudin1在结肠癌中高表达,Claudin7与肝癌的复发有关。Claudin蛋白为表面蛋白，表明其可作为各种治疗策略的有用靶标。Claudin18.2表达具有高度特异性，在正常组织中的表达仅限于分化的上皮胃粘膜细胞，但不存在于胃干细胞区,不表达于其他正常组织中，但在若干癌症类型中高表达，例如胃、食管、胰腺和肺的肿瘤以及人癌症细胞系，例如在原发性胃腺癌及其转移瘤中Claudin 18.2的表达高达70％，这些生物学特征表明Claudin18.2可作为一个理想的肿瘤治疗靶点。
胃癌及胰腺癌均是目前公认的预后差且死亡率高的癌症。在胃癌的治疗方式中，化疗是进展期胃癌的主要治疗手段，采用细胞毒药物联合方案化疗，进展期胃癌患者的中位生存时间也仅11个月左右。目前，国际上无一致公认的进展期胃癌标准化疗方案。生物大分子药物方面除曲妥珠单抗(Trastuzumab)以及雷莫芦单抗(Ramucirumab)的III期临床实验获得阳性结果外，其他胃癌靶向治疗药物大多结果不甚理想或尚处于临床研究的早期阶段。现有药物的核心缺陷及未满足的临床需求使得晚期或复发性胃癌的治疗选择非常有限，预后极差，死亡率较高。胰腺癌在全球肿瘤死亡率中高居第四位，其5年生存率不足5％。每年全世界胰腺癌新发病例超过350,000人；死亡病例超过340,000人。国内、外的研究表明，大约60％的胰腺癌受试者在确定诊断时已发生远处转移，25％受试者为局部晚期，不能进行根治性切除术，中位生存期仅为6-9个月。因此，胃癌及胰腺癌的目前药物需求极大。
基于Claudin18.2的表达特异性，针对Claudin18.2的CAR-T细胞治疗有希望成为攻克上述难治性癌症的方式之一。因此，发展具有高特异性和良好临床疗效的靶向Claudin18.2的CAR-T疗法是迫切而必要的。
发明内容
在本申请中，发明人首先开发了具有优良性质的能够特异性识别/结合Claudin18.2人源化的抗体，在此基础上，发明人又付出了大量的创造性劳动，进一步构建获得了能够特异性结合Claudin18.2的嵌合抗原受体(CAR)。本发明的CAR能够以非MHC限制的方式将免疫效应细胞特异性和反应性指向表达Claudin18.2的细胞从而使其被清除，且与已知的靶向Claudin18.2的CAR相比具有更优的功能特性。因此，本发明的CAR具有用于预防和/或治疗胃癌、胃腺癌和胰腺癌等Claudin18.2相关肿瘤的潜力，具有重大的临床价值。
单链抗体及缀合物
本发明涉及能够特异性结合CLDN18.2的单链抗体，其包含如下任一组的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH和VL通过连接子连接：
(1)具有如SEQ ID NO:13所示的序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:14所示的序列或其变体的VL；或
(2)具有如SEQ ID NO:16所示的序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:17所示的序列或其变体的VL；
其中，(1)-(2)中所述的变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，或5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)。优选地，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述连接子包含如(GmS)n所示的序列，其中m选自1-6的整数，优选地，m为3、4、或5，n选自1-10的整数，优选地，n为2、3、4、5、或6。在某些实施方案中，所述连接子包含如SEQ ID NO:44所示的序列。
在某些实施方案中，所述单链抗体为scFv、di-scFv或(scFv)2。
在某些实施方案中，所述单链抗体包含选自下列的氨基酸序列：(1)SEQ ID NOs:19、23任一项所示的氨基酸序列；(2)与SEQ ID NOs:19、23任一项所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，所述单链抗体包含选自下列的氨基酸序列：(1)SEQ ID NOs:65、66任一项所示的氨基酸序列；(2)与SEQ ID NOs:65、66任一项所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
单链抗体的制备
本发明的单链抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明的单链抗体的DNA分子。将所得DNA分子***表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的单链抗体。所述DNA分子可以是根据氨基酸序列优化的核苷酸序列。载体和宿主细胞的选择和制备方法可以根据领域内的现有公知完成。
缀合物
本发明的单链抗体可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对CLDN18.2(特别是人CLDN18.2)的结合。因此，本发明的单链抗体还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的单链抗体功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导单链抗体与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。
因此，本发明提供了缀合物，其包含本发明的单链抗体以及连接于所述单链抗体的修饰部分。
在某些实施方案中，所述修饰部分是可检测的标记，例如酶、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。在某些实施方案中，所述缀合物包含本发明的单链抗体以及连接于所述单链抗体的可检测的标记。本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，
Figure BDA0003084572240000051
)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。教导该标记物的使用的专利包括，但不限于，美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；及4,366,241(全部通过引用并入本文)。如上所述的可检测的标记可通过本领域已知的方法检测。例如，放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测，荧光标记物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测，及测热标记物通过简单可视化着色标记物来检测。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的单链抗体，以降低潜在的位阻。
检测方法和试剂盒
前述特异性结合CLDN18.2的单链抗体或其缀合物可用于检测CLDN18.2在样品中的存在或其水平。前述特异性结合CLDN18.2的单链抗体或其缀合物可用来制备检测CLDN18.2在样品中的存在或其水平的试剂盒。试剂盒制备方法和检测方法可参照在本申请的发明人在PCT/CN2019/126495申请中描述的方法。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明涉及靶向CLDN18.2的CAR(抗CLDN18.2-CAR)，其特征包括非MHC限制的CLDN18.2识别能力，其赋予表达该CAR的免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞)不依赖于抗原加工及提呈而识别表达CLDN18.2的细胞的能力。
因此，本发明第一方面提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外配体(或抗原)结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域以及胞内信号传导结构域。
I.胞外抗原结合结构域
本发明的嵌合抗原受体中所包含的胞外抗原结合结构域包含能够特异性结合CLDN18.2(例如人CLDN18.2)的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1a)如下的三个重链CDRs：如SEQ ID NO:13所示的重链可变区(VH)所含的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3；和/或，如下的三个轻链CDRs：如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区(VL)所含的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3；
或，
(1b)如下的三个重链CDRs：(1a)中所述的CDR-H1或与其相比含有氨基酸突变的变体，(1a)中所述的CDR-H2或与其相比含有氨基酸突变的变体，(1a)中所述的CDR-H3或与其相比含有氨基酸突变的变体；和/或，如下的三个轻链CDRs：(1a)中所述的CDR-L1或与其相比含有氨基酸突变的变体，(1a)中所述的CDR-L2或与其相比含有氨基酸突变的变体，(1a)中所述的CDR-L3或与其相比含有氨基酸突变的变体；其中，(1b)中所述的三个重链CDRs和/或三个轻链CDRs中至少一个CDR，与(1a)中相应的CDR相比含有氨基酸突变，所述氨基酸突变为一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，上述CDRs根据IMGT，Kabat，Chothia或AbM编号***定义。
在某些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中CDRs按IMGT编号***定义：
所述VH包括：具有SEQ ID NO：1所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-H1；具有SEQ ID NO：2所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-H2；以及具有SEQ ID NO：3所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-H3；
所述VL包括：具有SEQ ID NO：4所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-L1；具有SEQ ID NO：5所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-L2；以及具有SEQ ID NO：6所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-L3。
在某些实施方案中，所述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)中的至少一个CDR含有氨基酸突变，所述氨基酸突变为一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)。
在某些实施方案中，所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中CDRs按AbM编号***定义：
所述VH包括：具有SEQ ID NO：15所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-H1；具有SEQ ID NO：20所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-H2；以及具有SEQ ID NO：21所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-H3；
所述VL包括：具有SEQ ID NO：26所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-L1；具有SEQ ID NO：27所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-L2；以及具有SEQ ID NO：30所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-L3。
在某些实施方案中，所述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)中的至少一个CDR含有前述氨基酸突变，所述氨基酸突变为一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)。
在某些实施方案中，所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包括来自人的免疫球蛋白的构架区(FRs)。
在某些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域包含：具有如SEQ ID NO:13所示的序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:14所示的序列或其变体的VL；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(2a)如下的三个重链CDRs：如SEQ ID NO:16所示的重链可变区(VH)所含的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3；和/或，如下的三个轻链CDRs：如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区(VL)所含的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3；
或，
(2b)如下的三个重链CDRs：(2a)中所述的CDR-H1或与其相比含有氨基酸突变的变体，(2a)中所述的CDR-H2或与其相比含有氨基酸突变的变体，(2a)中所述的CDR-H3或与其相比含有氨基酸突变的变体；和/或，如下的三个轻链CDRs：(2a)中所述的CDR-L1或与其相比含有氨基酸突变的变体，(2a)中所述的CDR-L2或与其相比含有氨基酸突变的变体，(2a)中所述的CDR-L3或与其相比含有氨基酸突变的变体；其中，(2b)中所述的三个重链CDRs和/或三个轻链CDRs中至少一个CDR，与(2a)中相应的CDR相比含有氨基酸突变，所述氨基酸突变为一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，上述CDRs根据IMGT，Kabat，Chothia或AbM编号***定义。
在某些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中CDRs按IMGT编号***定义：
所述VH包括：具有SEQ ID NO：7所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-H1；具有SEQ ID NO：8或53所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-H2；以及具有SEQ ID NO：9所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-H3；
所述VL包括：具有SEQ ID NO：10所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-L1；具有SEQ ID NO：11所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-L2；以及具有SEQ ID NO：12所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-L3。
在某些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中CDRs按AbM编号***定义：
所述VH包括：具有SEQ ID NO：31所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-H1；具有SEQ ID NO：32或37所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-H2；以及具有SEQ ID NO：33所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-H3；
所述VL包括：具有SEQ ID NO：34所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-L1；具有SEQ ID NO：35所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-L2；以及具有SEQ ID NO：36所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR-L3。
在某些实施方案中，所述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)中的至少一个CDR含有氨基酸突变，所述氨基酸突变为一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)。
在某些实施方案中，所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包括来自人的免疫球蛋白的构架区(FRs)。
在某些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域包含：具有如SEQ ID NO:16所示的序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:17所示的序列或其变体的VL；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包括但不限于骆驼Ig、IgNAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、单链抗体(例如scFv、di-scFv、(scFv)2)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为单链抗体。在某些实施方案中，所述单链抗体为scFv、di-scFv或(scFv)2。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH和VL通过连接子连接。在某些实施方案中，所述连接子包含如(GmS)n所示的序列，其中m选自1-6的整数。在某些优选的实施方案中，m为3、4、或5；n选自1-10的整数。在某些优选的实施方案中，n为2、3、4、5、或6。在某些更优选的实施方案中，所述连接子具有如SEQ ID NO:44所示的序列。
在某些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域为单链抗体。
在某些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域包含：
(1)具有如SEQ ID NO:13所示的序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:14所示的序列或其变体的VL；或
(2)具有如SEQ ID NO:16所示的序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:17所示的序列或其变体的VL；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；在某些优选地实施方案中，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域包含单链抗体，所述单链抗体包含选自下列的氨基酸序列：(1)SEQ ID NOs:19、23、65、66任一项所示的氨基酸序列；(2)与SEQID NOs:19、23、65、66任一项所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；或，(3)与SEQ ID NOs:19、23、65、66任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域具有特异性地结合一个以上抗原或受体的特征，如除了结合CLDN18.2外，还结合CD19、CD20、CD22、CD33、CD123、或CD138等分子。在某些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域是所述双特异性抗体或多特异性抗体。在某些实施方案中，所述双特异性抗体或多特异性抗体能够特异性结合CLDN18.2，并且具有针对选自下列的靶点的特异性：CD19、CD20、CD22、CD33、CD123、或CD138。
II.跨膜结构域
本发明的嵌合抗原受体所包含的跨膜结构域可以是本领域已知的任何蛋白结构，只要其能够在细胞膜(特别是真核细胞膜)中热力学稳定。适用于本发明的CAR的跨膜结构域可衍生自天然来源。在此类实施方案中，所述跨膜结构域可衍生自任何膜结合的或跨膜的蛋白质。或者，所述跨膜结构域可为合成的非天然存在的蛋白质区段，例如主要包含疏水残基例如亮氨酸和缬氨酸的蛋白质区段。
在某些实施方案中，所述跨膜结构域是选自下列蛋白的跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD137、CD152、CD154和PD-1及其任意组合。在某些优选的实施方案中，所述跨膜结构域是选自下列蛋白的跨膜区：CD8α、CD4、PD-1、CD152和CD154。在某些优选的实施方案中，所述跨膜结构域包含CD8α的跨膜区。在某些示例性实施方案中，所述跨膜结构域包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
III.间隔结构域
本发明的嵌合抗原受体所包含间隔结构域位于胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间。
在某些实施方案中，所述间隔结构域包含免疫球蛋白(例如IgG1或IgG4)的CH2和CH3区。在此类实施方案中，不受特定理论的约束，认为CH2和CH3使所述CAR的抗原结合结构域从表达CAR的细胞的细胞膜延伸出去，并且可更精确地模拟天然TCR的大小和结构域结构。
在某些实施方案中，所述间隔结构域包含铰链结构域。铰链结构域可以是通常在蛋白质的两个结构域之间发现的氨基酸区段，其可以允许蛋白质具有柔性并且允许一个或两个结构域相对于彼此的运动。因此，所述铰链结构域可以是任何氨基酸序列，只要其能够提供胞外抗原结合结构域的这种柔性以及其相对于跨膜结构域的这种运动性。
在某些实施方案中，所述铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链区或其部分。在某些实施方案中，所述铰链结构域包含CD8α的铰链区或其部分，例如含有CD8α的铰链区的至少15个(例如20、25、30、35或40个)连续氨基酸的片段。在某些示例性实施方案中，所述间隔结构域包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述间隔结构域包含铰链结构域，所述铰链结构域包含PD-1、CD152或CD154的铰链区。在某些实施方案中，所述间隔结构域包含PD-1、CD152或CD154的铰链区的至少15个(例如20、25、30、35或40个)连续氨基酸。
IV.信号肽
在某些实施方案中，本发明的CAR可进一步在其N端包含信号肽。通常，信号肽是将与其连接的序列靶向至所需位点的多肽序列。在某些实施方案中，所述信号肽可以将与其连接的CAR靶向至细胞的分泌途径，并允许该CAR进一步整合并锚定到脂质双分子层中。可用于CAR的信号肽是本领域技术人员已知的。在某些实施方案中，所述信号肽包含重链信号肽(例如IgG1的重链信号肽)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体2(GM-CSFR2)信号肽、或CD8α信号肽。在某些优选的实施方案中，所述信号肽选自CD8α信号肽。在某些示例性实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的CAR与另外的生物活性分子共表达。所述另外的生物活性分子可以有其专有的信号肽，为与上一段的信号肽区别，此信号肽命名为信号肽-2。信号肽-2引导另外的生物活性分子转运到细胞内特定的位点或细胞膜外。所述信号肽-2可与上一段所述的信号肽相同或不同。优选地，所述信号肽-2可与上一段所述的信号肽不同。
V.胞内信号传导结构域
本发明的CAR中所包含的胞内信号传导结构域参与将有效的抗原受体结合(本发明的CAR与CLDN18.2的结合)的信号传导进免疫效应细胞内部，激活表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能，或增强表达CAR的免疫效应细胞的至少一种细胞因子的分泌(例如IL-2，IFN-γ)。
在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。
在某些实施方案中，所述初级信号传导结构域可以是包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的任何胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，所述初级信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。在某些实施方案中，所述初级信号传导结构域包含选自下列的蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在某些实施方案中，所述初级信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导结构域。
在某些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域可以是来自共刺激分子的胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域包含选自下列的蛋白的胞内信号传导结构域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD270(HVEM)、CD278(ICOS)或DAP10。
在某些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域选自CD28的胞内信号传导结构域、或CD137(4-1BB)的胞内信号传导结构域、或二者片段的组合。
在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含一个共刺激信号传导结构域。在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含两个或更多个共刺激信号传导结构域。在此类实施方案中，所述两个或更多个共刺激信号传导结构域可以是相同的，也可以是不同的。
在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域以及至少一个共刺激信号传导结构域。所述初级信号传导结构域以及至少一个共刺激信号传导结构域可以以任意顺序串联至跨膜结构域的羧基端。
在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域可包含CD3ζ的胞内信号传导结构域和CD137的胞内信号传导结构域。在某些示例性实施方案中，所述CD3ζ的胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。在某些示例性实施方案中，所述CD137的胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在某些示例性实施方案中，所述嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域具有SEQ IDNO：49所示序列。
VI.全长CAR
本发明提供了能够特异性地结合CLDN18.2的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体从其N端至C端依次包含胞外抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域。在某些优选实施方案中，其中所述胞内信号传导结构域从N端到C端为共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域。
在某些实施方案中，所述间隔结构域包含CD8(例如CD8α)的铰链区，其具有SEQ IDNO：45所示序列。在某些实施方案中，所述跨膜结构域包含CD8(例如CD8α)的跨膜区，其具有SEQ ID NO：46所示序列。
在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域，其中初级信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导结构域，其具有SEQID NO：48所示序列。共刺激信号传导结构域包含CD137的胞内信号传导结构域，其具有SEQID NO：47所示序列。在某些优选的实施方案中，所述嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域具有SEQ ID NO：49所示序列。
在某些优选的实施方案中，所述嵌合抗原受体从其N端至C端依次包含所述信号肽、胞外抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域(从N端到C端为共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域)。
在某些示例性实施方案中，所述信号肽包含IgG1的重链信号肽或CD8α信号肽。在某些示例性实施方案中，所述信号肽包含CD8α信号肽，其具有SEQ ID NO：42所示序列。
在某些示例性实施方案中，所述CAR具有选自下列的氨基酸序列：(1)SEQ ID NOs:25、29任一项所示的氨基酸序列，(2)与SEQ ID NOs:25、29任一项所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，并且所述序列基本保留了其所源自的氨基酸序列的至少一种生物学活性(例如，能够以非MHC限制的方式将免疫效应细胞的特异性和反应性指向表达CLDN18.2的细胞的能力)；或者，(3)与SEQ ID NOs:25、29任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)，在某些优选的实施方案中，所述的置换是保守置换。
VII共表达的CAR和另外的生物活性分子
本发明提供了共表达的CAR和另外的生物活性分子，其包含第一方面所述的能够特异性地结合CLDN18.2的嵌合抗原受体和另外的生物活性分子。自裂解肽能阻止翻译过程中氨基酸形成共价键并维持翻译继续进行，这样一来，翻译产物就被“自切割”，从而使特异性地结合CLDN18.2的嵌合抗原受体和另外的生物活性分子分离。能够特异性地结合CLDN18.2的嵌合抗原受体成为独立的具有胞外抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域以及胞内信号传导结构域的CAR。另外的生物活性分子或者分泌到细胞外或者表达成膜嵌合型的多肽或蛋白。随着表达特异性地结合CLDN18.2-CAR的免疫细胞在肿瘤微环境的扩增和富集，另外的生物活性分子富集在肿瘤微环境，与抗CLDN18.2-CAR协同发挥抗肿瘤效应。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性分子选自下列组分的一种或一种以上：特异性地结合免疫检查点的抗体或其抗原结合片段(例如，抗PD-1、PD-L1、CTLA-4、或LAG-3抗体或其抗原结合片段)、细胞因子(例如，IL-15、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21)、或膜嵌合型多肽(例如，mIL-15、mIL-7、mIL-12、mIL-18、mIL-21)；
在某些实施方案中，编码抗CLDN18.2-CAR的核酸序列通过自裂解肽的核酸序列与另外的生物活性分子的核酸序列连接。编码抗CLDN18.2-CAR的核酸序列可以在编码另外的生物活性分子的核酸序列的5’端或3’端。在某些示例的实施方案中，编码抗CLDN18.2-CAR的核酸序列在编码另外的生物活性分子的核酸序列的5’端。任何能够引起融合蛋白裂解成两个独立的蛋白的自裂解肽可以应用到本发明中。在某些示例的实施方案中，所述自裂解肽为P2A，具有SEQ ID NO:50所示的序列。其核苷酸序列可以根据基因重组的需要进行优化。
在某些实施方案中，包含CAR和另外的生物活性分子的融合蛋白具有如下的结构：
N’-信号肽--特异地结合人CLDN18.2的胞外抗原结合结构域--间隔结构域—跨膜结构域-胞内信号传导结构域-自裂解肽-(信号肽-2)p--另外的生物活性分子-C’。其中信号肽-2与N’的信号肽相同或不同。P为0或1。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性分子在其临近的上游具有与CLDN18.2-CAR的N端不同的信号肽。在某些示例的实施方案中，所述信号肽-2为人IL2信号肽，具有如SEQ ID NO：43所示的序列。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性分子为抗PD-1线性抗体，优选地，所述线性抗体具有如SEQ ID NO：51所示的序列。
在某些实施方案中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO：39所示的序列或其变体序列。在某些实施方案中，所述变体序列与SEQ ID NO：39相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)，所述变体序列保留SEQ ID NO：39的生物学活性。在某些实施方案中，所述变体序列具有与SEQ ID NO：39相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性的序列，所述变体序列保留SEQ ID NO：39的生物学活性。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性分子为膜嵌合型IL-15，优选地，所述膜嵌合型IL-15具有如SEQ ID NO：52所示的序列。
在某些实施方案中，所述融合蛋白由SEQ ID NO：38所示的编码核苷酸序列或其变体表达。所述变体具有与SEQ ID NO：38相比至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的序列。上述变体基本保留了SEQ ID NO：38的生物学活性(例如，能够编码表达具有以非MHC限制的方式将免疫效应细胞的特异性和反应性指向表达CLDN18.2的细胞的能力，和编码表达的生物活性分子保留预表达的生物活性分子的基本活性)。
在某些实施方案中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO：41所示的序列或其变体序列。在某些实施方案中，所述变体序列与SEQ ID NO：41相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)，所述变体序列保留SEQ ID NO：41的生物学活性。在某些实施方案中，所述变体序列具有与SEQ ID NO：41相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性的序列，所述变体序列保留SEQ ID NO：41的生物学活性。
在某些实施方案中，所述融合蛋白由SEQ ID NO：40所示的编码核苷酸序列或其变体表达。所述变体具有与SEQ ID NO：40相比至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的序列。上述变体基本保留了SEQ ID NO：40的生物学活性(例如，能够编码表达具有以非MHC限制的方式将免疫效应细胞的特异性和反应性指向表达CLDN18.2的细胞的能力，和编码表达的生物活性分子保留预表达的生物活性分子的基本活性)。
嵌合抗原受体的制备
生成嵌合抗原受体以及包含该嵌合抗原受体的免疫效应细胞(例如T细胞)的方法是本领域已知的，可包括用至少一种编码CAR的多核苷酸转染细胞，并在细胞中表达多核苷酸。例如，可将编码本发明的CAR的核酸分子包含于表达载体(例如，慢病毒载体)中，所述表达载体能够在宿主细胞例如T细胞中表达，以制造所述CAR。
因此，本发明第二方面提供了一种分离的核酸分子，其包含编码第一方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
本领域技术人员理解，由于遗传密码的简并性，编码一种本发明的嵌合抗原受体的核苷酸序列可以具有多种不同的序列。因此，除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。
在某些示例性实施方案中，所述编码第一方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列选自：(1)SEQ ID NOs:24、28任一项所示的序列或其简并变体；(2)与(1)所述的序列相比基本上相同的序列，例如，与(1)所述相比具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的序列，或，与(1)所述的序列相比具有一个或更多个核苷酸取代的序列；并且所述序列基本保留了其所源自的核苷酸序列的至少一种生物学活性(例如，能够编码具有以非MHC限制的方式将免疫效应细胞的特异性和反应性指向表达CLDN18.2的细胞的能力)。
在某些情况下，可以将编码第一方面所述的CAR的第一核苷酸序列通过编码自裂解肽的核苷酸序列与编码另外的生物活性分子的第二核苷酸序列连接。本领域技术人员已知通过自裂解肽连接的两个蛋白会在翻译过程中无法形成正常的肽链连接，从而形成一种类似蛋白水解酶的作用将前后两个蛋白顺式“切开”，因此，当上述核酸分子在细胞中表达时，CAR会在自裂解肽处与另外的生物活性分子发生裂解，从而使得该生物活性分子分泌到CAR-T细胞外或嵌合表达在CAR-T细胞膜上，协同发挥抗肿瘤作用。
因此，本发明第三方面提供了一种核酸构建体，其包含编码第一方面所述的嵌合抗原受体的第一核苷酸序列，并且进一步包含编码另外的生物活性分子的第二核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过编码自裂解肽(例如P2A，E2A，F2A或T2A)的核苷酸序列连接。在某些实施方案中，所述自裂解肽是P2A(例如，如SEQ ID NO：50所示的序列的P2A)。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性分子具有抗肿瘤活性。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性分子选自下列组分的一种或一种以上：免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1、PD-L1、CTLA-4、或LAG-3抗体或抗原结合片段)、细胞因子(例如，IL-15、IL-7、IL-12、IL-18、或IL-21)、或膜嵌合型多肽(例如，mIL-15、mIL-7、mIL-12、mIL-18、或mIL-21)。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性分子选自的免疫检查点抑制剂为抗PD-1或PD-L1抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗PD-1或PD-L1抗体或其抗原结合片段为scFv。
在某些示例性实施方案中，所述抗PD-1或PD-L1抗体或其抗原结合片段包含如下任一组的重链可变区和/或轻链可变区：(1)Nivolumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(2)Pembrolizumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(3)Atezolizumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(4)Durvalumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(5)Avelumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(6)具有SEQ ID NO:67所示序列或其变体的VH和/或具有SEQ ID NO:68所示序列或其变体的VL，(7)具有SEQ ID NO:63所示序列或其变体的VH和/或具有SEQ ID NO:64所示序列或其变体的VL。
在某些实施方案中，所述PD-1或PD-L1抗体或其抗原结合片段包括但不限于骆驼Ig、IgNAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、单链抗体(例如scFv、di-scFv、(scFv)2)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)。
在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段为单链抗体。在某些实施方案中，所述单链抗体为scFv、di-scFv或(scFv)2。
在某些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段具有SEQ ID NO:63或其变体序列的重链可变区和/或SEQ ID NO:64轻链可变区或其变体序列的轻链可变区。所述的变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)。优选地，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述PD-L1抗体或其抗原结合片段包含：(1)SEQ ID NO:67所示的重链可变区；和/或SEQ ID NO:68所示的轻链可变区；或(2)下述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中，所述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)与(1)中所述的序列相比，至少一个具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列，或者与(1)中所述的序列相比，至少一个序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)。优选地，所述的置换是保守置换。
在某些优选的实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段为scFv，所述单链抗体具有SEQ ID NO:63所示序列的重链可变区和/或SEQ ID NO:64所示序列的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段为scFv，所述单链抗体具有SEQ ID NO:67所示序列的重链可变区和/或SEQ ID NO:68所示序列的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，所述VH和VL通过连接子连接。在某些优选的实施方案中，所述连接子包含如(GmS)n所示的序列，其中m选自1-6的整数。在某些优选的实施方案中，m为3、4、或5；n选自1-10的整数。在某些优选的实施方案中，n为2、3、4、5、或6。在某些优选的实施方案中，所述连接子具有SEQ ID NO：44的序列。
在某些示例的实施方案中，抗PD-1单链抗体包含选自下列的氨基酸序列：(1)SEQID NO:51所示的氨基酸序列；(2)与SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列；(3)与SEQ ID NO:51所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
在某些示例的实施方案中，所述编码特异性的结合CLDN18.2嵌合抗原受体和抗PD-1单链抗体的核酸构建体包含选自下列的核苷酸序列：(1)SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列或其简并变体；(2)与(1)所述的核苷酸序列相比基本上相同的序列，例如与(1)所述的序列相比具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的序列，或者与(1)所述的序列相比具有一个或更多个核苷酸取代的序列。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性分子选自的膜嵌合型多肽为mIL-15。在某些实施方案中，所述膜嵌合型多肽mIL-15序列包含选自下列的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO：52所示的序列；(2)与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列；(3)与SEQ ID NO:52所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)。在某些优选地实施方案中，所述的置换是保守置换。
在某些示例性实施方案中，所述编码特异性的结合CLDN18.2嵌合抗原受体和膜嵌合型多肽mIL-15的核酸构建体包含选自下列的核苷酸序列：(1)SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列或其简并变体；(2)与(1)所述的核苷酸序列相比基本上相同的序列，例如与(1)所述的序列相比具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的序列，或者与(1)所述的序列相比具有一个或更多个核苷酸取代的序列。
在某些示例的实施方案中，所述另外的生物活性分子为SEQ ID NO：51所示的序列。在另外的生物活性分子的N端包含信号肽-2。在某些实施方案中，与所述另外的生物活性分子连接的信号肽-2不同于嵌合抗原受体中所包含的信号肽。在某些实施方案中，与所述另外的生物活性分子连接的信号肽-2是IL2信号肽，IL2信号肽是指IL2天然基因序列中所包含的信号肽序列，优选地，所述IL2天然基因为人IL2天然基因，所述IL2信号肽是人IL2信号肽。在某些示例性实施方案中，所述IL2信号肽包含如SEQ ID NO：43所示的序列。
在某些实施方案中，所述第一核苷酸序列位于所述第二核苷酸序列的上游。在某些示例性实施方案中，所述编码自裂解肽的序列连接至所述第一核苷酸序列的3’端，并且连接至所述第二核苷酸序列的5’端。
本发明第四方面提供了一种载体，其包含第二方面所述的分离的核酸分子或第三方面所述的核酸构建体。
在某些实施方案中，所述载体选自DNA载体，RNA载体，质粒，转座子载体，CRISPR/Cas9载体，病毒载体。
在某些实施方案中，所述载体是表达载体。
在某些实施方案中，所述载体是游离型载体。
在某些实施方案中，所述载体是病毒载体。
在某些示例性实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
在某些实施方案中，所述载体是游离型或非整合病毒载体，例如整合缺陷型逆转录病毒或慢病毒。
本发明第五方面提供了一种宿主细胞，其包含如上第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体或第四方面所述载体。可以通过各种合适的方式将如上所述的载体引入宿主细胞，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、电穿孔、TALEN方法、ZFN方法、非病毒载体介导的转染(例如脂质体)或病毒载体介导的转染(如慢病毒感染，逆转录病毒感染，腺病毒感染)，以及其他用于转移入宿主细胞的物理、化学或生物学手段，如转座子技术，CRISPR-Cas9等技术。
在某些实施方案中，所述宿主细胞包含第二方面所述的分离的核酸分子或包含所述核酸分子的载体，所述宿主细胞表达本发明的嵌合抗原受体。
在某些实施方案中，所述宿主细胞包含第三方面所述的核酸构建体或包含所述核酸构建体的载体，所述宿主细胞表达本发明的嵌合抗原受体以及另外的生物活性分子。
在某些实施方案中，所述宿主细胞选自哺乳动物(如人)的免疫细胞。在某些实施方案中，所述免疫细胞来源于患者或健康供体。在某些实施方案中，所述免疫细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。
在第六方面，本发明提供了制备表达本发明的嵌合抗原受体的细胞的方法，其包括：(1)提供宿主细胞；(2)获得能够表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞；其中步骤(2)包括：将如第二方面所述的分离的核酸分子或包含所述核酸分子的载体引入所述宿主细胞。在另一方面，本发明提供了制备共表达本发明的嵌合抗原受体以及另外的生物活性分子的细胞的方法，其包括：(1)提供宿主细胞；(2)获得能够共表达所述嵌合抗原受体和另外的生物活性分子的宿主细胞；其中步骤(2)包括：将如第三方面所述的核酸构建体或包含所述核酸构建体的载体引入所述宿主细胞。
在某些实施方案中，所述宿主细胞选自免疫细胞，例如T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞及其任意组合。在某些实施方案中，所述免疫细胞选自T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及这些细胞的任意组合。
在某些实施方案中，在步骤(1)中，所述免疫细胞经过预处理；所述预处理包括免疫细胞的分选、激活和/或增殖；在某些实施方案中，所述预处理包括将免疫细胞与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触，从而刺激所述免疫细胞并诱导其增殖，由此生成经预处理的免疫细胞。
在某些实施方案中，在步骤(2)中，将核酸分子或载体通过病毒感染引入宿主细胞。在某些实施方案中，在步骤(2)中将核酸分子或载体通过非病毒载体转染的方式引入宿主细胞，如通过转座子的载体***、CRISPR/Cas9载体、TALEN方法、ZFN方法、电穿孔方法、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或显微注射等方法。
在某些实施方案中，在步骤(2)之后，所述方法还包括：扩增步骤(2)获得的宿主细胞。
经改造的免疫细胞
通过本发明提供的上述制备方法可将来源于患者或健康供体的免疫细胞改造为表达特异性结合CLDN18.2的CAR以及可选的另外的生物活性分子的免疫细胞。
因此，本发明第七方面还提供了一种经改造的免疫细胞，其表达本发明的特异性结合CLDN18.2的CAR。
在某些实施方案中，所述经改造的免疫细胞包含第二方面所述的分离的核酸分子或包含所述核酸分子的载体。
在某些实施方案中，所述经改造的免疫细胞还表达另外的生物活性分子。在某些实施方案中，所述经改造的免疫细胞包含第三方面所述的核酸构建体或包含所述核酸构建体的载体。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性分子选自免疫检查点抗体或其抗原结合片段(例如，抗PD-1、PD-L1、CTLA-4、或LAG-3抗体或其抗原结合片段)、细胞因子(例如，IL-15、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21)、或膜嵌合型多肽(例如，mIL-15、mIL-7、mIL-12、mIL-18、mIL-21)。
在某些实施方案中，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段选自抗PD-1抗体或其抗原结合片段(例如scFv)。在某些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合片段包含如SEQID NO：51所示的序列。
在某些实施方案中，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段选自抗PD-1或抗PD-L1抗体或其抗原结合片段(例如scFv)。在某些实施方案中，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段选自抗PD-1或抗PD-L1抗体或其抗原结合片段选自Nivolumab，Pembrolizumab，Atezolizumab，Durvalumab，或Avelumab。在某些实施方案中，所述抗PD-1或抗PD-L1抗体或其抗原结合片段选自PCT/CN2019/106599中的PD-L1抗体。在某些实施方案中，所述抗PD-1或抗PD-L1抗体或其抗原结合片段选自CN201910939944.8或其同族专利申请中的PD-1抗体。
在某些实施方案中，所述抗PD-1或抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含如下一组的重链可变区和/或轻链可变区：
(1)Nivolumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区；
(2)Pembrolizumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区；
(3)Atezolizumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区；
(4)Durvalumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区；
(5)Avelumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区；
(6)具有SEQ ID NO:67所示序列或其变体的VH和/或具有SEQ ID NO:68所示序列或其变体的VL；或，
(7)具有SEQ ID NO:63所示序列或其变体的VH和/或具有SEQ ID NO:64所示序列或其变体的VL；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述膜嵌合型多肽为mIL-15。在某些实施方案中，所述膜嵌合型多肽mIL-15序列如SEQ ID NO：52所示。
在某些实施方案中，所述经改造的免疫细胞包含第二方面任一项所述的分离的核酸分子、第三方面任一项所述的核酸构建体或第四方面任一项所述的载体，或与他们相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)的核酸分子、核酸构建体或载体。
在某些实施方案中，其中所述免疫细胞来源于患者或健康供体的T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。所述免疫细胞获得自患者或健康供体。这些免疫细胞被通过上文中所提供的方法导入如第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体或第四方面所述的载体从而制备为经改造的免疫细胞。
在某些实施方案中，经改造的免疫细胞还具有CLDN18.2靶点以外的结合特异性，如经改造的免疫细还结合CD19、CD20、CD22、CD33、CD123、或CD138。
在某些实施方案中，经改造的免疫细胞还包括敲除一个或多个内源基因，其中所述内源基因选自：编码TCRα、TCRβ、CD52、糖皮质激素受体(GR)、脱氧胞苷激酶(dCK)、或免疫检查点蛋白，例如程序性死亡-1(PD-1)的基因。
在第八方面，本发明提供了制备前述经改造的免疫细胞的方法，其包括：(1)提供来自患者或者健康供体的免疫细胞；(2)获得能够表达CLDN18.2特异性结合嵌合抗原受体的免疫细胞或共表达CLDN18.2特异性结合的嵌合抗原受体和生物活性分子的免疫细胞；其中步骤(2)包括将第二方面所述分离的核酸分子或第三方面所述的核酸构建体或第四方面所述的载体引入步骤(1)所述的免疫细胞。
在某些实施方案中，所述免疫细胞选自T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及这些细胞的任意组合。
在某些实施方案中，在步骤(1)中，所述免疫细胞经过预处理；所述预处理包括免疫细胞的分选、激活和/或增殖；在某些实施方案中，所述预处理包括将免疫细胞与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触，从而刺激所述免疫细胞并诱导其增殖，由此生成经预处理的免疫细胞。
在某些实施方案中，在步骤(2)中，将核酸分子、核酸构建体或载体通过病毒感染引入免疫细胞。在某些实施方案中，在步骤(2)中将核酸分子、核酸构建体或载体通过非病毒载体转染的方式引入免疫细胞，如通过转座子的载体***、CRISPR/Cas9载体、TALEN方法、ZFN方法、电穿孔方法、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或显微注射等方法。
在某些实施方案中，在步骤(2)之后，所述方法还包括：扩增步骤(2)获得的免疫细胞。
免疫细胞组合物
在第九方面，本发明还提供了免疫细胞组合物，所述免疫细胞组合物包括前述经改造的免疫细胞，以及可选的未改造和/或未成功改造的免疫细胞，这些未改造和/或未成功改造的免疫细胞不表达特异性针对CLDN18.2的CAR。限制于当前的技术水平及一些未知的原因，并不是所有免疫细胞经过改造都能表达特异性针对CLDN18.2的CAR。而且不表达CAR的免疫细胞也有一定的生物学活性，因此免疫细胞组合物可以含有表达和不表达特异性针对CLDN18.2的CAR的免疫细胞，该免疫细胞组合物依然能够满足临床应用的需求。在某些实施方案中经改造的表达特异性针对CLDN18.2的CAR的免疫细胞占免疫细胞组合物总细胞数的大约10％-100％，优选地40％-80％。
在某些实施方案中，免疫细胞组合物被培养成免疫细胞系，因此，另一方面，本发明还提供了含有免疫细胞组合物的免疫细胞系。
在第十方面，本发明提供了制备特异性结合CLDN18.2的嵌合抗原受体，或用于制备表达所述嵌合抗原受体的细胞或者共表达所述嵌合抗原受体以及另外的生物活性分子的免疫细胞的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包括如第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体或第四方面所述的载体，或第五方面所述的宿主细胞，和必要的溶剂，如无菌水，生理盐水，或细胞培养液，如LB培养液，如EliteCell原代T淋巴细胞培养体系(产品编号：PriMed-EliteCell-024)，以及可选的，还包括使用说明书。
在另一个方面，本发明提供了前述试剂盒用于制备能够特异性结合CLDN18.2的嵌合抗原受体、或表达所述嵌合抗原受体的细胞、或共表达所述嵌合抗原受体以及另外的生物活性分子的免疫细胞的应用。
药物组合物
在第十一方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体、第四方面所述的载体、第五方面所述的宿主细胞、第七方面所述经改造的免疫细胞或第九方面所述免疫细胞组合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，例如具有抗肿瘤活性的药物。
在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂是干扰素、白细胞介素-2或化疗药物。
在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂选自：表柔比星、奥沙利铂、卡培他滨、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇中的一种或多种。
在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体、第四方面所述的载体、第五方面所述的宿主细胞、第七方面所述经改造的免疫细胞或第九方面所述免疫细胞组合物与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体、第四方面所述的载体、第五方面所述的宿主细胞、第七方面所述经改造的免疫细胞或第九方面所述免疫细胞组合物与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含：第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体、第四方面所述的载体、第五方面所述的宿主细胞、第七方面所述经改造的免疫细胞或第九方面所述免疫细胞组合物。
本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体、第四方面所述的载体、第五方面所述的宿主细胞、第七方面所述经改造的免疫细胞或第九方面所述免疫细胞组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体、第四方面所述的载体、第五方面所述的宿主细胞、第七方面所述经改造的免疫细胞或第九方面所述免疫细胞组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体、第四方面所述的载体、第五方面所述的宿主细胞、第七方面所述经改造的免疫细胞或第九方面所述免疫细胞组合物通过静脉注射或推注给予。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体、第四方面所述的载体、第五方面所述的宿主细胞、第七方面所述经改造的免疫细胞或第九方面所述免疫细胞组合物。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体、第四方面所述的载体、第五方面所述的宿主细胞、第七方面所述经改造的免疫细胞或第九方面所述免疫细胞组合物的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫***的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
在本发明中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。
治疗方法及用途
在另一方面，本发明提供了一种用于在受试者中预防和/或***、和/或延迟肿瘤进展、和/或降低或抑制肿瘤复发的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体、第四方面所述的载体、第五方面所述的宿主细胞、第七方面所述经改造的免疫细胞、第九方面所述免疫细胞组合物或第十一方面所述的药物组合物。
在某些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的单链抗体。
在某些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体、第四方面所述的载体、第五方面所述的宿主细胞、第七方面所述经改造的免疫细胞、第九方面所述免疫细胞组合物或第十一方面所述的药物组合物。在某些实施方案中，所述宿主细胞是免疫细胞(例如人免疫细胞)。
在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(1)提供所述受试者所需的免疫细胞(例如T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、或这些细胞的任意组合)；(2)将包含本发明第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体或第四方面所述的载体导入步骤(1)所述的免疫细胞，以获得表达所述嵌合抗原受体的细胞或者共表达所述嵌合抗原受体以及另外的生物活性分子的免疫细胞；(3)将步骤(2)中获得的免疫细胞施用至所述受试者以进行治疗。
在某些实施方案中，所述方法通过剂量分次，例如一次，两次，三次或更多次分开施用部分剂量，向所述受试者施用表达本发明的CAR的免疫细胞，例如在治疗的第一天施用总剂量的第一百分比，在随后的(例如第二，第三，第四，第五，第六或第七或更晚)治疗日施用总剂量的第二百分比，例如在随后的(例如第三，第四，第五，第六，第七，第八，第九，第十或更晚)治疗日施用总剂量的第三百分比(例如，剩余百分比)。
在某些实施方案中，在治疗的第一天施用总剂量的10％的细胞，在第二天施用总剂量的30％的细胞，并且在第三天施用总剂量的剩余60％的细胞。
在某些实施方案中，在治疗的第一天施用总剂量的50％的细胞，在随后的(例如第二，第三，第四，第五，第六或第七或更晚)治疗日施用总剂量的50％的细胞。在某些实施方案中，在治疗的第一天施用总剂量的1/3的细胞，在随后的(例如第二，第三，第四，第五，第六或第七或更晚)治疗日施用总剂量的1/3的细胞，在随后的(例如第三，第四，第五，第六，第七，第八，第九，第十或更晚)施用总剂量的1/3的细胞。
在某些实施方案中，总细胞剂量包含1×107至10×108个CAR阳性免疫细胞，例如包含(1-5)×107至(5-10)×108个CAR阳性免疫细胞。
在某些实施方案中，医师可以根据病人的状态，肿瘤的大小和阶段，或联合治疗的药物等临床情况来调节剂量或治疗方案。
在某些实施方案中，所述肿瘤选自实体肿瘤、血液肿瘤和癌症的转移性、难治性或复发性病灶。
在某些实施方案中，所述肿瘤或癌症选自食管癌、胃肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、结直肠癌、肾癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌、胃腺癌、胃食管交界处(GEJ)腺癌、头颈癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、***、卵巢癌、***癌、睾丸癌、生殖细胞癌、骨癌、皮肤癌、胸腺癌、胆管癌、胆囊癌、黑素瘤、间皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、肉瘤、神经胶质母细胞瘤、白血病。
在某些实施方案中，所述肿瘤选自胃癌、胃腺癌、胃食管交界处(GEJ)腺癌、食管癌、胃肠癌、胰腺癌，肺癌(例如非小细胞肺癌)。
在某些实施方案中，所述肿瘤选自为胃癌、胃腺癌、或胃食管交界处(GEJ)腺癌，例如局部晚期不可切除或转移的胃癌、胃腺癌、或胃食管交界处(GEJ)腺癌。
在某些实施方案中，所述肿瘤为CLDN18.2阳性。在某些实施方案中，所述肿瘤为HER2阴性。在某些实施方案中，所述肿瘤为CLDN18.2阳性，且HER2阴性。HER2阴性指的是细胞表面没有大量的HER2蛋白，包括IHC 1+，或IHC 2+/FISH阴性，还包括IHC 0至1+及IHC 1+至2+的范围。
在某些实施方案中，将本发明的第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体、第四方面所述的载体、第五方面所述的宿主细胞、第七方面所述经改造的免疫细胞、第九方面所述免疫细胞组合物或第十一方面所述的药物组合物与另外的试剂联合施用。在某些实施方案中，所述另外的试剂包括(i)增加包含CAR核酸或CAR多肽的细胞(例如表达本发明的CAR的免疫细胞，本发明的经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物)的功效的作用剂；(ii)改善与施用包含CAR核酸或CAR多肽的细胞(例如表达本发明的CAR的免疫细胞，本发明的经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物)相关的一种或多种副作用的作用剂；(iii)具有抗肿瘤活性的另外的药学活性剂。在某些优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂选自：表柔比星、奥沙利铂、卡培他滨、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇中的一种或多种。这些试剂可以在施用本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体、第四方面所述的载体、第五方面所述的宿主细胞、第七方面所述经改造的免疫细胞、第九方面所述免疫细胞组合物或第十一方面所述的药物组合物之前、同时或之后施用。
在某些实施方案中，以上所述方法还包括向所述受试者施用第二疗法，所述第二疗法可以是已知用于肿瘤的任何疗法，例如手术、化疗、放疗、免疫疗法、基因疗法、DNA疗法、RNA疗法、纳米疗法、病毒疗法、辅助疗法及其任意组合。
在某些实施方案中，所述第二疗法可以与以上所述的方法分开、联合、同时或相继应用。
在某些优选实施方案中，所述化疗选自：表柔比星、奥沙利铂、卡培他滨、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇中的一种或多种。
在某些实施方案中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。
在另一个方面，提供了本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体、第四方面所述的载体、第五方面所述的宿主细胞、第七方面所述经改造的免疫细胞、第九方面所述免疫细胞组合物或第十一方面所述的药物组合物在制备用于在受试者中预防和/或治疗和/或辅助***、和/或延迟肿瘤进展、和/或降低或抑制肿瘤复发的药物中的用途。前述治疗方法中的剂量，剂型，给药途径，适应症，联合治疗等各个方面都可以应用到所述药物的用途中。
缩略词
CLDN18.2 Claudin 18.2
CAR 嵌合抗原受体
CDR 免疫球蛋白可变区中的互补决定区
CDR-H1 免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区1
CDR-H2 免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区2
CDR-H2-1 免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区2的第一条序列
CDR-H2-2 免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区2的第二条序列
CDR-H3 免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区3
CDR-L1 免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区1
CDR-L2 免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区2
CDR-L3 免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区3
FR 抗体构架区：抗体可变区中除CDR残基以外的氨基酸残基
VH 抗体重链可变区
VL 抗体轻链可变区
AbM AbM CDR定义方式来源于Martin的相关研究(Martin ACR,Cheetham JC,Rees AR(1989)Modelling antibody hypervariableloops:A combined algorithm.ProcNatl Acad Sci USA 86:9268–9272)，此定义方法整合了Kabat及Chothia两者的部分定义。
Kabat 由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号***(参见，例如Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
Chothia 由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号***，其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见，例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。
IMGT 基于由Lefranc等人发起的国际免疫遗传学信息***(TheinternationalImMunoGeneTics information
Figure BDA0003084572240000361
(IMGT))的编号***，可参阅Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003。
IL-2 白细胞介素2
IFN 干扰素
PCR 聚合酶链式反应
FACS 流式细胞荧光分选
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、免疫学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“抗体”指能够通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合靶(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所用，该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且包括其片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(例如scFv，di-scFv，(scFv)2)和结构域抗体(包括例如鲨鱼和骆驼抗体)、以及包括抗体的融合蛋白、以及包括抗原识别位点的任何其它修饰构型的免疫球蛋白分子。本发明的抗体不受任何特定的产生抗体的方法限制。抗体包括任何类型的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要属于任何特定的类型。取决于抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分配到不同的类型。有五种主要类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。重链恒定区由4个结构域(CH1、hinge region、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(C1q)的结合。
抗体的VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDRs和4个FRs组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDRs，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号***进行定义，例如可按照Kabat编号***(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号***(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号***(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号***所定义的CDR。并且，不同编号***之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
在本发明中，抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号***确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT编号***确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR通过IMGT编号***确定。在本发明中，除特别标注所述CDR为何种编号***定义外，均是通过IMGT编号***定义。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的片段的多肽，例如全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fd、Fv、scFv、di-scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
如本文中所使用的，术语“骆驼Ig”或“骆驼VHH”是指重链抗体的最小已知抗原结合单位(Koch-Nolte等人,FASEB J.,21:3490-3498(2007))。“重链抗体”或“骆驼抗体”是指含有两个VH结构域并且不含轻链的抗体(Riechmann L.等人,免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)231:25-38(1999)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利第6,005,079号)。
如本文中所使用的，术语“IgNAR”或“免疫球蛋白新抗原受体”是指来自鲨鱼免疫组库的由一个可变新抗原受体(VNAR)结构域和五个恒定新抗原受体(CNAR)结构域的同源二聚体组成的一类抗体。
如本文中所使用的，术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544 546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
如本文中所使用的，术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDRs赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDRs)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
如本文中所使用的，术语“Fc”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。
如本文中所使用的，术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。在某些实施方案中，VH和VL结构域可以以任何合适的排列彼此相对定位。例如，包含NH2-VH-VH-COOH、NH2-VL-VL-COOH的scFv。所述scFv可以形成任何工程上可能的结构，单链抗体(scFv)，串联抗体(tandem di-scFvs)，双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白，骆驼Ig、IgNAR等。在本发明的某些实施方案中，scFv可形成di-scFv，其指的是两个或两个以上单个scFv串联而形成抗体。在本发明的某些实施方案中，scFv可形成(scFv)2，其指的是两个或两个以上单个scFv并联而形成抗体。
如本文中所使用的，术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段在同一多肽链(VH-VL)中包含连接到轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用过短以使得同一链上的两个结构域之间不能配对的连接子，迫使结构域与另一链的互补结构域配对，并且产生两个抗原结合位点。双功能抗体可以是二价的或双特异性的。双功能抗体更全面描述于例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,自然医学(Nat.Med.)9:129-134(2003)；和Hollinger等人,PNAS USA 90:6444-6448(1993)中。三功能抗体和四功能抗体也描述于Hudson等人,自然医学9:129-134(2003)中。
如本文中所使用的，术语“单域抗体(single-domain antibody,sdAb)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力(Holt,L.等人,生物技术趋势(Trends in Biotechnology),21(11):484-490，2003)。单域抗体也称为纳米抗体(nanobody)。
上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，表述“特异性结合”或“特异性针对”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量KD、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用表面等离子体共振术(SPR)在Biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或Kinexa来测量解离常数。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“核酸分子”、“核苷酸序列”、“多核苷酸”是指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)或重组DNA。多核苷酸包括单链和双链多核苷酸。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸***其中的一种核酸运载工具。载体可以包括在细胞中直接自主复制的序列，或可以包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及病毒载体等。病毒载体的非限制性实例包括，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“游离型载体”中游离型是指载体能够复制而不整合到宿主的染色体DNA中并且不由***宿主细胞逐渐丧失，还意指所述载体在染色体外或游离地复制。
如本文中所使用的，术语“病毒载体”广泛用以指包括典型地促进核酸分子转移或整合到细胞的基因组中的病毒衍生的核酸元件的核酸分子(例如转移质粒)，或介导核酸转移的病毒颗粒。除了核酸之外，病毒颗粒典型地将包括各种病毒组分并且有时还包括宿主细胞组分。
术语“病毒载体”可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或指转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要衍生自病毒的结构和/或功能遗传元件。
如本文中所使用的，术语“逆转录病毒载体”是指含有主要衍生自逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。
如本文中所使用的，术语“慢病毒载体”是指含有主要衍生自慢病毒的结构和功能遗传元件或其部分(包括LTR)的病毒载体或质粒。在某些实施方案中，术语“慢病毒载体”、“慢病毒表达载体”可以用以指慢病毒转移质粒和/或感染性慢病毒颗粒。在本文提及元件(例如克隆位点、启动子、调节元件、异源核酸等)时，应理解，这些元件的序列以RNA形式存在于本发明的慢病毒颗粒中并且以DNA形式存在于本发明的DNA质粒中。
如本文中所使用的，“整合缺陷型”逆转录病毒或慢病毒是指具有不能将病毒基因组整合到宿主细胞的基因组中的整合酶的逆转录病毒或慢病毒。在某些实施方案中，整合酶蛋白突变以特异性降低其整合酶活性。整合缺陷型慢病毒载体可以通过修饰编码整合酶蛋白的pol基因，产生编码整合缺陷型整合酶的突变pol基因而获得。所述整合缺陷型病毒载体已经描述于专利申请WO 2006/010834中，所述专利申请以全文引用的方式并入本文中。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞，免疫细胞(如T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞等)。宿主细胞可以包括单个细胞或细胞群体。
在某些实施方案中，所述宿主细胞可以包括经本发明第二方面所述的分离的核酸分子、第三方面所述的核酸构建体或包含所述核酸分子或核酸构建体的载体体内、离体或体外电穿孔、转染、感染或转导的细胞。在此类实施方案中，所述宿主细胞优选是免疫细胞。
如本文中所使用的，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指包含至少一个细胞外抗原结合结构域，间隔结构域，跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文也称为“胞内信号传导结构域”)的重组多肽构建体，其将针对目的抗原(例如CLDN18.2)的基于抗体的特异性与免疫效应细胞活化胞内结构域组合以展现针对表达该目的抗原(例如CLDN18.2)细胞的特异性免疫活性。在本发明中，表述“表达CAR的免疫效应细胞”是指表达CAR并且具有由该CAR的靶向结构域决定的抗原特异性的免疫效应细胞。制造CAR(例如，用于癌症治疗)的方法是本领域已知的，可参见例如，Park等人,Trends Bio technol.,29:550-557,2011；Grupp等人,N Engl J Med.,368:1509-1518,2013；Han等人,J.Hematol.Oncol.,6:47,2013；PCT专利公开文本WO2012/079000、WO2013/059593；和美国专利公开文本2012/0213783，其全部通过引用整体并入本文。
如本文中所使用的，术语“胞外抗原结合结构域”与“胞外配体结合结构域”可以互换使用，是指能够特异性结合目的抗原或受体的多肽。该结构域将能够与细胞表面分子相互作用。例如，可以选择胞外抗原结合结构域来识别作为与特定疾病状态相关的靶细胞细胞表面标志物的抗原。
如本文中所使用的，术语“胞内信号传导结构域”是指传导效应信号功能信号并引导细胞进行专门的功能的蛋白质部分。因此，胞内信号传导结构域具有激活表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能的能力。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
如本文中所使用的，术语“初级信号传导结构域”是指能够以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级活化的蛋白质部分。以刺激方式作用的初级信号传导结构域通常含有已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(I TAM)的信号传导基序。含有特别用于本发明中的初级信号传导结构域的ITAM的非限制性实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、C D3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。
如本文中所使用的，术语“共刺激信号传导结构域”是指共刺激分子的胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体以外的在结合到抗原后提供T淋巴细胞的高效活化和功能所需的第二信号的细胞表面分子。所述共刺激分子的非限制性实例包括CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD270(HVEM)、CD278(ICOS)、DAP10。
如本文中所使用的，术语“自裂解肽”是指一类可以诱导细胞中重组蛋白的裂解的肽，例如2A自切割肽，它是一类18-22个aa长的肽家族。2A肽家族的四个成员经常用于生命科学研究。它们是P2A，E2A，F2A和T2A。F2A来自***病毒18。T2A的序列可参见例如SEQ IDNO:56，P2A的序列可参见例如SEQ ID NO:50，E2A的序列可参见例如SEQ ID NO:57，F2A的序列可参见例如SEQ ID NO:58。
在本文中，膜嵌合型多肽指的是多肽或蛋白表达后不完全脱离表达该多肽或蛋白细胞的细胞膜，所述多肽或蛋白可能具有穿膜的结构，或者与细胞膜连接但游离于细胞之外。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：无菌水，生理盐水，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，肿瘤)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，术语“受试者”是指包括其中可以引出免疫应答的活生物体。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有肿瘤(例如与CLDN18.2相关的肿瘤)，或者，具有患有上述疾病的风险。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如，肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如，肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫***的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
如本文中使用的，术语“免疫细胞”是指涉及免疫反应例如涉及促进免疫效应子功能的细胞。免疫细胞的实例包括T细胞(例如α/βT细胞和γ/δT细胞)、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓来源巨噬细胞。
本发明所述的免疫细胞可以是自身的/自体的(“自我”)或非自身的(“非自我”，例如同种异体的、同基因的或异基因的)。如本文中使用的，“自身的”是指来自同一受试者的细胞；“同种异体的”是指与比较细胞遗传不同的同一物种的细胞；“同基因的”是指与比较细胞遗传相同的来自不同受试者的细胞；“异基因的”是指与比较细胞来自不同物种的细胞。在优选实施例中，本发明的细胞是同种异体的。
可用于本文所述的CAR的示例性免疫细胞包括T淋巴细胞。术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公知的并且意图包括胸腺细胞、未成熟的T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化的T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助(Th)细胞，例如T辅助1(Th1)或T辅助2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助T细胞(HTL；CD4T细胞)CD4T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8T细胞)、CD4CD8T细胞、CD4CD8T细胞或任何其它T细胞子组。在某些实施方案中，T细胞可以包括原初T细胞和记忆T细胞。
本领域技术人员将理解，其它细胞也可以用作具有如本文所述的CAR的免疫细胞。具体来说，免疫细胞还包括NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞、NKT细胞、嗜中性白细胞和巨噬细胞。免疫细胞还包括免疫细胞的祖细胞，其中所述祖细胞可以在体内或体外经诱导以分化成免疫细胞。因此，在某些实施方案中，免疫细胞包括免疫细胞的祖细胞，例如含于衍生自脐血、骨髓或流动周边血液的CD34+细胞群体内的造血干细胞(HSC)，其在受试者中投与后分化成成熟免疫细胞，或其可以在体外经诱导以分化成成熟免疫细胞。
如本文中使用的，术语“经改造的免疫细胞”是指，表达本文所述的任何一种CAR，或导入了本文所述的任何一种分离的核酸或载体的免疫细胞。可以用多种方法将编码CAR多肽的多核苷酸引入细胞后，也可以在细胞中原位合成CAR多肽。或者，可以在细胞外生产CAR多肽，然后将其引入细胞。将多核苷酸构建体引入细胞的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，可以使用稳定的转化方法将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中。在其他实施方案中，瞬时转化方法可用于瞬时表达多核苷酸构建体，并且多核苷酸构建体未整合到细胞的基因组中。在其它实施方案中，可以使用病毒介导的方法。多核苷酸可以通过任何合适的方法引入细胞，例如重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)，脂质体等。瞬时转化方法包括，例如但不限于显微注射、电穿孔或微粒轰击。多核苷酸可以包括在载体中，例如质粒载体或病毒载体。
如本文中使用的，术语“免疫效应子功能”是指免疫效应细胞的增强或促进对靶细胞的免疫攻击(例如对靶细胞的杀伤，或者抑制其生长或增殖)的功能或反应。例如，T细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
术语“癌症”“肿瘤”可互换使用，其是指以体内异常细胞的不受控生长为特征的一大类疾病。不受管制的细胞***可能导致恶性肿瘤或侵入邻近组织的细胞的形成，并可能通过淋巴***或血流转移到身体的远端部位。癌症包括良性和恶性癌症以及休眠肿瘤或微转移。癌症也包括血液学恶性肿瘤。
术语“血液学恶性肿瘤”包括淋巴瘤，白血病，骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤，以及脾癌和***肿瘤。示例性淋巴瘤包括B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤。B细胞淋巴瘤，包括例如霍奇金淋巴瘤。T细胞淋巴瘤，包括例如皮肤T细胞淋巴瘤。血液学恶性肿瘤还包括白血病，例如继发性白血病或急性淋巴细胞性白血病。血液恶性肿瘤还包括骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)及其他血液学和/或B细胞或T细胞相关的癌症。
在本文中，组合疗法包括将本发明的单链抗体、第九方面所述的宿主细胞、本发明的经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物与一或多种另外的第二疗法的活性治疗剂(例如化学治疗剂)或其他预防或治疗模式(例如，放疗)组合使用。
第二疗法示例性的抗癌剂可包括化学治疗剂(例如有丝***抑制剂)、烷化剂(例如氮芥Nitrogen Mustard)、抗代谢物(例如叶酸类似物)、天然产物(例如长春花生物碱Vinca Alkaloid)、多种试剂(例如铂配位络合物)、激素和拮抗剂(例如肾上腺皮质类固醇)、免疫调节剂(例如溴匹立明Bropirimine,Upjohn)等。其他抗癌治疗包括特异性靶向癌细胞的其他抗体。
在此类组合疗法中，各种活性剂经常具有不同的互补作用机制，组合疗法可能导致协同效应。组合疗法包含影响免疫反应(例如增强或活化反应)之治疗剂及影响(例如抑制或杀死)肿瘤/癌细胞之治疗剂。组合疗法可降低抗药性癌细胞发生的可能性。组合疗法可允许试剂中的一或多种试剂剂量减少，以减少或消除与试剂中之一或多种相关的不良作用。此类组合疗法可对潜在疾病、病症或病状具有协同的治疗或预防作用。
在本文中，“组合”包括可以分开施用的疗法，例如针对单独投药分开调配(例如，可以在套组中提供)，及可以按单一调配物(亦即“共调配物”)一起施用的疗法。在某些实施方案中，本发明的单链抗体、第九方面所述的宿主细胞、本发明的经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物可与第二疗法依次序施用。在其他实施方案中，本发明的单链抗体、第九方面所述的宿主细胞、本发明的经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物可与第二疗法同时施用。本发明的单链抗体、第九方面所述的宿主细胞、本发明的经改造的免疫细胞或免疫细胞组合物可以与至少一种其他(活性)药剂以任何方式组合使用。
在本文中，Claudin 18.2阳性，由专业临床病理医师进行免疫组化和染色强度评价获得。HER2阴性，包括IHC 1+，或IHC 2+/FISH阴性，还包括IHC 0至1+及IHC 1+至2+的范围。
发明的有益效果
本发明提供了靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体，表达本发明的嵌合抗原受体的免疫效应细胞只对Claudin18.2靶肿瘤细胞产生特异性杀伤，对Claudin18.1和不表达Claudin18.2的肿瘤细胞无杀伤效果，具有良好的特异性。同时体内试验显示，表达本发明的嵌合抗原受体的免疫效应细胞在低剂量下能显著抑制肿瘤的生长，并且动物耐受性良好，预示本发明的嵌合抗原受体可能为实体瘤患者带来潜在的获益。此外，本发明提供了共表达本发明的嵌合抗原受体以及另外的生物活性分子的免疫细胞，该免疫细胞含有表达靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体的核酸和另外的生物活性分子核酸，另外的生物活性分子核酸位于编码靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体的核酸的下游经裂解肽核酸相连。生物活性分子表达后在裂解肽处断裂，分泌到免疫细胞外，或嵌合表达在免疫细胞膜中。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。
附图说明
图1-4显示了CAR-T细胞(1E9.2-T、2C6.9-T、空白T)对靶细胞的杀伤活性检测结果。
图5-6显示了CAR-T细胞(1E9.2-T、2C6.9-T、空白T)激活后IL-2分泌水平检测结果。
图7-8显示了CAR-T细胞(1E9.2-T、2C6.9-T、空白T)激活后IFN-γ分泌水平检测结果。
图9显示了CAR-T细胞(2C6.9-T、2C6.9-T-PD-1、2C6.9-T-mIL-15)对靶细胞的杀伤活性检测结果。
图10显示了靶细胞刺激后，2C6.9-T细胞、2C6.9-T-PD-1细胞分泌PD-1量的检测结果。
图11显示了经2C6.9-T细胞、对标T细胞治疗的荷瘤B-NDG鼠的肿瘤体积变化曲线。
图12显示了经2C6.9-T细胞、对标T细胞治疗的荷瘤B-NDG鼠的体重变化曲线。
图13显示了经2C6.9-T细胞、空白T细胞治疗的荷瘤NOD/SCID鼠的肿瘤体积变化曲线。
图14显示了经2C6.9-T细胞、空白T细胞治疗的荷瘤NOD/SCID鼠的体重变化曲线。
图15显示了经2C6.9-T细胞、空白T细胞治疗的荷瘤NOD/SCID鼠的靶器官的组织切片。
序列信息
本发明涉及的序列信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
Figure BDA0003084572240000511
Figure BDA0003084572240000521
Figure BDA0003084572240000531
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：靶向人Claudin 18.2scFv抗体的制备
通过杂交瘤技术筛选得到2株鼠源抗CLDN18.2单克隆抗体1E9.2、2C6.9。对上述鼠源单克隆抗体进行分析，获得其CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3，CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，VH，VL的序列(参见序列信息表)。然后进行人源化上述方法最终获得人源化抗体1E9.2-HZ11(其VH和VL分别如SEQ ID NO:13和14所示)；2C6.9-HZ21(其VH和VL分别如SEQ ID NO:16和17所示)。2C6.9-HZ21的CDR-H2的序列进一步改造为如SEQ ID NOs:37或53所示的序列。
将上述人源化抗体的VH和VL通过linker(SEQ ID NO:44)连接，获得scFv，各scFv的序列信息如下表所示。
表2：scFv的结构
Figure BDA0003084572240000532
Figure BDA0003084572240000541
实施例2：嵌合抗原受体(CAR)慢病毒表达载体的构建及制备
1)慢病毒质粒的构建：
基于上述实施例中的scFv序列以及对标T scFv序列(对标T来源于文献J NatlCancer Inst.2019Apr 1；111(4):409-418，为文献中的hu8E5)，进一步构建CAR慢病毒表达载体。以CD137的胞内结构域和CD3Zeta的ITAM区作为激活信号，与上述scFv进行融合，同时加上信号肽，CD8铰链区，CD8跨膜区，使用引物F(SEQ ID NO:54)和引物R(SEQ ID NO:55)，构建嵌合抗原受体表达载体，构建的嵌合抗原受体结构如下表3所示。
表3：嵌合抗原受体的结构
Figure BDA0003084572240000542
2)病毒包装：
将以上构建的CAR慢病毒质粒与转染试剂混合液逐滴加入到293T(ATCC)细胞中，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％CO2培养箱连续培养48小时后，收集培养皿中含有病毒的培养基上清，过滤，离心，病毒重悬于PBS缓冲液，置于-80℃保存。
实施例3：共表达CAR慢病毒表达载体的构建及制备
在实施例2的CAR结构基础上，通过编码P2A自裂解肽(氨基酸序列为SEQ ID NO:50)的序列连接编码其他生物活性分子(例如PD-1scFv，其核苷酸序列如SEQ ID NO：72所示，其上游的P2A自裂解肽核苷酸序列为SEQ ID NO:69；或mIL-15，其核苷酸序列如SEQ IDNO:73所示，其上游的P2A自裂解肽核苷酸序列为SEQ ID NO：70)的序列，以获得共表达CAR。通过与实施例2相同的方法制备该共表达CAR的慢病毒表达载体。上述共表达CAR在细胞中表达时，会从P2A序列中的PGP处裂解，从而使得所连接的生物活性分子分泌到CAR-T细胞外或嵌合表达在CAR-T细胞膜上，协同发挥抗肿瘤作用。例如，由于CLDN18.2 CAR-T特异性地与肿瘤细胞结合，活化后2C6.9-T-PD-1CAR-T通过分泌抗PD-1抗体减轻或消除免疫抑制，增加抗肿瘤效果。2C6.9-T-mIL-15CAR-T活化后，CAR-T细胞表达膜嵌合的IL-15,膜嵌合的IL-15通过刺激分泌一些细胞因子增加抗肿瘤效果并使抗肿瘤效果更持久。共表达CAR的结构以及编码核酸序列如下表所示。
表4：共表达CAR的结构
Figure BDA0003084572240000551
实施例4：CAR-T细胞的制备
1)原代T细胞分离：人PBMC细胞与Dynabeads(Thermo)室温孵育，经磁极，T细胞重悬于X-vivo 15培养基中，并添加10％FBS，300U/mL IL-2,5ng/mL IL-15和10ng/mL IL-7，(IL-2、IL-15、IL-7购自近岸蛋白质科技有限公司)置于37℃，5％CO2的培养箱中保存。
2)T细胞的激活：
调整细胞密度至1×106细胞/mL，六孔板中加入细胞因子及抗体复合物(300U/mL的IL-2、10ng/mL IL-7、5ng/mL IL-15、500ng/mL Anti-CD3(OKT3)、2μg/mL Anti-CD28)，连续培养48小时。
3)病毒感染：
(1)按照MOI＝20，计算所需要的病毒量。计算公式如下：所需病毒量(mL)＝(MOI*细胞数量)/病毒滴度。
(2)将病毒迅速复温到37℃。在六孔板中加入上述计算所得的病毒量，添加终浓度为6μg/mL的polybrene，充分混匀后，离心。
(3)离心结束后，于37℃5％CO2的培养箱中，继续培养备用。
通过上述方法分别获得表达实施例2中所述的CAR(1E9.2-T、2C6.9-T)的CAR-T细胞以及表达实施例3中所述的共表达CAR的CAR-T细胞。
实验例5：CAR-T细胞的阳性率检测
在慢病毒表达质粒中，编码CAR的核酸序列与编码截短型EGFR的核酸序列在同一个启动子的驱动下表达，由于原代T细胞膜表面不表达EGFR，因此可以使用识别EGFR的抗体对慢病毒转染的T细胞进行标记并通过流式进行测定，依此反映CAR在T细胞表面的表达水平。通过如上方法检测实施例4获得的CAR-T细胞的CAR阳性率，FACS检测结果如下表所示。结果显示，所有CAR-T细胞的CAR阳性率均大于50％，表明慢病毒转染效应细胞后，成功表达了CAR，成功构建了表达Claudin18.2-CAR的嵌合抗原受体T细胞。
表5：CAR的阳性率检测结果
嵌合抗原受体 CAR的阳性率
1E9.2-T 50.31％
2C6.9-T 57.92％
实验例6：CAR-T细胞对靶细胞的杀伤活性评价
6.1人Claudin18.2和人Claudin18.1过表达细胞系构建
将人Claudin 18.2完整编码序列(基因编号：NM_001002026.2，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)和人Claudin 18.1完整编码序列(基因编号：NM_016369.3，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)克隆到慢病毒载体pLVX-IRES-puro上，并通过文献所述(Mohammadi Z etl.,Mol Biotechnol.2015Sep；57(9):793-800.)慢病毒包装***制备病毒，获得病毒后分别感染HEK293T及L929细胞，通过嘌呤霉素筛选及单克隆挑选，获得单克隆的HEK293T-Claudin 18.1(简称为293T-18.1)、HEK293T-Claudin 18.2(简称为293T-18.2)、L929-Claudin 18.2(简称为L929-18.2)稳定细胞系，用于后续实验。
6.2评价1E9.2-T和2C6.9-T细胞对靶细胞的杀伤活性
通过测定1E9.2-T和2C6.9-T细胞对靶细胞的裂解能力以及其释放细胞因子的能力来评价CAR-T细胞的杀伤活性，具体步骤如下：
1)裂解活性：靶细胞L929-18.2和L929在E-Plate板中，RPMI1640+10％FBS，5％CO237℃培养箱中培养至细胞指数(活细胞与检测板孔中微电极相互作用，产生电阻抗的改变，通过标准公式将这些信号转化为特定的参数——细胞指数，细胞指数很好地衡量了细胞的状态——生长、扩散、形状改变、死亡、应激等，细胞指数是一个无量纲的参数，由RTCA测得的阻抗值通过标准公式推算获得)达到1(细胞指数为1时，细胞状态最好)后，以1E9.2-T、2C6.9-T以及未转染CAR的对照T细胞(空白T)作为效应细胞，然后按照1:1和2.5:1的E/T(效应细胞/靶细胞)比例，进行实时细胞分析，实时测量效应/靶细胞共孵育的裂解结果(细胞指数由仪器自主生成，反应的是细胞数目和细胞粘附状态的变化，细胞数量增多，细胞指数增大。而细胞贴壁状态的变化也会影响细胞指数的变化，如细胞贴壁后铺展开，细胞指数增大，贴壁细胞被杀伤后，细胞指数变小，细胞裂解，细胞指数也会下降)。
2)细胞因子释放检测：以1E9.2-T、2C6.9-T、未转染CAR的空白T细胞作为效应细胞，然后按照10:1、5:1和1：1的E/T(效应细胞/靶细胞，结果仅列代表性数据)比例与293T-18.2和293T-18.1在96孔板中，DMEM+10％FBS，5％CO2 37℃培养箱中培养过夜。培养结束后，使用ELISA kit检测IL-2及IFN-γ的分泌水平，使用酶标仪读取OD 450nm值。
将上述处理后的数据使用GraphPad 6.0进行作图。
5)结果分析：
1E9.2-T、2C6.9-T的杀伤活性检测结果如图1-4所示。IL-2分泌水平检测结果如图5-6所示。IFN-γ分泌水平检测结果如图7-8所示。
上述结果显示，1E9.2-T、2C6.9-T可以激活原代T细胞并高效的介导T细胞对表达CLDN18.2的肿瘤细胞的杀伤(图1，2)，且引起细胞因子分泌量的显著升高(图5、7)。特别地，1E9.2-T、2C6.9-T对野生型L929细胞无杀伤(图3、4)，且几乎不诱导293T-18.1肿瘤细胞释放IL-2或IFN-γ(图6、8)，上述结果表明1E9.2-T、2C6.9-T只能特异性的裂解表达Claudin18.2的肿瘤细胞，并引起IL-2和IFN-γ分泌量的显著升高，不能特异性裂解表达Claudin18.1的肿瘤细胞，不能引起IL-2或IFN-γ分泌量的升高，无脱靶现象。
6.3评价共表达CAR-T对靶细胞的杀伤活性
通过测定共表达CAR-T细胞对靶细胞的裂解能力以及PD-1释放能力来评价CAR-T细胞的杀伤活性，具体步骤如下：
空白T，2C6.9-T和2C6.9-T-mIL-15,2C6.9-T-PD-1与靶细胞NUGC4-luciferase(用实施例6.1的方法制备获得表达人luciferase的稳定细胞系NUGC4-luciferase)按照3:1，1:1，0.5:1，0.1:1的E/T(效应细胞/靶细胞)比例加入到白色96孔板中，5％CO2 37℃培养箱中共孵育培养18～24h，培养结束后，加入20μl荧光检测试剂，使用酶标仪检测荧光强度。
4)ELISA检测PD-1分泌：检测方法与常规ELISA类似。病毒转导后5天，取3.3×106个CAR-T/100μl，各设至2个复孔，加入96孔板中培养24h，收集上清，冻存于-80℃。具体检测方法如下：1μ/ml gPD-1-hFcH(自制)，4℃包被过夜；清洗BSA PBS，封闭后加入梯度稀释的PD-1scFv(自制)标准品(ng/ml)，37℃孵育2-6小时；用300μl PBST清洗3次；用PBS(2％BSA)稀释生物素标记的Protein L，加100μl至对应的孔中，37℃孵育1.5小时；用300μl PBST清洗5次；加入100μl HRP标记的链霉素，37℃孵育30分钟，用300μl PBST清洗；加入100μl TMB显色液显色；加入终止液后酶标仪450nm读数。
将上述处理后的数据使用GraphPad 6.0进行作图。
5)结果分析：
如图9所示，CAR-T在不同的E/T比例下都能有效裂解肿瘤细胞。2C6.9-T-PD-1培养24h后，PD-1分泌能力显著高于传统型2C6.9-T，如图10.
实验例7：CAR-T细胞体内药效评价
用实施例6.1的方法制备获得表达人Claudin18.2的稳定细胞系N87-Claudin18.2(简称为N87-18.2)。
动物分组：荷瘤N87-18.2细胞(5×106/只)成功的48只B-NDG鼠，6-8周龄雌鼠，随机分为4组，组1，给予PBS，组2给予空白T细胞(UTD)，组3给予CAR-T(2C6.9-T)，组4给予对标T。
处理：给药24h前腹腔注射环磷酰胺100mg/kg,day1回输CAR-T，尾静脉注射，剂量为5×105/只，给药后观察并定期测量小鼠肿瘤体积及体重。
用游标卡尺测量肿瘤直径，并按如下计算公式计算肿瘤体积：V＝0.5a×b2，其中a和b分别表示肿瘤的长径和短径。每天观察记录动物死亡情况。
采用以下公式计算肿瘤生长抑制率TGI(％)，用于CAR-T的抑瘤疗效：
TGI(％)＝[1-(VT末-VT始)/(VC末-VC始)]*100％
其中VT末：处理组实验结束时肿瘤体积均值
VT始：处理组给药开始时肿瘤体积均值
VC末：阴性对照组实验结束时肿瘤体积均值
VC始：阴性对照组给药开始时肿瘤体积均值
结论：如图11所示，从第14天起，CAR-T显示出对N87-18.2在老鼠体内的生长的抑制作用，抑制作用持续到观察的终止，且呈剂量依赖关系，第20天起，CAR-T显著性地抑制N87-18.2在老鼠体内的生长，2C6.9-T和对标T的TGI分别为108.16％和93.12％(空白T组为23％)。2C6.9-T组动物对治疗耐受良好(图12)。
实验例8：CAR-T细胞体内药效及安全性评价
用实施例6.1的方法制备获得表达人Claudin18.2的稳定细胞系N87-Claudin18.2(简称为N87-18.2)。
动物分组：荷瘤N87-18.2细胞(5×106/只)成功的16只NOD/SCID鼠，6-8周龄雌鼠，待肿瘤长至80～100mm3时，剔除瘤体积过小或过大的小鼠个体，随机分为2组，组1，给予空白T细胞(UTD)，组2给予CAR-T(2C6.9-T)。
处理：给药24h前腹腔注射环磷酰胺100mg/kg,day0回输CAR-T，尾静脉注射，剂量为1×107/只，给药后观察并定期测量小鼠肿瘤体积及体重。试验结束后通过大体解剖观察、脏器重量分析及组织病理学检查。
用游标卡尺测量肿瘤直径，并按如下计算公式计算肿瘤体积：V＝0.5a×b2，其中a和b分别表示肿瘤的长径和短径。每天观察记录动物死亡情况。
采用以下公式计算肿瘤生长抑制率TGI(％)，用于CAR-T的抑瘤疗效：
TGI(％)＝[1-(VT末-VT始)/(VC末-VC始)]*100％
其中VT末：处理组实验结束时肿瘤体积均值
VT始：处理组给药开始时肿瘤体积均值
VC末：阴性对照组实验结束时肿瘤体积均值
VC始：阴性对照组给药开始时肿瘤体积均值
结论：如图13所示，从第7天起，CAR-T显示出对N87-18.2在老鼠体内的生长的抑制作用，第24天对动物进行解剖。2C6.9-T的TGI为68％(空白T组为0％)。2C6.9-T组动物对治疗耐受良好(图14)。通过对大体解剖观察、小鼠血生化指标检测、脏器重量分析及组织病理学检查的数据进行分析，未发现可能与2C6.9-T候选物相关的改变，因此，综上所述，本次安全性评价表明静脉注射1×107 2C6.9-T未见明显毒理学靶器官(图15)。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川科伦博泰生物医药股份有限公司
<120> 靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体、其组合物及用途
<130> IDC210085
<150> CN202010500359.0
<151> 2020-06-04
<160> 73
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 2
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<213> 人工序列
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<223> 人源化抗体1E9.2hz11重链可变区
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Ser Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Tyr Gly Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体1E9.2hz11轻链可变区
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ser Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AbM 1E9.2 CDR-H1
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Gly Phe Ser Phe Ser Asn Ser Ala Met Ser
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体2C6.9hz21 重链可变区
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Arg Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Glu Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体2C6.9hz21 轻链可变区
<400> 17
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Phe Ile Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<212> DNA
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<220>
<223> 1E9.2-HZ11-scfv核苷酸
<400> 18
gacatcgtga tgacccagag ccccgactcc ctggccgtga gcctgggcga gagagccacc 60
atcaactgca agagcagcca gagcctgctg aacagcggca accagaagaa ctacctgacc 120
tggtatcagc agaagcccgg ccagccccct aagctgctga tctactggag cagcaccaga 180
gagagcggcg tgcctgacag gttcagcggc tccggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240
atcagcagcc tgcaggccga ggacttcgcc gtgtactact gccagaacga ctactactac 300
cccctgacct tcggcggcgg caccaaggtg gagatcaagg gcggcggcgg ctccggcggc 360
ggcggaagcg gcggcggcgg cagcgaggtg cagctggtgg agagcggcgg cggcctggtg 420
aagcccggcg gcagcctgcg gctgagctgc gccgccagcg gcttcagctt cagcaacagc 480
gccatgagct gggtgcggca ggcccccggc aagggcctgg agtgggtgag caccatcagc 540
agcggcgact cctacaccta ctacgccgac agcgtgaagg gcagattcac catcagcaga 600
gacaacgcca agaactccct gtacctgcag atgaacagcc tgagggccga ggacaccgcc 660
gtgtactact gcgccagaca gggctacggc aacgccctgg actactgggg ccagggcacc 720
ctggtgaccg tgagcagc 738
<210> 19
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1E9.2-HZ11-scfv氨基酸
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ser Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Ser
145 150 155 160
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Thr Ile Ser Ser Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Gln Gly Tyr Gly Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AbM 1E9.2 CDR-H2
<400> 20
Thr Ile Ser Ser Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr
1 5 10
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AbM 1E9.2 CDR-H3
<400> 21
Gln Gly Tyr Gly Asn Ala Leu Asp Tyr
1 5
<210> 22
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C6.9-HZ21-scfv 核苷酸
<400> 22
gacatcgtga tgacccagtc ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gagagccaca 60
atcaactgca agagcagcca gagcctgctg aacagcggca accagaagaa ctacctgacc 120
tggtatcagc agaagcccgg ccagccccct aagctgctga tctactgggc ctccaccaga 180
gactccggcg tgcccgacag attcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240
atcagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccagaatga ctttatcttc 300
cccctgacct tcggcggcgg caccaaggtg gagatcaagg gcgggggcgg cagcggcggc 360
ggcggcagcg gcggcggcgg cagccaggtg cagctgcagg agagcggccc cggcctggtg 420
aagcccagcg agaccctgag cctgacctgc accgtgtccg gcttcagcct gaccagatac 480
ggcgtgagct ggatcagaca gcctcccggc aagggcctgg agtggatcgg cgtgatctgg 540
ggcgagggca acaccaacta caaccccagc ctgaagagca gagtgaccat cagcaaggac 600
agcagcaaga gccaggtgtc cctgaagctg agcagcgtga ccgccgccga caccgccgtg 660
tactactgcg ccagagtgaa cttcggcaac gccctggact actggggcca gggcaccctg 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 23
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C6.9-HZ21-scfv 氨基酸
<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Phe Ile Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
130 135 140
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Arg Tyr
145 150 155 160
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
165 170 175
Gly Val Ile Trp Gly Glu Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
180 185 190
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu
195 200 205
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Val Asn Phe Gly Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 24
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1E9.2-T核苷酸
<400> 24
atggccctgc ccgtgaccgc cctgctgctg cccctggccc tgctgctgca cgccgccagg 60
cccgacatcg tgatgaccca gagccccgac tccctggccg tgagcctggg cgagagagcc 120
accatcaact gcaagagcag ccagagcctg ctgaacagcg gcaaccagaa gaactacctg 180
acctggtatc agcagaagcc cggccagccc cctaagctgc tgatctactg gagcagcacc 240
agagagagcg gcgtgcctga caggttcagc ggctccggca gcggcaccga cttcaccctg 300
accatcagca gcctgcaggc cgaggacttc gccgtgtact actgccagaa cgactactac 360
taccccctga ccttcggcgg cggcaccaag gtggagatca agggcggcgg cggctccggc 420
ggcggcggaa gcggcggcgg cggcagcgag gtgcagctgg tggagagcgg cggcggcctg 480
gtgaagcccg gcggcagcct gcggctgagc tgcgccgcca gcggcttcag cttcagcaac 540
agcgccatga gctgggtgcg gcaggccccc ggcaagggcc tggagtgggt gagcaccatc 600
agcagcggcg actcctacac ctactacgcc gacagcgtga agggcagatt caccatcagc 660
agagacaacg ccaagaactc cctgtacctg cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc 720
gccgtgtact actgcgccag acagggctac ggcaacgccc tggactactg gggccagggc 780
accctggtga ccgtgagcag caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaagcgt gccggccagc ggcggggggc 900
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatttgggc ccctctggct 960
ggtacttgcg gggtcctgct gctttcactc gtgatcactc tttactgtaa gcgcggtcgg 1020
aagaagctgc tgtacatctt taagcaaccc ttcatgaggc ctgtgcagac tactcaagag 1080
gaggacggct gttcatgccg gttcccagag gaggaggaag gcggctgcga actgcgcgtg 1140
aaattcagcc gcagcgcaga tgctccagcc tacaagcagg ggcagaacca gctctacaac 1200
gaactcaatc ttggtcggag agaggagtac gacgtgctgg acaagcggag aggacgggac 1260
ccagaaatgg gcgggaagcc gcgcagaaag aatccccaag agggcctgta caacgagctc 1320
caaaaggata agatggcaga agcctatagc gagattggta tgaaagggga acgcagaaga 1380
ggcaaaggcc acgacggact gtaccaggga ctcagcaccg ccaccaagga cacctatgac 1440
gctcttcaca tgcaggccct gccgcctcgg 1470
<210> 25
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1E9.2-T氨基酸
<400> 25
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu
20 25 30
Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln
35 40 45
Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ser Ser Thr
65 70 75 80
Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
145 150 155 160
Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
165 170 175
Ser Phe Ser Asn Ser Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
180 185 190
Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr
195 200 205
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
210 215 220
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Tyr Gly Asn Ala Leu Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
275 280 285
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
290 295 300
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
305 310 315 320
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
325 330 335
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
340 345 350
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
355 360 365
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
370 375 380
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
385 390 395 400
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
405 410 415
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
420 425 430
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
435 440 445
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
450 455 460
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
465 470 475 480
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AbM 1E9.2 CDR-L1
<400> 26
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AbM 1E9.2 CDR-L2
<400> 27
Trp Ser Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 28
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C6.9-T核苷酸
<400> 28
atggccctgc ccgtgaccgc cctgctgctg cccctggccc tgctgctgca cgccgccagg 60
cccgacatcg tgatgaccca gtcccccgac agcctggccg tgagcctggg cgagagagcc 120
acaatcaact gcaagagcag ccagagcctg ctgaacagcg gcaaccagaa gaactacctg 180
acctggtatc agcagaagcc cggccagccc cctaagctgc tgatctactg ggcctccacc 240
agagactccg gcgtgcccga cagattcagc ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg 300
accatcagca gcctgcaggc cgaggacgtg gccgtgtact actgccagaa tgactttatc 360
ttccccctga ccttcggcgg cggcaccaag gtggagatca agggcggggg cggcagcggc 420
ggcggcggca gcggcggcgg cggcagccag gtgcagctgc aggagagcgg ccccggcctg 480
gtgaagccca gcgagaccct gagcctgacc tgcaccgtgt ccggcttcag cctgaccaga 540
tacggcgtga gctggatcag acagcctccc ggcaagggcc tggagtggat cggcgtgatc 600
tggggcgagg gcaacaccaa ctacaacccc agcctgaaga gcagagtgac catcagcaag 660
gacagcagca agagccaggt gtccctgaag ctgagcagcg tgaccgccgc cgacaccgcc 720
gtgtactact gcgccagagt gaacttcggc aacgccctgg actactgggg ccagggcacc 780
ctggtgaccg tgagcagcac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 840
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaagcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 900
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 960
acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 1020
aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 1080
gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 1140
ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 1200
ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 1260
gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 1320
aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 1380
aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1440
cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg 1467
<210> 29
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C6.9-T氨基酸
<400> 29
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu
20 25 30
Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln
35 40 45
Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr
65 70 75 80
Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Phe Ile Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
145 150 155 160
Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
165 170 175
Ser Leu Thr Arg Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
180 185 190
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Glu Gly Asn Thr Asn Tyr
195 200 205
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys
210 215 220
Ser Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Asn Phe Gly Asn Ala Leu Asp Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AbM 1E9.2 CDR-L3
<400> 30
Gln Asn Asp Tyr Tyr Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AbM 2C6.9 CDR-H1
<400> 31
Gly Phe Ser Leu Thr Arg Tyr Gly Val Ser
1 5 10
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AbM 2C6.9 CDR-H2-1
<400> 32
Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AbM 2C6.9 CDR-H3
<400> 33
Val Asn Phe Gly Asn Ala Leu Asp Tyr
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AbM 2C6.9 CDR-L1
<400> 34
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AbM 2C6.9 CDR-L2
<400> 35
Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AbM 2C6.9 CDR-L3
<400> 36
Gln Asn Asp Phe Ile Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AbM 2C6.9 CDR-H2-2
<400> 37
Val Ile Trp Gly Glu Gly Asn Thr Asn
1 5
<210> 38
<211> 2319
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C6.9-T-PD-1核苷酸
<400> 38
atggccctgc ccgtgaccgc cctgctgctg cccctggccc tgctgctgca cgccgccagg 60
cccgacatcg tgatgaccca gtcccccgac agcctggccg tgagcctggg cgagagagcc 120
acaatcaact gcaagagcag ccagagcctg ctgaacagcg gcaaccagaa gaactacctg 180
acctggtatc agcagaagcc cggccagccc cctaagctgc tgatctactg ggcctccacc 240
agagactccg gcgtgcccga cagattcagc ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg 300
accatcagca gcctgcaggc cgaggacgtg gccgtgtact actgccagaa tgactttatc 360
ttccccctga ccttcggcgg cggcaccaag gtggagatca agggcggggg cggcagcggc 420
ggcggcggca gcggcggcgg cggcagccag gtgcagctgc aggagagcgg ccccggcctg 480
gtgaagccca gcgagaccct gagcctgacc tgcaccgtgt ccggcttcag cctgaccaga 540
tacggcgtga gctggatcag acagcctccc ggcaagggcc tggagtggat cggcgtgatc 600
tggggcgagg gcaacaccaa ctacaacccc agcctgaaga gcagagtgac catcagcaag 660
gacagcagca agagccaggt gtccctgaag ctgagcagcg tgaccgccgc cgacaccgcc 720
gtgtactact gcgccagagt gaacttcggc aacgccctgg actactgggg ccagggcacc 780
ctggtgaccg tgagcagcac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 840
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaagcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 900
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 960
acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 1020
aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 1080
gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 1140
ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 1200
ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 1260
gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 1320
aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 1380
aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1440
cttcacatgc aggccctgcc gcctcggcgg gccaagagag gatctggagc cacaaatttt 1500
agcctgctga aacaggccgg agatgtggag gaaaaccctg gccctatgta taggatgcag 1560
ctgctgagct gtattgccct gagccttgca ctggtgacca atagcgaggt gcagctggtg 1620
cagagcggcg ccgaggtgaa gaagcctggc gccagcgtga aggtgagctg caaggcctcc 1680
ggctacacct tcaccgacta ctacatgaac tgggtgcgag aggcccccgg ccagggcctg 1740
gagtggatgg gcgagatcaa tcccaagtac ggcgatacca cctacaatca gaagttcaag 1800
gaccgggcca ccctgaccgt ggataagtct acatctacag cctatatgga gctgagcagc 1860
ctgagatccg atgataccgc agtgtattat tgtgccaaag gaattagact gtttgactct 1920
tggggccagg gaaccctagt gaccgtaagc agcggaggag gaggcagcgg aggaggcgga 1980
tctggcggcg gcggctccga catccagctg acccagagcc ccagcagcct gagcgccagc 2040
gtgggcgaca gggtgaccat cacctgccgg ccctccggca acgtgcacaa ttacttcgcc 2100
tggtaccagc agaagcccgg caagagccct aagctgctgg tgtataatgc caagacactg 2160
gctgaaggcg tgcctagtag gtttagcggc agcggaagcg gcactgatta tacactgaca 2220
atttctagcc tgcagcctga ggattttgct acatattatt gtcatcatta ctatacagcc 2280
ccttttacat ttggaggcgg aacaaaggtg gagattaag 2319
<210> 39
<211> 773
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C6.9-T-PD-1氨基酸
<400> 39
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu
20 25 30
Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln
35 40 45
Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr
65 70 75 80
Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Phe Ile Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
145 150 155 160
Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
165 170 175
Ser Leu Thr Arg Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
180 185 190
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Glu Gly Asn Thr Asn Tyr
195 200 205
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys
210 215 220
Ser Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Asn Phe Gly Asn Ala Leu Asp Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly
485 490 495
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
500 505 510
Pro Gly Pro Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser
515 520 525
Leu Ala Leu Val Thr Asn Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
530 535 540
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
545 550 555 560
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Glu Ala Pro
565 570 575
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Asp
580 585 590
Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp
595 600 605
Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp
610 615 620
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Ile Arg Leu Phe Asp Ser
625 630 635 640
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
645 650 655
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln
660 665 670
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
675 680 685
Cys Arg Pro Ser Gly Asn Val His Asn Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln
690 695 700
Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu
705 710 715 720
Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
725 730 735
Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
740 745 750
Tyr Cys His His Tyr Tyr Thr Ala Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr
755 760 765
Lys Val Glu Ile Lys
770
<210> 40
<211> 2730
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C6.9-T-mIL-15核苷酸
<400> 40
atggccctgc ccgtgaccgc cctgctgctg cccctggccc tgctgctgca cgccgccagg 60
cccgacatcg tgatgaccca gtcccccgac agcctggccg tgagcctggg cgagagagcc 120
acaatcaact gcaagagcag ccagagcctg ctgaacagcg gcaaccagaa gaactacctg 180
acctggtatc agcagaagcc cggccagccc cctaagctgc tgatctactg ggcctccacc 240
agagactccg gcgtgcccga cagattcagc ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg 300
accatcagca gcctgcaggc cgaggacgtg gccgtgtact actgccagaa tgactttatc 360
ttccccctga ccttcggcgg cggcaccaag gtggagatca agggcggggg cggcagcggc 420
ggcggcggca gcggcggcgg cggcagccag gtgcagctgc aggagagcgg ccccggcctg 480
gtgaagccca gcgagaccct gagcctgacc tgcaccgtgt ccggcttcag cctgaccaga 540
tacggcgtga gctggatcag acagcctccc ggcaagggcc tggagtggat cggcgtgatc 600
tggggcgagg gcaacaccaa ctacaacccc agcctgaaga gcagagtgac catcagcaag 660
gacagcagca agagccaggt gtccctgaag ctgagcagcg tgaccgccgc cgacaccgcc 720
gtgtactact gcgccagagt gaacttcggc aacgccctgg actactgggg ccagggcacc 780
ctggtgaccg tgagcagcac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 840
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaagcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 900
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 960
acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 1020
aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 1080
gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 1140
ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 1200
ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 1260
gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 1320
aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 1380
aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1440
cttcacatgc aggccctgcc gcctcggcga gctaaacgag gctcaggcgc gacgaacttt 1500
agtttgctga agcaagctgg ggatgtagag gaaaatccgg gtcccatgga ttggacttgg 1560
attttgttcc tcgttgccgc agcgactcgc gtccatagta actgggtgaa tgtaataagt 1620
gatttgaaaa aaattgaaga tcttattcaa tctatgcata ttgatgctac tttatatacg 1680
gaaagtgatg ttcaccccag ttgcaaagta acagcaatga agtgctttct cttggagtta 1740
caagttattt cacttgagtc cggagatgca agtattcatg atacagtaga aaatctgatc 1800
atcctagcaa acaacagttt gtcttctaat gggaatgtaa cagaatctgg atgcaaagaa 1860
tgtgaggaac tggaggaaaa aaatattaaa gaatttttgc agagttttgt acatattgtc 1920
caaatgttca tcaacacttc ttccgggggc ggcagtggag gtggcggtag cggcgggggt 1980
ggctctggtg gaggcggctc tgggggcgga agtctgcaga tcacgtgccc tccccccatg 2040
tccgtggaac acgcagacat ctgggtcaag agctacagct tgtactccag ggagcggtac 2100
atttgtaact ctggtttcaa gcgtaaagcc ggcacgtcca gcctgacgga gtgcgtgttg 2160
aacaaggcca cgaatgtcgc ccactggaca acccccagtc tcaaatgcat tagagaccct 2220
gccctggttc accaaaggcc agcgccaccc tccacagtaa cgacggcagg ggtgacccca 2280
cagccagaga gcctctcccc ttctggaaaa gagcccgcag cttcatctcc cagctcaaac 2340
aacacagcgg ccacaacagc agctattgtc ccgggctccc agctgatgcc ttcaaaatca 2400
ccttccacag gaaccacaga gataagcagt catgagtcct cccacggcac cccctctcag 2460
acaacagcca agaactggga actcacagca tccgcctccc accagccgcc aggtgtgtat 2520
ccacagggcc acagcgacac cactgtggct atctccacgt ccactgtcct gctgtgtggg 2580
ctgagcgctg tgtctctcct ggcatgctac ctcaagtcaa ggcaaactcc cccgctggcc 2640
agcgttgaaa tggaagccat ggaggctctg ccggtgactt gggggaccag cagcagagat 2700
gaagacttgg aaaactgctc tcaccaccta 2730
<210> 41
<211> 910
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C6.9-T-mIL-15氨基酸
<400> 41
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu
20 25 30
Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln
35 40 45
Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr
65 70 75 80
Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Phe Ile Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
145 150 155 160
Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
165 170 175
Ser Leu Thr Arg Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
180 185 190
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Glu Gly Asn Thr Asn Tyr
195 200 205
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys
210 215 220
Ser Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Asn Phe Gly Asn Ala Leu Asp Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly
485 490 495
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
500 505 510
Pro Gly Pro Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala
515 520 525
Thr Arg Val His Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
530 535 540
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
545 550 555 560
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
565 570 575
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
580 585 590
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
595 600 605
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
610 615 620
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
625 630 635 640
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
645 650 655
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu
660 665 670
Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp
675 680 685
Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser
690 695 700
Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu
705 710 715 720
Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys
725 730 735
Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr
740 745 750
Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser
755 760 765
Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala
770 775 780
Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser
785 790 795 800
Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly
805 810 815
Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala
820 825 830
Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr
835 840 845
Val Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val
850 855 860
Ser Leu Leu Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala
865 870 875 880
Ser Val Glu Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr
885 890 895
Ser Ser Arg Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu
900 905 910
<210> 42
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8α信号肽
<400> 42
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 43
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽-2
<400> 43
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker
<400> 44
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 45
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区(CD8α)
<400> 45
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 46
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 跨膜区 (CD8TM)
<400> 46
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 47
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胞内信号传导结构域(4-1BB)
<400> 47
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 48
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胞内信号传导结构域(CD3ζ)
<400> 48
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 49
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胞内信号传导结构域(4-1BB-CD3ζ)
<400> 49
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
35 40 45
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
50 55 60
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
65 70 75 80
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
85 90 95
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
100 105 110
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
115 120 125
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
130 135 140
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
145 150
<210> 50
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 50
Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln
1 5 10 15
Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 51
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-1 scFv
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ile Arg Leu Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
130 135 140
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Pro Ser Gly Asn Val
145 150 155 160
His Asn Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys
165 170 175
Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser
195 200 205
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Tyr Tyr Thr
210 215 220
Ala Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235
<210> 52
<211> 395
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mIL-15
<400> 52
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp
20 25 30
Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp
35 40 45
Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu
50 55 60
Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr
65 70 75 80
Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly
85 90 95
Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys
100 105 110
Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe
115 120 125
Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln Ile Thr
145 150 155 160
Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser
165 170 175
Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys
180 185 190
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala
195 200 205
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
210 215 220
Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu
245 250 255
Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala
260 265 270
Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr
275 280 285
Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser
290 295 300
Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln
305 310 315 320
Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val Ala Ile
325 330 335
Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu
340 345 350
Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu
355 360 365
Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg
370 375 380
Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu
385 390 395
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IMGT 2C6.9 CDR-H2-2
<400> 53
Ile Trp Gly Glu Gly Asn Thr
1 5
<210> 54
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物F
<400> 54
caggtgtcgt gattcgaatt cgccaccatg gccctgccc 39
<210> 55
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物R
<400> 55
tcgcggcgct ggcgtcgtgg tgctgctcac ggtcaccagg 40
<210> 56
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 56
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 57
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 57
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 58
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 58
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 59
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1E9.2 鼠源重链可变区
<400> 59
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Tyr Gly Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 60
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1E9.2 鼠源轻链可变区
<400> 60
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ser Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 61
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C6.9 鼠源重链可变区
<400> 61
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Arg Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Phe His Ser Phe Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Asn Phe Gly Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C6.9鼠源轻链可变区
<400> 62
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Glu Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Phe Ile Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 63
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-1抗体重链可变区
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ile Arg Leu Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 64
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-1抗体轻链可变区
<400> 64
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Pro Ser Gly Asn Val His Asn Tyr
20 25 30
Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Tyr Tyr Thr Ala Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 65
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1E9.2-HZ11-scfv氨基酸2
<400> 65
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ser Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
145 150 155 160
Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Ser Ala Met Ser Trp Val Arg
165 170 175
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly
180 185 190
Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
195 200 205
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
210 215 220
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Tyr Gly
225 230 235 240
Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250 255
<210> 66
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C6.9-HZ21-scfv 氨基酸2
<400> 66
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Phe Ile Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
130 135 140
Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys
145 150 155 160
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Arg Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
165 170 175
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Glu
180 185 190
Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser
195 200 205
Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
210 215 220
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Asn Phe Gly Asn
225 230 235 240
Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250 255
<210> 67
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-L1抗体 重链可变区 氨基酸
<400> 67
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 68
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-L1抗体 轻链可变区 氨基酸
<400> 68
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 69
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A核苷酸序列1
<400> 69
cgggccaaga gaggatctgg agccacaaat tttagcctgc tgaaacaggc cggagatgtg 60
gaggaaaacc ctggccct 78
<210> 70
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A核苷酸序列2
<400> 70
cgagctaaac gaggctcagg cgcgacgaac tttagtttgc tgaagcaagc tggggatgta 60
gaggaaaatc cgggtccc 78
<210> 71
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽-2核苷酸
<400> 71
atgtatagga tgcagctgct gagctgtatt gccctgagcc ttgcactggt gaccaatagc 60
<210> 72
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-1 scFv核苷酸
<400> 72
gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ctggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactactaca tgaactgggt gcgagaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatgggcgag atcaatccca agtacggcga taccacctac 180
aatcagaagt tcaaggaccg ggccaccctg accgtggata agtctacatc tacagcctat 240
atggagctga gcagcctgag atccgatgat accgcagtgt attattgtgc caaaggaatt 300
agactgtttg actcttgggg ccagggaacc ctagtgaccg taagcagcgg aggaggaggc 360
agcggaggag gcggatctgg cggcggcggc tccgacatcc agctgaccca gagccccagc 420
agcctgagcg ccagcgtggg cgacagggtg accatcacct gccggccctc cggcaacgtg 480
cacaattact tcgcctggta ccagcagaag cccggcaaga gccctaagct gctggtgtat 540
aatgccaaga cactggctga aggcgtgcct agtaggttta gcggcagcgg aagcggcact 600
gattatacac tgacaatttc tagcctgcag cctgaggatt ttgctacata ttattgtcat 660
cattactata cagccccttt tacatttgga ggcggaacaa aggtggagat taagtga 717
<210> 73
<211> 1188
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mIL-15核苷酸
<400> 73
atggattgga cttggatttt gttcctcgtt gccgcagcga ctcgcgtcca tagtaactgg 60
gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt gaagatctta ttcaatctat gcatattgat 120
gctactttat atacggaaag tgatgttcac cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc 180
tttctcttgg agttacaagt tatttcactt gagtccggag atgcaagtat tcatgataca 240
gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa 300
tctggatgca aagaatgtga ggaactggag gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt 360
tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac acttcttccg ggggcggcag tggaggtggc 420
ggtagcggcg ggggtggctc tggtggaggc ggctctgggg gcggaagtct gcagatcacg 480
tgccctcccc ccatgtccgt ggaacacgca gacatctggg tcaagagcta cagcttgtac 540
tccagggagc ggtacatttg taactctggt ttcaagcgta aagccggcac gtccagcctg 600
acggagtgcg tgttgaacaa ggccacgaat gtcgcccact ggacaacccc cagtctcaaa 660
tgcattagag accctgccct ggttcaccaa aggccagcgc caccctccac agtaacgacg 720
gcaggggtga ccccacagcc agagagcctc tccccttctg gaaaagagcc cgcagcttca 780
tctcccagct caaacaacac agcggccaca acagcagcta ttgtcccggg ctcccagctg 840
atgccttcaa aatcaccttc cacaggaacc acagagataa gcagtcatga gtcctcccac 900
ggcaccccct ctcagacaac agccaagaac tgggaactca cagcatccgc ctcccaccag 960
ccgccaggtg tgtatccaca gggccacagc gacaccactg tggctatctc cacgtccact 1020
gtcctgctgt gtgggctgag cgctgtgtct ctcctggcat gctacctcaa gtcaaggcaa 1080
actcccccgc tggccagcgt tgaaatggaa gccatggagg ctctgccggt gacttggggg 1140
accagcagca gagatgaaga cttggaaaac tgctctcacc acctatga 1188

Claims (25)

1.特异性结合CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域以及胞内信号传导结构域，其中所述胞外抗原结合结构域包含能够特异性结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)下述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中CDRs按IMGT编号***定义：
(1a)包含如下3个CDRs的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：1或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO：2或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO：3或其变体的CDR-H3；和/或，
包含如下3个CDRs的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：4或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO：5或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO：6或其变体的CDR-L3；
或
(1b)包含如下3个CDRs的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：7或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO：8或53或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO：9或其变体的CDR-H3；和/或，
包含如下3个CDRs的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：10或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO：11或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO：12或其变体的CDR-L3；
或者，
(2)下述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中CDRs按AbM编号***定义：
(2a)包含如下3个CDRs的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：15或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO：20或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO：21或其变体的CDR-H3；和/或，
包含如下3个CDRs的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：26或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO：27或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO：30或其变体的CDR-L3；
或
(2b)包含如下3个CDRs的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：31或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO：32或37或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO：33或其变体的CDR-H3；和/或，
包含如下3个CDRs的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：34或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO：35或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO：36或其变体的CDR-L3；
其中，(1a)、(1b)、(2a)、(2b)任一项中所述的变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段特异地结合人CLDN18.2；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段还包括来自人的免疫球蛋白的构架区(FRs)。
2.权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)SEQ ID NO：13所示的VH或其变体，和/或，SEQ ID NO：14所示的VL或其变体；或
(b)SEQ ID NO：16所示的VH或其变体，和/或，SEQ ID NO：17所示的VL或其变体；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
3.权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗体或其抗原结合片段选自骆驼Ig、IgNAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、单链抗体(例如scFv、di-scFv或(scFv)2)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)；优选地，所述抗体或其抗原结合片段是单链抗体，例如scFv、di-scFv或(scFv)2。
4.权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述胞外抗原结合结构域为单链抗体，所述单链抗体包含：
(1)具有如SEQ ID NO:13所示的序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:14所示的序列或其变体的VL；或
(2)具有如SEQ ID NO:16所示的序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:17所示的序列或其变体的VL；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换；
优选的，所述单链抗体为scFv、di-scFv或(scFv)2；
优选地，所述VH和VL通过连接子连接；优选地，所述连接子包含如(GmS)n所示的序列，其中m选自1-6的整数；优选地，m为3、4、或5；优选地，n选自1-10的整数；优选地，n为2、3、4、5、或6；更优选地，所述连接子具有SEQ ID NO：44的序列；
优选地，所述单链抗体包含选自下列的氨基酸序列：(1)SEQ ID NOs:19、23、65、66任一项所示的氨基酸序列；(2)与SEQ ID NOs:19、23、65、66任一项所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列；或(3)与SEQ ID NOs:19、23、65、66任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
5.权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述跨膜结构域是选自下列蛋白的跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD137、CD152、CD154和PD-1；
优选地，所述跨膜结构域是选自下列蛋白的跨膜区：CD8α、CD4、PD-1、CD152和CD154；
优选地，所述跨膜结构域包含序列如SEQ ID NO：46所示的CD8α的跨膜区。
6.权利要求1-5任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述间隔结构域位于胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间，所述间隔结构域选自铰链结构域和/或免疫球蛋白(例如IgG1或IgG4)的CH2和CH3区；
优选地，所述铰链结构域包含CD8α、PD-1、CD152或CD154的铰链区；更优选地，所述铰链结构域包含序列如SEQ ID NO：45所示的CD8α的铰链区。
7.权利要求1-6任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体进一步在其N端包含信号肽；
优选地，所述信号肽包含重链信号肽(例如IgG1的重链信号肽)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体2(GM-CSFR2)信号肽，或CD8α信号肽；更优选地，所述信号肽选自序列如SEQID NO：42所示的CD8α信号肽。
8.权利要求1-7任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域；
优选地，所述胞内信号传导结构域从N端到C端依次包含共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域；
优选地，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域以及至少一个共刺激信号传导结构域；
优选地，所述初级信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)；
优选地，所述初级信号传导结构域包含选自以下蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b或CD66d；更优选地，所述初级信号传导结构域包含序列如SEQ ID NO：48所示的CD3ζ的胞内信号传导结构域；
优选地，所述共刺激信号传导结构域包含选自下列蛋白的胞内信号传导结构域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD270(HVEM)、CD278(ICOS)或DAP10；
优选地，所述共刺激信号传导结构域选自CD28的胞内信号传导结构域或CD137(4-1BB)的胞内信号传导结构域或二者片段的组合，其中所述CD137(4-1BB)的胞内信号传导结构域序列如SEQ ID NO：47所示；
更优选地，所述胞内信号传导结构域序列如SEQ ID NO：49所示。
9.权利要求1-8任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体从其N端至C端依次包含所述信号肽、胞外抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域；
优选地，所述信号肽包含IgG1的重链信号肽或CD8α信号肽(例如，如SEQ ID NO：42所示序列的信号肽)；
优选地，所述间隔结构域包含CD8(例如CD8α)的铰链区(例如，如SEQ ID NO：45所示序列的铰链区)；
优选地，所述跨膜结构域包含CD8(例如CD8α)的跨膜区(例如，如SEQ ID NO：46所示序列的跨膜区)；
优选地，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域，其中所述初级信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导结构域(例如，如SEQ ID NO：48所示序列)，所述共刺激信号传导结构域包含CD137的胞内信号传导结构域(例如，如SEQ IDNO：47所示序列)；更优选地，所述嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域具有SEQ ID NO：49所示序列；
优选地，所述嵌合抗原受体具有选自下列的氨基酸序列：(1)SEQ ID NOs:25、29任一项所示的氨基酸序列；(2)与SEQ ID NOs:25、29任一项所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；或者，(3)与SEQ ID NOs:25、29任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
10.分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-9任一项所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列；
优选地，所述分离的核酸分子的序列选自：(1)SEQ ID NOs:24、28任一项所示的序列或其简并变体；(2)与(1)中任一项所示序列相比基本上相同的序列(例如，与(1)中任一项所示的序列相比具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的序列，或，与(1)中任一项所示的序列相比具有一个或更多个核苷酸取代的序列)。
11.核酸构建体，其包含所述编码权利要求1-9任一项所述的嵌合抗原受体的第一核苷酸序列，并且进一步包含编码另外的生物活性分子的第二核苷酸序列；
优选地，所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过编码自裂解肽(例如P2A，E2A，F2A或T2A)的核苷酸序列连接；优选地，所述自裂解肽是P2A(例如，如SEQ ID NO：50所示的序列的P2A)；
优选地，所述第一核苷酸序列选自：(1)SEQ ID NOs:24、28任一项所示的序列或其简并变体；(2)与(1)中任一项所示的序列相比基本上相同的序列(例如，与(1)中任一项所示的序列相比具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的序列，或，与(1)中任一项所示的序列相比具有一个或更多个核苷酸取代的序列)；
优选地，所述另外的生物活性分子选自下列组分的一种或一种以上：免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1、PD-L1、CTLA-4、或LAG-3抗体或其抗原结合片段)、细胞因子(例如，IL-15、IL-7、IL-12、IL-18、或IL-21)、或膜嵌合型多肽(例如，mIL-15、mIL-7、mIL-12、mIL-18、或mIL-21)；
优选地，所述另外的生物活性分子在其N端进一步包含信号肽-2；优选地，所述信号肽-2不同于嵌合抗原受体中所包含的信号肽；优选地，所述另外的生物活性分子N端的信号肽-2是IL2信号肽(例如，如SEQ ID NO：43所示的序列的IL2信号肽)。
12.权利要求11所述的核酸构建体，其中，所述另外的生物活性分子选自的免疫检查点抑制剂为抗PD-1或PD-L1抗体或其抗原结合片段(例如scFv)；
优选地，所述抗PD-1或PD-L1抗体或其抗原结合片段包含如下任一组的重链可变区和/或轻链可变区：(1)Nivolumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(2)Pembrolizumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(3)Atezolizumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(4)Durvalumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(5)Avelumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(6)具有SEQ ID NO:67所示序列或其变体的VH和/或具有SEQ ID NO:68所示序列或其变体的VL，(7)具有SEQ ID NO:63所示序列或其变体的VH和/或具有SEQ ID NO:64所示序列或其变体的VL；
优选地，所述抗PD-1或PD-L1抗体或其抗原结合片段为单链抗体；
优选地，所述单链抗体包含选自下列的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；(2)与SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列；(3)与SEQ ID NO:51所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换；
优选地，所述核酸构建体包含选自下列的核苷酸序列：(1)SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列或其简并变体；(2)与(1)中所述的序列相比基本上相同的序列，例如与(1)中所述的序列相比具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的序列。
13.权利要求11所述的核酸构建体，其中，所述另外的生物活性分子选自的膜嵌合型多肽为mIL-15；
优选地，所述膜嵌合型多肽mIL-15序列包含选自下列的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO：52所示的序列；(2)与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列；(3)与SEQ ID NO:52所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换；
优选地，所述核酸构建体包含选自下列的核苷酸序列：(1)SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列或其简并变体；(2)与(1)所述的序列相比基本相同的序列，例如与(1)所述的序列相比具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的序列。
14.载体，其包含权利要求10所述的分离的核酸分子，或权利要求11-13任一项所述的核酸构建体；
可选地，所述载体选自DNA载体，RNA载体，质粒，转座子载体，CRISPR/Cas9载体，或病毒载体；
优选地，所述载体是病毒载体；更优选地，所述病毒载体是慢病毒载体，腺病毒载体或逆转录病毒载体。
15.经改造的免疫细胞，其表达权利要求1-9任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)；
可选地，所述免疫细胞进一步还表达另外的生物活性分子，所述另外的生物活性分子选自以下组分的一种或一种以上：特异性地结合免疫检查点的抗体或其抗原结合片段(例如，抗PD-1、PD-L1、CTLA-4、或LAG-3抗体或其抗原结合片段)、细胞因子(例如，IL-15、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21)、或膜嵌合型多肽(例如，mIL-15、mIL-7、mIL-12、mIL-18、mIL-21)；
优选地，所述膜嵌合型多肽为mIL-15；优选地，所述膜嵌合型多肽mIL-15序列如SEQ IDNO：52所示。
16.权利要求15的经改造的免疫细胞，其表达权利要求1-9任一项所述的嵌合抗原受体和抗PD-1或PD-L1抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述抗PD-1或PD-L1抗体或其抗原结合片段包含如下一组的重链可变区和/或轻链可变区：
(1)Nivolumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区；
(2)Pembrolizumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区；
(3)Atezolizumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区；
(4)Durvalumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区；
(5)Avelumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区；
(6)具有SEQ ID NO:67所示序列或其变体的VH和/或具有SEQ ID NO:68所示序列或其变体的VL；或，
(7)具有SEQ ID NO:63所示序列或其变体的VH和/或具有SEQ ID NO:64所示序列或其变体的VL；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
17.权利要求15或16的经改造的免疫细胞，所述抗PD-1或PD-L1抗体或其抗原结合片段为单链抗体；
优选的，所述单链抗体为scFv、di-scFv或(scFv)2；
优选地，所述VH和VL通过连接子连接；优选地，所述连接子包含如(GmS)n所示的序列，其中m选自1-6的整数；优选地，m为3、4、或5；优选地，n选自1-10的整数；优选地，n为2、3、4、5、或6；优选地，所述连接子具有SEQ ID NO：44的序列；
优选地，所述单链抗体包含选自下列的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；(2)与SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列；(3)与SEQ ID NO:51所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
18.权利要求15-17任一项所述的免疫细胞，其中，所述免疫细胞包含权利要求10所述的分离的核酸分子，或权利要求11-13任一项所述的核酸构建体或权利要求14所述的载体。
19.权利要求15-18任一项所述的免疫细胞，其还具备以下特征中的一项或多项：
(i)所述免疫细胞还具有CLDN18.2靶点以外的结合特异性；优选地，所述免疫细胞还具有针对选自下列的靶点的结合特异性：CD19、CD20、CD22、CD33、CD123、或CD138；
(ii)所述免疫细胞还包括一个或多个内源基因的敲除，其中所述内源基因选自：编码TCRα、TCRβ、CD52、糖皮质激素受体(GR)、脱氧胞苷激酶(dCK)、或免疫检查点蛋白(例如PD-1)的基因。
20.权利要求15-19任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞来源于T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合；优选地，所述免疫细胞得自患者；可选地，所述免疫细胞得自健康供体。
21.制备权利要求15-20任一项所述的免疫细胞的方法，其包括：(1)提供来自患者或者健康供体的免疫细胞；(2)获得能够表达CLDN18.2特异性结合嵌合抗原受体的免疫细胞或共表达CLDN18.2特异性结合的嵌合抗原受体和生物活性分子的免疫细胞；其中步骤(2)包括将权利要求10所述的分离的核酸分子或权利要求11-13任一项所述的核酸构建体或权利要求14所述的载体引入步骤(1)所述的免疫细胞。
22.免疫细胞组合物，包括权利要求15-20任一项所述的经改造的免疫细胞；可选地，所述组合物还包括未改造和/或未成功改造的免疫细胞；优选地，所述经改造的免疫细胞数占所述免疫细胞组合物细胞总数的10％-100％，更优选40％-80％。
23.试剂盒，其包括权利要求10所述的分离的核酸分子，权利要求11-13任一项所述的核酸构建体，或权利要求14所述的载体；
可选地，所述试剂盒用于制备权利要求1-9任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)或权利要求15-20任一项所述的免疫细胞。
24.药物组合物，其含有权利要求10所述的分离的核酸分子，权利要求11-13任一项所述的核酸构建体，或权利要求14所述的载体，或权利要求15-20任一项所述的免疫细胞，或权利要求22所述的免疫细胞组合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；
优选地，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，例如具有抗肿瘤活性的药物；
优选地，所述另外的药学活性剂是干扰素、白细胞介素-2或化疗药物；
优选地，所述另外的药学活性剂选自：表柔比星、奥沙利铂、卡培他滨、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇中的一种或多种。
25.权利要求10所述的分离的核酸分子，或权利要求11-13任一项所述的核酸构建体，或权利要求14所述的载体，或权利要求15-20任一项所述的免疫细胞，或权利要求22所述的免疫细胞组合物，或权利要求24所述的药物组合物，在制备用于在受试者中预防和/或治疗和/或辅助***、和/或延迟肿瘤进展、和/或降低或抑制肿瘤复发的药物中的用途；
优选地，所述肿瘤选自实体肿瘤、血液肿瘤和癌症的转移性、难治性或复发性病灶；
优选的，所述肿瘤或癌症选自食管癌、胃肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、结直肠癌、肾癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌、胃腺癌、胃食管交界处(GEJ)腺癌、头颈癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、***、卵巢癌、***癌、睾丸癌、生殖细胞癌、骨癌、皮肤癌、胸腺癌、胆管癌、胆囊癌、黑素瘤、间皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、肉瘤、神经胶质母细胞瘤、白血病；
优选地，所述肿瘤选自胃癌、胃腺癌、胃食管交界处(GEJ)腺癌、食管癌、胃肠癌、胰腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)；
优选地，所述肿瘤选自为胃癌、胃腺癌或胃食管交界处(GEJ)腺癌，例如局部晚期不可切除或转移的胃癌、胃腺癌或胃食管交界处(GEJ)腺癌；
优选地，所述肿瘤为CLDN18.2阳性，更优选地，所述肿瘤为HER2阴性；
优选地，所述受试者是人。
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