CN113748128B - 分离缺少能够结合至蛋白A的Fc区域的抗体或抗体片段的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开分离抗体或抗体片段的方法，其包含以下步骤：a）提供包含具有VH3区域且缺少能够结合至蛋白A的Fc区域的抗体或抗体片段的进料；b）将进料与具有共价偶联配体的分离树脂接触，其中配体包含如SEQ ID NO 1所定义的多肽且其中抗体或抗体片段结合至分离树脂；c）可选地用清洗液清洗分离树脂；d）用洗脱液从分离树脂中洗脱该抗体或抗体片段并回收该抗体或抗体片段。

Description

分离缺少能够结合至蛋白A的Fc区域的抗体或抗体片段的 方法
发明的技术领域
本发明涉及免疫球蛋白的分离，以及更具体地涉及用于分离具有VH3区域且缺少能够结合至蛋白A的Fc区域的抗体或抗体片段的方法。
发明背景
蛋白A亲和色谱广泛地使用于免疫球蛋白（如治疗抗体）的分离。蛋白A配体选择性结合至免疫球蛋白的Fc区域并且因此允许高效的捕获步骤。对于缺乏Fc区域的抗体构建体（如抗体片段）或对于具有不结合至蛋白A的Fc区域变体的免疫球蛋白（如IgG3或IgM），天然的蛋白A仍可为有用的，因为它也结合至免疫球蛋白的VH3区域。然而，天然的蛋白A在生物工艺中使用的碱清洁条件下并不稳定，且碱稳定的蛋白A变体通常具有抑制VH3相互作用的突变，例如参见US20060194950，在此通过引用以其整体并入。此文献讨论了商业产品MabSelectTM SuRe中使用的蛋白A Fc结合B结构域中的G29A突变对VH3相互作用的抑制。能够结合缺乏Fc区域的抗体/片段的替代的配体包括蛋白L、蛋白G和骆驼科动物抗体。然而它们都对碱清洁条件高度敏感。
因此，存在对使用可经受碱清洁的分离树脂对不具有能够结合至蛋白A的Fc区域的抗体或抗体片段进行亲和色谱分离的方法的需要。
发明概述
本发明的一个方面是提供分离抗体或抗体片段的方法。这通过包含以下步骤的方法实现：
a）提供包含具有VH3区域且缺少能够结合至蛋白A的Fc区域的抗体或抗体片段的进料；
b）将进料与具有共价偶联至载体的配体的分离树脂接触，其中配体包含如SEQ IDNO 1所定义的多肽
AQX1AFYEILX2LPNLTEEQRX3AFIQSLKDDPSVSKAILAEAKKLNX4AQ SEQ ID NO 1
其中：
X1 = E、K、Y、T、F、L、W、I、M、V、A、H或R，
X2 = H或K，
X3 = N或A，以及
X4 = D、F、Y、W、K或R
且其中抗体或抗体片段结合至分离树脂；
c）可选地用清洗液清洗分离树脂；以及
d）用洗脱液从分离树脂中洗脱该抗体或抗体片段并回收该抗体或抗体片段。
一个优点是该方法允许抗体/缺少能够结合至蛋白A的Fc区域的抗体的分离。进一步的优点是配体和树脂是碱稳定的，且可经受用高达2 M NaOH的重复循环清洁。
本发明进一步适合的实施方案在从属权利要求中描述。
附图
图1显示了a）典型的IgG抗体和b）Fab片段的结构。
图2显示了10 mg VHH-EgA1在a）MabSelect Xtra；b）MabSelect SuRe；c）原型1上的色谱图。
图3显示了30 mg/mL VHH在原型1上的色谱图。
定义
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用，并被理解为也包括抗体片段、包含抗体或抗体片段的融合蛋白以及包含抗体或抗体片段的缀合物。
术语“Fc结合多肽”和“Fc结合蛋白”意思分别为能够结合至抗体可结晶部分（Fc）的多肽和蛋白，并且包括例如蛋白A和蛋白G或保持所述结合特性的其任意片段或融合蛋白。
本文中，术语“缺少能够结合至蛋白A的Fc区域的抗体或抗体片段”意思为缺乏Fc区域的抗体或抗体片段或具有不结合至蛋白A的Fc区域的抗体/抗体片段。缺乏Fc区域的抗体/抗体片段的实例包括Fab片段、单链可变片段（scFv）、结构域抗体、纳米抗体和双特异性T细胞接合器（BiTe，bi-specific T-cell engager）。具有不结合至蛋白A的Fc区域的抗体的实例包括IgG3抗体、IgM抗体、骆驼科动物VHH单结构域抗体和具有以使其不结合至蛋白A的方式进行改造的Fc区域的任意抗体。对特定的抗体/片段是否具有能够结合至蛋白A的Fc区域的实际测试是在上样缓冲液（20 mM磷酸盐，500 mM NaCl，pH 7）中将其上样于用非VH3结合蛋白A树脂MabSelectTM SuRe（GE Healthcare）填装的柱上，先用上样缓冲液然后用清洗缓冲液（50 mM柠檬酸盐pH6）清洗该柱，以及用洗脱缓冲液（50 mM柠檬酸盐pH 2.5）洗脱该柱。若抗体/片段不具有能够结合至蛋白A的Fc区域，将主要在上样流经物和/或清洗缓冲液中发现它。若它具有此类Fc区域，将主要在洗脱液中发现它。
在本文中，术语“接头”意思为在多聚体中使两个多肽单元、单体或结构域彼此连结的元件。
本文中，术语“间隔物”意思为将多肽或多肽多聚体连接至载体的元件。
关于氨基酸序列的比较的术语“%同一性”通过诸如在Altshul等人(1990) J.Mol. Biol., 215: 403-410中描述的基本局部比对工具（BLASTTM）等标准比对算法确定。用于此的基于网络的软件可在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiPROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome从美国国家医学图书馆免费获得。在此，算法“blastp（蛋白-蛋白BLAST）”被使用于比对查询序列与主题序列以及确定i.a. %同一性。
本文中，术语“天然的蛋白A”意思为包含五个直接彼此连结的天然的免疫球蛋白结合结构域E、D、A、B、C的多肽，如SEQ ID NO. 31中所定义的。该多肽可进一步包含在N末端的前导序列以及在C末端或N末端的偶联元件。
如本文中所使用的，术语“包含（comprises）”、“包含（comprising）”、“含有（containing）”、“具有（having）”等可具有在美国专利法中归属于其的含义，并且可意为“包括（includes）”、“包括（including）”等；类似地，“基本上由……组成（consistingessentially of）”或“基本上由……组成（consists essentially）”具有在美国专利法中所归属的含义，并且该术语是开放式的（只要所阐述内容的基本或新颖特征不被比所阐述内容更多的内容的存在所改变，则允许比所阐述内容更多的内容的存在），但不包括现有技术的实施方案。
实施方案详述
在一个方面，本发明公开用于分离不具有能够结合至葡萄球菌（Staphylococcus）蛋白A的Fc区域的抗体或抗体片段的方法。该方法包含以下步骤：
a）提供包含具有VH3区域且缺少能够结合至蛋白A的Fc区域的抗体或抗体片段的进料，如澄清的细胞培养上清液。具体而言，待分离的进料中的目标物类可为具有VH3区域且没有Fc区域的抗体片段。它们可例如选自Fab、scFv、结构域抗体、纳米抗体和BiTe。待分离的进料中的目标物类也可为具有VH3区域和不结合至蛋白A的Fc区域的抗体。它们可例如选自IgG3、IgM和骆驼科动物VHH单结构域抗体。总的来说，抗体或抗体片段可能够通过VH3区域结合至天然的蛋白A。对非Fc抗体/片段，可通过检查它们是否与MabSelectTM或MabSelect Xtra树脂（GE Healthcare）结合容易地对此进行测试，所述树脂包含根据上述定义的共价偶联的天然的蛋白A配体。
b）将进料与具有共价偶联至载体的配体的分离树脂接触，其中配体包含如SEQ IDNO 1所定义的或与SEQ ID NO 1具有至少85%（例如至少90%或至少95%）同一性的多肽
AQX1AFYEILX2LPNLTEEQRX3AFIQSLKDDPSVSKAILAEAKKLNX4AQ SEQ ID NO 1
其中：
X1 = E、K、Y、T、F、L、W、I、M、V、A、H或R，
X2 = H或K，
X3 = N或A，以及
X4 = D、F、Y、W、K或R
且其中抗体或抗体片段结合至分离树脂。抗体或抗体片段与分离树脂的结合强度可在纳摩尔范围内或更强。
c）可选地用清洗液清洗分离树脂，以去除污染物和/或杂质。清洗液可为例如pH5-7的缓冲液。
d）用洗脱液从分离树脂中洗脱该抗体或抗体片段并回收该抗体或抗体片段。洗脱液可适当地为pH 2-5的缓冲液。
在步骤d）之后，该方法可进一步包含用pH 13或更高的清洁液清洁所述分离树脂的步骤e）。清洁液可包含0.1-2 M（如0.5-2 M）的碱金属氢氧化物（如NaOH）。
在一些实施方案中，步骤a）-e）被重复至少50次，如至少200次。
在特定实施方案中，X1 = E，X2 = H，X3 = N和/或X4 = D。此类实施方案的实例包括：
SEQ ID NO 2
AQEAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSVSKAILAEAKKLNDAQ；
SEQ ID NO 3
AQKAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSVSKAILAEAKKLNDAQ；
SEQ ID NO 4
AQEAFYEILKLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSVSKAILAEAKKLNDAQ；
SEQ ID NO 5
AQEAFYEILHLPNLTEEQRAAFIQSLKDDPSVSKAILAEAKKLNDAQ；
以及SEQ ID NO 6
AQEAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSVSKAILAEAKKLNWAQ。
在一些实施方案中，配体包含多肽P的多聚体。此类多聚体可适当地通过包含0-25个氨基酸残基（如0-15个氨基酸残基）的接头区域L连结，且可例如具有(P - L)n-1 - P或L-(P - L)n-1 - P的结构。多聚体可为例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体。它可为同多聚体，其中多聚体中所有单元是相同的，或它可为异多聚体，其中至少一个单元与其他的不同。有利的是，多聚体中所有单元都是碱稳定的，例如通过包含上文所公开的突变。多肽可通过多肽C末端和N末端之间的肽键直接地彼此连结。或者，多聚体中两个或更多个单元可通过包含低聚或聚合物类的接头而连结，所述接头为例如包含具有多至25或30个氨基酸残基（例如3-25、3-20或3-15个氨基酸残基）的肽的接头。接头可例如包含肽序列或基本由肽序列组成，所述肽序列由氨基酸序列所定义或与该氨基酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%同一性，所述氨基酸序列选自APKVDAKFDKE、APKVDNKFNKE、APKADNKFNKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APK、APKYEDGVDAKFDKE和YEDG，或替代地选自APKADNKFNKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APKYEDGVDAKFDKE和YEDG。它们也可基本由氨基酸序列所定义的或与该氨基酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%同一性的肽序列组成，所述氨基酸序列选自APKADNKFNKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APK和APKYEDGVDAKFDKE。
此类接头的性质应当优选不破坏蛋白单元的空间构象稳定性。这可例如通过防止在接头中存在脯氨酸而实现。此外，接头优选应当在碱性环境中也足够稳定，以免削弱突变蛋白单元的特性。为此目的，若接头不含天冬酰胺则是有利的。若接头不含谷氨酰胺则可额外地为有利的。多聚体可进一步在N末端包含多个氨基酸残基，其例如起源于克隆过程或构成来自被裂解的信号序列的残基。额外的氨基酸残基的数目可为例如20个或更少，如15个或更少，如10个或更少或者5个或更少。作为具体的实例，多聚体可在N末端包含AQ、AQGT、VDAKFDKE、AQVDAKFDKE或AQGTVDAKFDKE序列（也叫做前导序列）。多聚体可例如包含SEQ IDNO 7所定义的或与SEQ ID NO 7具有至少80%、至少90%或至少95%同一性的序列或基本由其组成。
SEQ ID NO 7
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKVDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQEAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLPNLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAFIQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSVSKAILAEAKK LNDAQAPKC
在一些实施方案中，如上文所公开的，多肽和/或多聚体在C末端或N末端进一步包含一个或多个偶联元件，其选自一个或多个半胱氨酸残基、多个赖氨酸残基和多个组氨酸残基。偶联元件也可位于C末端或N末端的1-5个氨基酸残基内，如在1-3或1-2个氨基酸残基内。偶联元件可例如为在C末端的单个半胱氨酸。偶联元件可直接地连结至C或N末端，或它/它们可通过包含多达15个氨基酸（如1-5、1-10或5-10个氨基酸）的一段序列而连结。此一段序列优选应当在碱性环境中也足够稳定，以免削弱突变蛋白的特性。为此目的，若该一段序列不含天冬酰胺则是有利的。若该一段序列不含谷氨酰胺则可额外地为有利的。具有C端半胱氨酸的优点是蛋白的端点偶联可通过半胱氨酸的巯基与载体上的亲电子基团的反应实现。这提供了偶联蛋白优秀的移动性，其对结合能力是重要的。
多肽或多聚体可通过使用例如存在于配体中的巯基（在半胱氨酸中）、氨基（在赖氨酸或N端中）和/或羧基（在天冬氨酸或谷氨酸或C端中）基团的常规偶联技术附着至载体。双环氧化合物、表氯醇、CNBr、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）等是周知的偶联试剂。在载体和多肽/多聚体之间，可引入被称为间隔物的分子，这改善了多肽/多聚体的可用性并促进了多肽/多聚体与载体的化学偶联。取决于多肽/多聚体的性质和偶联条件，偶联可为多点偶联（如通过多个赖氨酸）或单点偶联（如通过单个半胱氨酸）。
在某些实施方案中，多肽或多聚体通过硫醚键偶联至载体。用于实施此类偶联的方法在此领域中众所周知，且此领域技术人员可使用标准技术和设备容易地实施所述方法。硫醚键是柔性且稳定的，并且普遍适合在亲和色谱法中使用。具体而言，当硫醚键通过在多肽或多聚体上的末端或靠近末端的半胱氨酸残基获得时，偶联的多肽/多聚体的移动性被增强，这提供了改善的结合能力和结合动力学。在一些实施方案中，多肽/多聚体通过上文所述的蛋白上提供的C端半胱氨酸偶联。这允许了半胱氨酸巯基与载体上的亲电子基团（如环氧基团、卤代醇基团等）的有效偶联，从而形成硫醚桥偶联。
在某些实施方案中，载体包含多羟基聚合体，如多糖。多糖的实例包括诸如葡聚糖、淀粉、纤维素、普鲁兰多糖、琼脂、琼脂糖等。多糖是固有亲水的，具有低程度的非特异性相互作用，它们提供高含量的反应性（可活化）羟基且它们通常对生物工艺中使用的碱性清洁溶液是稳定的。
在一些实施方案中，载体包含琼脂或琼脂糖。本发明中使用的载体可根据诸如反向悬浮凝胶化（S Hjertén: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964)）等标准方法容易地制备。或者，基础基质为市售产品，如以SEPHAROSE™ FF（GE Healthcare）名称销售的交联琼脂糖珠子。在对大规模分离特别有利的实施方案中，已使用在US6602990或US7396467（在此通过引用以它们的整体并入）中描述的方法调整载体以提高它们的刚度，且因此使基质更适合于高流速。
在某些实施方案中，载体（如聚合体、多糖或琼脂糖载体）是以例如羟烷基醚交联而交联的。产生此类交联的交联剂试剂可为例如表卤代醇（如表氯醇）、双环氧化合物（如丁二醇二缩水甘油醚）、烯丙基化试剂（如烯丙基卤化物或烯丙基缩水甘油醚）。交联对载体刚度是有益的，且改善化学稳定性。羟烷基醚交联是碱稳定的，且不引起显著的非特异性吸附。
在一些实施方案中，固体载体以过滤器（如膜或深度过滤器基质）的形式存在。具体而言，载体可包含一张或多张纤维素纳米纤维片或膜，例如如在US9802979、US20160288089和PCT/EP2019/050227中所描述的，所述专利在此通过引用以它们的整体并入。为了改善化学和机械稳定性，可适当地将纤维素纳米纤维交联。
实施例
实施例1 单重链可变结构域（VHH）的表达
来自骆驼科起源的单重链可变结构域（VHH）（又称为纳米抗体）在大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）中异源表达。VHH片段基于来自K R Schmitz等人；Structure21, 1214-1224, (2013) SEQ ID NO 23的序列：
>4KRN:A|PDBID|链|序列
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKQREFVAAIRWSGGYTYYTDSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATYLSSDYSRYALPQRPLDYDYWGQGTQVTVSSLEHHHHHH
通过使用OmpA信号肽（大肠杆菌，外膜蛋白A，UniProt P0A910）将此序列修饰用于外周胞质表达，且引入作为二肽AQ的信号肽裂解位点，其后接KpnI的酶限制位点（氨基酸VD）。在信号肽的处理后最终的蛋白具有SEQ ID NO 24中发现的序列：
AQVDQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKQREFVAAIRWSGGYTYYTDSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATYLSSDYSRYALPQRPLDYDYWGQGTQVTVSSLEHHHHHH
此序列由DNA合成公司ATUM（美国加利福尼亚州）使用来自大肠杆菌表达的有专利的密码子优化法产生，并被克隆至含有IPTG诱导型启动子的表达载体（质粒）中。质粒被转化至化学感受态大肠杆菌K12细胞中。将质粒溶解于25 mM Tris pH 8.5中达到20 ng/µl的浓度。在冰浴上将1 µl质粒添加至50 µl解冻的感受态细胞并保持低温20分钟。随后在42℃热激60秒，随后在冰浴上冷却2分钟。细胞在冰上冷却之后，添加950 µl Luria肉汤（LB），并将细胞在摇橱（shake-hood）中以225 rpm孵育60分钟。在孵育后，将细胞以每板100 µl铺板于Luria琼脂（LA）平板上，且将平板在设置为37℃的烘箱中孵育过夜。次日，挑选单个菌落并让其在LB中生长至最终的OD 600 nm为1，随后添加15%甘油并冷冻于-80℃中直至进一步使用时。将冷冻细胞库解冻，并使用100 µl用于接种100 mL补充50 mg/L卡那霉素的Terrific Broth（TB），并且在摇橱中37℃生长过夜。次日，使用10 mL过夜培养物接种补充50 mg/L卡那霉素的750 mL发酵培养基。当培养物达到在600 nm测量的光密度（OD）为80时，用终浓度1 mM的IPTG诱导培养物。在诱导后，将培养物在恒定温度和pH中在通气和搅动条件下保持12 h。在24 h后结束发酵，且通过2500 x g离心30分钟将细胞与上清液分离。倒掉上清液，将细胞重悬于600 mL PBS中并在48℃热孵育3 h，以释放外周胞质表达的蛋白。将热处理的悬浮液以10 000 x g离心30分钟，随后使用0.2 µm过滤器无菌过滤。将澄清的上清液上样到填装24 mL MabSelectTM 树脂（GE Healthcare，瑞典乌普萨拉）的HiScale 16柱（GE Healthcare，瑞典乌普萨拉）上，用20 mM磷酸盐pH 7，500 mM NaCl平衡。用50 mM柠檬酸盐pH 6清洗该柱以减少洗脱合并物中的电导率，随后用50 mM柠檬酸盐pH 2.5洗脱。纯化的VHH片段在11 mL合并物体积中具有7.7 g/L的浓度。通过添加2 M tris碱将洗脱合并物调整至pH 7。
实施例2 在不同色谱树脂上VHH抗体片段的VH3结合
根据US20180094024中所描述的方法，实施例1中产生的VHH片段被测试用于结合至不同色谱树脂，即MabSelectTM Xtra（GE Healthcare，瑞典乌普萨拉）、MabSelectTM SuRe（GE Healthcare，瑞典乌普萨拉）和原型1：与SEQ ID NO 7的六聚体配体偶联的中值珠子直径（d50，v）57 µm的高度交联琼脂糖珠子，所述专利在此通过引用以其整体并入。所有实验都使用ÄKTA Pure 150 FPLC***（GE Healthcare，瑞典乌普萨拉）实施。使用预填装的1 mLHiTrapTM柱（GE Healthcare，瑞典乌普萨拉）测试MabSelectTM Xtra和MabSelectTM SuRe。原型1被填装于具有1.94 mL柱体积（CV）的Tricorn 5柱（GE Healthcare，瑞典乌普萨拉）中。所有色谱运行均使用20 mM磷酸盐，500 mM NaCl，pH 7作为运行缓冲液实施，以及其次是由50 mM柠檬酸盐pH 6组成的缓冲液，以及50 mM柠檬酸盐pH 2.5作为洗脱缓冲液。为测试与不同树脂的结合，将10 mg实施例1中产生的VHH 片段溶解于7 mL运行缓冲液（20 mM磷酸盐pH 7，500 mM NaCl）中，并上样于1 mL MabselectTM Xtra、SuRe或原型1柱上。来自色谱运行的结果显示于图2a）-c）。VHH片段与MabSelectTM Xtra柱结合，具有73%的回收率，且与原型1结合，具有86%的回收率。然而，片段与MabSelectTM SuRe树脂结合非常弱，仅具有4%的回收率，且大部分蛋白是在上样或清洗步骤中发现的。此外，使用6分钟停留时间，通过上样直至达到10%穿透，测量原型1对VHH片段的动态结合能力。将Tricorn 5/100柱用原型1填装至1.98 mL CV。用作为运行缓冲液的20 mM磷酸盐，150 mM NaCl pH 7.4以及含50 mM醋酸盐pH 3.5的洗脱缓冲液B进行能力测量。在几次运行之间用0.5 M NaOH将柱再生。将VHH片段在50 mL运行缓冲液中稀释至2.3 mg/mL，并用Sterivex 0.22 μm过滤器过滤。终浓度通过在280 nm处的UV测量确定。在开始运行前，将柱以1 mL/分钟的流速平衡。通过在旁路中运行样品，测量样品的最大吸光度。样品的施用以0.33 mL/分钟的流速实施（6分钟停留时间），直至在280 nm处的吸光度达到吸光度最大值的10%。清洗步骤以1 mL/分钟的流速实施10 CV，随后用缓冲液B等度洗脱。用0.5 M NaOH以1 mL/分钟的流速在3 CV期间实施CIP。在所选择的出口收集大于100 mAU的峰。使用6分钟停留时间，在10%穿透（QB10）下，原型1树脂的动态结合能力为36 mg/mL。
图2 a）
柱：MabSelectTM Xtra
样品：10 mg VHH-EgA1（SEQ ID NO 25）
缓冲液：起始：20 mM磷酸盐，500 mM NaCl，pH 7
清洗2：50 mM柠檬酸盐pH 6
洗脱：50 mM柠檬酸盐pH 2.5
图2 b）
柱：MabSelectTM SuRe
样品：10 mg VHH-EgA1（SEQ ID NO 25）
缓冲液：起始：20 mM磷酸盐，500 mM NaCl，pH 7
清洗2：50 mM柠檬酸盐pH 6
洗脱：50 mM柠檬酸盐pH 2.5
图2 c）
柱：原型1
样品：10 mg VHH-EgA1（SEQ ID NO 25）
缓冲液：起始：20 mM磷酸盐，500 mM NaCl，pH 7
清洗2：50 mM柠檬酸盐pH 6
洗脱：50 mM柠檬酸盐pH 2.5
实施例3 Fab的VH3结合
通过使用木瓜蛋白酶裂解从全长单克隆抗体（mAb）中产生VH3型Fab。通过添加2 MTris碱将mAb溶液（54 ml，1836 mg）调整至pH 7.5，然后将其在消化缓冲液（25 mM磷酸钠，1mM EDTA，5 mM 巯基乙醇，pH 7.5）中1：1稀释。将木瓜蛋白酶晶体添加至该溶液（21 mg）。将该溶液在37℃孵育过夜。次日，将400 µl抗蛋白酶（木瓜蛋白酶抑制剂）添加至消化的mAb。将溶液施用至HiScale 26/135 Capto L柱（GE Healthcare，瑞典乌普萨拉）上以纯化裂解的Fab片段。将消化的合并物上样至用25 mM Tris pH 8平衡的Capto L柱上，随后是使用50mM柠檬酸钠pH 5.0的第二清洗以及用50 mM柠檬酸钠盐pH 2.3的洗脱。以使用SuperdexTM200 Increase（GE Healthcare，瑞典乌普萨拉）的SEC对Fab进行分析以验证mAb的完全裂解。使用6分钟停留时间，通过上样直至达到10%穿透，测量原型1对Fab的动态结合能力。用原型1填装Tricorn 5/100柱至1.98 mL CV。使用作为运行缓冲液的20 mM磷酸盐，150 mMNaCl pH 7.4以及含50 mM醋酸盐pH 3.5的洗脱缓冲液B进行能力测量。用0.5 M NaOH在几次运行之间将柱再生。将Fab在100 mL运行缓冲液中稀释至2.25 mg/mL，并用Sterivex0.22 μm过滤器过滤。终浓度通过在280 nm处的UV测量确定。在开始运行前，以1 mL/分钟的流速平衡该柱。通过在旁路中运行样品，测量样品最大吸光度。样品的施用以0.33 mL/分钟的流速实施（6分钟停留时间），直至在280 nm处的吸光度达到吸光度最大值的10%。清洗步骤以1 mL/分钟的流速实施10 CV，随后用缓冲液B等度洗脱。用0.5 M NaOH以1 mL/分钟的流速在3 CV期间实施CIP。在所选择的出口收集大于100 mAU的峰。以6分钟停留时间，在10%穿透（QB10）下，原型1树脂的动态结合能力为106 mg/mL。
实施例4 单重链可变结构域（VHH）片段序列中的点突变
为了测试蛋白A和单重链可变结构域（VHH）片段之间相互作用的稳固性，制造了一系列点突变，随后测试对MabSelectTM Xtra、SuRe和原型1保留的亲和性。VHH序列由DNA合成公司ATUM（美国加利福尼亚州）使用用于大肠杆菌表达的有专利的密码子优化法产生，并被克隆至含有IPTG诱导型启动子的表达载体（质粒）中。质粒被转化至化学感受态大肠杆菌K12细胞中。将质粒溶解于25 mM Tris pH 8.5中达到20 ng/µl的浓度。在冰浴上将1 µl质粒添加至50 µl解冻的感受态细胞并保持低温20分钟。然后，在42℃实施热激60s，随后在冰浴上冷却2分钟。细胞在冰上冷却后，添加950 µl Luria肉汤（LB），并将细胞在摇橱中以225rpm孵育60分钟。在孵育后，将细胞以每板100 µl铺板于Luria琼脂（LA）平板上，且将平板在设置为37℃的烘箱中孵育过夜。次日，挑选单个菌落并让其在LB中生长至最终的OD 600 nm为1，随后添加15%甘油并冷冻于-80℃中直至进一步使用时。将冷冻细胞库解冻，并使用500µl用于接种100 mL补充50 mg/L卡那霉素的Terrific Broth（TB）。培养在37℃生长直至OD600 nm达到1，随后用终浓度1 mM的IPTG诱导。在诱导后，该培养在37℃生长过夜，并在次日早上通过2300 x g离心20分钟停止。将沉淀重悬于25 mM Tris-HCl，500 mM NaCl pH 8.0中，然后进行声处理（40%振幅，2分钟，5秒开/3秒关），10000 x g离心10分钟并通过0.2 µm过滤器过滤。然后将样品施用至MabSelectTM Xtra、MabselectTM SuRe和原型1柱以验证结合。收集流经物级分直至洗脱峰被验证。若未获得峰，则使用25 mM Tris pH 8.0作为运行缓冲液和在5 CV梯度中用50 mM Tris，250 mM咪唑pH 8.0的洗脱，对流经物级分运行镍琼脂糖凝胶FF (Ni-Sepharose FF)柱（GE Healthcare，瑞典乌普萨拉）。
Y = 是，已验证的结合，N = 无已验证的结合。
VHH-EgA1（T57K），SEQ ID NO 25
AQVDQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKQREFVAAIRWSGGYKYYTDSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATYLSSDYSRYALPQRPLDYDYWGQGTQVTVSSLEHHHHHH
VHH-EgA1（T57K、K64R），SEQ ID NO 26
AQVDQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKQREFVAAIRWSGGYKYYTDSVRGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATYLSSDYSRYALPQRPLDYDYWGQGTQVTVSSLEHHHHHH
VHH-EgA1（T57P），SEQ ID NO 27
AQVDQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKQREFVAAIRWSGGYPYYTDSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATYLSSDYSRYALPQRPLDYDYWGQGTQVTVSSLEHHHHHH
VHH-EgA1（T57S），SEQ ID NO 28
AQVDQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKQREFVAAIRWSGGYSYYTDSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATYLSSDYSRYALPQRPLDYDYWGQGTQVTVSSLEHHHHHH
VHH-EgA1（T57R），SEQ ID NO 29
AQVDQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKQREFVAAIRWSGGYRYYTDSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATYLSSDYSRYALPQRPLDYDYWGQGTQVTVSSLEHHHHHH
VHH-EgA1（S70T），SEQ ID NO 30
AQVDQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKQREFVAAIRWSGGYTYYTDSVKGRFTITRDNAKTTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATYLSSDYSRYALPQRPLDYDYWGQGTQVTVSSLEHHHHHH
此书面说明书使用实例以公开本发明，包括最佳模式，并且也使任意本领域技术人员能实施本发明，包括制作并使用任意设备或***以及实施并入的任意方法。本发明的可专利范围由权利要求定义，且可包括本领域技术人员想到的其他实例。若此类其他实例具有与权利要求的字面语言并无差异的结构要素，或者若它们包括与权利要求的字面语言并无实质差异的等效的结构要素，则此类其他实例预期在权利要求的范围内。在正文中提及的所有专利和专利申请在此通过引用以它们的整体并入，如同单独并入一样。

Claims (18)

1.分离抗体或抗体片段的方法，其包含以下步骤：
a）提供包含具有VH3区域且缺少能够结合至蛋白A的Fc区域的抗体或抗体片段的进料；
b）将所述进料与具有共价偶联至载体的配体的分离树脂接触，其中所述配体包含如SEQ ID NO 2所定义的多肽，并且其中所述抗体或抗体片段结合至所述分离树脂；
c）可选地用清洗液清洗所述分离树脂；以及
d）用洗脱液从所述分离树脂中洗脱所述抗体或抗体片段并且回收所述抗体或抗体片段。
2.权利要求1的方法，其中所述配体包含通过包含0-15个氨基酸残基的接头区域连结的所述多肽的多聚体。
3.权利要求2的方法，其中所述多聚体为四聚体、五聚体或六聚体。
4.权利要求3的方法，其中所述配体包含如SEQ ID NO 7所定义的多聚体。
5.权利要求2-4中任一项的方法，其中所述多聚体通过来源于所述多聚体上的C端半胱氨酸的硫醚键偶联至所述载体。
6.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述载体包含交联的琼脂糖珠子。
7.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述载体包含交联的纤维素纳米纤维。
8.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述进料为澄清的细胞培养上清液。
9.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述抗体或抗体片段为具有VH3区域且缺少Fc区域的抗体片段。
10.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述抗体片段选自Fab、scFv、结构域抗体、纳米抗体和BiTe。
11.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述抗体片段与所述分离树脂的结合强度在纳摩尔范围内或更强。
12.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述抗体或抗体片段能够通过VH3区域结合至天然的蛋白A。
13.权利要求1-4中任一项的方法，其中该方法包含步骤c）且其中污染物和/或杂质在步骤c）中被去除。
14.权利要求13的方法，其中所述清洗液为pH 5-7的缓冲液。
15.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述洗脱液为pH 2-5的缓冲液。
16.权利要求1-4中任一项的方法，其进一步包含在步骤d）之后用pH 13或更高的清洁液清洁所述分离树脂的步骤e）。
17.权利要求16的方法，其中所述清洁液包含0.5-2 M碱金属氢氧化物。
18.权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤a）-e）被重复至少50次。
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