CN113747787A - 用于植物材料筛选和繁殖的方法、***和设备 - Google Patents

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Abstract

提供了用于繁殖植物材料的方法和***以及由此获得的植物细胞。所述方法包括：提供包括多种植物原生质体的溶液，所述溶液包括包封介质或包封介质前体；将所述溶液引入到微流体装置中；在所述微流体装置中形成所述溶液的液滴，所述液滴中的至少一些液滴包封单个原生质体；使所述包封介质或所述包封介质前体在所述微流体装置中凝胶化；以及收集经包封的原生质体。所述***包括：微流体装置，所述微流体装置包括液滴发生器；第一注射***，所述第一注射***包括第一液体并且被配置成将所述第一液体注射到所述液滴发生器中；以及第二注射***，所述第二注射***包括第二液体并且被配置成将与所述第一液体不可混溶的第二液体单独注射到所述液滴发生器中。所述第一液体是包括原生质体的溶液，并且所述第一液体包括包封介质或包封介质前体，并且所述***被配置成使得在所述液滴发生器中形成液滴，每个液滴包围单个原生质体或无原生质体并且包括所述包封介质或所述包封介质前体。所述液滴中的所述包封介质或所述包封介质前体在微流体中凝胶化，以产生包围单个原生质体或无原生质体的经凝胶化的液滴。

Description

用于植物材料筛选和繁殖的方法、***和设备
技术领域
本发明涉及植物工程领域。具体地，本发明涉及用于修饰、选择和繁殖植物材料的方法、***和设备。
背景技术
植物基因工程、选择和繁殖形成现代园艺和农业的基本部分。最近的研究已经证明，有可能将如Cas9等蛋白质复合物和其它试剂递送到植物原生质体中(参见例如，Woo等人,2015、Liang等人,2016或Malnoy等人,2016)，由此为植物工程中的新途径打开大门。然而，这目前受到难以筛选存在关注修饰的植物以及经修饰的原生质体的存活率低的阻碍。因此，整个基因编辑的植物的复原率很低。
微流体已被提议作为植物***快速表型的潜在方法(Yu等人,2017)。这种***依赖于使用微流体芯片来分离各个水性液滴中的单个原生质体，然后基于荧光信号对所述各个水性液滴进行分选。然而这种***中的细胞存活率很低，因此随后复原有活力的植物是高度低效的或甚至不可能的。这个问题在与基因工程和基因编辑过程组合时特别突出，所述基因工程和基因编辑过程本身对细胞存活具有影响并且可能具有低转化效率。事实上，在这种情况下，经转化的植物的有效选择和高复原特别重要。因此，使用这种技术修饰和选择植物目前效率太低以致无法进行商业应用。
WO2018/071448A1描述了产生和分析包括如单细胞或原生质体等生物样品的微胶囊的微流体***和方法。包括生物样品的微胶囊可以通过在生物样品周围形成水凝胶的聚合方法来保持。然而，包封凝胶的聚合是复杂的，只有在以独立相形式引入第三试剂时发生。聚合剂是不能产生均匀聚合的钙化油酸，并且这与仅从一个轴分配的钙化油酸相结合使得均匀聚合不可能。细胞的分离需要外部组件(滤纸)来实现。另外，细胞中荧光的检测仅通过将细胞捕获在微孔中而发生，这意味着细胞无法快速分选和有效或快速分离。所描述的装置和方法缺乏将植物细胞复原为全植物的适合性。
WO 2017/218486 A1涉及用于乳化可变形凝胶珠粒中的固体载体(如聚合物或铝或钢金属)的方法和组合物。在一些实施例中，用单细胞将单个固体载体包封在液滴中。此装置不旨在保护植物细胞或增加细胞对全植物再生的效率，并且不涵盖装置内荧光检测或包封细胞分选。
CN106190779描述了一种基于微流体芯片的单细胞分离和包封装置和方法。本文件集中于医学应用并且缺乏与植物细胞一起使用的适合性。细胞包封试剂主要由缓冲液构成并且不使用水凝胶。没有描述保护和支持植物细胞从单细胞到全植物的化学措施，并且也不存在进行荧光检测或细胞分选功能的任何能力。
Yu等人(“单植物细胞的基于液滴的微流体分析与筛选(Droplet-basedmicrofluidic analysis and screening of single plant cells)”,《公共科学图书馆·综合(PLoS ONE)》13(5):e0196810.2018年5月)描述了基于荧光报告蛋白的基因表达对单独包封在水性微滴中的植物原生质体的高通量表征和分选。没有公开用于保护单个植物细胞或改进将其再生回到全植物的效率的成功方法。相反，装置纯粹是诊断性的，缺乏任何再生包封并且因此仅允许非常低的再生可能性。细胞包封并且然后通过荧光特征进行的分选也发生在两个不同的装置上，因为连接所述装置很复杂，从而导致损坏和/或污染的风险增加。
类似地，Grasso和Lintilhac(“活的植物原生质体的微珠包封：用于处理单个植物细胞的新工具(Microbead encapsulation of living plant protoplasts:A new toolfor the handling of single plant cells)”,《植物科学应用(Applications in PlantSciences)》2016 4(5):1500140)提供了用于将单个植物原生质体掺入精确大小的琼脂糖微珠中的方案。没有努力改进从单细胞再生全植物的效率，或基于其荧光特征对细胞进行分选。使用水凝胶化学，所述水凝胶化学将降低单个植物细胞活力并且在包封细胞中是低效的，结果是产生了其中仅25％含有细胞的胶囊。
因此，仍然需要选择、修饰和复原植物，特别是进行基因工程或编辑过程的植物的新的且更有效的方法。
发明内容
一方面，本发明涉及一种包括微流体芯片的***，所述***允许高效地复原植物原生质体并且繁殖成全植物。引入微流体芯片中的原生质体被引导通过微流体通道，所述微流体通道将细胞溶液分离成单细胞，所述单细胞然后被包封在保护原生质体并且向其提供营养的介质中。因此，所得原生质体的活力大大增加，并且从这些原生质体中复原全植物的效率也大大提高。
具体地，本发明提供了一种用于繁殖植物材料的***，所述***包括：微流体装置，所述微流体装置包括液滴发生器；第一注射***，所述第一注射***包括第一液体并且被配置成将所述第一液体注射到所述液滴发生器中；以及第二注射***，所述第二注射***包括第二液体并且被配置成将与所述第一液体不混溶的第二液体单独注射到所述液滴发生器中。所述第一液体是包括原生质体的溶液，并且所述第一液体包括包封介质或包封介质前体。所述***被配置成使得在所述液滴发生器中形成液滴，每个液滴包围单个原生质体或无原生质体并且包括所述包封介质或所述包封介质前体。所述***被进一步配置成使得所述液滴中的所述包封介质或所述包封介质前体在装置中凝胶化，以产生包围单个原生质体或无原生质体的经凝胶化的液滴。
在实施例中，所述***另外包括基于如荧光特征等特性筛选微流体装置中的原生质体的构件。可以将阳性选择的经包封的细胞引导出微流体装置并且沉积到维持细胞***和生长的培养基上。这从根本上增加了选择正确细胞的机会，从而减少了植物复原后必需的筛选量。
在实施例中，微流体装置是微流体芯片。
具体地，所述***可以进一步包括在液滴发生器下游的第一检测***和第一分选***，其中所述第一检测***被配置成检测穿过微流体装置的液滴中叶绿素的存在。所述第一分选***操作性地连接到所述第一检测***并且被配置成如果检测***未能检测到液滴中叶绿素的存在，则将液滴引导到微流体装置的侧通道中。
代替第一检测和分选***或除了第一检测***和分选***之外，所述***可以包括在液滴发生器下游的第二检测***和第二分选***，其中所述第二检测***被配置成检测在微流体装置中流动的液滴中期望特性的存在。所述第二分选***操作性地连接到所述第二检测***并且被配置成如果所述第二检测***未检测到液滴中期望特性的存在，则将液滴引导到微流体装置的侧通道中。
在实施例中，所述***进一步包括用于收集离开所述微流体装置的液滴的收集***。所述***还可以任选地包括被配置成将单个液滴沉积到培养物载体上的自动分配器。
另一方面，本发明涉及用于繁殖植物材料的方法。所述方法包括：提供包括多种植物原生质体的溶液，所述溶液包括包封介质或包封介质前体；将所述溶液引入微流体芯片中；在所述微流体芯片中形成所述溶液的液滴，所述液滴中的至少一些液滴包封单个原生质体；使所述包封介质或所述包封介质前体在所述微流体芯片中凝胶化；以及收集经包封的原生质体。
有利地，这种方法可以实现所得原生质体的活力的改进，并且因此提高从这些原生质体中复原全植物的效率。
在优选的实施例中，所述方法进一步包括检测在微流体装置中流动的液滴中原生质体的存在，并且在与含有原生质体的液滴分开的通道中引导不含有原生质体的液滴。在一些实施例中，检测液滴中原生质体的存在包括检测与叶绿素相关联的荧光信号。有利地，这使得能够仅复原和培养具有再生植物的潜力的那些液滴，从而提高植物复原过程的效率并且减少用于在培养中维持液滴的材料和资源。
在实施例中，在所述微流体装置中形成所述溶液的液滴的方法包括：通过主通道引入包括多种原生质体的第一溶液；以及通过在包封区内与所述主通道相交并且由此与所述主通道连通的两个侧通道引入第二溶液，所述第二溶液与包括所述原生质体的所述第一溶液不混溶。有利地，这可以通过调整主通道和侧通道中的流体压力以及调整主通道和流体通道的直径来产生具有一致可预测的大小和体积的液滴流，其中液滴的大小可以根据原生质体的大小来选择。另外，发明人已经发现这种配置可以很好地发挥作用，以相对缓慢的流动产生植物原生质体的适当大小的液滴，这对细胞是温和的并且因此进一步提高了所述方法的复原效率。优选地，主通道的直径不小于约50且不大于150μm、不小于约80且不大于约120μm或任选地约100μm。侧通道的直径可以不小于约50且不大于约300μm、不小于约100且不大于约300μm、不小于约150且不大于约250μm或任选地约200μm。在实施例中，主通道包括紧邻包封区之前和之后的收缩区段，其中主通道的口径比紧邻之前和之后的区段更窄。较窄区段的直径为约60μm。
在实施例中，包封介质前体或包封介质选自由以下组成的组：海藻酸钠；琼脂；琼脂糖；琼脂取代物(如phytagelTM)；和结冷胶。
在实施例中，所述溶液包括包封介质前体，并且使所述包封介质前体在所述微流体装置中凝胶化包括使所述微流体装置中的所述溶液液滴与直接或间接触发所述包封介质前体凝胶化的化合物接触，由此形成经凝胶化的包封介质。
在一些实施例中，所述包封介质前体是海藻酸钠。在实施例中，所述溶液进一步包括Ca2+离子，其中所述Ca2+离子以可释放的方式与所述溶液分离。这允许以可控的方式触发藻酸盐凝胶化。另外，海藻酸钠通常是可获得的并且与许多植物繁殖条件和培养基相容。在实施例中，Ca2+离子是螯合的。在此类实施例中，触发凝胶化的化合物可以是酸。有利地，可以选择在触发Ca2+离子释放所需的浓度下无毒的酸。例如，可以有利地使用乙酸，因为乙酸在所需浓度下对植物细胞无毒，并且对人类操作者也无毒。
在实施例中，使所述微流体芯片中的所述溶液液滴与直接或间接触发所述包封介质前体凝胶化的化合物接触包括将所述化合物包含在与所述第一液体不混溶并且用于在所述微流体芯片中产生所述液滴的第二液体中。有利地，这可以使得在形成液滴之后不久或在形成液滴的时候实现液滴的受控凝胶化。
在一些此类实施例中，可以在第二液体中提供酸。发明人已经发现，有利地可能的是在适合用作第二液体的疏水性溶液中提供酸，其方式为使得酸可以扩散到液滴中并且触发包封介质前体凝胶化。优选地，所述酸以介于约0.3体积％与约2体积％之间、介于约0.5体积％与约1体积％之间、介于约0.35体积％与约0.5体积％之间或约0.35体积％的浓度存在于第二液体中。发明人已经发现，酸在油中的此类浓度足以触发存在于包括原生质体的溶液的液滴中的藻酸盐凝胶化，同时不会过度降低所述溶液的pH，从而也避免或减少对液滴中细胞的损害。有利地，所述酸可以以使得液滴中的pH降低到不小于约5.5，适当地不大于约5.9，通常约5.7的浓度存在于第二液体中。
在替代性实施例中，所述溶液包括包封介质，并且使所述包封介质在微流体芯片中凝胶化包括应用触发液滴发生器下游的所述包封介质凝胶化的条件。在一些此类实施例中，触发所述凝胶化的条件包含温度的降低。此类实施例可以有利地避免对于提供触发凝胶化的另外的化合物的和/或控制此类化合物的存在的需要。
在有利的实施例中，所述植物原生质体的溶液包括生长促进剂。使用选自由以下组成的组的一种或多种化合物是特别有利的：盐；维生素；碳水化合物；生长素；细胞***素；激素；植物磺肽素；和寡肽。生长促进剂可以有利地启动和/或促进植物从经包封的原生质体中复原。
在一些实施例中，所述方法进一步包括检测与流过所述微流体装置的所述原生质体相关联的期望特性的存在以及在与含有具有所述期望特性的原生质体的液滴不同的通道中引导含有不具有所述期望特性的原生质体的液滴。有益地，此类实施例可以例如借助于与细胞分选器，例如介电聚焦器组合的检测***，例如光学检测***来实施。
在实施例中，检测期望特性的存在包括检测与荧光蛋白或分子相关联的荧光信号。
在实施例中，检测期望特性的存在包括检测指示感染的信号的存在或不存在。在一些实施例中，检测指示感染的信号的存在包括检测与病原体核酸或病原体蛋白的存在相关联的荧光或化学发光信号。有利地，本发明的方法因此可以用于选择健康的原生质体并且仅从这些细胞再生植物。无病害植物材料的繁殖是众所周知地难，因为在培养物中包含甚至单个感染细胞可能会否定对培养物进行消毒所做的所有努力。本发明的方法有利地提供了这个问题的解决方案，所述解决方案显著提高了健康细胞的复原率，同时可靠地排除了任何不健康的细胞。
因此根据另一方面，本发明提供了一种选择和繁殖无病害植物材料的方法，所述方法包括用病害标志物处理原生质体的溶液以及应用前述方面的方法来分离、选择和繁殖植物材料。
有利地，本发明的方法可以替代地或另外地用于选择具有期望特性的原生质体，例如因为此特性已被工程化到植物中。植物中的工程特性是资源密集的，至少部分是因为工程过程通常具有非常低的产量，并且可能在评估这些植物中的任何植物是否已经被成功修饰之前，大量的细胞通常在资源和时间密集过程中生长回到植物中。因为本发明的方法能够在植物再生之前以可靠的方式选择具有期望特性的原生质体，并且能从原生质体中高效地复原植物，所以可以将培养中的努力和资源专门集中于生长具有期望特性的那些植物。
因此，根据另外的方面，本发明提供了一种对具有期望表型或特性的植物材料进行工程化的方法，所述方法包括对原生质体群体进行基因修饰以及应用本文所述的方法来分离、选择和繁殖植物材料。
根据另外的方面，本发明涉及一种植物细胞，所述植物细胞是使用本发明的方法获得的，并且涉及一种植物或小植株，所述植物或小植株是通过所述植物细胞的再生获得的。在实施例中，所述植物细胞是基因工程化的。
在一些实施例中，所述植物选自以下中的一种或多种：茄(Solanum spp.)、芸苔(Brassica spp.)、辣椒(Capsicum spp.)、羽扇豆(Lupinus spp.)、菜豆(Phaseolusspp.)、豇豆(Vigna spp)、蚕豆(Vicia faba)；鹰嘴豆(Cicer arietinum)、豌豆(Pisumsativum)、山黧豆(Lathyrus spp.)、大豆(Glycine max)；四棱豆属(Psophocarpus)；木豆(Cajanus cajan)；花生(Arachis hypogaea)；莴苣(Lactuca spp.)、芦笋(Asparagusofficinalis)；芹菜(Apium graveolens)；葱(Allium spp.)、甜菜(Beta vulgaris)；菊苣(Cichorium intybus)；欧蒲公英(Taraxacum officinale)、芝麻菜(Eruca spp.)、南瓜(Cucurbita spp.)、菠菜(Spinacia oleracea)；西洋菜(Nasturtium officinale)；黄瓜(Cucumis spp.)、油橄榄(Olea europaea)；野胡萝卜(Daucus carota)；甘薯(Ipomoeabatatas)；毛果薯(Ipomoea eriocarpa)；木薯(Manihot esculenta)；生姜(Zingiberofficinale)；辣根(Armoracia rusticana)；向日葵(Helianthus spp.)、***(Cannabisspp.)、欧防风(Pastinaca sativa)；萝卜(Raphanus sativus)；姜黄(Curcuma longa)；薯蓣(Dioscorea spp.)、胡椒(Piper spp.)、玉蜀黍(Zea spp.)、大麦(Hordeum spp.)、棉花(Gossypium spp.)、小麦(Triticum spp.)、葡萄(Vitis vinifera)；李(Prunus spp.)、苹果(Malus domestica)；梨(Pyrus spp.)、野草莓(Fragaria vesca)和草莓属(Fragaria)×草莓(ananassa)；覆盆子(Rubus idaeus)；甘蔗(Saccharum officinarum)；芦粟(Sorghumsaccharatum)；野蕉(Musa balbisiana)和芭蕉属(Musa)×大蕉(paradisiaca)；稻(Oryzasativa)；烟草(Nicotiana tabacum)；拟南芥(Arabidopsis thaliana)；柑橘(Citrusspp.)、科杨(Populus spp.)；郁金香(Tulipa gesneriana)；苜蓿(Medicago sativa)；香脂冷杉(Abies balsamea)；东方燕麦(Avena orientalis)；叶片芒果(Bromus mango)；金盏花(Calendula officinalis)；香脂菊(Chrysanthemum balsamita)；康乃馨(Dianthuscaryophyllus)；桉(Eucalyptus spp.)；二花凤仙(Impatiens biflora)；亚麻(Linumusitatissimum)；番茄(Lycopersicon esculentum)；杧果(Mangifera indica)；莲(Nelumbo spp.)；赖草(Poaceae spp.)；黑麦(Secale cereale)；万寿菊(Tageteserecta)；和印加孔雀草(Tagetes minuta)。
根据任何方面的方法可以包括如本文所述的用于繁殖植物材料的***和设备的任何实施例。另外，关于本文所述的方法所描述的任何特征可以存在于如本文所述的用于植物繁殖的***和设备中。
附图说明
现在将参考附图仅通过举例的方式来描述本发明的一个或多个实施例，在附图中：
图1是根据本发明的实施例的繁殖和选择植物的方法的流程图；
图2是根据本发明的实施例的植物繁殖和选择***的示意图；
图3A、3B、3C是根据本发明的实施例的用于颗粒变形分析***的微流体装置的示意图；
图4A-D示出了根据本发明的微流体装置的芯片设计示意图(图4A、4C)，以及图4A和4C的芯片的包封区的更详细的示意图(分别为图4B和4D)；
图5是示出了对于使用图4A-4B上所示的装置根据本发明获得的样品(经包封的原生质体)和包括未经包封的原生质体的比较样品，在培养6天后***原生质体的比例的图；
图6A-D示出了在培养5天之后，在比较样品(未经包封的原生质体—图6A-D)、根据本发明获得的样品(即，在微流体包封之后—图6C-D)中的原生质体培养物的照片。
具体实施方式
虽然本发明将通过举例的方式进行描述，但本领域的技术人员将会理解，在不脱离如所附权利要求书中限定的本发明的精神和范围的情况下，可以修改本发明以采取许多替代性形式。
本文中引用的所有参考文献均通过引用整体并入。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。
根据本发明，提供了一种包括微流体装置的***，以及允许使用所述微流体装置高效地复原植物原生质体并且繁殖成全植物的方法。引入微流体装置中的原生质体被引导通过微流体通道，所述微流体通道将细胞溶液分离成单细胞，所述单细胞然后被包封在保护原生质体并且向其提供营养的介质中。因此，所得原生质体的活力大大增加，并且从这些原生质体中复原全植物的效率也大大提高。
图1示出了根据本发明的实施例的繁殖和选择植物的方法的流程图。在步骤100，从植物组织的样品中获得原生质体的溶液。
如本文所使用的，术语“植物原生质体”(贯穿本公开也简称为“原生质体”)是指已经将植物细胞的细胞壁完全或部分去除的植物细胞。细胞壁的去除可以通过机械、化学或酶方法来实现。在实施例中，使用细胞壁消化酶从合适的植物材料中获得原生质体。例如，酶，如纤维素酶、离析酶、果胶酶、半纤维素酶、果胶裂解酶、崩溃酶、木聚糖酶和其组合可以适用于本发明的上下文中。在实施例中，纤维素酶可以以1w％-1.5w％的浓度使用。在实施例中，离析酶可以以0.2w％-0.4w％的浓度使用。在实施例中，半纤维素酶可以以2w％-5w％的浓度使用。在实施例中，果胶酶可以以0.01w％-0.5w％的浓度使用。在实施例中，崩溃酶可以以0.5w％-2w％的浓度使用。用于从植物组织获得原生质体的方案是本领域已知的(参见例如，Sheen等人,2007)并且在此将不再进一步讨论。在实施例中，合适的植物细胞材料可以包含根组织、叶肉和/或培养的愈伤组织。在实施例中，原生质体是使用在Yoo、Cho和Sheen(2007)中描述的方案获得的，所述文献通过引用并入本文。
在步骤110，原生质体被任选地工程化以获得期望特性，如下文将进一步解释的。
在实施例中，(任选地经工程化的)原生质体在重新悬浮在溶液中之前被洗涤一次或多次。例如，原生质体可以使用缓冲液洗涤一次或多次。在步骤112，将含有原生质体的溶液引入到微流体装置中进行颗粒分离、用包封介质包封和任选地筛选和选择。在实施例中，悬浮原生质体的溶液适于原生质体所源自的植物物种。在实施例中，植物培养基(例如，Gamborg-B5或Murashige Skooge)可以补充有可以特别适于所使用的物种的一种或多种盐、维生素和碳水化合物。在实施例中，溶液适于刺激原生质体再生。在实施例中，通过将原生质体暴露于一种或多种生长素、细胞***素、激素、植物磺肽素、寡肽或支持原生质体再生的其它组分或其组合，溶液适于维持细胞的未分化状态。可以例如在Eeckhaut等人,2013中找到用于制备支持原生质体再生的溶液的方案。在实施例中，所述溶液包括Ca2+离子。Ca2 +离子被认为是帮助细胞壁重整的重要组分，并且因此其在溶液中的存在促进了原生质体再生和复原。另外，如下文将进一步解释的，Ca2+离子可以在原生质体的包封中起重要作用。在实施例中，含有原生质体的溶液中的基本上所有Ca2+离子都以可释放的方式螯合或以其它方式与溶液分离。适用于在水溶液中以可释放的方式分离Ca2+离子的螯合剂是本领域已知的。在实施例中，Ca2+离子被EDTA(乙二胺四乙酸)螯合。在实施例中，包括原生质体的溶液包括Ca2+离子和EDTA，并且溶液中EDTA的浓度基本上等于或高于Ca2+离子的浓度。在实施例中，溶液包括至少50mM、至少80mM、至少100mM、至少120mM、至少150mM或至少200mM Ca2+离子。在实施例中，溶液包括Ca2+离子，如CaCl2。
如本文所使用的，术语“微流体”是指涉及在具有从数十到数百微米的最低尺寸的通道网络中操纵流体的科学和技术，通常涉及在皮升到微升范围内的体积。如本文所使用的，包括微流体通道的装置可以被称为“微流体芯片”。微流体芯片通常是尺寸介于几平方毫米到平方厘米大小之间的一块材料，其中创建了具有期望配置的通道。硅、玻璃或塑料芯片是微流体装置的常用衬底。微流体芯片可以包含其中蚀刻或雕刻有几何特征的通道，所述通道被设计成混合多种组分、培养或储存液体、分离组分或移动流体组分。
在步骤114，在微流体芯片中将原生质体溶液分离成单细胞流。例如，这可以通过调节原生质体溶液的浓度、通道的大小和/或微流体芯片中溶液的流速来实现。在步骤116，通过形成包括原生质体的液滴并触发在液滴的至少外部部分中形成凝胶来包封原生质体。在实施例中，液滴的形成可以通过将微流体芯片中包括原生质体的溶液流与不与原生质体溶液混溶的第二液体流汇聚来实现。在实施例中，第二液体是疏水性液体。例如，第二液体可以包括油，优选地惰性油。例如，第二液体可以包括矿物油。
如本文所使用的，术语“包封”涉及在原生质体周围形成例如凝胶等非液体介质(在本文中称为“包封介质”)的过程，如形成或包围其中保护原生质体的液滴。包封通过在细胞周围形成一层保护性介质，保护性介质的作用如“人工细胞壁”一样，确保原生质体在流经和流出***时受到保护。因此，原生质体的细胞活力增加，并且从这些原生质体中复原全植物的效率得以提高。
在实施例中，原生质体悬浮于其中的溶液包括包封介质前体，并且包封步骤包括形成液滴和触发溶液中至少一些包封介质前体凝胶化。在本公开的上下文中，包封介质前体是能够在预定凝胶化条件下凝胶化的化合物。
在实施例中，包封介质包括海藻酸钙，并且包封溶液包括海藻酸钠作为包封介质前体。海藻酸钠能够在存在Ca2+离子的情况下凝胶化。当与Ca2+离子接触时，海藻酸钠溶液形成海藻酸钙凝胶，所述海藻酸钙凝胶可以形成用于存在于原生质体溶液中的原生质体的保护性“胶囊”。
在实施例中，包封步骤包括使包括原生质体和包封介质前体的溶液与包括直接或间接触发包封介质前体凝胶化的化合物的第二溶液接触。例如，包封介质前体可以包括海藻酸钠，并且包封步骤可以包括使包括原生质体和海藻酸钠的溶液与包括Ca2+离子的溶液或能够引起存在于包括原生质体和海藻酸钠的溶液中的Ca2+离子释放的药剂接触。例如，包括原生质体的溶液可以包括海藻酸钠和与EDTA螯合的Ca2+离子。在此类实例中，溶液可以与包括酸的第二液体(在本文中也称为“第二溶液”)接触。例如，第二液体可以包括乙酸或优选地对原生质体无毒的任何其它酸，其浓度足以引起Ca2+离子从EDTA螯合物中释放。在实施例中，第二液体包括浓度为至少约0.3体积％的乙酸。在实施例中，第二液体包括浓度为至多约2体积％的乙酸。在实施例中，第二液体包括浓度为至少约0.3体积％且至多约2体积％、至少约0.5体积％且至多约1体积％、适当地介于约0.35体积％与约0.5体积％之间或为约0.35体积％的乙酸。在实施例中，第二液体包括一定量的酸，使得第二溶液中的5μl pH中性的水溶液液滴达到至少与在第二溶液含有0.3体积％的乙酸的情况下将获得的一样低的pH，并且优选地不低于在第二溶液含有2体积％的乙酸的情况下将获得的pH。在实施例中，第二液体包括一定量的酸，使得原生质体溶液的液滴的pH介于约5.5与约5.9之间，优选地约5.7，这是由于在液滴周围的第二液体中存在酸。如技术人员将理解的，第二液体中导致液滴中的此pH的酸的精确浓度可以至少取决于所使用的特定酸。另外，如技术人员将理解的，第二液体中的pH当量可以低于在液滴中优选实现的pH。例如，第二液体中的pH当量可以介于至少约4.5与约7之间，优选地介于约5与6之间，例如介于5与5.5之间。
在实施例中，第二溶液的pH相当于包括至少约0.3体积％乙酸的油、包括介于约0.3体积％与约2体积％之间、介于约0.5体积％与约1体积％、介于约0.35体积％与约0.5体积％之间或约0.35体积％乙酸的油的溶液的pH。应当理解，pH可以通过添加例如一个或多个H+供体(例如，质子溶剂)或路易斯酸来调整。在实施例中，第二溶液包括乳化剂。在实施例中，第二溶液包括浓度介于约2体积％与约10体积％之间、介于约2体积％与约5体积％之间或为约4体积％的乳化剂。在实施例中，乳化剂是聚山梨醇酯80(也称为Span 80)。乳化剂可以有助于将酸分散在第二溶液中，特别是当第二溶液是疏水性的时。
在实施例中，第二溶液包括直接触发包封介质前体凝胶化的化合物。例如，第二溶液可以包括酸，并且酸可以直接触发第一溶液中的包封介质前体凝胶化，其中包封介质前体的凝胶化可以由H+离子触发。此类实施例可以例如使用结冷胶(gellan gum)作为包封介质前体。
在实施例中，包封介质前体是海藻酸钠，并且海藻酸钠是以0.01到10重量％、0.01到5重量％、0.1到5重量％、0.5到5重量％、0.1到2重量％、0.5到2重量％或0.5到1.5重量％的浓度提供在包括原生质体的溶液中。
在实施例中，包封介质包括能够凝胶化(例如基于冷却)的其它化合物。例如，包封介质可以包括低熔化(EEO)琼脂糖、低熔化(EEO)琼脂、植物凝胶和/或结冷胶(例如，
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)。在实施例中，低熔化(EEO)琼脂糖可以以0.01-5重量％的浓度存在。在实施例中，低熔化(EEO)琼脂可以以0.01-5重量％的浓度存在。在实施例中，植物凝胶可以以0.01-2重量％的浓度存在。在实施例中，结冷胶可以以0.01-0.2重量％的浓度存在。在实施例中，包封步骤116包括形成包括原生质体的液滴以及通过冷却液滴流触发在液滴的至少外部部分中形成凝胶。因此，本发明的***可以包括冷却液滴流的构件。
在实施例中，包括包封介质或包封介质前体的溶液包括生长促进剂，如下文将进一步解释的。这进一步增加了经包封的原生质体的细胞活力并且导致更高的全植物复原产率。在实施例中，特定胶凝剂的选择和包封介质的组成可以取决于原生质体所源自的植物物种和/或原生质体悬浮于其中的溶液(例如，生长促进性溶液)的组成。
如技术人员将理解的，包封步骤旨在产生各自包围单个原生质体的液滴，其中液滴被凝胶化或包括经凝胶化的外层。然而，实际上，根据原生质体溶液中原生质体的浓度和微流体芯片中使用的流速，可以形成包括多于一个(例如，两个)或无原生质体(“空液滴”)的液滴。优选地，原生质体的浓度和流速被选择成使得空液滴比包括多于一个原生质体的液滴更有可能。
在步骤118，任选地引导包括包封介质的液滴通过第一检测和分选***。第一检测和分选***被配置成检测每个液滴中原生质体的存在。例如，与叶绿素相关联的荧光信号的存在可以用于此目的，如下文将进一步解释的。检测和分选***将任何空液滴(即，不含有原生质体的液滴)引导到与确定为含有原生质体的液滴不同的通道，其中前者可以例如被引导到废物收集***。在实施例中，检测和分选***被省略，并且所有液滴(包含空液滴)从微流体芯片中排出122。
在步骤120，液滴任选地流过另外的检测和分选***。另外的检测和分选***被配置成检测包封在每个液滴中的原生质体中期望特性的存在。例如，可以检测与荧光蛋白相关联的荧光信号的存在，所述荧光蛋白的编码序列通过步骤110的操作已经在原生质体中引入或激活。另外的检测和分选***可以将任何阴性液滴(即，不具有期望特性的液滴)引导到与阳性液滴不同的通道，其中前者可以例如被引导到废物收集***。如技术人员将理解的，另外的检测和分选***的性质可以根据待测试的特性以及在步骤110是否进行了原生质体的修饰而改变。在实施例中，第二检测和分选***可以被省略。在实施例中，多个特性可以由一个或多个另外的检测和分选***检测。在此类实施例中，液滴可以被认为是阴性的，并且如果所述特性中的任何特性、预定子集或所有特性都不存在，则液滴被运送到废物收集***。第一检测和分选***和另外的检测和分选***可以各自存在或不存在。在实施例中，第一检测和分选***和另外的检测和分选***可以组合成单个***，所述单个***检测原生质体的存在和期望特性两者，并且在与任何阳性(并且因此非空)液滴不同的通道中引导任何阴性或空液滴。
在步骤122，(任选地选择的)液滴通过出口从微流体芯片中排出。
在步骤124，收集液滴并且将其铺板在细胞培养板上，如下文将进一步解释的。在步骤126，培养经包封的原生质体以产生微愈伤组织。这些微愈伤组织然后可以用于再生整个小植株。
图2是根据本发明的实施例的通用***的示意图。***1包括液体注射***2、微流体芯片4、废物收集***6和原生质体收集***8。收集***8可以包括用于收集流出微流体芯片4的经包封的原生质体的机构。在实施例中，可以将收集***8中收集的经包封的原生质体手动分配到选择的细胞培养***上。在实施例中，可以自动分配收集***8中收集的经包封的原生质体。例如，“喷墨打印机”型分配***可以用于将经包封的原生质体分配到选择的细胞培养***上。在实施例中，可以将经包封的原生质体手动或自动分配到一个或多个微孔培养板上。有利地，可以将单独的经包封的原生质体分配在每个微孔中。适当时，可以使用其它类型的培养板。在实施例中，可以用含有胶凝剂的培养基(例如，琼脂板)将经包封的原生质体固定在培养板的孔中。在实施例中，可以在培养板中提供植物生长培养基。
所展示的***另外包括检测***10和分选***12。例如，检测***10可以包括激光二极管和荧光检测***，如荧光显微镜或光电检测器。来自检测***的数据被传输到计算装置14，例如计算机。计算装置14包括处理器、存储器和接口。计算装置14被配置成使用来自检测***10的数据来标识流过微流体芯片的具有目标特性的原生质体，并且任选地通过接口将数据提供给用户。计算装置14可以处理来自检测***10的数据，以便优选地接近实时地向分选***12产生控制信号。分选***12包括用于引导原生质体在微流体芯片4中提供的两个或更多个分支中的选定的一个分支中流过微流体芯片4的机构。在实施例中，分选***12包括能够产生介电泳力的压力阀或一对电极。如上所述，可以串联提供多个这种检测10和分选12***，以选择不同的特性。例如，第一检测***10和分选***12可以选择非空的液滴，并且第二检测***10和分选***12可以选择对于目标特性为阳性的液滴。检测***、分选***和微流体芯片将在下文相关部分中更详细地描述。
液体注射***2通常包括至少两个注射器2a、2b和将注射器连接到微流体芯片4上的入口的管2c。具体地，液体注射***2包括第一注射器2a，所述第一注射器被配置成将作为原生质体溶液的第一液体注射到微流体芯片的入口中；以及至少第二注射器2b(或两个单独的注射器2b，如在所描绘的实施例中)，所述第二注射器被配置成将第二液体注射到微流体芯片的两个另外的入口中。如上所述，第二液体可以包括与第一液体不混溶的介质，以形成第一液体的液滴。液体注射***2有利地包括泵送机构，所述泵送机构允许操作者控制液体流入微流体芯片4中。如本领域的技术人员将理解的，本领域已知的适合与微流体芯片一起使用的任何注射***都可以用于本发明的***中。优选地，注射***包括注射泵，所述注射泵被配置成提供不中断的流动。优选地，使用一次性无菌塑料设备或可重复使用的可灭菌设备来确保注射***不会在***中引入任何污染。例如，可以使用neMESYS注射泵(Cetoni)、2ml Plastipak注射器(BD)和/或1/16英寸PTFE管
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或其它可高压灭菌的塑料管或类似的无脉冲注射器设备。类似地，废物收集***6通常包括一个或多个容器6a和将微流体芯片上的一个或多个出口连接到一个或多个容器6a的管6b。收集***的细节对于本发明不是必要的，并且在此将不再进一步详细描述。
如图3A-C所示(下文更详细地讨论)，微流体芯片4包含主通道26，由流体或液体(第一液体)流携带原生质体通过所述主通道；以及两个侧通道28a和28b，使与第一液体不混溶的第二液体的相应流通过所述两个侧通道与主通道26中的流汇聚。在主通道26与侧通道28a、28b的汇合点处，形成包括单个原生质体和包封介质或包封介质前体的液滴。在实施例中，包封介质或包封介质前体的凝胶化也在汇合点处触发，从而形成包括经凝胶化的包封介质的单个液滴。在实施例中，凝胶化是由存在于第二液体中的组分直接或间接触发的。在实施例中，凝胶化是在液滴形成之后触发的，例如通过应用促进凝胶化的条件，如通过冷却液滴。
在实施例中，每个液滴平均含有单细胞。例如，液体注射***2可以被配置成使得原生质体溶液以略低于包封介质注射到微流体芯片4中的压力的压力注射到所述微流体芯片中。这有利地导致在主通道26和侧通道28a、28b的相交处形成的包封介质的大部分液滴包括一个细胞或无细胞。
根据本发明的实施例，提供了一种微流体芯片和包括所述微流体芯片的用于繁殖植物材料的***。
图3A、3B和3C示意性地示出了根据本发明的实施例的微流体芯片20。微流体芯片20包括第一或主流入口22，并且在图3A和3B的实施例中，包括一对第二液体流入口24a、24b。第一入口22用于将原生质体流引入到微流体芯片20的主通道26中。入口24a、24b用于将第二液体流引入到微流体芯片的侧通道28a和28b中，以便形成包括原生质体和包封介质或包封介质前体的液滴。在替代性实施例中，如图3C上所示，可以提供单个入口24以供给到两个通道28a和28b中。
在实施例中，如图3B和3C上所示，微流体芯片20包括一个或多个惯性聚焦器(inertial focuser)44。例如，惯性聚焦器可以包括具有不同曲率半径和宽度的交替弯曲部。可以使用其它聚焦原理，如Xuan等人,2010中描述的聚焦原理。这种流体元件具有两个主要作用：所述流体元件将分散的细胞向下聚焦到单个流中，集中在惯性聚焦器下游的通道中间；并且所述流体元件在沿着流的连续细胞之间引入的均匀间隔。在惯性聚焦器中，聚焦效应是二次迪恩流(secondary Dean flow)与惯性升力之间的适当比率的结果，所述比率进而取决于通道尺寸、纵横比、曲率半径、颗粒直径和流速(参见例如，Amini等人,2014)。纵向间隔取决于悬浮液浓度、通道雷诺数Rec和颗粒雷诺数Rep。可以利用能够将颗粒聚集成单个流的微流体元件(参见例如，Di Carlo等人,2007；Kahkeshani等人,2016)。在微流体芯片内发生任何选择事件之后，主通道分为两个通道，惯性聚焦有利于两条臂中的一个臂。除非物理地移动，否则细胞将始终沿着受偏爱的臂向下移动。可以利用能够这样做的微结构(参见例如，Chung等人,2013)。
两个侧通道28a、28b在包封区36处与主通道26相交。有利地，侧通道28a、28b在包封区36中围绕主通道26基本上对称地布置。优选地，侧通道28a、28b基本上垂直于包封区36中的主通道26，使得所述侧通道在相对侧处与主通道26相交。侧通道、主通道和包封区协作以形成微流体液滴发生器。
有利地，因为包封流和主流通过单独的入口被引入到芯片中，所以所述流可以由单独的注射***2独立地控制。
在穿过包封区36之后，组合流继续行进穿过主通道26，并且在图3A上描绘的实施例中，行进穿过第一检测区38。在第一检测区38中，在包封区36中形成的液滴暴露在叶绿素吸收波长的光下，并且检测在叶绿素发射波长中发射的存在或不存在。
在检测区38之后，图3A上所示的微流体芯片20包括与分选***相关联的另外的侧通道28c。分选***能够将液滴引导出主通道26并且进入侧通道28c中。侧通道28c可以通过出口40与废物收集***相连通。
在图3C上描绘的实施例中，微流体芯片包括第二检测区38'。在第二检测区段区域38'中，评估主通道26中的液滴是否存在目标特性。例如，可以将液滴暴露于已经在细胞中引入或激活的荧光蛋白的吸收波长的光，并且可以检测在所述蛋白质的发射波长中发射的存在或不存在。
在第二检测区38'之后，图3A上描绘的微流体芯片20包括与分选***相关联的另外的侧通道28d。分选***能够将液滴引导出主通道26并且进入侧通道28d中。侧通道28c可以通过出口42与废物收集***相连通。
最后，主通道中的液滴通过出口44排出。
在本发明的一些实施例中，主通道26和侧通道28具有基本上相等的横截面。在其它实施例中，主通道26和侧通道28具有不同的横截面。在实施例中，侧通道28a、28b具有基本上相等的横截面。在实施例中，侧通道28c、28d在主通道的对应区域中(即，在流分成主通道26和侧通道28c或28d的点处)具有与主通道26的横截面不同的横截面。在实施例中，主通道26具有恒定的横截面。在实施例中，主通道26包括多个区段，并且每个区段可以具有与所述区段之前或之后的横截面不同的横截面。这些尺寸由待分析颗粒的平均大小以及可能例如针对细胞分选(参见下文)存在的其它要求决定。有益地，通道的大小可以被选择成超过颗粒的那些尺寸至少50％，以避免与通道壁的潜在机械接触。在实施例中，所述通道中的一些或所有通道具有基本上矩形的横截面。一些或所有通道可以具有椭圆形或圆形横截面。在实施例中，主通道和/或侧通道的直径/宽度W可以介于至少40μm与至多300μm之间。术语通道的宽度和直径在本说明书中可互换地使用，以指代将被称为圆形横截面的通道中的直径和矩形横截面的通道中的宽度的尺寸。在实施例中，主通道26的宽度介于约50与约150μm之间、介于约80与约120μm之间或为约100μm。在实施例中，侧通道28A、28B的宽度介于约50与约300μm之间、介于约100与约300μm之间、介于约150与约250μm之间或为约200μm。在实施例中，如图3B上所展示的，主通道26包括紧邻包封区36之前和之后的区段262、264，其中主通道比紧邻之前(区段260)或之后(区段266)的区段260、266更窄。例如，区段260和266的直径可以为约100μm，并且区段262、264的直径可以为约60μm。
如先前所解释的，在包封区38中，液滴是通过第一液体流和第二液体流的汇聚形成的，所述第二液体与所述第一液体不混溶。在图2和3上所示的实施例中，第一液体流和第二液体流的汇聚是使用交叉配置获得的，所述交叉配置涉及传送第一液体的第一或主通道和传送第二液体的两个侧通道。这种配置也被称为流动聚焦***，其中第一液体的流动“挤压”在第二液体的两个流之间，从而产生液滴。发明人已经发现这种配置优于其它液滴发生器配置，因为这种配置能够使用相对缓慢的流动同时产生适当大小的液滴(其中流体压力和通道宽度两者均有助于确定液滴大小)。液滴的相对缓慢的流动可能是有利的，因为其对于细胞相对温和并且更容易监测，以便用于例如质量控制和细胞分选目的。在本公开的上下文中，如果流速低于约200微升/小时，则所述流速可以称为“慢”。如技术人员将理解的，其它配置是可能的。具体地，可以在本发明的上下文中使用被认为适合于在微流体芯片中产生液滴的任何配置。例如，第一液体和第二液体可以注射在两个正交通道中，其中传送第一液体的通道与传送第二液体的单个通道汇合，从而产生此后在传送第二液体的通道中行进的第一液体的液滴。
根据本发明的实施例，原生质体被包封在包括生长促进剂的介质中。这提高了根据本发明产生的原生质体的存活率，并且因此提高了使用本发明的方法和设备复原完整植物的效率。
根据本发明的实施例，可以基于与叶绿素相关联的荧光信号的存在来选择在微流体芯片中流动的微胶囊。这使得能够选择含有活原生质体的微胶囊，由此提高使用本发明的方法和***复原完整植物的效率。
在实施例中，本发明的***包括被配置成检测与叶绿素相关联的荧光信号的存在的荧光检测***。例如，检测***可以被配置成提供叶绿素吸收波长的光(激发光)并且检测叶绿素发射波长的光的发射。例如，检测***可以包括发射介于405到544nm之间的光的光源和用于检测高于495nm，如介于600与800nm之间的光的发射的检测器。在实施例中，激发光由激光二极管提供。在实施例中，发射光由荧光显微镜检测。
在实施例中，本发明的***可以包括用于基于一种或多种期望特性检测和任选地选择经包封的原生质体的机构。因为本发明的***和装置包括微流体芯片，其中每个经包封的原生质体依次流过主通道，所以理论上可以另外地获得可以从在微流体通道中流动的细胞获得的任何信息。在实施例中，本发明的***包括光学检测***，如荧光检测***。与分选机构组合，这使得能够选择具有指示目标特性的荧光标志物的原生质体。在实施例中，本发明的方法包括将荧光蛋白的编码序列引入到原生质体培养物中。在此类实施例中，本发明的方法可以包括使用荧光检测***来检测荧光蛋白在流过微流体装置的经包封的原生质体中的表达。
在实施例中，荧光检测***可以被配置成检测指示叶绿素的存在的信号和指示荧光标志物(其指示目标特性)的存在的信号两者。在此类实施例中，检测***可以联接到分选机构，并且所述***可以被配置成使得分选机构基于指示叶绿素的存在的信号和指示荧光标志物的存在的信号的组合存在来分离两个不同通道之间的微胶囊。
在实施例中，可以将化学发光检测***添加到***中。与分选机构组合，这使得能够选择具有指示目标特性的化学发光标志物的原生质体。在实施例中，本发明的方法包括将一种或多种化学发光蛋白(例如，荧光素、水母发光蛋白等)的编码序列引入到原生质体培养物中。在此类实施例中，本发明的方法可以包括使用发光检测***来检测化学发光蛋白在流过微流体装置的经包封的原生质体中的表达。
在一些实施例中，可以单独或与任何其它实施例组合地将用于测量细胞的其它性质的***添加到***中。例如，可以将测量原生质体的大小和/或形态的成像***添加到***中。例如，成像/光学***可以用于提供包封是否成功的指示(即，原生质体是否存在于液滴中)。另外，在包封之前或之后评估原生质体的大小和/或形态的***可以用于提供原生质体活力的指示。在此类***中，有可能选择更可能成功复原的原生质体。
根据本发明的实施例，微流体芯片包括一个或多个分选机构，所述一个或多个分选机构与以上提及的检测机构中的一个或多个检测机构可操作地连接。在实施例中，如上所述，分选机构通过计算装置与检测机构连接。
在实施例中，微流体芯片包括与主流动通道分开的一个或多个另外的侧分支，并且***包括一对电极，所述一对电极被配置成根据从检测机构接收的信号通过介电泳(DEP)将经包封的原生质体引导到主分支或侧分支。有利地，DEP提供了一种对单个经包封的原生质体进行分选的方式，而不需要改变由注射泵产生的流动速度或方向性。
在实施例中，例如在优选避免使用电场的情形下，可以使用光介电泳(ODEP)代替DEP。有利地，ODEP允许实现与光学镊子类似的效果，同时将原生质体暴露于不太强的光，从而降低荧光团漂白或损坏原生质体本身的风险。
在实施例中，可以使用磁性分选。在实施例中，用于改变微颗粒的位置和/或影响微颗粒进入微流体***的多个分支中的一个分支的其它***和装置是本领域已知的并且将不再进一步描述(参见例如，Gi-Hun Lee等人,2016；Tzu-Keng Chiu,2016)。
在包封和分选含有经包封的原生质体的液滴之后，如上所述，可以将单个经包封的原生质体手动或自动置于组织培养***中，例如置于含有植物生长培养基的琼脂凝胶板上或置于含有凝胶和具有植物生长促进性培养基的液体的微孔板中。
在实施例中，可以使用愈伤组织诱导培养基。例如，可以使用培养基，如GamborgB5、Murashige Skoog或其它。如上所述，盐、维生素和生长素、细胞***素和/或促进单个原生质体生长成愈伤组织的其它激素可以包含在培养基或组织培养板中。
在实施例中，可以将已经达到预定大小的愈伤组织移入具有不同生长素和细胞***素比率的植物生长培养基中以诱导芽形成。在实施例中，可以将已经经历芽形成的愈伤组织移到另一种植物生长培养基中以诱导根形成。优选地，可以在无菌条件下进行愈伤组织的任何操作。
由上述方法产生的小植株然后可以用于常规的微繁殖技术。
根据本发明的实施例，提供了用于对具有目标特性的植物进行有效地工程化和复原的新方法和设备。本发明提供的单细胞快速表型分析和全植物的高复原效率的组合在植物工程的背景下是特别有利的。
具体地，本发明可以用于在植物原生质体已经用CRISPR/Cas9、其它核酸引导的核酸酶或如TALEN或ZFN等任何其它核酸酶进行基因编辑处理之后筛选植物原生质体。在实施例中，本发明可以用于在植物原生质体已经进行如WO2017061805A1中描述的基因编辑处理之后筛选植物原生质体，所述文献通过引用并入本文。
在实施例中，所述方法包括使用PEG转化或其它细胞膜渗透技术将核糖核蛋白(RNP)或其它核酸酶蛋白递送到单个原生质体中(参见例如，Woo等人,2015)。
在实施例中，核酸酶可以用如GFP、RFP等荧光分子或如荧光素等基于非蛋白的荧光标志物或化学发光标志物来标记。有利地，所述标志物可以用于确保核酸酶被成功递送到细胞。因此，***可以选择含有基因编辑物质的原生质体(例如，如上所述，通过在微流体芯片中进行分选，例如根据液滴中原生质体的存在/不存在，与分选组合或在分选的后续步骤中进行分选)，由此显著提高基因编辑过程的效率。
如技术人员将理解的，本发明的方法不限于用与核酸酶连接的荧光或化学发光信号产生分子来分选细胞，而是限于存在于原生质体中的任何荧光或化学发光信号，如源自原生质体的成功质粒转化的荧光或化学发光蛋白。
在实施例中，本发明的***可以用于根据目标质粒的存在或不存在来分选原生质体(例如，选择已经经历成功的质粒转化的原生质体)，其中质粒转化可以旨在用于基因编辑或任何其它目的。
在实施例中，本发明的***和方法可以用于选择通过转基因植物的细胞壁降解产生的原生质体，所述转基因植物表达具有例如荧光或化学发光蛋白作为基因表达信号的转基因。
在实施例中，本发明的***和方法可以用于选择通过转基因植物的细胞壁降解产生的原生质体，所述转基因植物表达具有例如指示细胞类型的荧光或化学发光蛋白的转基因。
在实施例中，本发明的***和方法可以用于选择使用本领域已知的任何转化方法(例如，PEG、质粒等)用任何荧光标记的分子，如蛋白质(例如，抗体、转录因子等)或能够与植物细胞的任何内部组分相互作用的其它分子转化的原生质体。
根据本发明的实施例，提供了包括根据本发明的用于繁殖和选择植物材料的***的诊断测定。
园艺和农业植物繁殖中的大问题之一是需要确保待繁殖的植物材料是无病害的。实际上，如由病毒、细菌或真菌病原体引起的那些病害等病害可能对培养物产生破坏性影响。目前，发现植物材料是否无病害的主要方法是通过聚合酶链反应(PCR)诊断测试。此类测试是极其费力且昂贵的，尤其是当在怀疑已经暴露于感染原的数百或甚至数千株植物上进行时。另外，即使使用这些方法检测到病害，所述病害仍必须从培养物中去除。用于此的最常用方法是分离植物分生组织，并且使用植物的这一部分进行繁殖。这依赖于以下假设：如果感染被发现得足够早，则植物分生组织不太可能被感染，并且因此从分生组织重新生长植物增加了植物培养物无病害的可能性。然而，这也是劳动密集且昂贵的。另外，即使存在于分离的分生组织中的单个感染细胞，无论是来自分生组织本身还是由于污染，都可能危及整个操作。实际上，即使分生组织的最精确的显微分离将含有数百个植物细胞，并且在任何单个细胞中感染原的存在将损害繁殖。
本发明的方法和装置可以用于解决所有上述问题。具体地，如叶子、子叶或分生组织等任何植物材料可以用作原生质体的起始来源。另外，因为本发明的装置和方法产生可以高效地复原为完整植物中的单个经包封的原生质体，所以复原的每个单株植物源自单个细胞，并且因此是完全且确信地是无病害的或有病害的(在这种情况下，其可以被丢弃)。
另外，本发明的筛选能力可以用于在有病害原生质体复原和生长之前滤除那些有病害原生质体，由此确保仅繁殖无病害植物材料。在实施例中，基于病害标志物的存在或不存在来选择经包封的原生质体。例如，可以使用指示如病毒、细菌或真菌病原体等病原的存在的光学输出。在实施例中，基于荧光或化学发光的病害检测方法可以用于检测单细胞中病原体的存在(参见综述，例如Fang和Ramasamy,2015)。
在实施例中，诊断性FISH(荧光原位杂交)可以用于检测来自单个植物原生质体中发现的细菌或真菌的核糖体RNA以及DNA。在实施例中，诊断性FISH可以用于检测单个植物原生质体中发现的病毒核酸。有利地，此类方法可以能够检测培养的病原体和非培养的病原体两者。因此，分离和生长所讨论的病原体的能力对于病原体的检测不是必需的。
在实施例中，免疫荧光技术可以用于检测病原体源性分子(例如，蛋白质)。例如，具有被设计成结合特异性病害标志物的荧光标记的抗体可以用于检测病原的存在。
使用所述的任何病害检测方法，本发明的方法和***可以使得能够选择未显示病害标志物的经包封的原生质体。因此，本发明可以实现无病害材料的有效选择和繁殖。
如技术人员将理解的，产生光输出的任何其它诊断方法可以与本发明的装置组合以获得无病害植物材料的有效筛选和选择。
根据本发明的实施例，提供了包括根据本发明的用于繁殖和选择植物材料的***的诊断测定。
许多可商购获得的植物未与种子一起繁殖，而是通过插条(cutting)的组织培养。从插条产生新的小植株的过程是非常费力的，并且通常是缓慢的。实际上，所述过程依赖于组织培养技师将现有植物切片成数十或数百个小组织样品，然后将所述小组织样品置于组织培养培养基中以再生。一旦从插条长出小植株，就将所述过程重复一次或多次，以便获得期望量的小植株，通常为100,000到10,000,000个单位。这个过程仍然是高度手动的，并且因此是非常劳动密集的、缓慢且重复的。另外，每个插条阶段与将病害引入到材料中的风险增加相关联。
本发明的方法和装置可以用于解决所有上述问题。具体地，如叶子、子叶或分生组织等任何植物材料可以用作原生质体的起始来源，并且每株植物包括数亿个细胞，所述数亿个细胞中的大部分细胞具有使用本发明的方法和***复原为全植物中的潜力。本发明的微流体芯片允许以非常高的速率，例如100到1000个细胞每分钟包封单个植物细胞。如上所述，当将经包封的原生质体置于组织培养条件下时，用生长促进性缓冲液包封的每个原生质体能够实现全植物的高复原。因此，本发明的方法和***能够使用单个快速自动化步骤以商业相关规模(例如，100,000到1,000,000个单位)产生植物单元。这显著降低了产生材料所需的成本、时间和劳动力，并且显著降低了病害引入的风险。
可以理解的是，本发明对于代表商业食物或动物饲料作物、商业生物质或生物燃料作物、用于实验室使用的模型植物生物体、医学植物、园艺植物和稀有植物，如濒危的、培育的或经基因工程化的品种的植物物种的应用具有特别的价值。设想本发明特别有用的植物物种和属包含但不限于茄(例如，番茄(S.lycopersicum)、四倍体马铃薯(S.tuberosum)、茄子(S.melongena)、人参果(S.muricatum)、树番茄(S.betaceum))；芸苔(例如，甘蓝(B.oleracea)、芜菁甘蓝(B.napobrassica)、甘蓝型油菜(B.napus)、树树菜(B.cretica)、岩生酒瓶树(B.rupestris)和白菜型油菜(B.rapa))；辣椒(例如，一年生辣椒(C.annuum)、浆果辣椒(C.baccatum)、黄灯笼辣椒(C.chinense)、灌木状辣椒(C.frutescens)、茸毛辣椒(C.pubescens)；羽扇豆(例如，狭叶羽扇豆(L.angustifolius)、白羽扇豆(L.albus)、南美羽扇豆(L.mutabilis)和黄花羽扇豆(L.luteus))；菜豆(例如，灰栒子菜豆(P.acutifolius)、红花菜豆(P.coccineus)、棉豆(P.lunatus)、菜豆(P.vulgaris)和小香竹菜豆(P.dumosus))；豇豆(例如，乌头叶豇豆(V.aconitifolia)、红豆(V.angularis)、黑吉豆(V.mungo)、绿豆(V.radiata)、班巴拉花生(V.subterranea)和豆角(V.unguiculata))；蚕豆；鹰嘴豆、豌豆、山黧豆(例如，草香豌豆(Lathyrus spp.)和玫红山黧豆(L.tuberosus))；小扁豆(Lens spp.)(例如，小扁豆(L.culinaris)和兵豆(L.esculenta))；大豆；四棱豆属；木豆；花生；莴苣(例如，叶用莴苣(L.sativa)、毒莴苣(L.serriola)、野莴苣(L.saligna)、臭莴苣(L.virosa)和紫花山莴苣(L.taterica))；芦笋；芹菜；葱(例如，洋葱(A.cepa)、大葱(A.oschaninii)、象大蒜(A.ampeloprasum)、分葱(A.wakegi)、韭葱(A.porrum)、大蒜(A.sativum)和虾夷葱(A.schoenoprasum))；甜菜；菊苣；欧蒲公英、芝麻菜(例如，芝麻菜(E.vesicaria)和芸芥(E.sativa))；南瓜(例如，南瓜(C.argyosperma)、猴面包树南瓜(C.digitata)、美洲南瓜(C.pepo)、金香栗南瓜(C.moschata)、厄瓜多尔南瓜(C.ecuadorensis)、黑籽南瓜(C.ficifolia)、臭瓜(C.foetidissima)、加洛蒂南瓜(C.galeottii)、西葫芦(C.lundelliana)、印度南瓜(C.maxima)、中国南瓜(C.moshata)、足叶南瓜(C.pedatifolia)、扎根南瓜(C.radicans))；菠菜；西洋菜；黄瓜(例如，黄瓜(C.sativus)、***瓜(C.melo)、野黄瓜(C.hystrix)、澳大利亚黄瓜(C.picrocarpus)和西印度瓜(C.anguria))；油橄榄；野胡萝卜；甘薯；毛果薯；木薯；生姜；辣根；向日葵(例如，向日葵(H.annuus)和菊芋(H.tuberosus))；***(例如，***(C.sativa)和印度***(C.indica))；欧防风；萝卜；姜黄；薯蓣(例如，参薯(D.rotundata)、脚板薯(D.alata)、蒣(D.polystachya)、黄独(D.bulbifera)、有刺甘薯(D.esculenta)、山药(D.dumetorum)、三浅裂薯蓣(D.trifida)和黄山药(D.cayennensis))；胡椒(例如，树胡椒(P.aduncum)、几内亚胡椒(P.guineense)和黑胡椒(P.nigrum))；玉蜀黍(例如，玉米(Z.mays)和多年生玉米(Z.diploperennis))；大麦(例如，大麦(H.vulgare)、小大麦(H.pusillum)、大蒜芥(H.murinum)、野生大麦(H.marinum)、芒颖大麦草(H.)和短尾大麦(H.intercedens))；棉花(例如，陆地棉(G.hirsutum)、海岛棉(G.barbadense)、亚洲棉(G.arboreum)和草本棉(G.herbaceum))；小麦(例如，小麦(T.aestivum)和提莫非维小麦(T.timopheevii))；葡萄；李(例如，欧洲甜樱桃(P.avium)、杏(P.armeniaca)、樱桃李(P.cerasifera)、欧洲酸樱桃(P.cerasus)、欧洲李(P.domestica)、桃(P.persica)和扁桃(P.dulcis))；苹果；梨(例如，西洋梨(P.communis)、心瓣梨(P.cordata)和沙梨(P.pyrifolia))；野草莓和草莓属×草莓；覆盆子；甘蔗；芦粟；野蕉和芭蕉属×大蕉；稻；烟草；拟南芥；柑桔(例如，来檬(C.×aurantiifolia)、酸橙(C.×aurantium)、青柠(C.×latifolia)、柠檬(C.×limon)、黎檬(C.×limonia)、葡萄柚(C.×paradisi)、甜橙(C.×sinensis)和大红桔(C.×tangerina)；科杨(例如，欧洲山杨(P.tremula)、大叶钻天杨(P.balsamifera)和毛白杨(P.tomentosa))；郁金香；苜蓿；香脂冷杉；东方燕麦；叶片芒果；金盏花；香脂菊；康乃馨；桉(例如，白木桉(E.leucoxylon)、斑皮桉(E.maculata)、苞片桉(E.polybractea)、萨金桉(E.sargentii))；二花凤仙；亚麻；番茄；杧果；莲(例如，荷花(N.nucifera)和莲花(N.pentapatala))；赖草；黑麦；万寿菊；和印加孔雀草。
现在将通过以下非限制性实例进一步说明本发明。
实例
实例1
在此实例中，评估了使用本发明的方法和装置选择的原生质体的复原率(活力)。此实例表明，与可用比较设置获得的相比，本发明的方法和设备允许从原生质体有效地复原完整植物。
方法
原生质体的产生：使用在Yoo、Cho和Sheen,2007中描述的方案获得拟南芥原生质体，并且在缓冲液中洗涤两次以去除任何游离钙离子。然后将经洗涤的原生质体重新悬浮于第一溶液中至细胞浓度为200个细胞/微升。第一溶液包括100mM CaCl2、100mM EDTA、2％w/v海藻酸钠和0.5M甘露醇，通过高压灭菌进行灭菌。
装置制造：获得了如图4A-B(其中图4B示出了图4A的装置的包封区的更详细的视图)和4C-D(其中图4D示出了图4C的装置的包封区的更详细的视图)上所示的微流体芯片。使用标准光刻技术开发微流体芯片的模具。具体地，使用光刻技术在硅晶片上使用SU-8产生阴性模。通过使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)(Sylgard 184Silicone Elastomer Kit；道康宁公司(Dow Corning Corporation))的软平版印刷使用SU-8模具获得复制品，并且使用等离子体结合将复制品粘附到干净的载玻片。
包封：通过细胞加载入口22将原生质体悬浮液引入到装置中，并且将呈矿物油形式的包括0.35％v/v乙酸和4％w/w乳化剂(具体地Span 80)的第二液体引入到端口24中。将两种液体加载到具有鲁尔锁配件以及外径为0.8mm和内径为0.25mm的聚醚醚酮(PEEK)生物相容性管的1ml注射器中。使用注射器泵独立地控制两个注射器的流量，从而产生5微升/小时的第一液体(原生质体溶液)流和63微升/小时的第二液体(油和酸)流。在第一液体(携带细胞以及包封介质前体、海藻酸钠和螯合Ca2+离子)流与第二液体(油和酸)流之间的接点处，形成包括单个原生质体的液滴，并且由于第一溶液中的pH降低，随着第二溶液中的酸在液滴中扩散，第一溶液中的钙离子被释放。这进而导致存在于第一溶液中的藻酸盐将钠交换成钙，并且至少在每个液滴的外层中凝胶化。将经凝胶化的液滴通过连接到输出端口44的管排出，并且收集在包括矿物油在缓冲液相之上的falcon管中。在这种设置中，经凝胶化的胶囊下沉通过油并且收集在缓冲液中。
培养：藻酸盐胶囊在室温下在环境光照下温育，并且取样进行细胞***测量。
比较样品：如上所述获得原生质体并如上所述进行培养，无需进行包封。
图5示出了对于使用图4A-5B上所示的装置根据本发明获得的样品(经包封的原生质体)和包括未经包封的原生质体的比较样品，在培养6天后***原生质体的比例。获得了每个条件的两个重复，并且图6上的误差条示出了所获得的值的95％置信区间。
图6A-B示出了在培养5天之后的比较样品的照片。图6C-D示出了根据本发明的在培养5天之后获得的样品(即，微流体包封之后)的照片。如从图6A-B上可以看出，未经包封的原生质体培养物含有许多受损细胞和片段。相比之下，图6C-D上的包封原生质体包括藻酸盐胶囊内的健康***细胞(由图6C-D上的箭头指示)。如从图6D上可以看出，根据本发明的经包封的原生质体在培养5天之后显示重新形成的细胞壁。
图5和6A-D上的数据显示，根据本发明的包封在培养6天之后将拟南芥原生质体细胞***的可能性增加了600％(图5)，并且产生健康的***细胞。
实例2
在此实例中，发明人试图通过释放存在于第一液体中的螯合Ca2+离子确定第二液体(在此特定实例中为矿物油)中酸的最佳浓度，以触发第一液体中藻酸盐凝胶化。如上所述，通过与Ca2+离子组合触发存在于第一溶液(含有原生质体的溶液)中的藻酸盐凝胶化。在一些实施例中，第一溶液包括钙离子，但钙离子被EDTA结合，因此藻酸盐不能接近并且不触发固化。当第一溶液与酸化的油接触时，乙酸扩散到液滴中。酸的扩散降低了液滴的pH，从而导致EDTA从溶液中掉落并释放钙离子。所释放的钙离子然后触发海藻酸盐的固化。在不希望受理论束缚的情况下，据信较低浓度的酸是优选的，以便降低损害原生质体的风险。然而，如果第二液体中酸的浓度太低，则可能不足以引起藻酸盐的适当凝胶化。优选地，使用液滴中为至少5、至少5.5或约5.7的pH。在实施例中，使用至多6.8或至多6.5的pH。
在15ml falcon管中，将三个10ml的矿物油样品(具有4％Span 80)用0.1％、0.5％和1％v/v的乙酸酸化。添加5μl包封溶液(即，第一溶液，但没有原生质体——100mM CaCl2、100mM EDTA、2％w/v海藻酸钠和0.5M甘露醇，通过高压灭菌进行灭菌)并且使其浸入油的底部。一旦包封溶液液滴已经沉降在底部，将falcon管剧烈摇动以测试液滴的完整性(或包封溶液是否已经固化)。
具有0.5％和1％乙酸的油中的液滴保持完整，而在具有0.1％v/v乙酸的油中的液滴则不完整。因此，以相同的方式对含有0.25％和0.35％乙酸的矿物油进行测试。含有0.25％乙酸的油未使藻酸盐固化，但具有0.35％乙酸的油确实使藻酸盐固化。
这个实验结果表明，相当于0.35％乙酸的酸浓度足以引起第一溶液中的藻酸盐凝胶化。如在以上实例1中所证明的，此类浓度不会引起对原生质体的显著损害。
实例3
在此实例中，将评估使用本发明的方法和装置选择的西红柿(番茄)原生质体的复原率(活力)。此实例表明，与可用比较设置获得的相比，本发明的方法和设备允许从原生质体更有效地复原完整植物。
方法
原生质体的产生：可以使用在Hossain、Imanishi和Egashira,1995和Shahin,1985中描述的方案获得番茄原生质体，并且在不含CaCl2的TM2缓冲液中洗涤两次以去除任何游离钙离子。可以进行与上述实例1中的步骤类似的后续步骤。可以将经洗涤的原生质体重新悬浮于第一溶液中至细胞浓度为200个细胞/微升。第一溶液包括100mM CaCl2、100mMEDTA、2％w/v海藻酸钠和0.5M甘露醇，通过高压灭菌进行灭菌。
装置制造：将获得如图4A-B(其中图4B示出了图4A的装置的包封区的更详细的视图)和4C-D(其中图4D示出了图4C的装置的包封区的更详细的视图)上所示的微流体芯片。可以使用标准光刻技术开发微流体芯片的模具。具体地，可以使用光刻技术在硅晶片上使用SU-8产生阴性模。可以通过使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)(Sylgard 184SiliconeElastomer Kit；道康宁公司)的软平版印刷使用SU-8模具获得复制品，并且使用等离子体结合将复制品粘附到干净的载玻片。
包封：可以通过细胞加载入口22将原生质体悬浮液引入到装置中，并且可以将呈矿物油形式的包括0.35％v/v乙酸和4％w/w乳化剂(具体地Span 80)的第二液体引入到端口24中。可以将两种液体加载到具有鲁尔锁配件以及外径为0.8mm和内径为0.25mm的聚醚醚酮(PEEK)生物相容性管的1ml注射器中。可以使用注射器泵独立地控制两个注射器的流量，从而产生5微升/小时的第一液体(原生质体溶液)流和63微升/小时的第二液体(油和酸)流。在第一液体(携带细胞以及包封介质前体、海藻酸钠和螯合Ca2+离子)流与第二液体(油和酸)流之间的接点处，可以形成包括单个原生质体的液滴，并且由于第一溶液中的pH降低，随着第二溶液中的酸在液滴中扩散，第一溶液中的钙离子被释放。这进而导致存在于第一溶液中的藻酸盐将钠交换成钙，并且至少在每个液滴的外层中凝胶化。可以将经凝胶化的液滴通过连接到输出端口44的管排出，并且收集在包括矿物油在缓冲液相之上的falcon管中。在这种设置中，经凝胶化的胶囊下沉通过油并且收集在缓冲液中。
培养：藻酸盐胶囊可以在室温下在环境光照下温育，并且取样进行细胞***测量。
比较样品：可以如上所述获得原生质体并如上所述进行培养，无需进行包封。
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Claims (26)

1.一种用于繁殖植物材料的方法，所述方法包括：提供包含多种植物原生质体的溶液，所述溶液包含包封介质或包封介质前体；将所述溶液引入到微流体装置中；在所述微流体装置中形成所述溶液的液滴，所述液滴中的至少一些液滴包封单个原生质体；使所述包封介质或所述包封介质前体在所述微流体装置中凝胶化；以及收集经包封的原生质体。
2.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法进一步包括：检测在所述微流体装置中流动的液滴中原生质体的存在；以及将不含有原生质体的液滴引导到与含有原生质体的液滴不同的通道中，任选地其中检测液滴中原生质体的存在包括检测与叶绿素相关联的荧光信号。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述微流体装置中形成所述溶液的液滴包括：将包含原生质体的溶液引入主通道中；以及将第二溶液引入在包封区内与所述主通道相交的两个主通道中，所述第二溶液与包含原生质体的溶液不可混溶；优选地其中：
所述主通道的宽度介于约50μm与约150μm之间、介于约80μm与约120μm之间或为约100μm；和/或
其中侧通道的宽度介于约50μm与约300μm之间、介于约100μm与约300μm之间、介于约150μm与约250μm之间或为约200μm；和/或
所述主通道包括紧邻所述包封区之前和之后的区段，其中所述主通道比紧邻之前和之后的区段更窄，任选地其中较窄区段的直径为约60μm。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述植物原生质体的溶液包括生长促进剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述生长促进剂包括选自包括以下的组的一种或多种化合物：盐、维生素、碳水化合物、生长素、细胞***素、激素、植物磺肽素和寡肽。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包封介质前体或所述包封介质选自：海藻酸钠、琼脂、琼脂糖、植物凝胶或结冷胶。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述溶液包括包封介质前体，并且使所述包封介质前体在所述微流体装置中凝胶化包括使所述微流体装置中的溶液液滴与直接或间接触发所述包封介质前体凝胶化的化合物接触，从而形成经凝胶化的包封介质。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述包封介质前体是海藻酸钠。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述溶液进一步包括Ca2+离子，其中所述Ca2+离子以可释放的方式与所述溶液分离，优选地其中所述Ca2+离子被螯合。
10.根据权利要求9所述的方法，其中触发凝胶化的化合物是酸，优选地无毒酸，如乙酸。
11.根据权利要求7到10中任一项所述的方法，其中使所述微流体装置中的溶液液滴与直接或间接触发所述包封介质前体凝胶化的化合物接触包括将所述化合物包含在与所述第一液体不可混溶并且用于在所述微流体装置中产生液滴的第二液体中。
12.根据权利要求11所述的方法，在从属于权利要求10时，其中所述酸以介于约0.3体积％与约2体积％之间、介于约0.5体积％与约1体积％之间、介于约0.35体积％与约0.5体积％之间或约0.35体积％的浓度存在于所述第二液体中，或者其中所述酸以使得所述液滴中的pH降低到介于5.5与5.9之间，优选地约5.7的浓度存在。
13.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述溶液包括包封介质，并且使所述包封介质在所述微流体装置中凝胶化包括应用在液滴发生器下游触发所述包封介质凝胶化的条件，任选地其中触发所述凝胶化的条件包括温度的降低。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括检测与流过所述微流体装置的所述原生质体相关联的期望特性的存在以及将含有不具有所述期望特性的原生质体的液滴引导到与含有具有所述期望特性的原生质体的液滴不同的通道中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中检测期望特性的存在包括检测与荧光蛋白相关联的荧光信号。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中检测期望特性的存在包括检测指示感染的信号的存在或不存在。
17.根据权利要求16所述的方法，其中检测指示感染的信号的存在包括检测与病原体核酸或病原体蛋白的存在相关联的荧光或化学发光信号。
18.一种选择和繁殖无病害植物材料的方法，所述方法包括用病害标志物处理原生质体的溶液以及应用根据权利要求17所述的方法来分离、选择和繁殖植物材料。
19.一种对具有期望特性的植物材料进行工程化的方法，所述方法包括对原生质体群体进行基因修饰以及应用根据权利要求14或15所述的方法来分离、选择和繁殖植物材料。
20.一种用于繁殖植物材料的***，所述***包括：微流体装置，所述微流体装置包括液滴发生器；第一注射***，所述第一注射***包括第一液体并且被配置成将所述第一液体注射到所述液滴发生器中；以及第二注射***，所述第二注射***包括第二液体并且被配置成将与所述第一液体不可混溶的第二液体单独注射到所述液滴发生器中，其中所述第一液体是包括原生质体的溶液并且所述第一液体包括包封介质或包封介质前体，其中所述***被配置成使得在所述液滴发生器中形成液滴，每个液滴包围单个原生质体或无原生质体并且包括所述包封介质或所述包封介质前体，并且所述液滴中的所述包封介质或所述包封介质前体在微流体中凝胶化，以产生包围单个原生质体或无原生质体的经凝胶化的液滴。
21.根据权利要求20所述的***，其中所述***进一步包括在所述液滴发生器下游的第一检测***和第一分选***，其中所述第一检测***被配置成检测在所述微流体装置中流动的液滴中叶绿素的存在，并且所述第一分选***操作性地连接到所述第一检测***并且被配置成如果所述检测***未检测到液滴中存在叶绿素，则将该液滴引导到所述微流体装置的侧通道中。
22.根据权利要求20或21所述的***，其中所述***包括在所述液滴发生器下游的第二检测***和第二分选***，其中所述第二检测***被配置成检测在所述微流体装置中流动的液滴中期望特性的存在，并且所述第二分选***操作性地连接到所述第二检测***并且被配置成如果所述第二检测***未检测到液滴中存在所述期望特性，则将所述液滴引导到所述微流体装置的侧通道中。
23.根据权利要求20到22中任一项所述的***，其进一步包括用于收集离开所述微流体装置的液滴的收集***以及自动化分配***，所述自动化分配***被配置成将单个液滴沉积到培养物载体上。
24.一种植物细胞，其通过根据权利要求1到19中任一项所述的方法获得，任选地其中所述植物细胞是基因工程化的。
25.一种植物，其从根据权利要求24所述的植物细胞中获得。
26.根据权利要求25所述的植物，其中所述植物选自以下中的一种或多种：茄(Solanumspp.)、芸苔(Brassica spp.)、辣椒(Capsicum spp.)、羽扇豆(Lupinus spp.)、菜豆(Phaseolus spp.)、豇豆(Vigna spp)、蚕豆(Vicia faba)；鹰嘴豆(Cicer arietinum)、豌豆(Pisum sativum)、山黧豆(Lathyrus spp.)、大豆(Glycine max)；四棱豆属(Psophocarpus)；木豆(Cajanus cajan)；花生(Arachis hypogaea)；莴苣(Lactuca spp.)、芦笋(Asparagus officinalis)；芹菜(Apium graveolens)；葱(Allium spp.)、甜菜(Betavulgaris)；菊苣(Cichoriumintybus)；欧蒲公英(Taraxacum officinale)、芝麻菜(Erucaspp.)、南瓜(Cucurbita spp.)、菠菜(Spinacia oleracea)；西洋菜(Nasturtiumofficinale)；黄瓜(Cucumis spp.)、油橄榄(Olea europaea)；野胡萝卜(Daucus carota)；甘薯(Ipomoea batatas)；毛果薯(Ipomoea eriocarpa)；木薯(Manihot esculenta)；生姜(Zingiber officinale)；辣根(Armoracia rusticana)；向日葵(Helianthus spp.)、***(Cannabis spp.)、欧防风(Pastinaca sativa)；萝卜(Raphanus sativus)；姜黄(Curcumalonga)；薯蓣(Dioscorea spp.)、胡椒(Piper spp.)、玉蜀黍(Zea spp.)、大麦(Hordeumspp.)、棉花(Gossypium spp.)、小麦(Triticum spp.)、葡萄(Vitis vinifera)；李(Prunusspp.)、苹果(Malus domestica)；梨(Pyrus spp.)、野草莓(Fragaria vesca)和草莓属(Fragaria)×草莓(ananassa)；覆盆子(Rubus idaeus)；甘蔗(Saccharum officinarum)；芦粟(Sorghum saccharatum)；野蕉(Musa balbisiana)和芭蕉属(Musa)×大蕉(paradisiaca)；稻(Oryza sativa)；烟草(Nicotiana tabacum)；拟南芥(Arabidopsisthaliana)；柑橘(Citrus spp.)、科杨(Populus spp.)；郁金香(Tulipa gesneriana)；苜蓿(Medicago sativa)；香脂冷杉(Abies balsamea)；东方燕麦(Avena orientalis)；叶片芒果(Bromus mango)；金盏花(Calendula officinalis)；香脂菊(Chrysanthemumbalsamita)；康乃馨(Dianthus caryophyllus)；桉(Eucalyptus spp.)；二花凤仙(Impatiens biflora)；亚麻(Linum usitatissimum)；番茄(Lycopersicon esculentum)；杧果(Mangifera indica)；莲(Nelumbo spp.)；赖草(Poaceae spp.)；黑麦(Secalecereale)；万寿菊(Tagetes erecta)；和印加孔雀草(Tagetes minuta)。
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