CN113736687B - 一株抗病促生耐盐芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株抗病促生耐盐芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)，保藏号为CGMCC No.19502。本发明所述耐盐芽孢杆菌对茄腐皮镰刀菌引起的根腐病具有很强的抑制作用，用该菌菌液防治油用牡丹根腐病具有较好的防治效果，且还能够促进油用牡丹植株的生长，从而可减少化肥和农药投入、减轻环境污染，实现农业可持续发展。

Description

一株抗病促生耐盐芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及植物病害生物防治微生物领域，尤其涉及一株抗病促生耐盐芽孢杆菌及其应用。
背景技术
油用牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)是一种原产于我国的新型木本油料作物，其产籽能力强、种籽出油率高，且牡丹籽油中含有超过90％的不饱和脂肪酸，特别是其中α-亚麻酸高于40％，是橄榄油的40倍，具有养生保健、抗氧化、美容等功效。目前，油用牡丹已在我国山东、河南、陕西、山西、安徽、甘肃等地大面积种植。随着种植面积的扩大以及种植年限的增加，油用牡丹各种病害的发生也逐年上升，引起牡丹籽的减产，同时影响牡丹籽油品质，其中危害较严重的是根腐病，它是一种由茄腐皮镰刀菌(Fusarium solani)引起的土传病害。
目前在生产实践中对土传病害的防治主要是使用一些化学农药进行土壤消毒或通过作物轮作方式预防，但农药的使用会造成环境污染和食品安全问题，而且增加生产成本，还会诱发病原菌产生抗药性。生防防治预防土传病害是一种绿色、环保、经济的方法，在有效控制病害的同时，对于人类和动植物安全无害，并且减少环境污染，符合国家对可持续农业和环境友好型社会的发展要求，成为近年来病害防治的研究热点。
生防微生物主要包括真菌类(如木霉、青霉等)、放线菌类(如链霉菌)、细菌类(如芽孢杆菌、假单胞杆菌等)。而细菌中芽孢杆菌(Bacillus spp.)因能产生芽孢抵抗恶劣的条件，且繁殖速度快，易在土壤定殖等优点被广泛应用。目前筛选到的具有抑制植物病原微生物的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)、暹罗芽孢杆菌(B.siamensis)等。2019年中国专利(公开号：CN109825457A)公开了一株耐盐芽孢杆菌(B.halotolerants)E40207a2对马铃薯Y病毒引起的病毒病害具有显著拮抗作用；和中国专利(公开号：CN110343641A)公布了一株耐盐芽孢杆菌(B.halotolerants)SYW-1可有效防治棉花黄萎病，有利于提高棉花的产量和品质；此外，中国专利(公开号：CN110819565A)公布的一株耐盐芽孢杆菌(B.halotolerants)BW9具有较强的拮抗活性、产铁载体活性和固氮作用，可以有效的抑制多种植物病原菌，由此说明耐盐芽孢杆菌具有作为生防微生物的潜力。同时上述专利结果也表明，同一种耐盐芽孢杆菌对不同病原菌的拮抗效果存在较大差别，因此在应用耐盐芽孢杆菌作为生防制剂的过程中，需要继续筛选更多能够防治其他病害的菌株，为该菌的应用提供更丰富的菌种资源。
生防菌株的筛选环境主要是土壤，包括根际土壤和非根际土壤。根际土壤是受植物根系影响最显著的土壤环境，使微生物的数量和种类也明显高于非根际土壤。根际微生物具有多种功能，如解磷菌、固氮菌及其他植物促生菌、抗病菌等，因此是获得多种功能微生物的资源库。研究报道，有学者对牡丹根腐病病原菌具有拮抗作用的生防菌进行了筛选(王雪山等，牡丹根腐病拮抗菌的筛选与鉴定，山东农业科学，2012年第44卷第7期；吴玉柱等，6种生防真菌、细菌防治牡丹根腐病的研究，山东林业科技，2004年第6期)，但研究对象均为观赏性牡丹，关于以结籽为目的的油用牡丹根腐病病原菌生防菌的筛选的研究还鲜见报道。为了确保油用牡丹丰产稳产，保证牡丹籽油的品质，降低油用牡丹根腐病的发生，有必要针对该病害进行生防微生物的筛选，充分挖掘和利用利用其根际有益微生物。
发明内容
本发明目的在于提供一株具有抗病促生耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)LS147及其应用，该菌对茄腐皮镰刀菌引起的根腐病具有很强的抑制作用，用该菌菌液防治油用牡丹根腐病具有较好的防治效果，且还能够促进油用牡丹植株的生长，从而可减少化肥和农药投入、减轻环境污染，实现农业可持续发展。
本发明的耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)LS147，是从山西长治地区健康的5年生油用牡丹植株的根际土壤分离筛选出来的菌种，对茄腐皮镰刀菌有很强的抑制效果。在LB固体培养基上该菌株生长快速，菌落为灰白色，不透明，培养36h后出现皱褶，菌体杆状，具有芽孢，革兰氏染色阳性，能够利用淀粉，明胶，产生过氧化化氢酶，产氨，V.P.测定为阳性。将菌株LS147进行16S rRNA基因扩增和测序分析，结果表明菌株LS147与Bacillushalotolerans(NR 115929.1和NR 115063.1)同源性最高达99％以上，与其他芽孢杆菌相距较远。基于以上特征，将LS147菌株命名为耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)，该菌于2020年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNo.19502，经检测存活。
本发明进一步提供所述的耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)在防治植物根腐病中的应用。优选地，所述植物是油用牡丹，进一步优选地所述根腐病是由茄腐皮镰刀菌(Fusarium solani)引起的根腐病。
具体应用时，是利用所述耐盐芽孢杆菌的菌液对植物进行灌根。所述耐盐芽孢杆菌的菌液是菌体悬浮液，优选地制备方法如下：将所述耐盐芽孢杆菌进行液体培养，优选是在LB液体培养基中，于28℃、140rpm摇床中培养48～96h，获得发酵液作为菌体悬浮液，更优选地，用无菌蒸馏水稀释至发酵液至108cfu·mL-1作为菌体悬浮液。
本发明还提供所述的耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)在促进植物生长中的应用。优选地，所述植物是油用牡丹。
本发明还提供所述的耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)在防治由板栗疫病病原菌(Cryphonectria parasitica)、细菌性杨树溃疡病原菌(Botryosphaeriadothidea)、辣椒疫霉病病原菌(Phytophthora capsici)、大白菜根腐病病原菌(Fusariumoxysporum)、番茄细菌性斑点病原菌(Pseudomonas syringae)、胡萝卜软腐病原菌(Pectobacterium carotovorum)或/和番茄青枯病原菌(Ralstonia solanacearum)引起的植物病害中的应用。
本发明通过实施验证表明，所述耐盐芽孢杆菌LS147对于油用牡丹根腐病具有较好的防治效果，且具有良好防效的同时，能够促进油用牡丹植株的生长。此外，本发明耐盐芽孢杆菌LS147除了对茄腐皮镰刀菌引起的根腐病具有很强的抑制作用，对板栗疫病病病原菌、番茄青枯病病原菌和细菌性杨树溃疡病原菌也具有很强的抑制作用，此外对辣椒疫霉病病原菌、大白菜根腐病病原菌、番茄细菌性斑点病原菌具有较强的抑制作用，对胡萝卜软腐病原菌也有一定的抑制作用，其抑菌作用优于实验室保存的一株耐盐芽孢杆菌LS10，由此说明耐盐芽孢杆菌LS147具有潜在的对多种病害的预防效果。因此，将可将本发明耐盐芽孢杆菌作为生防制剂用于防治植物根腐病特别是油用牡丹根腐病，从而可减少化肥和农药投入、减轻环境污染，实现农业可持续发展。
附图说明
图1使用软件MEGA X基于ITS序列构建茄腐皮镰刀菌的***发育树。
图2使用软件MEGA X基于mtSSU序列构建茄腐皮镰刀菌的***发育树。
图3LS147菌落特征。
图4本发明LS147菌株16S rDNA***发育树。
图5耐盐芽孢杆菌产铁载体能力鉴定。
图6耐盐芽孢杆菌LS147菌株生长曲线。
图7灌根处理后不同时间双抗标记菌株在土壤中定殖数量变化。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例1耐盐芽孢杆菌LS147的分离、鉴定
1、土壤样品来源
土壤取自山西长治市襄垣县油用牡丹种植基地，选取生长健康的5年生油用牡丹植株，将植株连根拔起，轻轻抖落后用无菌毛刷刷取粘在根部的土壤(即根际土)，每5棵植株的样品混为一个土样，将土壤装入无菌塑封袋，带回实验室于4℃冰箱中保存。
2、芽孢杆菌菌株的分离
取10g根际土壤样品放于90mL的无菌蒸馏水中，均匀振荡30min后，85℃水浴锅中高温水浴处理30min以杀死绝大部分非芽孢细菌，将上层清液分别稀释至10-3，10-4，10-5倍。取100μL稀释液涂布于LB固体培养基上(NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5)。倒置培养于37℃恒温培养箱，24-36h后观察平板，挑选形态，色泽，大小不同的菌落于固体LB平板上划线。将纯化后的菌株保存于4℃冰箱，供下一步拮抗菌的筛选。
3、病原菌的采集
病原菌的采集过程具体如下：
1)油用牡丹根腐病的采集：采自山西长治地区油用牡丹主要种植基地，品种为凤丹牡丹，采集具有地上部枯萎、地下部腐烂变黑的典型根腐病症状的油用牡丹植株，标记后带回实验室。2)培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：200g去皮马铃薯切成小块后，放于蒸馏水中煮，待水开后用8层纱布过滤并用蒸馏水补充至1L，加入20g葡萄糖和16g琼脂粉。3)病原菌的分离与纯化：采用常规组织法进行病原菌的分离：先将凤丹病根用自来水洗净，取其病健交界处，依次用75％的酒精处理30s、0.1％升汞处理30～60s，无菌水冲洗3遍，将冲洗好的牡丹根切成4～5mm的方块放入加入链霉素(1％)的PDA培养基中，放在28℃培养箱中培养，将经过单孢分离与纯化的菌株保存于4℃冰箱，备用。4)病原菌的致病性测定：分离到的所有菌株进行致病性实验，使用长势一致并且无任何病害的3年生凤丹，用已灭菌的接种***凤丹根部表皮，接下来将根部放在1×108个·ml-1的孢子悬浮液中浸泡30min，以无菌水浸泡30min为空白对照。然后将凤丹种植在基质土中，每盆2棵，每个处理10棵凤丹苗，重复3次，然后放置在25℃温室中，接种48h后每天浇水，保证其发病条件。种植30天后调查凤丹植株的发病程度，计算病情指数。5)病原菌的鉴定：包括形态观察和分子生物学鉴定，在马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)(配方：200g去皮马铃薯切成小块后，放于蒸馏水中煮，待水开后用8层纱布过滤并用蒸馏水补充至1L，加入20g蔗糖和16g琼脂粉)中接种病原菌，观察并记录菌落的特征。在康乃馨琼脂培养基(CLA)(配方：已烘干灭菌的康乃馨叶片若干，琼脂20g，蒸馏水1L)中接种病原菌，待长出菌落后用显微镜观察分生孢子的形态特征。利用OMEGA真菌提取试剂盒进行病原菌基因组DNA的提取，采用通用引物ITS：(ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和引物mt SSU(NMS1a:5’-CAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATG-3’，NMS2b:5’-GCGGATCATCGAATTAAATAACAT-3’)进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL，DNA模板2μL，上下游引物各1μL，ddH2O 8.5μL，2×Taq PCR SuperMix 12.5μL。PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，退火(ITS：55℃1min；mt SSU：60℃1.5min)，72℃延伸1min，35个循环；72℃再延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检查后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果在NCBI中进行BLAST分析，使用MEGA X软件进行***发育树构建。
结果：在山西省长治地区油用牡丹‘凤丹’大田共采标样22株，共分离获得43个纯培养菌株，依据菌落形态特征，其中41个分离物属于茄腐皮镰刀菌(F.solani)，分离频率为95.35％，再根据显微观察，初步鉴定为上述分离物归属为8株茄腐皮镰刀菌。致病性测定结果表明，有4株茄腐皮镰刀菌使所处理的植株发病较严重，且可再分离到所接菌株，其菌株编号分别为FD1、FD8、FD10、FD13，发病率为100％，病情指数分别为86.67％、85.00％，36.67％，71.67％。发病植株主要症状为根部变黑，出现腐烂，与田间结果一致。将致病性实验中已发病的根再接入到PDA平板中进行菌株的分离，在相同营养与培养条件下，所分离的菌株与所接菌株形态相同，根据柯赫法则，证明所接菌株为凤丹根腐病的病原菌。以上实验说明菌株FD1、FD8、FD10、FD13为油用牡丹‘凤丹’的病原菌，但致病力有所不同。对上述4株菌进行分子鉴定，菌测序结果在GenBank中进行比对，其序列与茄腐皮镰刀菌(F.solani)的相似性达到98％～100％(***发育树请见图1和图2)，再结合形态学观察，明确引起油用牡丹根腐病的4株病原菌均是茄腐皮镰刀菌(F.solani)。
4、拮抗菌的初筛
采用平板对峙培养法，对上述分离菌株进行拮抗效果的筛选。在改良PDA培养基(即PDA培养基与LB培养基1:1比例混合：18.5g PDA，NaCl 5g，胰蛋白胨5g，酵母浸粉2.5g，琼脂粉10g，蒸馏水1000mL)平板中央，将活化好的病原菌(选择引起油用牡丹根腐病发病率最高的4株茄腐皮镰刀菌FD1、FD8、FD10、FD13)用灭菌打孔器取直径为0.5cm的圆形病原菌块放在平板中心，将待检测芽孢杆菌点接在距离病原菌块2.5cm处，每个平板接3种芽孢杆菌，28℃培养箱中培养5-7d，每天观察并记录芽孢杆菌对病原菌的抑制情况。
5、拮抗菌的复筛
将初筛中对病原菌(FD1、FD8、FD10、FD13)均有抑制作用的芽孢杆菌进行复筛。拮抗菌的复筛：挑单菌落接种在LB液体培养基中，37℃、150rpm培养24-48h，培养好的菌液用于接下来的平板对峙实验。在改良PDA平板中心接种已活化的直径0.5cm病原菌块，在距离病原菌块2.5cm的两侧对称打孔，每孔加入100μL的菌液，每个菌株重复3次，在28℃培养箱中培养5-7d后用游标卡尺测定测量病原菌生长情况和拮抗半径，计算抑菌率。初筛结果表明，对4株茄腐皮镰刀菌均具有抑菌作用的菌株共有22株，且不同拮抗菌株对4株茄腐皮镰刀菌的抑制效果存在差异。选择对4株茄腐皮镰刀菌均具有较强抑制效果的3株菌进行抑菌率的统计，结果见表1。综合来看，抑菌效果最好的是LS147，对4株茄腐皮镰刀菌的抑菌率在65.73％-78.54％之间。
表1拮抗菌株对4株病原菌的抑菌率(％)
Figure BDA0003154093240000061
6、拮抗菌LS147的理化特征及16S rRNA分子鉴定
参照《常见细菌***鉴定手册》对拮抗茄腐皮镰刀菌效果较好的菌株LS147进行形态学观察和生理生化鉴定，同时将菌株LS147进行16S rRNA基因扩增和测序分析。在LB固体培养基上该菌株生长快速，菌落为灰白色，不透明，培养36h后出现皱褶，菌体杆状，具有芽孢，革兰氏染色阳性，能够利用淀粉，明胶，产生过氧化化氢酶，产氨，V.P.测定为阳性，结果见图3、表2。16S rRNA基因测序后在NCBI上进行BLAST比对分析，结果表明，该菌与Bacillushalotolerans(NR 115283.1)同源性最高达100％，与其他芽孢杆菌相距较远。基于以上特征，将LS147菌株命名为耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)(图4)，该菌于2020年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.19502。
表2 LS147菌株形态特征及生理生化测定结果
Figure BDA0003154093240000071
注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。
实施例2耐盐芽孢杆菌LS147固氮及促生功能测定
具有植物促生作用的微生物一般是通过产生某些促生因子分泌到环境中，从而促进植物生长。实验室条件下通过测定微生物是否产生吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)、产生铁载体和ACC脱氨酶来判断其对植物的促生作用。
1、产铁载体能力鉴定
将活化好的耐盐芽孢杆菌LS147接种在CAS培养基中，在28℃培养48h-144h，根据菌落周围是否产生橙黄色透明圈判断菌株是否具有产铁载体能力。
2、ACC脱氢酶活性鉴定
将活化好的耐盐芽孢杆菌LS147先划线接种在DF培养基中，37℃倒置培养24～36h后，将DF培养基中的菌株转移至以ACC为唯一氮源的ADF培养基中培养，若该菌株可以正常生长，则说明该菌株能够利用ACC，具有ACC脱氢酶活性；反之则无。
3、固氮能力鉴定
将菌株用干净牙签将待测菌株挑入Ashby无氮固体培养基，传代6代，能良好生长说明有固氮能力，无法长出说明不具固氮能力。
各种培养基及配方如下：
液体LB培养基：NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，定容至1L，pH 7.0-7.5；
DF培养基：KH2PO4 4g，Na2HPO4 6g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.2g，葡萄糖2g，葡萄糖酸2mL，柠檬酸2g，(NH4)2SO4 2g，定容至1L，pH 7.2。
ADF培养基：以3mmol/LACC代替DF培养基中的(NH4)2SO4为唯一氮源。
CAS检测培养基，包括如下溶液：
溶液a：将0.012g CAS(铬天青S)溶于10mL蒸馏水中，再加入含有10mmol/L HCl的2mL1mmol/L FeCl3溶液；
溶液b：取0.015g HDTMA(十六烷基三甲基溴化铵)溶于8mL蒸馏水中；
染料溶液c：将溶液a缓慢加入溶液b中，轻轻晃动，使得两溶液互相混合均匀，得到染液c；
将10×MM9盐溶液：(Na2HPO4，30g；KH2HPO4，1.5g；NaCl，2.5g；NH4Cl，5g；双蒸水，500mL)20mL和哌嗪二乙醇磺酸6.04g加入有150mL的双蒸水的洁净三角瓶中，混匀后用50％的NaOH调节pH到6.8，并加入琼脂粉3.2g，并得到培养基d。
将染料溶液c，培养基d和1mmol/L CaCl2，1mmol/L MgSO4·7H2O(张璐，2014)，20％的葡萄糖分别灭菌(115℃，20min)，10％的酸水解酪蛋白过滤除菌后，都置于50℃水浴锅保温待用。
分别量取上述0.2mL 1mmol/L CaCl2，4mL 1mmol/L MgSO4·7H2O，6mL 10％的酪蛋白氨基酸及2mL 20％的葡萄糖，加入培养基d中再沿瓶壁加入染液c，充分混匀(但勿产生气泡)，即得蓝色定性检测培养基，然后按每皿30mL倾注于培养皿中，置于无菌操作台待用。
Ashby无氮固体培养基：甘露醇10g；NaCl 0.2g；CaCO3 5g；KH2PO4 0.2g；MgSO40.2g；CaSO4 0.1g；琼脂粉18g；水1000mL。
结果如图5所示，耐盐芽孢杆菌LS147菌落周围产生了橙黄色透明圈，说明该菌能够产生铁载体；此外菌株能够在仅含有ACC为唯一氮源的ADF培养基中生长，表明其具有产ACC脱氨酶能力；在Ashby无氮固体培养基上连续传代培养6代后，耐盐芽孢杆菌LS147仍然可以在该无氮培养基上生长，表明其具有固氮能力。
实施例3耐盐芽孢杆菌LS147的生长及定殖能力
作为生防菌剂，除了需要具有抗病能力，还需要具有较强的生长速率，并确保在施用田间后能够在较长时期保持其生物活性，因此测定了耐盐芽孢杆菌LS147在生长曲线和在土壤中的定殖情况。
1、生长特性测定：取耐盐芽孢杆菌LS147种子液以1％接种量接种在20mL LB液体培养基中，37℃，130r/min的摇床中培养，分别在2、4、6、8、10、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72h取菌液，用酶标仪在590nm下测定吸光值(OD590)，绘制生长曲线。
2、定殖能力测定：首先对耐盐芽孢杆菌LS147进行利福平和氨苄青霉素两种抗生素的标记，在装有20mL LB液体培养基的三角瓶中加入利福平溶液，使其终浓度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL、160μg/mL、200μg/mL、300μg/mL。吸取100μL已活化好的菌液加到含有10μg/mL利福平的培养基中，28℃培养36～48h，吸取该瓶中100μL菌液转移至含有20μg/mL利福平的培养基中培养，这样依次培养，即可筛选出具有利福平抗性的突变菌株。将具有利福平抗性的突变菌株使用相同方法进行氨苄青霉素抗性标记，将菌株逐步在含有10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL氨苄青霉素的培养基中进行培养，使得菌株获得双抗标记。以茄腐皮镰刀菌(FD1、FD8、FD10、FD13)为材料，采用平板对峙法对双抗标记菌株的抑制效果进行验证，确保其保持原来抗病能力。将上述菌种培养后制成108CFU/mL的菌悬液，灌根处理种植有2年生油用牡丹的盆栽中，每盆菌液添加量为50mL，每个处理3盆。分别在灌根后1周、4周、7周、10周、15周进行根际土壤取样，采用梯度稀释法，取10-3、10-4和10-5稀释度的土壤稀释液在同时含有利福平和氨苄抗性的LB培养基上进行涂布，于30℃培养箱中培养24～72h，计数并计算土壤中菌株的数量，并对回收菌株抑菌能力进行检测，以验证耐盐芽孢杆菌LS147在土壤中的定殖能力。
结果表明，耐盐芽孢杆菌LS147生长快速，接种6h开始进入对数期，并于接种后18h后达到稳定期，之后一直保持稳定的菌体数量(见图6)。经双抗标记后菌株仍然保持了抑菌效果，且抑菌能力未发生显著变化，结果见表3；菌液灌根处理不同时间后活菌数量呈现一定的下降趋势，但在处理7周后，活性数能够稳定在一定水平，即使在处理后15周，活菌数仍然维持在每克土壤6×106CFU以上，一定的活菌数量保证了菌种抗病性的发挥，为其作为生防菌剂的应用提供了保障(见图7)。
表3 LS147双抗标记菌株与原始菌株抑菌率变化
Figure BDA0003154093240000091
实施例4耐盐芽孢杆菌LS147的拮抗功能谱
选择发病率较普遍的植物真菌病害和细菌病害的病原微生物为实验材料，采用平板对峙法对耐盐芽孢杆菌LS147拮抗菌谱进行测定，同时选择实验室保存的另外一株抗病耐盐芽孢杆菌LS10为对照菌株。其中病原真菌为：1.辣椒疫霉病病原菌(Phytophthoracapsici)；2.板栗疫病病原菌(Cryphonectria parasitica)；3.杨树立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；大白菜根腐病病原菌(Fusarium oxysporum)。病原细菌为：1.番茄细菌性斑点病原菌(Pseudomonas syringae)；2.胡萝卜软腐病原菌(Pectobacteriumcarotovorum)；3.番茄青枯病原菌(Ralstonia solanacearum)；4.细菌性杨树溃疡(Botryosphaeria dothidea)。
结果表明(表4)，耐盐芽孢杆菌LS147除了对茄腐皮镰刀菌引起的根腐病具有很强的抑制作用，对板栗疫病病病原菌、番茄青枯病病原菌和细菌性杨树溃疡病原菌也具有很强的抑制作用，此外对辣椒疫霉病病原菌、大白菜根腐病病原菌、番茄细菌性斑点病原菌具有较强的抑制作用，对胡萝卜软腐病原菌也有一定的抑制作用，其抑菌作用优于实验室保存的一株耐盐芽孢杆菌LS10，由此说明耐盐芽孢杆菌LS147具有潜在的对多种病害的预防效果。
表4耐盐芽孢杆菌LS147抑菌谱
Figure BDA0003154093240000101
注：“-”无拮抗；“+”0<拮抗半径<3mm；“++”3<拮抗半径<8mm；“+++”拮抗半径>8mm。
实施例5耐盐芽孢杆菌LS147对油用牡丹根腐病的防治效果
将在LB液体培养基中培养了18h的耐盐芽孢杆菌LS147作为种子液，以1％的接种量接种于LB液体培养基中，于28℃、140rpm摇床中培养48～96h，用无菌蒸馏水稀释发酵液菌体深度至108cfu/mL备用。将病原菌茄腐皮镰刀菌FD1、FD8、FD10、FD13用打孔器打成直径为7mm的菌块，混合接入PD培养基中，每250ml接种8块菌片，28℃、160rpm摇床中培养7d，离心后用纱布过滤得到菌丝体，将其放入搅拌机中加无菌水打碎，用蒸馏水稀释至孢子为106个/mL备用。以2年生的油用牡丹植株为试验材料，挑选大小一致，健康的植株，用清水洗去浮土，用75％的酒精清洗一遍后进行移植。在直径为24.5cm、高20.5cm的塑料盆中装土5kg，均匀栽种6棵牡丹苗，定期浇水。在缓苗两个月后，采用灌根法进行接菌液种。共设置5个处理组：处理1(CK)：对照，自来水100mL；处理2(R)：接种耐盐芽孢杆菌LS147，生防菌悬液和清水各50mL；处理3(P+R)：同时接种耐盐芽孢杆菌LS147和病原菌，生防菌悬液和病原菌孢子悬浮液各50mL；处理4(P)：接种病原菌，病原菌孢子悬浮液和清水各50mL；处理5(P+C)：接种病原菌，同时添加化学农药恶霉灵，病原菌孢子悬浮液和500倍恶霉灵稀释液各50mL。每个处理3次重复。生防菌菌悬液和恶霉灵每隔7d灌根一次，共灌根3次，在最后一次灌根两个月后进行收苗。统计发病率，计算病情指数；测定植株株高、根鲜重、株鲜重等指标。
在第3次生防菌液灌根后，继续种植2个月后收苗，统计植株发病情况，结果如表5所示，在没有添加病原菌的处理CK和处理R中，植株均未发病，在只添加病原菌的处理P中，植株全部发病，出现根部腐烂变黑，病害发生严重，病情指数为87.96％。在添加病原菌与耐盐芽孢杆菌LS147的处理P+R和添加病原菌与药剂的处理P+C中，发病率和病情指数显著低于处理P，P+R处理组发病率和病情指数分别降低了55.38％和60.74％，虽然比P+C处理组的效果略低，但P+R和P+C处理与之间没有达到显著差异，说明耐盐芽孢杆菌LS147对于油用牡丹根腐病具有较好的防治效果。
表5耐盐芽孢杆菌LS147对油用牡丹根腐病的防治效果
Figure BDA0003154093240000111
生防菌液处理对油用牡丹植株的促生作用结果如表6所示，只添加病原菌的处理P各项植株指标显著低于其他处理组，说明病害的发生阻滞了油用牡丹植株的正常生长。耐盐芽孢杆菌LS147的处理R植株鲜重、干重、地上部植株高度和根长各项指标均大于处理CK，说明耐盐芽孢杆菌LS147具有促进植物生长的作用。与添加病原菌的处理P相比，添加病原菌与耐盐芽孢杆菌LS147的处理P+R能够明显提高植物的鲜重、干重、地上部植株高度和根长；和添加病原菌与药剂的处理P+C相比，处理P+R的各项指标均大于处理P+C组，但植株各指标间没有达到显著差异。以上结果表明耐盐芽孢杆菌LS147具有良好的病害防治效果的同时，能够促进油用牡丹植株的生长。
表6耐盐芽孢杆菌LS147对油用牡丹的影响
Figure BDA0003154093240000112

Claims (11)

1.一株耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans），保藏号为CGMCC No. 19502。
2.如权利要求1所述的耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）在防治植物根腐病中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物是油用牡丹。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述根腐病是由茄腐皮镰刀菌（Fusarium solani）引起的根腐病。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：其利用所述耐盐芽孢杆菌的菌液对植物进行灌根。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述耐盐芽孢杆菌的菌液是菌体悬浮液。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述菌体悬浮液的制备方法如下：将所述耐盐芽孢杆菌在LB液体培养基中，于28 ℃、140 rpm摇床中培养48～96 h，获得发酵液作为菌体悬浮液。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：用无菌蒸馏水稀释发酵液至108 cfu·mL-1作为菌体悬浮液。
9.如权利要求1所述的耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）在促进植物生长中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物是油用牡丹。
11.如权利要求1所述的耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）在防治由板栗疫病病原菌（Cryphonectria parasitica）、细菌性杨树溃疡病原菌（Botryosphaeria dothidea）、辣椒疫霉病病原菌（Phytophthora capsici）、大白菜根腐病病原菌 （Fusarium oxysporum）、番茄细菌性斑点病原菌（Pseudomonas syringae）、胡萝卜软腐病原菌（Pectobacterium carotovorum）或/和番茄青枯病原菌（Ralstonia solanacearum）引起的植物病害中的应用。
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