CN113728923B

CN113728923B - 一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法

Info

Publication number: CN113728923B
Application number: CN202111158334.8A
Authority: CN
Inventors: 汪玲敏; 但忠; 木万福; 麻继仙; 杨龙; 李易蓉; 苏银玲; 唐正富; 吕维梧; 李丽琼; 陈光平; 杨子祥
Original assignee: RESEARCH INSTITUTE OF TROPICAL ECO-AGRICULTURAL SCIENCES YUNAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: RESEARCH INSTITUTE OF TROPICAL ECO-AGRICULTURAL SCIENCES YUNAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2041-09-30
Also published as: CN113728923A

Abstract

本发明属于番茄育种技术领域，具体公开一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法，包括以下步骤，外植体的选择；外植体消毒；预处理：将灭菌后的花蕾切开取出花药，接种于愈伤组织分化培养基MS+1mg/L 6‑BA+0.5mg/LNAA+0.1mg/L 2,4‑D+40g/L蔗糖中，放入4℃冰箱预处理24h；愈伤组织分化培养；诱导愈伤组织快速增殖：待愈伤组织形成后，切下愈伤组织转接到愈伤增殖培养基；发明以番茄花药为外植体，利用植物组织培养技术成功诱导出番茄花药愈伤组织，诱导率高达48%，并对诱导出的愈伤组织进行100%快速增殖，增殖系数达4.25；大量番茄花药愈伤的获得为再生单倍体植株奠定坚实的基础，对番茄单倍体育种技术的推进具有重要意义。

Description

一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法

技术领域

本发明属于番茄育种技术领域，涉及一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法。

背景技术

番茄属于茄科番茄属一年生或多年生草本植物，原产于南美西部高原秘鲁、厄瓜多尔一带。番茄在我国仅有一百多年的栽种历史，但由于番茄风味独特、营养价值丰富，其内含的番茄红素及胡萝卜素具有抗氧化、抗衰老和预防癌症等功效而深受广大消费者的喜爱；并且番茄在栽培后能够取得较好的经济效益，故在国内外的栽培面积都在不断扩大。

近年来，我国的番茄种植面积及产量常年保持在110万hm²和5500万t以上，占全国蔬菜总产量的7%左右。但随着栽培面积的逐步扩大，番茄病害蔓延迅速，番茄黄化曲叶病毒病、褪绿病毒病、斑萎病毒病等病毒病在我国番茄各大主产区频发，对我国番茄的产量和品质造成了极大的危害，严重威胁到了我国番茄的安全生产。对于番茄多抗、优质的高端品种的需求越发迫切，但由于我国番茄栽培历史较短，番茄资源丰度及育种手段均与国外育种公司存在较大差距，故加快培育具有自主知识产权的优质多抗的番茄品种任重道远。

番茄属于自花授粉作物。目前国内的番茄育种多采用常规育种手段，经过多代自交提纯分离后获得纯系，但传统育种方法存在耗时、费工及多代自交后代植株易出现自交衰退等诸多问题，严重影响番茄育种进度。而双单倍体育种技术近年来逐渐成为育种家研究的热点，其花药培养及游离小孢子培养技术可以诱导花药雄核发育而形成单倍体植株，从而创制出具有目标性状的育种材料，可极大的缩短育种时间，提高育种效率，是一种番茄育种有效手段。但番茄属难用于诱导单倍体植株再生的顽拗性作物，目前番茄花药培养及游离小孢子培养技术均不成熟，大部分研究均集中在小孢子发育时期选择、非生物胁迫诱导、培养基选择及激素组合研究等方面，而研究结果大多停滞在花药愈伤组织或多细胞团及多核体阶段，且花药愈伤组织诱导率均较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法，为番茄双单倍体育种奠定基础。

为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：

一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法，包括以下步骤：

（1）外植体的选择：选择生长健壮的番茄植株上花粉发育时期处于单核靠边期的番茄花药作为外植体；

（2）外植体消毒；

（3）预处理：将灭菌后的花蕾切开取出花药，接种于愈伤组织分化培养基MS+1mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.1mg/L 2,4-D+40g/L蔗糖中，放入4℃冰箱预处理24h；

（4）愈伤组织分化培养：预处理完成后，将其放入25℃培养箱暗培养一周，后在25℃培养箱中光照培养14h/d，光照强度2500lx，两周更换一次培养基，直至愈伤形成；

（5）诱导愈伤组织快速增殖：待愈伤组织形成后，切下愈伤组织转接到愈伤增殖培养基MS+0.1mg/LZT+1mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+300mg/L水解酪蛋白30mg/L α-维生素E+40g/L蔗糖中进行愈伤增殖培养。

所述步骤（1）中，外植体于清晨7-8点时采摘，采摘番茄花蕾后立即放入冰盒。

本发明所述步骤（1）中所选花粉发育时期处于单核靠边期的番茄花药形态大致为花蕾即将开放，花瓣完全闭合，萼片矮于花瓣，花瓣及花药均为黄绿色状态，且必须选择生长健壮的番茄植株上的花蕾。

所述步骤（2）中，外植体消毒的步骤为：将已采摘的番茄花蕾先用洗洁精快速清洗一遍，再用流水冲洗2-3分钟，滤纸吸干水分，在75%酒精中浸泡20s，灭菌水清洗3次，7%次氯酸钠溶液中浸泡9min，灭菌水清洗3次，用灭菌滤纸吸干水分备用。

本发明所述步骤（2）中采摘花蕾先用洗洁精清洗一遍后可以大大降低污染率，在用75%酒精和1%次氯酸钠浸泡过程中要不断摇晃瓶体，使消毒液与花蕾充分接触，且用无菌水清洗后必须用无菌滤纸吸干花蕾上的水分，否则花蕾在后期操作过程中褐化严重。

所述本发明适用的番茄为大中型粉果番茄。

本发明的有益效果是：

1、采用本发明进行番茄花药愈伤诱导时，适宜花药培养的外植体选择容易，可从花药外观形态判断其花粉发育时期，不用每次试验都采用镜检及测量花蕾长度来确定花药发育时期，极大简化了试验操作流程，节约了大量时间成本。

2、本发明采用先接种后进行低温预处理的方式刺激愈伤组织形成，可使番茄花药愈伤组织诱导率比ck高15.7%。

3、3、本发明以番茄花药为外植体，利用植物组织培养技术成功诱导出番茄花药愈伤组织，诱导率高达48%，并对诱导出的愈伤组织进行100%快速增殖，增殖系数达4.25；大量番茄花药愈伤的获得为再生单倍体植株奠定坚实的基础，对番茄单倍体育种技术的推进具有重要意义。

附图说明

图1 为番茄花药培养示意图（A为番茄花药刚接种到培养基上的示意图；B为番茄花药分化出愈伤组织的示意图；C为番茄愈伤组织刚接种到愈伤组织增殖培养基中的示意图;D为番茄愈伤组织增殖后的示意图）。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明所使用的材料均在市场可以进行购买，所使用的番茄品种亮粉和粉莹购买于云南思农蔬菜种业发展有限责任公司；正康198购买于元谋正康农业科技有限责任公司。

实施例1

以亮粉品种花药为外植体；

一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法，具体实施步骤：

步骤1，适宜外植体的选择：

选择生长健壮的番茄植株上花粉发育时期处于单核靠边期的番茄花药作为外植体，在清晨7-8点时，采摘番茄花蕾后立即放入冰盒（放有冰块的保温泡沫盒）；

步骤2，外植体消毒：

将已采摘的番茄花蕾先用洗洁精快速清洗一遍，再用流水冲洗2-3分钟，滤纸吸干水分，在75%酒精中浸泡20s，灭菌水清洗3次，7%次氯酸钠溶液中浸泡9min，灭菌水清洗3次，用灭菌滤纸吸干水分；

步骤3，预处理：

将灭菌后的花蕾切开取出花药，接种于愈伤组织分化培养基MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.1mg/L 2,4-D+40g/L蔗糖中，放入4℃冰箱预处理24h；

步骤4，愈伤组织分化培养：

预处理完成后，将其放入25℃培养箱暗培养一周，后在25℃培养箱中光照培养14h/d，光照强度2500lx，两周更换一次培养基，直至愈伤形成；

步骤5，诱导愈伤组织快速增殖：

待愈伤组织形成后，切下愈伤组织转接到愈伤增殖培养基MS+0.1mg/L ZT+1mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+300mg/L水解酪蛋白+30mg/Lα-维生素E+40g/L蔗糖中进行愈伤增殖培养。

以上实施例的实施效果如图1所示，利用植物组织培养技术成功诱导出番茄花药愈伤组织，诱导率高达48%，并对诱导出的愈伤组织进行100%快速增殖，增殖系数达4.25；大量番茄花药愈伤的获得为再生单倍体植株奠定坚实的基础，对番茄单倍体育种技术的推进具有重要意义。

实施例2

其他步骤同实施例1，主要区别在以粉莹品种花药为外植体，根据上述步骤成功诱导出番茄花药愈伤组织，诱导率达46.4%，并对诱导出的愈伤组织进行100%快速增殖，增殖系数达4.17。

实施例3

其他步骤同实施例1，主要区别在以正康198品种花药为外植体，根据上述步骤成功诱导出番茄花药愈伤组织，根据上述步骤成功诱导出番茄花药愈伤组织，诱导率达44.8%，并对诱导出的愈伤组织进行100%快速增殖，增殖系数达4.05。

对比例1

以亮粉品种花药为外植体；

按照表1所示，诱导番茄花药愈伤组织培养基不同组分，设置8种诱导愈伤组织分化培养基处理，按照如下步骤进行：

采集适宜时期的番茄花蕾为外植体先用洗洁精快速清洗一遍，再用流水冲洗2-3分钟，滤纸吸干水分，在75%酒精中浸泡20s，灭菌水清洗3次，7%次氯酸钠溶液中浸泡9min，灭菌水清洗3次，用灭菌滤纸吸干水分；将花蕾切开，花药切去两端接种于诱导愈伤组织的培养基中，再放入25℃培养箱暗培养一周，后在25℃培养箱中光照培养14h/d，光照强度2500lx，两周更换一次培养基，接种30d后统计并计算愈伤诱导率，愈伤诱导率=（愈伤产生数/接种花药总数）*100%；表1所示为番茄花药在不同处理的愈伤组织分化培养基上的诱导率，结果显示在处理5 MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖的番茄花药愈伤诱导率最高，为29.8%，将该激素组合记为MS1。

对比例2

以亮粉品种花药为外植体；

将花药接种于对比例1中的最优的激素组合MS1：MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.1mg/L 2,4-D，并添加不同的蔗糖浓度，设置4个处理，根据实施例2中的步骤进行，接种30d后统计并计算愈伤诱导率，愈伤诱导率=（愈伤产生数/接种花药总数）*100%；表2所示为在同一愈伤组织分化培养基中添加不同浓度蔗糖的愈伤组织诱导率，结果显示添加40g/L蔗糖可是花药愈伤诱导率增至32.4%，将该组合记为MS2。

对比例3

以亮粉品种花药为外植体；

在其他培养条件一致的情况下，采用不同方式、不同时间4℃低温预处理，设置9个处理，将花药接种于MS2中，按照如下步骤进行：采集适宜的外植体，将外植体分为两份，设置处理1为不进行预处理的空白对照，处理2～5在采集后先放入4℃进行低温预处理后，再将花蕾进行消毒、接种等操作；处理6～9在采集后先进行外植体消毒，接种入培养基后再进行4℃低温预处理，完成预处理后再放入培养箱中培养，30d后统计并计算愈伤组织诱导率，愈伤诱导率=（愈伤产生数/接种花药总数）*100%。

表3所示为不同预培养方式下花药愈伤组织的诱导率，结果显示在同一培养条件下，将花药先接种于诱导培养基后再进行低温预培养24h可使愈伤组织诱导率增至48.1%。先将外植体接种于培养基内再进行低温预处理其诱导愈伤效果要优于先进行4℃低温预处理再接种的诱导效果，其可能原因为采集时绝大部分外植体花药发育时期处于单核靠边期，将花蕾采集后先进行4℃低温预处理，随着处理时间增长，花蕾中花药细胞继续生长发育，极有可能到进行接种时绝大部分花药已过了最适合诱导愈伤组织的单核靠边期而处于双核期，故导致花药愈伤诱导率降低。

对比例4

以亮粉品种花药为外植体；

按照表4所示诱导愈伤组织增殖培养基不同组分，设置8个愈伤组织增殖培养基处理，按照如下步骤进行：

取实施例3中经过低温预处理，通过愈伤诱导培养基MS2培养后产生的愈伤组织，将其分别接种于8种不同处理的愈伤增殖培养基中，每个培养皿接种10～12个愈伤组织，每2周跟换一次培养基，20d后统计愈伤组织增殖情况，记录增殖系数，愈伤增殖系数=∑每块愈伤增大倍数/接种愈伤总数；表4为花药愈伤组织在不同处理培养基中的增殖情况，结果显示在处理8 MS+0.1mg/L ZT+1mg/L 6-BA+ 0.5mg/L NAA+300mg/L水解酪蛋白+30mg/Lα-维生素E+40g/L蔗糖中愈伤组织增殖最快，增殖系数达4.25。

Claims

1.一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）外植体消毒；

（3）预处理：将灭菌后的花蕾切开取出花药，接种于愈伤组织分化培养基MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA+0.1mg/L 2,4-D+40g/L蔗糖中，放入4℃冰箱预处理24h；

（5）诱导愈伤组织快速增殖：待愈伤组织形成后，切下愈伤组织转接到愈伤增殖培养基MS+0.1mg/LZT+1mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+300mg/L水解酪蛋白+30mg/Lα-维生素E+40g/L蔗糖中进行愈伤增殖培养;

所述番茄为大中型粉果番茄。

2.根据权利要求1所述的一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，于清晨7-8点时采摘番茄花蕾后立即放入冰盒。

3.根据权利要求1所述的一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，外植体消毒的步骤为：将已采摘的番茄花蕾先用洗洁精快速清洗一遍，再用流水冲洗2-3分钟，滤纸吸干水分，在75%酒精中浸泡20s，灭菌水清洗3次，7%次氯酸钠溶液中浸泡9min，灭菌水清洗3次，用灭菌滤纸吸干水分备用。