CN113728104B - 用于调节ube3a-ats的化合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供用于减少细胞或受试者的泛素蛋白连接酶E3A(UBE3A)的内源性反义转录物UBE3A‑ATS的量或活性和在某些情况下增加细胞或受试者的父本UBE3A的表达和UBE3A蛋白的量的化合物、方法和药物组合物。此类化合物、方法和药物组合物可用于改善神经遗传性病症的至少一种症状或标志。此类症状和标志包括发育迟缓、运动失调、言语障碍、睡眠问题、癫痫发作和EEG异常。此类神经遗传性病症包括安格尔曼氏综合征。

Description

用于调节UBE3A-ATS的化合物和方法
序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表作为标题为BIOL0349WOSEQ_ST25.tst的文档提供，其创建于2020年3月16日，大小为1.87MB。序列表的电子格式中的信息以引用的方式整体并入本文中。
技术领域
提供用于减少细胞或受试者的泛素蛋白连接酶E3A(UBE3A)的内源性反义转录物UBE3A-ATS的量或活性和在某些情况下增加细胞或受试者的父本UBE3A的表达和UBE3A蛋白的量的化合物、方法和药物组合物。此类化合物、方法和药物组合物可用于改善神经遗传性病症的至少一种症状或标志。此类症状和标志包括发育迟缓、运动失调、言语障碍、睡眠问题、癫痫发作和EEG异常。此类神经遗传性病症包括安格尔曼氏综合征(AngelmanSyndrome)。
背景技术
安格尔曼氏综合征(Angelman Syndrome，AS)为一种发育障碍，其影响约1/15,000活胎，且由泛素蛋白连接酶E3A(UBE3A)的缺乏引起。在神经元中UBE3A基因的两个拷贝中，母本基因通常表达，而父本基因遭遇基因印记和沉默。当由于突变、缺失、染色体15的父本单亲二体性或印记缺陷而未从母亲遗传UBE3A基因的功能性拷贝时，引起安格尔曼氏综合征。参见Buiting等人,“Angelman Syndrome-insights into a rare neurogeneticdisorder”,Nature Rev.Neuro.,2016,12:584-593。
安格尔曼氏综合征患者经历发育迟缓和言语障碍，且常经历睡眠问题、癫痫发作和EEG异常。通常在生命最初几年诊断出所述病症，且可通过基因测试确认诊断。然而，安格尔曼氏综合征的疗法仍然有限且主要集中于症状管理。参见Williams,C.A.等人,Genet.Med.,12:385-395,2010。
近来，发现在神经元培养***与小鼠中当前用于治疗癌症的拓扑异构酶抑制剂使父本UBE3A表达“不沉默”。参见Huang,H.S.等人,Nature,481:185-189,2012。然而，不沉默父本UBE3A表达的确切机制仍然未知，且拓扑异构酶抑制剂充满安全性问题，因为已知其为非特异性的且能够诱导DNA损伤，诸如单链和双链断裂。
当前缺乏治疗诸如AS的神经遗传性病症的可接受的选择。因此，本文的目标为提供用于治疗此类疾病的化合物、方法和药物组合物。
发明内容
本文提供用于减少细胞或受试者的UBE3A-ATS RNA的量或活性和在某些实施方案中增加父本UBE3A RNA或蛋白的表达的化合物、方法和药物组合物。在某些实施方案中，受试者患有神经遗传性病症。在某些实施方案中，受试者患有安格尔曼氏综合征(AS)。在某些实施方案中，可用于减少UBE3A-ATS RNA或其一部分的表达的化合物为寡聚化合物。在某些实施方案中，可用于减少UBE3A-ATS RNA或其一部分的表达的化合物为修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，可用于增加父本UBE3A RNA或蛋白的表达的化合物为寡聚化合物。在某些实施方案中，可用于增加父本UBE3A RNA或蛋白的表达的化合物为修饰的寡核苷酸。
还提供可用于改善神经遗传性病症的至少一种症状或标志的方法。在某些实施方案中，神经遗传性病症为安格尔曼氏综合征。在某些实施方案中，症状或标志包括发育迟缓、运动失调、言语障碍、睡眠问题、癫痫发作和/或EEG异常。
具体实施方式
应了解以上一般描述和以下详细描述仅为例示性和说明性的且无限制性。本文中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。如本文所用，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式，诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用无限制性。此外，除非另外特别说明，否则诸如“要素”或”组分”的术语涵盖包括一个单元的要素和组分以及包括多于一个子单元的要素和组分。
本文中使用的章节标题仅仅出于组织的目的，且不应视为限制所述主题。本申请中引用的所有文献或文献的部分，包括(但不限于)专利、专利申请、文章、书籍和论文，关于本文中论述的文献的部分，均在此以引用的方式明确地并入，以及整体并入。
定义
除非提供特定定义，否则与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和医药化学相关的命名法以及其程序和技术为本领域中熟知且常用的命名法以及程序和技术。若允许，则所有专利、申请、公开的申请和其他公开以及本发明通篇所提及的其他数据以引用的方式整体并入本文中。
除非另外指示，否则以下术语具有以下含义：
定义
如本文所用，“2’-脱氧核苷”意指包含2’-H(H)脱氧核糖基糖部分的核苷。在某些实施方案中，2’-脱氧核苷为2’-β-D-脱氧核苷且包含2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，其具有如在天然存在的脱氧核糖核酸(DNA)中所发现的β-D构型。在某些实施方案中，2’-脱氧核苷可包含修饰的核碱基或可包含RNA核碱基(尿嘧啶)。
如本文所用，“2’-MOE”或“2’-MOE糖部分”意指2’-OCH2CH2OCH3基团代替核糖基糖部分的2’-OH基团。“MOE”意指甲氧基乙基。除非另外指示，否则2’-MOE具有β-D立体化学构型。
如本文所用，“2’-MOE核苷”意指包含2’-MOE糖部分的核苷。
如本文所用，“2’-OMe”或“2’-O-甲基糖部分”意指2’-OCH3基团代替核糖基糖部分的2’-OH基团。除非另外指示，否则2’-OMe具有β-D立体化学构型。
如本文所用，“2’-OMe核苷”意指包含2’-OMe糖部分的核苷。
如本文所用，“2’-取代的核苷”意指包含2’-取代的糖部分的核苷。如本文所用，关于糖部分的”2’-取代”意指糖部分包含至少一个不为H或OH的2’-取代基。
如本文所用，“5-甲基胞嘧啶”意指用连接于5位的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶为修饰的核碱基。
如本文所用，“施用”意指向受试者提供剂。
如本文所用，“反义活性”意指可归因于反义化合物与其靶核酸杂交的任何可检测和/或可测量的变化。在某些实施方案中，反义活性为与在缺乏反义化合物下的靶核酸水平或靶蛋白水平相比，靶核酸或由此类靶核酸编码的蛋白质的量或表达下降。
如本文所用，“反义化合物”意指能够实现至少一种反义活性的寡聚化合物。
如本文所用，关于治疗的“改善”意指相对于缺少治疗时的相同症状，至少一种症状好转。在某些实施方案中，改善为症状的严重性或频率降低，或症状的发作延迟或严重性或频率的进展减缓。在某些实施方案中，症状或标志为发育迟缓、运动失调、言语障碍、睡眠问题、癫痫发作和EEG异常。
如本文所用，“双环核苷”或“BNA”意指包含双环糖部分的核苷。
如本文所用，“双环糖”或“双环糖部分”意指包含两个环的修饰的糖部分，其中第二个环通过连接两个原子的桥形成，从而形成双环结构。在某些实施方案中，双环糖部分的第一个环为呋喃糖基部分。在某些实施方案中，双环糖部分不包含呋喃糖基部分。
如本文所用，“可裂解部分”意指在生理条件下，例如在细胞、受试者或人体内裂解的键或一组原子。
如本文所用，关于寡核苷酸的“互补”意指当寡核苷酸的核碱基序列与另一核酸以相对方向对准时寡核苷酸或其一个或多个部分的至少70％核碱基与靶核酸或其一个或多个部分的核碱基能够彼此氢键键合的寡核苷酸。如本文所用，互补核碱基意指能够彼此形成氢键的核碱基。互补核碱基对包括腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)、5-甲基胞嘧啶(mC)和鸟嘌呤(G)。互补寡核苷酸和/或靶核酸不需要在每个核苷处具有核碱基互补性。而是容许一些错配。如本文所用，关于寡核苷酸或其部分的“完全互补”或“100％互补”意指寡核苷酸或其部分与另一寡核苷酸或靶核酸在两种寡核苷酸中的较短寡核苷酸的各核碱基处互补或若寡核苷酸具有相同长度则在各核苷处互补。
如本文所用，“结合基团”意指直接或间接连接于寡核苷酸的一组原子。结合基团包括结合部分和将结合部分连接于寡核苷酸的结合接头。
如本文所用，“结合接头”意指将结合部分连接于寡核苷酸的单键或包含至少一个键的一组原子。
如本文所用，“结合部分”意指通过结合接头连接于寡核苷酸的一组原子。
如本文所用，在寡核苷酸的背景下“连续”是指彼此紧邻的核苷、核碱基、糖部分或核苷间键联。例如，“连续核碱基”意指在序列中彼此紧邻的核碱基。
如本文所用，“约束的乙基”或“cEt”或“cEt修饰的糖部分”意指β-D核糖基双环糖部分，其中双环糖的第二个环通过连接β-D核糖基糖部分的4’-碳和2’-碳的桥形成，其中所述桥具有式4’-CH(CH3)-O-2’，且其中桥的甲基呈S构型。
如本文所用，“cEt核苷”意指包含cEt修饰的糖部分的核苷。
如本文所用，“手性富集群体”意指多个具有相同分子式的分子，其中若特定手性中心为立体结构无规的，则所述群体内在所述特定手性中心含有特定立体化学构型的分子的数目或百分比超过群体内预期在相同特定手性中心含有相同特定立体化学构型的分子的数目或百分比。在各分子内具有多个手性中心的分子的手性富集群体可含有一个或多个立体结构无规的手性中心。在某些实施方案中，分子为修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，分子为包含修饰的寡核苷酸的化合物。
如本文所用，“缺口聚物(gapmer)”意指一种包含具有多个核苷的内部区域的修饰的寡核苷酸，所述核苷支持位于具有一个或多个核苷的外部区域之间的RNA酶H裂解，其中构成内部区域的核苷在化学上与构成外部区域的核苷不同。内部区域可称为“缺口”且外部区域可称为“侧翼”。除非另外指示，否则“缺口聚物”是指糖基序。除非另外指示，否则缺口的每个核苷的糖部分为2’-β-D-脱氧核糖基糖部分。因此，术语”MOE缺口聚物”指示具有包含2’-β-D-脱氧核苷的缺口和包含2’-MOE核苷的侧翼的缺口聚物。除非另外指示，否则MOE缺口聚物可包含一个或多个修饰的核苷间键联和/或修饰的核碱基，且此类修饰不需遵循糖修饰的缺口聚物模式。
如本文所用，“热点区域”为靶核酸上能够实现寡聚化合物介导的靶核酸的量或活性降低的一系列核碱基。
如本文所用，“杂交”意指互补寡核苷酸和/或核酸的配对或退火。虽然不限于特定机制，但杂交的最常见机制涉及互补核碱基之间的氢键键合，其可为沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)或反向胡斯坦氢键键合。
如本文所用，“核苷间键联”意指寡核苷酸中在连续核苷之间的共价键。如本文所用，“修饰的核苷间键联”意指除磷酸二酯核苷间键联以外的任何核苷间键联。“硫代磷酸酯核苷间键联”为其中磷酸二酯核苷间键联的非桥接氧原子的被硫原子置换的修饰的核苷间键联。
如本文所用，“接头-核苷”意指将寡核苷酸直接或间接连接至结合部分的核苷。接头-核苷位于寡聚化合物的结合接头内。即使接头-核苷与寡核苷酸连续，也不考虑其为寡聚化合物的寡核苷酸部分的一部分。
如本文所用，“非双环修饰的糖部分”意指一种修饰的糖部分，其包含在糖的两个原子之间不形成桥从而不形成第二个环的修饰，诸如取代基。
如本文所用，“错配”或“非互补”意指当第一寡核苷酸与第二寡核苷酸对准时第一寡核苷酸的核碱基不与第二寡核苷酸或靶核酸的对应核碱基互补。
如本文所用，“基序”意指寡核苷酸中未修饰和/或修饰的糖部分、核碱基和/或核苷间键联的模式。
如本文所用，“神经遗传性病症”意指由包括但不限于突变、缺失、单亲二体性或印记缺陷的遗传因素引起的神经***病状。
如本文所用，“核碱基”意指未修饰的核碱基或修饰的核碱基。如本文所用，“未修饰的核碱基”为腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或鸟嘌呤(G)。如本文所用，“修饰的核碱基”为除未修饰的A、T、C、U或G以外的能够与至少一个未修饰的核碱基配对的一组原子。“5-甲基胞嘧啶”为修饰的核碱基。通用碱基为可与五种未修饰的核碱基中的任一种配对的修饰的核碱基。如本文所用，“核碱基序列”意指靶核酸或寡核苷酸中与任何糖或核苷间键联修饰无关的连续核碱基顺序。
如本文所用，“核苷”意指包含核碱基和糖部分的化合物。核碱基和糖部分各自独立地为未修饰或修饰的。如本文所用，“修饰的核苷”意指包含修饰的核碱基和/或修饰的糖部分的核苷。修饰的核苷包括无碱基核苷，其缺乏核碱基。“连接核苷”为以连续次序连接的核苷(即连接的核苷之间不呈现其他核苷)。
如本文所用，“寡聚化合物”意指寡核苷酸和任选存在的一个或多个其他特征，诸如结合基团或端基。寡聚化合物可以和与第一寡聚化合物互补的第二寡聚化合物配对，或可为未配对的。“单链寡聚化合物”为未配对的寡聚化合物。术语“寡聚双链体”意指由具有互补核碱基序列的两种寡聚化合物形成的双链体。寡聚双链体的每种寡聚化合物可称为“双链体寡聚化合物”。
如本文所用，“寡核苷酸”意指通过核苷间键联连接的连接核苷链，其中每种核苷和核苷间键联可为修饰或未修饰的。除非另外指示，否则寡核苷酸由8-50个连接核苷组成。如本文所用，“修饰的寡核苷酸”意指其中至少一个核苷或核苷间键联为修饰的寡核苷酸。如本文所用，“未修饰的寡核苷酸”意指不包含任何核苷修饰或核苷间修饰的寡核苷酸。
如本文所用，“药学上可接受的载剂或稀释剂”意指适用于施用受试者的任何物质。某些此类载剂使药物组合物可配制为例如片剂、丸剂、糖锭、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、混悬液和***锭供受试者口服。在某些实施方案中，药学上可接受的载剂或稀释剂为无菌水、无菌盐水、无菌缓冲溶液或无菌人工脑脊髓液。
如本文所用，“药学上可接受的盐”意指化合物的生理学上和药学上可接受的盐。药学上可接受的盐保留母体化合物的所需生物活性且不赋予不希望的毒理效应。
如本文所用，“药物组合物”意指适合于施用受试者的物质的混合物。例如，药物组合物可包含寡聚化合物和无菌水溶液。在某些实施方案中，药物组合物在自由吸收分析中在某些细胞系中展示活性。
如本文所用，“前药”意指在体外呈一种形式，在受试者或其细胞内转变成不同形式的治疗剂。通常受试者内前药的转变由酶(内源性或病毒性酶)的作用，或细胞或组织中存在的化学物质和/或生理条件推动。
如本文所用，“降低或抑制量或活性”、“降低量或活性”或“抑制量或活性”是指相对于未处理的或对照样品中的转录表达或活性，转录表达或活性减少或受到阻断，且不一定指示转录表达或活性全部消除。
如本文所用，“RNA”意指包括不编码蛋白质的内源性反义转录物(例如UBE3A-ATS)的任何RNA转录物，且除非另外指定，否则还包括前体mRNA和成熟mRNA。
如本文所用，“RNAi化合物”意指至少部分地通过RISC或Ago2来调节靶核酸和/或由靶核酸编码的蛋白质的反义化合物。RNAi化合物包括(但不限于)双链siRNA、单链RNA(ssRNA)和微型RNA，包括微型RNA模拟物。在某些实施方案中，RNAi化合物调节靶核酸的量、活性和/或剪接。术语RNAi化合物排除通过RNA酶H起作用的反义化合物。
如本文所用，关于寡核苷酸的“自我互补”意指至少部分与本身杂交的寡核苷酸。
如本文所用，“标准细胞分析”意指实施例1中描述的分析及其合理变化。
如本文所用，在具有相同分子式的一群分子的背景下“立体结构无规的手性中心”意指具有无规立体化学构型的手性中心。例如，在包含立体结构无规的手性中心的一群分子中，具有立体结构无规的手性中心的(S)构型的分子的数目可但不一定与具有立体结构无规的手性中心的(R)构型的分子的数目相同。当由未设计成控制立体化学构型的合成方法产生时，手性中心的立体化学构型视为无规。在某些实施方案中，立体结构无规的手性中心为立体结构无规的硫代磷酸酯核苷间键联。
如本文所用，“受试者”意指人或非人动物。
如本文所用，“糖部分”意指未修饰的糖部分或修饰的糖部分。如本文所用，“未修饰的糖部分”意指如在RNA中发现的2’-OH(H)β-D-核糖基部分(“未修饰的RNA糖部分”)或如在DNA中发现的2’-H(H)β-D-脱氧核糖基糖部分(“未经修饰的DNA糖部分”)。未修饰的糖部分在1’、3’和4’中的每一个上具有一个氢，在3’上具有一个氧，且在5’上具有两个氢。如本文所用，“修饰的糖部分”或“修饰的糖”意指修饰的呋喃糖基糖部分或糖替代物。
如本文所用，“糖替代物”意指除呋喃糖基部分以外的可将核碱基连接至寡核苷酸中的另一基团，诸如核苷间键联、结合基团或端基的修饰的糖部分。包含糖替代物的修饰的核苷可并入寡核苷酸内的一个或多个位置中，且此类寡核苷酸能够与互补寡聚化合物或靶核酸杂交。
如本文所用，“症状或标志”意指指示疾病或病症的存在或程度的任何物理特征或测试结果。在某些实施方案中，症状为受试者或检查或测试所述受试者的医学专家显而易见的。在某些实施方案中，标志在进行包括(但不限于)死后测试的侵入性诊断测试时系显而易见的。
如本文所用，“靶核酸”和“靶RNA”意指设计反义化合物被来影响的核酸。
如本文所用，“靶区域”意指设计寡聚化合物来杂交的靶核酸的一部分。
如本文所用，“端基”意指共价连接于寡核苷酸的末端的化学基团或一组原子。
如本文所用，“治疗有效量”意指为受试者提供治疗益处的剂的量。例如，治疗有效量使疾病的症状或标志好转。
某些实施方案
本公开提供以下非限制性编号的实施方案：
实施方案1.一种寡聚化合物，其包含由12个至30个连接核苷组成的修饰的寡核苷酸，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与UBE3A-ATS RNA的同等长度部分至少90％互补，且其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个选自修饰的糖部分和修饰的核苷间键联的修饰。
实施方案2.一种寡聚化合物，其包含由12个至30个连接核苷组成且具有包含SEQID NO:17-2762、2786-2863、2872-2904中任一个的至少12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连续核碱基的核碱基序列的修饰的寡核苷酸。
实施方案3.一种寡聚化合物，其包含由12个至30个连接核苷组成且具有包含SEQID NO:2763-2785或2864-2871中任一个的至少12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个连续核碱基的核碱基序列的修饰的寡核苷酸。
实施方案4.一种寡聚化合物，其包含由12个至30个连接核苷组成且具有包含与以下互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的核碱基序列的修饰的寡核苷酸：
SEQ ID NO:1的核碱基461,413-461,487的同等长度部分；
SEQ ID NO:1的核碱基468,968-469,013的同等长度部分；或
SEQ ID NO:1的核碱基483,965-484,003的同等长度部分。
实施方案5.一种寡聚化合物，其包含由12个至30个连接核苷组成且具有包含选自以下的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个或至少18个连续核碱基的核碱基序列的修饰的寡核苷酸：
SEQ ID No:1053、1329、1501、1576、1873、1949、2025、2096、2245、2512、2591、2680-2682和2844；
SEQ ID No:376、377、2751-2756、2773-2776、2872、2873、2876-2878；或
SEQ ID No:172、764-770、995、1445、1668、1743、2255、2595、2762-2767。
实施方案6.如实施方案1-5中任一项所述的寡聚化合物，其中当跨越所述修饰的寡核苷酸的整个核碱基序列测量时，所述修饰的寡核苷酸具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2915或SEQ ID NO:2916的核碱基序列至少80％、85％、90％、95％或100％互补的核碱基序列。
实施方案7.如实施方案1-6中任一项所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷。
实施方案8.如实施方案7所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个包含修饰的糖部分的修饰的核苷。
实施方案9.如实施方案8所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个包含双环糖部分的修饰的核苷。
实施方案10.如实施方案9所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个包含具有2’-4’桥的双环糖部分的修饰的核苷，其中所述2’-4’桥选自-O-CH2-和-O-CH(CH3)-。
实施方案11.如实施方案7-10中任一项所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个包含非双环修饰的糖部分的修饰的核苷。
实施方案12.如实施方案11所述的寡聚化合物，其中所述非双环修饰的糖部分为2’-MOE修饰的糖部分或2’-OMe修饰的糖部分。
实施方案13.如实施方案7-8中任一项所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个包含糖替代物的修饰的核苷。
实施方案14.如实施方案13所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个包含选自吗啉代和PNA的糖替代物的修饰的核苷。
实施方案15.如实施方案1-8或11-14中任一项所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸不包含双环糖部分。
实施方案16.如实施方案1-15中任一项所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸为缺口聚物。
实施方案17.如实施方案1-16中任一项所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸具有包含以下的糖基序：
由1-6个连接5’-区核苷组成的5’-区；
由6-10个连接中央区核苷组成的中央区；和
由1-6个连接3’-区核苷组成的3’-区；其中
所述5’-区核苷中的每一个和所述3’-区核苷中的每一个包含修饰的糖部分且所述中央区核苷中的每一个包含2’-β-D-脱氧核糖基糖部分。
实施方案18.如实施方案17所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸具有：
由5个连接5’-区核苷组成的5’-区；
由10个连接中央区核苷组成的中央区；和
由5个连接3’-区核苷组成的3’-区；其中
所述5’-区核苷中的每一个和所述3’-区核苷中的每一个包含2’-MOE修饰的糖部分且所述中央区核苷中的每一个包含2’-β-D-脱氧核糖基糖部分。
实施方案19.如实施方案17所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸具有：
由4个连接5’-区核苷组成的5’-区；
由10个连接中央区核苷组成的中央区；和
由6个连接3’-区核苷组成的3’-区；其中
所述5’-区核苷中的每一个和所述3’-区核苷中的每一个2’-MOE修饰的糖部分且所述中央区核苷中的每一个包含2’-β-D-脱氧核糖基糖部分。
实施方案20.如实施方案17所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸具有
由6个连接5’-区核苷组成的5’-区；
由10个连接中央区核苷组成的中央区；和
由4个连接3’-区核苷组成的3’-区；其中
所述5’-区核苷中的每一个和所述3’-区核苷中的每一个2’-MOE修饰的糖部分且所述中央区核苷中的每一个包含2’-β-D-脱氧核糖基糖部分。
实施方案21.如实施方案17所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸具有
由5个连接5’-区核苷组成的5’-区；
由8个连接中央区核苷组成的中央区；和
由5个连接3’-区核苷组成的3’-区；其中
所述5’-区核苷中的每一个和所述3’-区核苷中的每一个2’-MOE修饰的糖部分且所述中央区核苷中的每一个包含2’-β-D-脱氧核糖基糖部分。
实施方案22.如实施方案17所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸具有
由4个连接5’-区核苷组成的5’-区；
由8个连接中央区核苷组成的中央区；和
由6个连接3’-区核苷组成的3’-区；其中
所述5’-区核苷中的每一个和所述3’-区核苷中的每一个2’-MOE修饰的糖部分且所述中央区核苷中的每一个包含2’-β-D-脱氧核糖基糖部分。
实施方案23.如实施方案17所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸具有
由4个连接5’-区核苷组成的5’-区；
由8个连接中央区核苷组成的中央区；和
由6个连接3’-区核苷组成的3’-区；其中
所述5’-区核苷中的每一个和所述3’-区核苷中的每一个2’-MOE修饰的糖部分且所述中央区核苷中的每一个包含2’-β-D-脱氧核糖基糖部分。
实施方案24.如实施方案1-23中任一项所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键联。
实施方案25.如实施方案24所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸的每个核苷间键联为修饰的核苷间键联。
实施方案26.如实施方案24或25所述的寡聚化合物，其中所述修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
实施方案27.如实施方案24或26所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷间键联。
实施方案28.如实施方案24、26或27中任一项所述的寡聚化合物，其中每个核苷间键联独立地选自磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联。
实施方案29.如实施方案1-24或27-28所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸具有选自以下的核苷间键联基序：soooossssssssssooss、sooooossssssssssoss、soooosssssssssoss、sooosssssssssooss、sooossssssssssoooss或soosssssssssoooss；其中，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联且o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案30.如实施方案1-29中任一项所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含修饰的核碱基。
实施方案31.如实施方案30所述的寡聚化合物，其中所述修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。
实施方案32.如实施方案1-31中任一项所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸由12-30个、12-22个、12-20个、14-18个、14-20个、15-17个、15-25个、16-20个、18-22个或18-20个连接核苷组成。
实施方案33.如实施方案1-32中任一项所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸由18个连接核苷组成。
实施方案34.如实施方案1-2、4或6-32中任一项所述的寡聚化合物，其中所述修饰的寡核苷酸由20个连接核苷组成。
实施方案35.如实施方案1-34中任一项所述的寡聚化合物，其由所述修饰的寡核苷酸组成。
实施方案36.如实施方案1-34中任一项所述的寡聚化合物，其包含有包含结合部分和结合接头的结合基团。
实施方案37.如实施方案36所述的寡聚化合物，其中所述结合接头由单键组成。
实施方案38.如实施方案36所述的寡聚化合物，其中所述结合接头为可裂解的。
实施方案39.如实施方案36所述的寡聚化合物，其中所述结合接头包含1-3个接头-核苷。
实施方案40.如实施方案36-39中任一项所述的寡聚化合物，其中所述结合基团在所述修饰的寡核苷酸的5’-端连接于所述修饰的寡核苷酸。
实施方案41.如实施方案36-39中任一项所述的寡聚化合物，其中所述结合基团在所述修饰的寡核苷酸的3’-端连接于所述修饰的寡核苷酸。
实施方案42.如实施方案1-34或36-41中任一项所述的寡聚化合物，其包含端基。
实施方案43.如实施方案1-42中任一项所述的寡聚化合物，其中所述寡聚化合物为单链寡聚化合物。
实施方案44.如实施方案1-38或40-43中任一项所述的寡聚化合物，其中所述寡聚化合物不包含接头-核苷。
实施方案45.一种寡聚双链体，其包含如实施方案1-42或44中任一项所述的寡聚化合物。
实施方案46.一种反义化合物，其包含如实施方案1-44中任一项所述的寡聚化合物或如实施方案45所述的寡聚双链体或由如实施方案1-44中任一项所述的寡聚化合物或如实施方案45所述的寡聚双链体组成。
实施方案47.一种药物组合物，其包含如实施方案1-44中任一项所述的寡聚化合物或如实施方案45所述的寡聚双链体和药学上可接受的载剂或稀释剂。
实施方案48.如实施方案47所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的稀释剂为人工脑脊髓液。
实施方案49.如实施方案48所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上由所述修饰的寡核苷酸和磷酸盐缓冲盐水组成。
实施方案50.一种方法，其包括向受试者施用如实施方案47-50中任一项所述的药物组合物。
实施方案51.一种治疗与UBE3A-ATS相关的疾病的方法，其包括向患有与UBE3A-ATS相关的疾病或处于发展所述疾病的风险下的个体施用治疗有效量的如实施方案47-49中任一项所述的药物组合物；从而治疗所述与UBE3A-ATS相关的疾病。
实施方案52.如实施方案51所述的方法，其中所述与UBE3A-ATS相关的疾病为安格尔曼氏综合征。
实施方案53.如实施方案50-52中任一项所述的方法，其中所述与UBE3A-ATS相关的疾病的至少一种症状或标志得到改善。
实施方案54.如实施方案53所述的方法，其中所述症状或标志为发育迟缓、运动失调、言语障碍、睡眠问题、癫痫发作或EEG异常。
实施方案55.一种根据以下化学结构的修饰的寡核苷酸：
(SEQ ID NO:1949)，或其盐。
实施方案56.一种根据以下化学结构的修饰的寡核苷酸：
(SEQ ID NO:1949)。
实施方案57.一种根据以下化学结构的修饰的寡核苷酸：
(SEQ ID NO:2751)，或其盐。
实施方案58.一种根据以下化学结构的修饰的寡核苷酸：
(SEQ ID NO:2751)。
实施方案59.一种根据以下化学结构的修饰的寡核苷酸：
(SEQ ID NO:2752)，或其盐。
实施方案60.一种修饰的寡核苷酸，其与以下化学结构相对应：
(SEQ ID NO:2752)。
实施方案61.一种根据以下化学结构的修饰的寡核苷酸：
(SEQ ID NO:765)，或其盐。
实施方案62.一种根据以下化学结构的修饰的寡核苷酸：
(SEQ ID NO:765)。
实施方案63.一种根据以下化学结构的修饰的寡核苷酸：
(SEQ ID NO:2866)，或其盐。
实施方案64.一种根据以下化学结构的修饰的寡核苷酸：
(SEQ ID NO:2866)。
实施方案65.一种根据以下化学结构的修饰的寡核苷酸：
(SEQ ID NO:2873)，或其盐。
实施方案66.一种根据以下化学结构的修饰的寡核苷酸：
(SEQ ID NO:2873)。
实施方案67.如实施方案55、57、59、61、63或65中任一项所述的修饰的寡核苷酸，其为所述化学结构的钠盐。
实施方案68.一种药物组合物，其包含如实施方案55-67中任一项所述的修饰的寡核苷酸和药学上可接受的载剂或稀释剂。
实施方案69.如实施方案68所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的稀释剂为人工脑脊髓液。
实施方案70.如实施方案69所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上由所述修饰的寡核苷酸和人工脑脊髓液组成。
实施方案71.一种化合物，其包含根据以下化学符号的修饰的寡核苷酸：mCesAeoTeo mCeoAeoTdsGdsAdsTds mCdsTdsTdsGdsGdsTdsAeoAeoGesGes mCe(SEQ ID NO:1949)，其中：
A＝腺嘌呤核碱基，
mC＝5-甲基胞嘧啶核碱基，
G＝鸟嘌呤核碱基，
T＝胸腺嘧啶核碱基，
e＝2’-MOE糖部分，
d＝2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案72.一种化合物，其包含根据以下化学符号的修饰的寡核苷酸：Tes mCeoAeo mCeo mCeoAeoTdsTdsTdsTdsGdsAds mCds mCdsTdsTds mCeoTesTesAe(SEQ ID NO:2751)，其中：
A＝腺嘌呤核碱基，
mC＝5-甲基胞嘧啶核碱基，
G＝鸟嘌呤核碱基，
T＝胸腺嘧啶核碱基，
e＝2’-MOE糖部分，
d＝2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案73.一种化合物，其包含根据以下化学符号的修饰的寡核苷酸：TesTeo mCe oAeo mCeo mCeoAdsTdsTdsTdsTdsGdsAds mCds mCdsTdsTeo mCesTesTe(SEQ ID NO:2752)，其中：
A＝腺嘌呤核碱基，
mC＝5-甲基胞嘧啶核碱基，
G＝鸟嘌呤核碱基，
T＝胸腺嘧啶核碱基，
e＝2’-MOE糖部分，
d＝2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案74.一种化合物，其包含根据以下化学符号的修饰的寡核苷酸：Ges mCeoAe oTeoAeo mCeo mCds mCdsAdsGdsGdsGdsTdsAdsGdsGdsAeoTesTes mCe(SEQ ID NO:765)，其中：
A＝腺嘌呤核碱基，
mC＝5-甲基胞嘧啶核碱基，
G＝鸟嘌呤核碱基，
T＝胸腺嘧啶核碱基，
e＝2’-MOE糖部分，
d＝2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案75.一种化合物，其包含根据以下化学符号的修饰的寡核苷酸：Aes mCeoGeo mCesAdsAdsTdsGdsTdsAdsTds mCdsAeoGeoGeo mCesAesAe(SEQ ID NO:2866)，其中：
A＝腺嘌呤核碱基，
mC＝5-甲基胞嘧啶核碱基，
G＝鸟嘌呤核碱基，
T＝胸腺嘧啶核碱基，
e＝2’-MOE糖部分，
d＝2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案76.一种化合物，其包含根据以下化学符号的修饰的寡核苷酸：Aes mCeo mCe oAeoTeoTdsTdsTdsGdsAds mCds mCdsTdsTds mCdsTeoTeoAesGes mCe(SEQ ID NO:2873)，其中：
A＝腺嘌呤核碱基，
mC＝5-甲基胞嘧啶核碱基，
G＝鸟嘌呤核碱基，
T＝胸腺嘧啶核碱基，
e＝2’-MOE糖部分，
d＝2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案77.如实施方案71-76中任一项所述的化合物，其包含共价连接于结合基团的所述修饰的寡核苷酸。
实施方案78.一种药物组合物，其包含如实施方案71-77中任一项所述的化合物和药学上可接受的稀释剂或载剂。
实施方案79.如实施方案78所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的稀释剂为人工脑脊髓液。
实施方案80.如实施方案79所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上由所述修饰的寡核苷酸和人工脑脊髓液组成。
实施方案81.一种如实施方案55-67中任一项所述的修饰的寡核苷酸的手性富集群体，其中所述群体富集包含至少一个具有特定立体化学构型的特定硫代磷酸酯核苷间键联的修饰的寡核苷酸。
实施方案82.如实施方案81所述的手性富集群体，其中所述群体富集包含至少一个具有(Sp)构型的特定硫代磷酸酯核苷间键联的修饰的寡核苷酸。
实施方案83.如实施方案81所述的手性富集群体，其中所述群体富集包含至少一个具有(Rp)构型的特定硫代磷酸酯核苷间键联的修饰的寡核苷酸。
实施方案84.如实施方案81所述的手性富集群体，其中所述群体富集在每个硫代磷酸酯核苷间键联具有特定的独立地选择的立体化学构型的修饰的寡核苷酸。
实施方案85.如实施方案84所述的手性富集群体，其中所述群体富集在每个硫代磷酸酯核苷间键联具有(Sp)构型的修饰的寡核苷酸。
实施方案86.如实施方案84所述的手性富集群体，其中所述群体富集在每个硫代磷酸酯核苷间键联具有(Rp)构型的修饰的寡核苷酸。
实施方案87.如实施方案84所述的手性富集群体，其中所述群体富集在一个特定硫代磷酸酯核苷间键联具有(Rp)构型且在剩余硫代磷酸酯核苷间键联中的每一个具有(Sp)构型的修饰的寡核苷酸。
实施方案88.如实施方案81或84所述的手性富集群体，其中所述群体富集具有至少3个在5’至3’方向上呈Sp、Sp和Rp构型的连续硫代磷酸酯核苷间键联的修饰的寡核苷酸。
实施方案89.一种如实施方案55-67中任一项所述的修饰的寡核苷酸的手性富集群体，其中所述修饰的寡核苷酸的所有所述硫代磷酸酯核苷间键联均为立体结构无规的。
I.某些寡核苷酸
在某些实施方案中，本文提供包含由连接核苷组成的寡核苷酸的寡聚化合物。寡核苷酸可为未修饰的寡核苷酸(RNA或DNA)或可为修饰的寡核苷酸。相对于未修饰的RNA或DNA，修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰。即，修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷(包含修饰的糖部分和/或修饰的核碱基)和/或至少一个修饰的核苷间键联。
A.某些修饰的核苷
修饰的核苷包含修饰的糖部分或修饰的核碱基或修饰的糖部分与修饰的核碱基两者。
1.某些糖部分
在某些实施方案中，修饰的糖部分为非双环修饰的糖部分。在某些实施方案中，修饰的糖部分为双环或三环糖部分。在某些实施方案中，修饰的糖部分为糖替代物。此类糖替代物可包含一个或多个与其他类型修饰的糖部分对应的取代。
在某些实施方案中，修饰的糖部分为包含具有一个或多个取代基的呋喃糖基环的非双环修饰的糖部分，所述取代基中没有一个桥接呋喃糖基环的两个原子来形成双环结构。此类非桥接取代基可在呋喃糖基的任何位置上，包括但不限于在2’、4’和/或5’位上的取代基。在某些实施方案中，非双环修饰的糖部分的一个或多个非桥接取代基为支化的。适合于非双环修饰的糖部分的2’-取代基的实例包括但不限于：2’-F、2’-OCH3(“OMe”或“O-甲基”)和2’-O(CH2)2OCH3(“MOE”)。在某些实施方案中，2’-取代基选自：卤代、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O-C1-C10烷氧基、O-C1-C10取代的烷氧基、O-C1-C10烷基、O-C1-C10取代的烷基、S-烷基、N(Rm)-烷基、O-烯基、S-烯基、N(Rm)-烯基、O-炔基、S-炔基、N(Rm)-炔基、O-烯基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(Rm)(Rn)或OCH2C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地为H、氨基保护基或取代或未取代的C1-C10烷基，和以下中所述的2’-取代基：Cook等人,U.S.6,531,584；Cook等人,U.S.5,859,221；和Cook等人,U.S.6,005,087。这些2’-取代基的某些实施方案可进一步被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苯甲基、苯基、硝基(NO2)、硫醇基、硫烷氧基、硫烷基、卤代、烷基、芳基、烯基和炔基。适合于非双环修饰的糖部分的4’-取代基的实例包括但不限于：烷氧基(例如甲氧基)、烷基和Manoharan等人,WO 2015/106128中所述的那些取代基。适合于非双环修饰的糖部分的5’-取代基的实例包括但不限于：5-甲基(R或S)、5’-乙烯基和5’-甲氧基。在某些实施方案中，非双环修饰的糖部分包含多于一个非桥接糖取代基，例如2’-F-5’-甲基糖部分，和Migawa等人,WO 2008/101157和Rajeev等人,US2013/0203836中所述的修饰的糖部分和修饰的核苷。
在某些实施方案中，2’-取代的非双环修饰的核苷包含有包含选自以下的非桥接2’-取代基的糖部分：F、NH2、N3、OCF3、OCH3、O(CH2)3NH2、CH2CH＝CH2、OCH2CH＝CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(Rm)(Rn)、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和N-取代的乙酰胺(OCH2C(＝O)-N(Rm)(Rn))，其中每个Rm和Rn独立地为H、氨基保护基或取代或未取代的C1-C10烷基。
在某些实施方案中，2’-取代的非双环修饰的核苷包含有包含选自以下的非桥接2’-取代基的糖部分：F、OCF3、OCH3、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(CH3)2、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和OCH2C(＝O)-N(H)CH3(“NMA”)。
在某些实施方案中，2’-取代的非双环修饰的核苷包含有包含选自以下的非桥接2’-取代基的糖部分：F、OCH3和OCH2CH2OCH3。
某些修饰的糖部分包含桥接呋喃糖基环的两个原子以形成第二环，产生双环糖部分的取代基。在某些此类实施方案中，双环糖部分在4’与2’呋喃糖环原子之间包含桥。此类4’至2’桥接糖取代基的实例包括但不限于：4’-CH2-2’、4’-(CH2)2-2’、4’-(CH2)3-2’、4’-CH2-O-2’(“LNA”)、4’-CH2-S-2’、4’-(CH2)2-O-2’(“ENA”)、4’-CH(CH3)-O-2’(称为“约束的乙基”或“cEt”)、4’-CH2-O-CH2-2’、4’-CH2-N(R)-2’、4’-CH(CH2OCH3)-O-2’(“约束的MOE”或“cMOE”)及其类似物(参见例如Seth等人,U.S.7,399,845；Bhat等人,U.S.7,569,686；Swayze等人,U.S.7,741,457；和Swayze等人,U.S.8,022,193)、4’-C(CH3)(CH3)-O-2’及其类似物(参见例如Seth等人,U.S.8,278,283)、4’-CH2-N(OCH3)-2’及其类似物(参见例如Prakash等人,U.S.8,278,425)、4’-CH2-O-N(CH3)-2’(参见例如Allerson等人,U.S.7,696,345和Allerson等人,U.S.8,124,745)、4’-CH2-C(H)(CH3)-2’(参见例如Zhou,等人,J.Org.Chem.,2009、74、118-134)、4’-CH2-C(＝CH2)-2’及其类似物(参见例如Seth等人,U.S.8,278,426)、4’-C(RaRb)-N(R)-O-2’、4’-C(RaRb)-O-N(R)-2’、4’-CH2-O-N(R)-2’和4’-CH2-N(R)-O-2’，其中各R、Ra和Rb独立地为H、保护基或C1-C12烷基(参见例如Imanishi等人,U.S.7,427,672)。
在某些实施方案中，此类4’至2’桥独立地包含1至4个独立地选自以下的连接基团：-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-和-N(Ra)-；
其中：
x为0、1或2；
n为1、2、3或4；
每个Ra和Rb独立地为H、保护基、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环族基、取代的C5-C7脂环族基、卤代、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚硫酰基(S(＝O)-J1)；并且
每个J1和J2独立地为H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
其他双环糖部分为本领域中已知，参见例如：Freier等人,Nucleic AcidsResearch,1997,25(22),4429-4443；Albaek等人,J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740；Singh等人,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc.,2007,129,8362-8379；Wengel等人,U.S.7,053,207；Imanishi等人,U.S.6,268,490；Imanishi等人U.S.6,770,748；Imanishi等人,U.S.RE44,779；Wengel等人,U.S.6,794,499；Wengel等人,U.S.6,670,461；Wengel等人,U.S.7,034,133；Wengel等人,U.S.8,080,644；Wengel等人,U.S.8,034,909；Wengel等人,U.S.8,153,365；Wengel等人,U.S.7,572,582；Ramasamy等人,U.S.6,525,191；Torsten等人,WO 2004/106356；Wengel等人,WO 1999/014226；Seth等人,WO 2007/134181；Seth等人,U.S.7,547,684；Seth等人,U.S.7,666,854；Seth等人,U.S.8,088,746；Seth等人,U.S.7,750,131；Seth等人,U.S.8,030,467；Seth等人,U.S.8,268,980；Seth等人,U.S.8,546,556；Seth等人,U.S.8,530,640；Migawa等人,U.S.9,012,421；Seth等人,U.S.8,501,805；和Allerson等人,美国专利公开号US2008/0039618和Migawa等人,美国专利公开号US2015/0191727。
在某些实施方案中，双环糖部分和并有此类双环糖部分的核苷通过异构体构型进一步定义。例如，LNA核苷(本文所述)可呈α-L构型或呈β-D构型。
α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)或α-L-LNA双环核苷已并入展示反义活性的寡核苷酸中(Frieden等人,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。本文中，双环核苷的概述包括两种异构体构型。当在本文中的例示实施方案中确定特定双环核苷(例如LNA或cEt)的位置时，除非另作说明，否则其呈β-D构型。
在某些实施方案中，修饰的糖部分包含一个或多个非桥接糖取代基和一个或多个桥接糖取代基(例如5’-取代和4’-2’桥接糖)。
在某些实施方案中，修饰的糖部分为糖替代物。在某些此类实施方案中，糖部分的氧原子被例如硫原子、碳原子或氮原子置换。在某些此类实施方案中，此类修饰的糖部分还包含如本文所述的桥接和/或非桥接取代基。例如，某些糖替代物包含4’-硫原子和在2’位(参见例如Bhat等人,U.S.7,875,733和Bhat等人,U.S.7,939,677)和/或5’位上的取代。
在某些实施方案中，糖替代物包含具有除5以外的个数的原子的环。例如，在某些实施方案中，糖替代物包含六元四氢吡喃(“THP”)。此类四氢吡喃可为进一步修饰或取代的。包含此类修饰的四氢吡喃的核苷包括但不限于己糖醇核酸(“HNA”)、安醇(anitol)核酸(“ANA”)、甘露糖醇核酸(“MNA”)(参见例如Leumann,CJ.Bioorg.&Med.Chem.2002,10,841-854)、氟HNA：
(“F-HNA”，参见例如Swayze等人,U.S.8,088,904；Swayze等人,U.S.8,440,803；Swayze等人,U.S.8,796,437；和Swayze等人,U.S.9,005,906；F-HNA还可称为F-THP或3’-氟四氢吡喃)和具有下式的包含其他修饰的THP化合物的核苷：
其中，独立地，对于所述修饰的THP核苷中的每一个：
Bx为核碱基部分；
T3和T4各自独立地为将修饰的THP核苷连接于寡核苷酸的其余部分的核苷间连接基团，或T3与T4中的一个为将修饰的THP核苷连接于寡核苷酸的其余部分的核苷间连接基团且T3与T4中的另一个为H、羟基保护基、连接的结合基团或5’或3’-端基；
q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；并且
R1和R2中的每一个独立地选自：氢、卤代、取代或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中X为O、S或NJ1且每个J1、J2和J3独立地为H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，提供修饰的THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个不为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个为甲基。在某些实施方案中，提供修饰的THP核苷，其中R1和R2中的一个为F。在某些实施方案中，R1为F且R2为H，在某些实施方案中，R1为甲氧基且R2为H，且在某些实施方案中，R1为甲氧基乙氧基且R2为H。
在某些实施方案中，糖替代物包含具有多于5个原子和多于一个杂原子的环。例如，已报导包含吗啉代糖部分的核苷和其在寡核苷酸中的使用(参见例如Braasch等人,Biochemistry,2002,41,4503-4510和Summerton等人,U.S.5,698,685；Summerton等人,U.S.5,166,315；Summerton等人,U.S.5,185,444；和Summerton等人,U.S.5,034,506)。如这里所用，术语“吗啉代”意指具有以下结构的糖替代物：
在某些实施方案中，吗啉代可例如通过从以上吗啉代结构添加或改变多个取代基来修饰。此类糖替代物在本文中称为“修饰的吗啉代”。
在某些实施方案中，糖替代物包含非环状部分。包含此类非环状糖替代物的核苷和寡核苷酸的实例包括但不限于：肽核酸(“PNA”)、非环状丁基核酸(参见例如Kumar等人,Org.Biomol.Chem.,2013,11,5853-5865)和Manoharan等人,WO2011/133876中所述的核苷和寡核苷酸。
本领域中已知可用于修饰的核苷中的许多其他双环和三环糖和糖替代物环系。
2.某些修饰的核碱基
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个包含未修饰的核碱基的核苷。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个包含修饰的核碱基的核苷。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个不包含核碱基的核苷，称为无碱基核苷。
在某些实施方案中，修饰的核碱基选自：5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶、烷基或炔基取代的嘧啶、烷基取代的嘌呤和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤。在某些实施方案中，修饰的核碱基选自：2-氨基丙基腺嘌呤、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-N-甲基鸟嘌呤、6-N-甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-核糖基尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇基、8-硫烷基、8-羟基、8-氮杂和其他8-取代的嘌呤、5-卤代、尤其5-溴、5-三氟甲基、5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、6-N-苯甲基腺嘌呤、2-N-异丁酰基鸟嘌呤、4-N-苯甲基胞嘧啶、4-N-苯甲基尿嘧啶、5-甲基4-N-苯甲基胞嘧啶、5-甲基4-N-苯甲基尿嘧啶、通用碱基、疏水性碱基、混杂碱基、尺寸扩大的碱基和氟化碱基。其他修饰的核碱基包括三环嘧啶，诸如1,3-二氮杂吩恶嗪-2-酮、1,3-二氮杂吩噻嗪-2-酮和9-(2-氨基乙氧基)-1,3-二氮杂吩恶嗪-2-酮(G-夹)。修饰的核碱基亦可包括其中嘌呤或嘧啶碱基经其他杂环置换的核碱基，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其他核碱基包括以下中公开的那些碱基：Merigan等人,U.S.3,687,808；The Concise Encyclopedia Of PolymerScience and Engineering,Kroschwitz,J.I.编辑,John Wiley&Sons,1990,858-859；Englisch等人,Angewandte Chemie,国际版,1991,30,613；Sanghvi,Y.S.,第15章,Antisense Research and Applications,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑,CRC Press,1993,273-288；和第6和15章,Antisense Drug Technology,Crooke S.T.编辑,CRC Press,2008,163-166和442-443。
教示某些以上提出的修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基的制备的公开包括但不限于：Manoharan等人,US2003/0158403；Manoharan等人,US2003/0175906；Dinh等人,U.S.4,845,205；Spielvogel等人,U.S.5,130,302；Rogers等人,U.S.5,134,066；Bischofberger等人,U.S.5,175,273；Urdea等人,U.S.5,367,066；Benner等人,U.S.5,432,272；Matteucci等人,U.S.5,434,257；Gmeiner等人,U.S.5,457,187；Cook等人,U.S.5,459,255；Froehler等人,U.S.5,484,908；Matteucci等人,U.S.5,502,177；Hawkins等人,U.S.5,525,711；Haralambidis等人,U.S.5,552,540；Cook等人,U.S.5,587,469；Froehler等人,U.S.5,594,121；Switzer等人,U.S.5,596,091；Cook等人,U.S.5,614,617；Froehler等人,U.S.5,645,985；Cook等人,U.S.5,681,941；Cook等人,U.S.5,811,534；Cook等人,U.S.5,750,692；Cook等人,U.S.5,948,903；Cook等人,U.S.5,587,470；Cook等人,U.S.5,457,191；Matteucci等人,U.S.5,763,588；Froehler等人,U.S.5,830,653；Cook等人,U.S.5,808,027；Cook等人,6,166,199；和Matteucci等人,U.S.6,005,096。
3.某些修饰的核苷间键联
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的核苷可使用任何核苷间键联连接在一起。两类主要核苷间连接基团由是否存在磷原子来定义。代表性含磷核苷间键联包括但不限于含有磷酸二酯键(“P(O2)＝O”)(还称为未修饰或天然存在的键)的磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(“P(O2)S”)和二硫代磷酸酯(“HS-P＝S”)。代表性不含磷核苷间连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫二酯、硫代氨基甲酸酯(-O-C(＝O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-SiH2-O-)；和N,N’-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。与天然存在的磷酸酯键联相比，修饰的核苷间键联可用于改变，通常增加寡核苷酸的核酸酶抗性。在某些实施方案中，具有手性原子的核苷间键联可制备为外消旋混合物或分开的对映异构体。含磷和不含磷核苷间键联的制备方法为本领域的技术人员所熟知。
具有手性中心的代表性核苷间键联包括但不限于烷基磷酸酯和硫代磷酸酯。包含具有手性中心的核苷间键联的修饰的寡核苷酸可制备为包含立体结构无规的核苷间键联的修饰的寡核苷酸群体，或制备为包含呈特定立体化学构型的硫代磷酸酯键的修饰的寡核苷酸群体。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸群体包含硫代磷酸酯核苷间键联，其中所有硫代磷酸酯核苷间键联均为立体结构无规的。此类修饰的寡核苷酸可使用随机选择每种硫代磷酸酯键的立体化学构型的合成法产生。但是，如本领域的技术人员所充分了解，每种个别寡核苷酸分子的每种个别硫代磷酸酯具有限定的立体构型。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸群体富集包含一个或多个呈特定的独立地选择的立体化学构型的特定硫代磷酸酯核苷间键联的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，特定硫代磷酸酯键联的特定构型存在于群体中至少65％分子中。在某些实施方案中，特定硫代磷酸酯键联的特定构型存在于群体中至少70％分子中。在某些实施方案中，特定硫代磷酸酯键联的特定构型存在于群体中至少80％分子中。在某些实施方案中，特定硫代磷酸酯键联的特定构型存在于群体中至少90％分子中。在某些实施方案中，特定硫代磷酸酯键联的特定构型存在于群体中至少99％分子中。修饰的寡核苷酸的此类手性富集群体可使用本领域中已知的合成法，例如以下中所述的方法产生：Oka等人,JACS 125,8307(2003)；Wan等人Nuc.Acid.Res.42,13456(2014)；和WO 2017/015555。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸群体富集具有至少一个呈(Sp)构型的所指示硫代磷酸酯的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸群体富集具有至少一个呈(Rp)构型的硫代磷酸酯的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，包含(Rp)和/或(Sp)硫代磷酸酯的修饰的寡核苷酸分别包含下式中的一种或多种，其中“B”指示核碱基：
除非另外指示，否则本文所述的修饰的寡核苷酸的手性核苷间键联可为立体结构无规的或呈特定立体化学构型。
中性核苷间键联包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(3’-CH2-N(CH3)-O-5’)、酰胺-3(3’-CH2-C(＝O)-N(H)-5’)、酰胺-4(3’-CH2-N(H)-C(＝O)-5’)、甲缩醛(3’-O-CH2-O-5’)、甲氧基丙基(MOP)和硫代甲缩醛(3’-S-CH2-O-5’)。其他中性核苷间键联包括包含硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、羧酰胺、硫化物、磺酸酯和酰胺的非离子键联(参见例如Carbohydrate Modifications in Antisense Research；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook编辑,ACS Symposium Series 580；第3章和第4章,40-65)。其他中性核苷间键联包括包含混合N、O、S和CH2构成部分的非离子键联。
B.某些基序
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个包含修饰的糖部分的核苷。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个包含修饰的核碱基的修饰的核苷。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷间键联。在此类实施方案中，修饰的寡核苷酸的修饰、未修饰和不同修饰的糖部分、核碱基和/或核苷间键联限定了模式或基序。在某些实施方案中，糖部分、核碱基和核苷间键联的模式各自彼此无关。因此，修饰的寡核苷酸可通过其糖基序、核碱基基序和/或核苷间键联基序来描述(如本文所用，核碱基基序描述与核碱基序列无关的对核碱基的修饰)。
1.某些糖基序
在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个类型的沿着寡核苷酸或其部分排列的呈限定模式或糖基序的修饰的糖和/或未修饰的糖部分。在某些情况下，此类糖基序包括但不限于本文中论述的任一糖修饰。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有缺口聚物基序，所述缺口聚物基序由两个外部区域或“侧翼”和中央或内部区域或“缺口”限定。缺口聚物基序(5’-侧翼、缺口和3’-侧翼)的三个区域形成核苷的连续序列，其中每个侧翼的核苷的至少一些糖部分与缺口的核苷的至少一些糖部分不同。具体地说，至少最靠近缺口的每个侧翼的核苷(5’-侧翼的最3’-核苷和3’-侧翼的最5’-核苷)的糖部分与相邻缺口核苷的糖部分不同，因此限定侧翼与缺口之间的边界(即侧翼/缺口接合处)。在某些实施方案中，缺口内的糖部分彼此相同。在某些实施方案中，缺口包括一个或多个具有与缺口的一个或多个其他核苷的糖部分不同的糖部分的核苷。在某些实施方案中，两个侧翼的糖基序彼此相同(对称缺口聚物)。在某些实施方案中，5’-侧翼的糖基序与3’-侧翼的糖基序不同(不对称缺口聚物)。
在某些实施方案中，缺口聚物的侧翼包含1-6个核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的每个侧翼的每个核苷包含修饰的糖部分。在某些实施方案中，缺口聚物的每个侧翼的至少一个核苷包含修饰的糖部分。在某些实施方案中，缺口聚物的每个侧翼的至少两个核苷包含修饰的糖部分。在某些实施方案中，缺口聚物的每个侧翼的至少三个核苷包含修饰的糖部分。在某些实施方案中，缺口聚物的每个侧翼的至少四个核苷包含修饰的糖部分。在某些实施方案中，缺口聚物的每个侧翼的至少五个核苷包含修饰的糖部分。
在某些实施方案中，缺口聚物的缺口包含7-12个核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口的每个核苷包含2’-β-D-脱氧核糖基糖部分。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口的至少一个核苷包含修饰的糖部分。
在某些实施方案中，缺口聚物为脱氧缺口聚物。在某些实施方案中，每个侧翼/缺口接合处的缺口侧上的核苷包含2’-脱氧核糖基糖部分，且每个侧翼/缺口接合处的侧翼侧上的核苷包含修饰的糖部分。在某些实施方案中，缺口的每个核苷包含2’-β-D-脱氧核糖基糖部分。在某些实施方案中，缺口聚物的每个侧翼的每个核苷包含修饰的糖部分。在某些实施方案中，缺口的确切一个核苷包含修饰的糖部分且缺口的每个剩余核苷包含2’-β-D-脱氧核糖基糖部分。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含具有充分修饰的糖基序的部分或由其组成。在此类实施方案中，修饰的寡核苷酸的充分修饰的部分的每个核苷包含修饰的糖部分。在某些实施方案中，整个修饰的寡核苷酸的每个核苷包含修饰的糖部分。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含具有充分修饰的糖基序的部分或由其组成，其中充分修饰的部分内的每个核苷包含相同修饰的糖部分，本文中称为统一修饰的糖基序。在某些实施方案中，充分修饰的寡核苷酸为统一修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，统一修饰的寡核苷酸的每个核苷包含相同2’-修饰。
本文中，缺口聚物的三个区域的长度(核苷数目)可使用以下表示法来提供：[5’-侧翼中的核苷数目]-[缺口中的核苷数目]-[3’-侧翼中的核苷数目]。因此，3-10-3缺口聚物由每个侧翼中3个连接核苷和缺口中10个连接核苷组成。在此类命名法后面为特定修饰的情况下，所述修饰为每个侧翼的每个糖部分中的修饰且缺口核苷包含2’-β-D-脱氧核糖基糖部分。因此，5-10-5MOE缺口聚物由5’-侧翼中5个连接2’-MOE核苷、缺口中10个连接2’-β-D-脱氧核苷和3’-侧翼中5个连接2’-MOE核苷组成。3-10-3cEt缺口聚物由5’-侧翼中3个连接cEt核苷、缺口中10个连接2’-β-D-脱氧核苷和3’-侧翼中3个连接cEt核苷组成。5-8-5缺口聚物由5’-侧翼中5个包含修饰的糖部分的连接核苷、缺口中8个连接2’-β-D-脱氧核苷和3’-侧翼中5个包含修饰的糖部分的连接核苷组成。5-8-5混合缺口聚物在5’-侧翼和/或3’-侧翼中具有至少两个不同的修饰的糖部分。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸为5-10-5MOE缺口聚物。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸为4-10-6MOE缺口聚物。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸为6-10-4MOE缺口聚物。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸为5-8-5MOE缺口聚物。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸为6-8-4MOE缺口聚物。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸为4-8-6MOE缺口聚物。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸为X-Y-Z MOE缺口聚物，其中X和Z独立地选自1、2、3、4、5或6且Y为7、8、9、10或11。
2.某些核碱基基序
在某些实施方案中，寡核苷酸包含沿着寡核苷酸或其部分排列的呈界定模式或基序的修饰和/或未修饰的核碱基。在某些实施方案中，每个核碱基为修饰的。在某些实施方案中，核碱基中没有一个为修饰的。在某些实施方案中，每个嘌呤或每个嘧啶为修饰的。在某些实施方案中，每个腺嘌呤为修饰的。在某些实施方案中，每个鸟嘌呤为修饰的。在某些实施方案中，每个胸腺嘧啶为修饰的。在某些实施方案中，每个尿嘧啶为修饰的。在某些实施方案中，每个胞嘧啶为修饰的。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸中的一些或所有胞嘧啶核碱基为5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，所有胞嘧啶核碱基均为5-甲基胞嘧啶，且修饰的寡核苷酸的所有其他核碱基均为未修饰的核碱基。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含修饰的核碱基的嵌段。在某些此类实施方案中，嵌段在寡核苷酸的3’-端。在某些实施方案中，嵌段在寡核苷酸的3’-端的3个核苷内。在某些实施方案中，嵌段在寡核苷酸的5’-端。在某些实施方案中，嵌段在寡核苷酸的5’-端的3个核苷内。
在某些实施方案中，具有缺口聚物基序的寡核苷酸包含有包含修饰的核碱基的核苷。在某些此类实施方案中，一个包含修饰的核碱基的核苷在具有缺口聚物基序的寡核苷酸的中央缺口中。在某些此类实施方案中，所述核苷的糖部分为2’-β-D-脱氧核糖基糖部分。在某些实施方案中，修饰的核碱基选自：2-硫代嘧啶和5-丙炔嘧啶。
3.某些核苷间键联基序
在某些实施方案中，寡核苷酸包含沿着寡核苷酸或其部分排列的呈限定模式或基序的修饰和/或未修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，各核苷间连接基团为磷酸二酯核苷间键联(P(O2)＝O)。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的每个核苷间连接基团为硫代磷酸酯核苷间键联(P(O2)＝S)。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的每个核苷间键联独立地选自硫代磷酸酯核苷间键联和磷酸二酯核苷间键联。在某些实施方案中，每个硫代磷酸酯核苷间键联独立地选自立体结构无规的硫代磷酸酯、(Sp)硫代磷酸酯和(Rp)硫代磷酸酯。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的糖基序为缺口聚物且缺口内的核苷间键联均为修饰的。在某些此类实施方案中，侧翼中一些或所有核苷间键联为未修饰的磷酸二酯核苷间键联。在某些实施方案中，末端核苷间键联为修饰的。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的糖基序为缺口聚物，且核苷间键联基序在至少一个侧翼中包含至少一个磷酸二酯核苷间键联，其中至少一个磷酸二酯键联不为末端核苷间键联，且剩余核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。在某些此类实施方案中，硫代磷酸酯键联均为立体结构无规的。在某些实施方案中，侧翼中的所有硫代磷酸酯键联为(Sp)硫代磷酸酯，且缺口包含至少一个Sp,Sp,Rp基序。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸群体富集包含此类核苷间键联基序的修饰的寡核苷酸。
在某些实施方案中，修饰的核苷酸具有核苷间键联基序soooossssssssssooss，其中每个“s”表示硫代磷酸酯核苷间键联且每个“o”表示磷酸二酯核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷酸具有核苷间键联基序sooooossssssssssoss，其中每个“s”表示硫代磷酸酯核苷间键联且每个“o”表示磷酸二酯核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷酸具有核苷间键联基序soooosssssssssoss，其中每个“s”表示硫代磷酸酯核苷间键联且每个“o”表示磷酸二酯核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷酸具有核苷间键联基序sooosssssssssooss，其中每个“s”表示硫代磷酸酯核苷间键联且每个“o”表示磷酸二酯核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷酸具有核苷间键联基序sooossssssssssoooss，其中每个“s”表示硫代磷酸酯核苷间键联且每个“o”表示磷酸二酯核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷酸具有核苷间键联基序soosssssssssoooss，其中每个“s”表示硫代磷酸酯核苷间键联且每个“o”表示磷酸二酯核苷间键联。
C.某些长度
可在不消除活性的情况下增加或减小寡核苷酸的长度。例如，在Woolf等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7305-7309,1992)中，测试了一系列13-25个核碱基长度的寡核苷酸在***注射模型中诱导靶RNA裂解的能力。在寡核苷酸的末端附近具有8或11个错配碱基的25个核碱基长度的寡核苷酸能够指导靶RNA的特异性裂解，不过裂解程度低于不含错配的寡核苷酸。类似地，靶特异性裂解使用13个核碱基的寡核苷酸，包括具有1或3个错配的寡核苷酸实现。
在某些实施方案中，寡核苷酸(包括修饰的寡核苷酸)可具有多个范围的长度中任一个。在某些实施方案中，寡核苷酸由X至Y个连接核苷组成，其中X表示在所述范围内的最小数目核苷，且Y表示在所述范围内的最大数目核苷。在某些此类实施方案中，X和Y各独立地选自8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50；限制条件为X≤Y。例如，在某些实施方案中，寡核苷酸由12至13个、12至14个、12至15个、12至16个、12至17个、12至18个、12至19个、12至20个、12至21个、12至22个、12至23个、12至24个、12至25个、12至26个、12至27个、12至28个、12至29个、12至30个、13至14个、13至15个、13至16个、13至17个、13至18个、13至19个、13至20个、13至21个、13至22个、13至23个、13至24个、13至25个、13至26个、13至27个、13至28个、13至29个、13至30个、14至15个、14至16个、14至17个、14至18个、14至19个、14至20个、14至21个、14至22个、14至23个、14至24个、14至25个、14至26个、14至27个、14至28个、14至29个、14至30个、15至16个、15至17个、15至18个、15至19个、15至20个、15至21个、15至22个、15至23个、15至24个、15至25个、15至26个、15至27个、15至28个、15至29个、15至30个、16至17个、16至18个、16至19个、16至20个、16至21个、16至22个、16至23个、16至24个、16至25个、16至26个、16至27个、16至28个、16至29个、16至30个、17至18个、17至19个、17至20个、17至21个、17至22个、17至23个、17至24个、17至25个、17至26个、17至27个、17至28个、17至29个、17至30个、18至19个、18至20个、18至21个、18至22个、18至23个、18至24个、18至25个、18至26个、18至27个、18至28个、18至29个、18至30个、19至20个、19至21个、19至22个、19至23个、19至24个、19至25个、19至26个、19至29个、19至28个、19至29个、19至30个、20至21个、20至22个、20至23个、20至24个、20至25个、20至26个、20至27个、20至28个、20至29个、20至30个、21至22个、21至23个、21至24个、21至25个、21至26个、21至27个、21至28个、21至29个、21至30个、22至23个、22至24个、22至25个、22至26个、22至27个、22至28个、22至29个、22至30个、23至24个、23至25个、23至26个、23至27个、23至28个、23至29个、23至30个、24至25个、24至26个、24至27个、24至28个、24至29个、24至30个、25至26个、25至27个、25至28个、25至29个、25至30个、26至27个、26至28个、26至29个、26至30个、27至28个、27至29个、27至30个、28至29个、28至30个或29至30个连接核苷组成。
D.某些修饰的寡核苷酸
在某些实施方案中，将以上修饰(糖、核碱基、核苷间键联)并入修饰的寡核苷酸中。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸通过其修饰基序和总体长度来表征。在某些实施方案中，此类参数各自彼此无关。因此，除非另外指示，否则具有缺口聚物糖基序的寡核苷酸的每个核苷间键联可为修饰或未修饰的，且可遵循或可不遵循糖修饰的缺口聚物修饰模式。例如，糖缺口聚物的侧翼区域内的核苷间键联可彼此相同或不同，且可与糖基序的缺口区域的核苷间键联相同或不同。同样，此类糖缺口聚物寡核苷酸可包含一个或多个与糖修饰的缺口聚物模式无关的修饰的核碱基。除非另外指示，否则所有修饰均与核碱基序列无关。
E.某些修饰的寡核苷酸群体
其中群体的所有修饰的寡核苷酸具有相同分子式的修饰的寡核苷酸群体可为立体结构无规的群体或手性富集群体。立体结构无规的群体中所有修饰的寡核苷酸的所有手性中心均为立体结构无规的。在手性富集群体中，所述群体的修饰的寡核苷酸中至少一个特定手性中心不为立体结构无规的。在某些实施方案中，手性富集群体的修饰的寡核苷酸富集β-D核糖基糖部分，且所有硫代磷酸酯核苷间键联均为立体结构无规的。在某些实施方案中，手性富集群体的修饰的寡核苷酸富集β-D核糖基糖部分与至少一个呈特定立体化学构型的特定硫代磷酸酯核苷间键联。
F.核碱基序列
在某些实施方案中，寡核苷酸(未修饰或修饰的寡核苷酸)通过其核碱基序列来进一步描述。在某些实施方案中，寡核苷酸具有与第二寡核苷酸或所确定的参考核酸，诸如靶核酸互补的核碱基序列。在某些此类实施方案中，寡核苷酸的部分具有与第二寡核苷酸或所确定的参考核酸，诸如靶核酸互补的核碱基序列。在某些实施方案中，寡核苷酸的部分或整个长度的核碱基序列与第二寡核苷酸或核酸，诸如靶核酸至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。
II.某些寡聚化合物
在某些实施方案中，本文提供由寡核苷酸(修饰或未修饰的)和任选一个或多个结合基团和/或端基组成的寡聚化合物。结合基团由一个或多个结合部分和将结合部分连接于寡核苷酸的结合接头组成。结合基团可连接于寡核苷酸的任一个或两个末端和/或任何内部位置。在某些实施方案中，结合基团连接于修饰的寡核苷酸的核苷的2’-位。在某些实施方案中，连接于寡核苷酸的任一个或两个末端的结合基团为端基。在某些此类实施方案中，结合基团或端基连接在寡核苷酸的3’和/或5’-端。在某些此类实施方案中，结合基团(或端基)连接在寡核苷酸的3’-端。在某些实施方案中，结合基团连接在寡核苷酸的3’-端附近。在某些实施方案中，结合基团(或端基)连接在寡核苷酸的5’-端。在某些实施方案中，结合基团连接在寡核苷酸的5’-端附近。
端基的实例包括但不限于结合基团、加帽基团、磷酸酯部分、保护基、修饰或未修饰的核苷和两个或更多个独立地修饰或未修饰的核苷。
A.某些结合基团
在某些实施方案中，寡核苷酸共价连接于一个或多个结合基团。在某些实施方案中，结合基团对所连接的寡核苷酸的一种或多种性质进行修饰，包括但不限于药效学、药物动力学、稳定性、结合、吸收、组织分布、细胞分布、细胞吸收、电荷和清除。在某些实施方案中，结合基团赋予所连接的寡核苷酸新特性，例如使寡核苷酸能够检测到的荧光团或报告基团。先前已描述某些结合基团和结合部分，例如：胆固醇部分(Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556)、胆酸(Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4,1053-1060)、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇)(Manoharan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306-309；Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1993,3,2765-2770)、巯基胆固醇(Oberhauser等人,Nucl.AcidsRes.,1992,20,533-538)、脂肪链(例如十二烷二醇或十一烷基残基)(Saison-Behmoaras等人,EMBO J.,1991,10,1111-1118；Kabanov等人,FEBS Lett.,1990,259,327-330；Svinarchuk等人,Biochimie,1993,75,49-54)、磷脂(例如二-十六烷基-外消旋-丙三醇或1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸三乙铵)(Manoharan等人,TetrahedronLett.,1995,36,3651-3654；Shea等人,Nucl.Acids Res.,1990,18,3777-3783)、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969-973)或金刚烷乙酸或棕榈基部分(Mishra等人,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)、十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937)、生育酚基团(Nishina等人,Molecular Therapy Nucleic Acids,2015,4,e220；和Nishina等人,Molecular Therapy,2008,16,734-740)或GalNAc簇(例如WO2014/179620)。
在某些实施方案中，结合基团可选自以下中任一个：C22烷基、C20烷基、C16烷基、C10烷基、C21烷基、C19烷基、C18烷基、C15烷基、C14烷基、C13烷基、C12烷基、C11烷基、C9烷基、C8烷基、C7烷基、C6烷基、C5烷基、C22烯基、C20烯基、C16烯基、C10烯基、C21烯基、C19烯基、C18烯基、C15烯基、C14烯基、C13烯基、C12烯基、C11烯基、C9烯基、C8烯基、C7烯基、C6烯基或C5烯基。
在某些实施方案中，结合基团可选自以下中任一个：C22烷基、C20烷基、C16烷基、C10烷基、C21烷基、C19烷基、C18烷基、C15烷基、C14烷基、C13烷基、C12烷基、C11烷基、C9烷基、C8烷基、C7烷基、C6烷基和C5烷基，其中烷基链具有一个或多个不饱和键。
1.结合部分
结合部分包括但不限于嵌入剂、报告分子、多胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、维生素部分、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、巯基胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素、荧光团和染料。
在某些实施方案中，结合部分包含活性原料药，例如阿司匹林(aspirin)、华法令(warfarin)、苯基保泰松(phenylbutazone)、布洛芬(ibuprofen)、舒洛芬(suprofen)、芬布芬(fen-bufen)、酮洛芬(ketoprofen)、(S)-(+)-普拉洛芬((S)-(+)-pranoprofen)、卡洛芬(carprofen)、丹磺基肌胺酸(dansylsarcosine)、2,3,5-三碘苯甲酸、芬戈莫德(fingolimod)、氟灭酸(flufenamic acid)、亚叶酸(folinic acid)、苯噻二嗪(benzothiadiazide)、***(chlorothiazide)、二氮(diazepine)、吲哚美辛(indo-methicin)、巴比妥酸盐(barbiturate)、头孢菌素(cephalosporin)、磺胺药(sulfa drug)、抗糖尿病药、抗细菌剂或抗生素。
2.结合接头
结合部分通过结合接头连接于寡核苷酸。在某些寡聚化合物中，结合接头为单一化学键(即结合部分通过单键直接连接于寡核苷酸)。在某些实施方案中，结合接头包含链结构，诸如烃基链，或诸如乙二醇、核苷或氨基酸单元的重复单元的寡聚物。
在某些实施方案中，结合接头包含选自烷基、氨基、侧氧基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟基氨基的一种或多种基团。在某些此类实施方案中，结合接头包含选自烷基、氨基、侧氧基、酰胺和醚基的基团。在某些实施方案中，结合接头包含选自烷基和酰胺基的基团。在某些实施方案中，结合接头包含选自烷基和醚基的基团。在某些实施方案中，结合接头包含至少一个含磷部分。在某些实施方案中，结合接头包含至少一个磷酸基。在某些实施方案中，结合接头包括至少一个中性连接基团。
在某些实施方案中，结合接头，包括上述结合接头，为双官能连接部分，例如本领域中已知可用于将结合基团连接于母体化合物，诸如本文提供的寡核苷酸的连接部分。一般而言，双官能连接部分包含至少两个官能团。官能团之一被选择为结合于母体化合物上的特定位点，且另一个被选择成结合于结合基团。用于双官能连接部分中的官能团的实例包括但不限于与亲核基团反应的亲电试剂和与亲电子基团反应的亲核试剂。在某些实施方案中，双官能连接部分包含一种或多种选自氨基、羟基、羧酸、硫醇、烷基、烯基和炔基的基团。
结合接头的实例包括但不限于吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)和6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其他结合接头包括但不限于取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C2-C10烯基或取代或未取代的C2-C10炔基，其中优选取代基的非限制性列表包括羟基、氨基、烷氧基、羧基、苯甲基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、卤代、烷基、芳基、烯基和炔基。
在某些实施方案中，结合接头包含1-10个接头-核苷。在某些实施方案中，结合接头包含2-5个接头-核苷。在某些实施方案中，结合接头包含准确3个接头-核苷。在某些实施方案中，结合接头包含TCA基序。在某些实施方案中，此类接头-核苷为修饰的核苷。在某些实施方案中，此类接头-核苷包含修饰的糖部分。在某些实施方案中，接头-核苷为未修饰的。在某些实施方案中，接头-核苷包含选自嘌呤、取代的嘌呤、嘧啶或取代的嘧啶的任选保护的杂环碱基。在某些实施方案中，可裂解部分为选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、4-N-苯甲酰基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、4-N-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、6-N-苯甲酰基腺嘌呤、鸟嘌呤和2-N-异丁酰基鸟嘌呤的核苷。在寡聚化合物到达靶组织之后通常需要接头-核苷从寡聚化合物裂解。因此，接头-核苷通常通过可裂解键彼此连接和连接于寡聚化合物的其余部分。在某些实施方案中，此类可裂解键为磷酸二酯键。
本文中，接头-核苷不视为寡核苷酸的一部分。因此，在寡聚化合物包含由指定数目或范围的连接核苷组成和/或与参考核酸具有指定互补百分比的寡核苷酸且寡聚化合物还包含含有包含接头-核苷的结合接头的结合基团的实施方案中，那些接头-核苷不计入寡核苷酸的长度，且在确定寡核苷酸与参考核酸的互补性百分比中不使用。例如，寡聚化合物可包含(1)由8-30个核苷组成的修饰的寡核苷酸和(2)包含1-10个与修饰的寡核苷酸的核苷连续的接头-核苷的结合基团。此类寡聚化合物中连续连接核苷的总数大于30个。替代地，寡聚化合物可包含由8-30个核苷组成且无结合基团的修饰的寡核苷酸。此类寡聚化合物中连续连接核苷的总数至多30个。除非另外指示，否则结合接头包含至多10个接头-核苷。在某些实施方案中，结合接头包含至多5个接头-核苷。在某些实施方案中，结合接头包含至多3个接头-核苷。在某些实施方案中，结合接头包含至多2个接头-核苷。在某些实施方案中，结合接头包含至多1个接头-核苷。
在某些实施方案中，需要结合基团从寡核苷酸裂解。例如，在某些情况下，包含特定结合部分的寡聚化合物更好地由特定细胞类型吸收，但一旦吸收寡聚化合物后，希望结合基团裂解以释放未结合或母体寡核苷酸。因此，某些结合接头可包含一个或多个可裂解部分。在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解键。在某些实施方案中，可裂解部分为包含至少一个可裂解键的一组原子。在某些实施方案中，可裂解部分包含具有一个、两个、三个、四个或多于四个可裂解键的一组原子。在某些实施方案中，可裂解部分在细胞或亚细胞区室，诸如溶酶体内，选择性地裂解。在某些实施方案中，可裂解部分由内源性酶，诸如核酸酶选择性地裂解。
在某些实施方案中，可裂解键选自：酰胺、酯、醚、磷酸二酯中的一种或两种酯、磷酸酯、氨基甲酸酯或二硫化物。在某些实施方案中，可裂解键为磷酸二酯的一种或两种酯。在某些实施方案中，可裂解部分包含磷酸酯或磷酸二酯。在某些实施方案中，可裂解部分为在寡核苷酸与结合部分或结合基团之间的磷酸酯或磷酸二酯键联。
在某些实施方案中，可裂解部分包含一种或多种接头-核苷或由其组成。在某些此类实施方案中，一种或多种接头-核苷通过可裂解键彼此连接和连接于寡聚化合物的其余部分。在某些实施方案中，此类可裂解键为未修饰的磷酸二酯键。在某些实施方案中，可裂解部分为通过磷酸二酯核苷间键联连接于寡核苷酸的3’-或5’-端核苷且通过磷酸酯或硫代磷酸酯键联共价连接于结合接头或结合部分的其余部分的2’-脱氧核苷。在某些此类实施方案中，可裂解部分为2’-脱氧腺苷。
3.靶向细胞的部分
在某些实施方案中，结合基团包含靶向细胞的部分。在某些实施方案中，结合基团具有如下通式：
其中n为1至约3；当n为1时，m为0，当n为2或更大时，m为1，j为1或0，且k为1或0。
在某些实施方案中，n为1，j为1且k为0。在某些实施方案中，n为1，j为0且k为1。在某些实施方案中，n为1，j为1且k为1。在某些实施方案中，n为2，j为1且k为0。在某些实施方案中，n为2，j为0且k为1。在某些实施方案中，n为2，j为1且k为1。在某些实施方案中，n为3，j为1且k为0。在某些实施方案中，n为3，j为0且k为1。在某些实施方案中，n为3，j为1且k为1。
在某些实施方案中，结合基团包含具有至少一个束缚配体的靶向细胞的部分。在某些实施方案中，靶向细胞的部分包含两个共价连接至支化基团的束缚配体。在某些实施方案中，靶向细胞的部分包含三个共价连接至支化基团的束缚配体。
B.某些端基
在某些实施方案中，寡聚化合物包含一个或多个端基。在某些此类实施方案中，寡聚化合物包含稳定5’-磷酸酯。稳定5’-磷酸酯包括(但不限于)5’-膦酸酯，包括(但不限于)5’-乙烯基膦酸酯。在某些实施方案中，端基包含一个或多个无碱基核苷和/或反向核苷。在某些实施方案中，端基包含一个或多个2’-连接核苷。在某些此类实施方案中，2’-连接核苷为无碱基核苷。
III.寡聚双链体
在某些实施方案中，本文所述的寡聚化合物包含具有与靶核酸互补的核碱基序列的寡核苷酸。在某些实施方案中，寡聚化合物与第二寡聚化合物配对以形成寡聚双链体。此类寡聚双链体包含具有与靶核酸互补的部分的第一寡聚化合物和具有与第一寡聚化合物互补的部分的第二寡聚化合物。在某些实施方案中，寡聚双链体的第一寡聚化合物包含以下或由以下组成：(1)修饰或未修饰的寡核苷酸和任选存在的结合基团和(2)第二修饰或未修饰的寡核苷酸和任选存在的结合基团。寡聚双链体的任一种或两种寡聚化合物可包含结合基团。寡聚双链体的每种寡聚化合物的寡核苷酸可包括非互补性悬垂核苷。
IV.反义活性
在某些实施方案中，寡聚化合物和寡聚双链体能够与靶核酸杂交，产生至少一种反义活性；此类寡聚化合物和寡聚双链体为反义化合物。在某些实施方案中，当在标准细胞分析中反义化合物降低或抑制靶核酸的量或活性25％或更多时，其具有反义活性。在某些实施方案中，反义化合物选择性地影响一种或多种靶核酸。此类反义化合物包含与一种或多种靶核酸杂交，产生一种或多种所需反义活性，且不与一种或多种非靶核酸杂交或不以产生显著非所需的反义活性的方式与一种或多种非靶核酸杂交的核碱基序列。
在某些反义活性中，反义化合物与靶核酸的杂交募集使靶核酸裂解的蛋白质。例如，某些反义化合物引起RNA酶H介导的靶核酸裂解。RNA酶H为使RNA:DNA双链体的RNA链裂解的细胞核酸内切酶。此类RNA:DNA双链体中的DNA无需为未修饰的DNA。在某些实施方案中，本文需要足够“DNA样”而引起RNA酶H活性的反义化合物。在某些实施方案中，容许缺口聚物的缺口中一个或多个非DNA样核苷。
在某些反义活性中，反义化合物或反义化合物的一部分被负载至RNA诱导沉默复合物(RISC)中，最终引起靶核酸裂解。例如，某些反义化合物引起靶核酸由Argonaute裂解。负载至RISC中的反义化合物为RNAi化合物。RNAi化合物可为双链(siRNA)或单链(ssRNA)。
在某些实施方案中，反义化合物与靶核酸的杂交不募集使靶核酸裂解的蛋白质。在某些实施方案中，反义化合物与靶核酸的杂交改变靶核酸的剪接。在某些实施方案中，反义化合物与靶核酸的杂交抑制靶核酸与蛋白质或其他核酸之间的结合相互作用。在某些实施方案中，反义化合物与靶核酸的杂交改变靶核酸的翻译。
可直接或间接观察反义活性。在某些实施方案中，反义活性的观察或检测涉及对靶核酸或由此类靶核酸编码的蛋白质的量的变化、核酸或蛋白质的剪接变异体的比率的变化和/或细胞或受试者的表型变化的观察或检测。
V.某些靶核酸
在某些实施方案中，寡聚化合物包含有包含与靶核酸互补的部分的寡核苷酸或由其组成。在某些实施方案中，靶核酸为内源性RNA分子。在某些实施方案中，靶核酸编码蛋白质。在某些此类实施方案中，靶核酸选自：不编码蛋白质的内源性反义转录物(例如UBE3A-ATS)、成熟mRNA和前体mRNA，包括内含子、外显子和未翻译区域。在某些实施方案中，靶RNA为反义转录物。在某些实施方案中，靶RNA为成熟mRNA。在某些实施方案中，靶核酸为前体mRNA。在某些此类实施方案中，靶区域完全在内含子内。在某些实施方案中，靶区域跨越内含子/外显子接合处。在某些实施方案中，靶区域至少50％在内含子内。在某些实施方案中，靶核酸为逆基因的RNA转录产物。在某些实施方案中，靶核酸为非编码RNA。在某些此类实施方案中，标靶非编码RNA选自：长的非编码RNA、短的非编码RNA、内含子RNA分子。
A.与靶核酸的互补性/错配
可在不消除活性的情况下引入错配碱基。例如，Gautschi等人(J.Natl.CancerInst.93:463-471,2001年3月)证明与bcl-2mRNA 100％互补且与bcl-xL mRNA有3个错配的寡核苷酸在活体外和活体内减少bcl-2和bcl-xL两者的表达的能力。此外，此寡核苷酸证明在活体内有效的抗肿瘤活性。Maher和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16:3341-3358,1988)在兔网状红血球分析中分别测试一系列串联14个核碱基的寡核苷酸和由两个或三个串联寡核苷酸的序列构成的28和42个核碱基的寡核苷酸抑制人DHFR翻译的能力。三个14个核碱基的寡核苷酸中的每一个在单独的情况下能够抑制翻译，不过水平比28或42个核碱基的寡核苷酸低。
在某些实施方案中，在寡核苷酸整个长度上寡核苷酸与靶核酸互补。在某些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸99％、95％、90％、85％或80％互补。在某些实施方案中，在寡核苷酸整个长度上寡核苷酸与靶核酸至少80％互补，且包含与靶核酸100％或完全互补的部分。在某些实施方案中，完全互补部分长度为6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个核碱基。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个相对于靶核酸错配的核碱基。在某些实施方案中，此类错配降低针对标靶的反义活性，但针对非标靶的活性降低的量更大。因此，在某些实施方案中，改善寡核苷酸的选择性。在某些实施方案中，错配特定位于具有缺口聚物基序的寡核苷酸内。在某些实施方案中，错配在自缺口区域的5’-端的位置1、2、3、4、5、6、7或8。在某些实施方案中，错配在自缺口区域的3’-端的位置9、8、7、6、5、4、3、2、1。在某些实施方案中，错配在自侧翼区域的5’-端的位置1、2、3或4。在某些实施方案中，错配在自侧翼区域的3’-端的位置4、3、2或1。
B.UBE3A-ATS
在某些实施方案中，寡聚化合物包含与靶核酸互补的寡核苷酸或其部分或由与靶核酸互补的寡核苷酸或其部分组成，其中靶核酸为UBE3A-ATS。在某些实施方案中，UBE3A-ATS核酸具有SEQ ID NO:1(GENBANK保藏号:NC_000015.10_TRUNC_24821647_25441028)、SEQ ID NO:2915(Ensemble基因ID ENSG00000224078)或SEQ ID NO:2916(Ensemble转录物ENST00000554726.1的cDNA)中所示的序列。
在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2915或SEQ ID NO:2916互补的寡聚化合物能够减少细胞中的UBE3A-ATS。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1互补的寡聚化合物能够增加细胞中的UBE3A RNA或蛋白质。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2915或SEQ ID NO:2916互补的寡聚化合物能够增加细胞中的父本UBE3A RNA或蛋白质。在某些实施方案中，细胞在活体外。在某些实施方案中，细胞在受试者中。在某些实施方案中，寡聚化合物由修饰的寡核苷酸组成。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2915或SEQ ID NO:2916互补的寡聚化合物在施用受试者时能够改善神经遗传性病症的一种或多种症状或标志。在某些实施方案中，神经遗传性病症为AS。在某些实施方案中，症状或标志选自发育迟缓、运动失调、言语障碍、睡眠问题、癫痫发作和EEG异常。
在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2915或SEQ ID NO:2916互补的寡聚化合物能够降低活体外UBE3A-ATS RNA的可检测量至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在某些实施方案中，与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2915或SEQ ID NO:2916互补的寡聚化合物能够增加活体外UBE3A蛋白质的可检测量至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2915或SEQ ID NO:2916互补的寡聚化合物能够减少受试者CSF中UBE3A-ATS RNA的可检测量至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2915或SEQ ID NO:2916互补的寡聚化合物能够增加受试者CSF中UBE3A蛋白质的可检测量至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
C.某些组织中的某些靶核酸
在某些实施方案中，寡聚化合物包含有包含与靶核酸互补的部分的寡核苷酸或由其组成，其中靶核酸在药理学相关组织中表达。在某些实施方案中，药理学相关组织为构成中枢神经***的细胞和组织。此类组织包括皮质、海马体和脊髓。
VI.某些药物组合物
在某些实施方案中，本文描述包含一种或多种寡聚化合物的药物组合物。在某些实施方案中，所述一种或多种寡聚化合物各自由修饰的寡核苷酸组成。在某些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的稀释剂或载剂。在某些实施方案中，药物组合物包含无菌盐水溶液和一种或多种寡聚化合物或由其组成。在某些实施方案中，无菌盐水为药品级盐水。在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种寡聚化合物和无菌水或由其组成。在某些实施方案中，无菌水为药品级水。在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种寡聚化合物和磷酸盐缓冲盐水(PBS)或由其组成。在某些实施方案中，无菌PBS为药品级PBS。在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种寡聚化合物和人工脑脊髓液或由其组成。在某些实施方案中，人工脑脊髓液为药品级。
在某些实施方案中，药物组合物包含修饰的寡核苷酸和人工脑脊髓液。在某些实施方案中，药物组合物由修饰的寡核苷酸和人工脑脊髓液组成。在某些实施方案中，药物组合物基本上由修饰的寡核苷酸和人工脑脊髓液组成。在某些实施方案中，人工脑脊髓液为药品级。
在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种寡聚化合物和一种或多种赋形剂。在某些实施方案中，赋形剂选自水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
在某些实施方案中，寡聚化合物可与药学上可接受的活性和/或惰性物质混合以制备药物组合物或制剂。用于配制药物组合物的组合物和方法取决于许多标准，包括(但不限于)施用途径、疾病程度或待施用剂量。
在某些实施方案中，包含寡聚化合物的药物组合物涵盖寡聚化合物的任何药学上可接受的盐、寡聚化合物的酯或此类酯的盐。在某些实施方案中，包含有包含一种或多种寡核苷酸的寡聚化合物的药物组合物在施用包括人的受试者后能够提供(直接或间接)生物学上活性代谢物或其残余物。因此，例如，本发明还关于寡聚化合物的药学上可接受的盐、前药、此类前药的药学上可接受的盐和其他生物同等物。合适的药学上可接受的盐包括(但不限于)钠盐和钾盐。在某些实施方案中，前药包含一个或多个连接于寡核苷酸的结合基团，其中所述结合基团在体内由内源核酸酶裂解。
脂质部分已用于多种方法中的核酸疗法中。在某些此类方法中，核酸，诸如寡聚化合物，引入预先形成的脂质体或由阳离子脂质和中性脂质的混合物制成的脂质复合物中。在某些方法中，在不存在中性脂质的情况下形成DNA与单阳离子或聚阳离子脂质的复合物。在某些实施方案中，脂质部分被选择成增加医药剂向特定细胞或组织的分布。在某些实施方案中，脂质部分被选择成增加医药剂向脂肪组织的分布。在某些实施方案中，脂质部分被选择成增加医药剂向肌肉组织的分布。
在某些实施方案中，药物组合物包含递送***。递送***的实例包括(但不限于)脂质体和乳液。某些递送***可用于制备某些药物组合物，包括包含疏水化合物的药物组合物。在某些实施方案中，使用某些有机溶剂，诸如二甲亚砜。
在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种被设计成将本发明的一种或多种医药剂递送至特定组织或细胞类型的组织特异性递送分子。例如，在某些实施方案中，药物组合物包括涂有组织特异性抗体的脂质体。
在某些实施方案中，药物组合物包含共溶剂***。某些此类共溶剂***包含例如苯甲醇、非极性表面活性剂、水可混溶性有机聚合物和水相。在某些实施方案中，此类共溶剂***用于疏水性化合物。此类共溶剂***的非限制性实例为VPD共溶剂***，其为包含3％w/v苯甲醇、8％w/v非极性表面活性剂Polysorbate 80TM和65％w/v聚乙二醇300的无水乙醇溶液。在不显著地改变溶解性和毒性特征的情况下可显著地改变此类共溶剂***的比例。此外，共溶剂组分的特性可变化：例如，可使用其他表面活性剂代替Polysorbate 80TM；聚乙二醇的分级尺寸可变化；其他生物相容性聚合物可替换聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；且其他糖或多糖可代替右旋糖。
在某些实施方案中，药物组合物被制备用于经口施用。在某些实施方案中，药物组合物被制备用于经颊施用。在某些实施方案中，药物组合物被制备用于通过注射施用(例如静脉内、皮下、肌肉内、鞘内(IT)、脑室内(ICV)等)。在某些此类实施方案中，药物组合物包含载剂且在水性溶液，诸如水或生理学相容的缓冲液，诸如汉克氏溶液(Hanks’ssolution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)或生理盐水缓冲液中配制。在某些实施方案中，包括其他成分(例如帮助溶解或用作防腐剂的成分)。在某些实施方案中，可注射混悬液使用适当液体载剂、悬浮剂等来制备。用于注射的某些药物组合物以单位剂型呈现，例如呈安瓿或呈多剂量容器。用于注射的某些药物组合物为于油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，且可含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的配制剂。适用于注射用药物组合物的某些溶剂包括(但不限于)亲脂性溶剂和脂油，诸如芝麻油、合成脂肪酸酯(诸如油酸乙酯或甘油三酯)和脂质体。
在某些条件下，本文所公开的某些化合物充当酸。尽管此类化合物可以质子化(游离酸)形式或者离子化并与阳离子(盐)缔合的形式进行描绘或描述，但此类化合物的水溶液以此类形式处于平衡的形式存在。例如，水溶液中寡核苷酸的磷酸酯键联以游离酸、阴离子和盐形式处于平衡的形式存在。除非另外指示，否则本文所述的化合物旨在包括所有此类形式。此外，某些寡核苷酸具有若干此类键联，每个键联均处于平衡。因此，溶液中的寡核苷酸以多个位置的所有形式均处于平衡的整体的形式存在。术语“寡核苷酸”旨在包括所有此类形式。所描绘的结构当然描绘了一种形式。然而，除非另外指出，否则此类图式同样旨在包括对应形式。在本文中，描述化合物的游离酸后接术语“或其盐”的结构明确包括可以完全或部分质子化/脱质子化/与阳离子缔合的所有此类形式。在某些情况下，鉴定出一种或多种特定阳离子。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸或寡聚化合物与钠一起在水溶液中。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸或寡聚化合物与钾一起在水溶液中。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸或寡聚化合物在PBS中。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸或寡聚化合物在水中。在某些此类实施方案中，溶液的pH用NaOH和/或HCl调节以达到所需pH。
在本文中，描述了某些特定剂量。剂量可为剂量单位的形式。为清楚起见，以毫克为单位的修饰的寡核苷酸或寡聚化合物的剂量(或剂量单位)指示修饰的寡核苷酸或寡聚化合物的游离酸形式的质量。如上文所述，在水溶液中，游离酸与阴离子和盐形式处于平衡。然而，出于计算剂量的目的，假定修饰的寡核苷酸或寡聚化合物以无溶剂、无乙酸钠、无水、游离酸的形式存在。例如，当修饰的寡核苷酸或寡聚化合物在包含钠的溶液(例如，盐水)中时，修饰的寡核苷酸或寡聚化合物可以被部分或完全脱质子化并与Na+离子缔合。然而，质子的质量仍然计入剂量的重量，并且Na+离子的质量不计入剂量的重量。因此，例如，100mg化合物编号1263518的剂量或剂量单位等于称重100mg的完全质子化分子的数目。这等同于106mg无溶剂、，无乙酸钠、无水、加钠的化合物编号1263518。当寡聚化合物包含结合基团时，在计算此类寡聚化合物的剂量时包括结合基团的质量。如果结合基团也具有酸，则出于计算剂量的目的，同样认为结合基团是完全质子化的。
VII.某些组合物
1.化合物编号1065645
在某些实施方案中，化合物编号1065645表征为具有序列(从5’到3’)CATCATGATCTTGGTAAGGC(SEQ ID NO:1949)的5-10-5MOE缺口聚物，其中核苷1-5和16-20(从5’到3’)中的每一个为2’-MOE核苷且核苷6-15中的每一个为2’-β-D-脱氧核苷，其中核苷2至3、3至4、4至5、5至6、16至17和17至18之间的核苷间键联为磷酸二酯核苷间键联且核苷1至2、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16、18至19和19至20之间的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联，且其中每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物编号1065645由以下化学符号表示：mCesAeoTeo mCeoAeoTd sGdsAdsTds mCdsTdsTdsGdsGdsTdsAeoAeoGesGes mCe(SEQ ID NO:1949)，其中：
A＝腺嘌呤核碱基，
mC＝5-甲基胞嘧啶核碱基，
G＝鸟嘌呤核碱基，
T＝胸腺嘧啶核碱基，
e＝2’-MOE糖部分，
d＝2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
在某些实施方案中，化合物编号1065645由以下化学结构表示：
(SEQ ID NO:1949)。
结构1.化合物编号1065645
在某些实施方案中，化合物编号1065645的钠盐由以下化学结构表示：
(SEQ ID NO:1949)。
结构2.化合物编号1065645的钠盐
2.化合物编号1263517
在某些实施方案中，化合物编号1263517表征为具有序列(从5’到3’)TCACCATTTTGACCTTCTTA(SEQ ID NO:2751)的6-10-4MOE缺口聚物，其中核苷1-6和17-20(从5’到3’)中的每一个为2’-MOE核苷且核苷7-16中的每一个为2’-β-D-脱氧核苷，其中核苷2至3、3至4、4至5、5至6、6至7和17至18之间的核苷间键联为磷酸二酯核苷间键联且核苷1至2、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16、16至17、18至19和19至20之间的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联，且其中每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物编号1263517由以下化学符号表示：Tes mCeoAeo mCeo mCeoAe oTdsTdsTdsTdsGdsAds mCds mCdsTdsTds mCeoTesTesAe(SEQ ID NO:2751)，其中：
A＝腺嘌呤核碱基，
mC＝5-甲基胞嘧啶核碱基，
G＝鸟嘌呤核碱基，
T＝胸腺嘧啶核碱基，
e＝2’-MOE糖部分，
d＝2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
在某些实施方案中，化合物编号1263517由以下化学结构表示：
(SEQ ID NO:2751)。
结构3.化合物编号1263517
在某些实施方案中，化合物编号1263517的钠盐由以下化学结构表示：
(SEQ ID NO:2751)。
结构4.化合物编号1263517的钠盐
3.化合物编号1263518
在某些实施方案中，化合物编号1263518表征为具有序列(从5’到3’)TTCACCATTTTGACCTTCTT(SEQ ID NO:2752)的6-10-4MOE缺口聚物，其中核苷1-6和17-20(从5’到3’)中的每一个为2’-MOE核苷且核苷7-16中的每一个为2’-β-D-脱氧核苷，其中核苷2至3、3至4、4至5、5至6、6至7和17至18之间的核苷间键联为磷酸二酯核苷间键联且核苷1至2、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16、16至17、18至19和19至20之间的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联，且其中每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。
/>
(SEQ ID NO:2752)。
结构5.化合物编号1263518
在某些实施方案中，化合物编号1263518的钠盐由以下化学结构表示：
(SEQ ID NO:2752)。
结构6.化合物编号1263518的钠盐
4.化合物编号1263533
在某些实施方案中，化合物编号1263533表征为具有序列(从5’到3’)GCATACCCAGGGTAGGATTC(SEQ ID NO:765)的6-10-4MOE缺口聚物，其中核苷1-6和17-20(从5’到3’)中的每一个为2’-MOE核苷且核苷7-16中的每一个为2’-β-D-脱氧核苷，其中核苷2至3、3至4、4至5、5至6、6至7和17至18之间的核苷间键联为磷酸二酯核苷间键联且核苷1至2、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16、16至17、18至19和19至20之间的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联，且其中每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物编号1263533由以下化学符号表示：Ges mCeoAeoTeoAeo mCeo mCds mCdsAdsGdsGdsGdsTdsAdsGdsGdsAeoTesTes mCe(SEQ ID NO:765)，其中：
A＝腺嘌呤核碱基，
mC＝5-甲基胞嘧啶核碱基，
G＝鸟嘌呤核碱基，
T＝胸腺嘧啶核碱基，
e＝2’-MOE糖部分，
d＝2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
在某些实施方案中，化合物编号1263533由以下化学结构表示：
(SEQ ID NO:765)。
结构7.化合物编号1263533
在某些实施方案中，化合物编号1263533的钠盐由以下化学结构表示：
(SEQ ID NO:765)。
结构8.化合物编号1263533的钠盐
5.化合物编号1273039
在某些实施方案中，化合物编号1273039表征为具有序列(从5’到3’)ACGCAATGTATCAGGCAA(SEQ ID NO:2866)的4-8-6MOE缺口聚物，其中核苷1-4和13-18(从5’到3’)中的每一个为2’-MOE核苷且核苷5-12中的每一个为2’-β-D-脱氧核苷，其中核苷2至3、3至4、13至14、14至15和15至16之间的核苷间键联为磷酸二酯核苷间键联且核苷1至2、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、16至17和17至18之间的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联，且其中每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物编号1273039由以下化学符号表示：Aes mCeoGeo mCesAdsAd sTdsGdsTdsAdsTds mCdsAeoGeoGeo mCesAesAe(SEQ ID NO:2866)，其中：
A＝腺嘌呤核碱基，
mC＝5-甲基胞嘧啶核碱基，
G＝鸟嘌呤核碱基，
T＝胸腺嘧啶核碱基，
e＝2’-MOE糖部分，
d＝2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
在某些实施方案中，化合物编号1273039由以下化学结构表示：
(SEQ ID NO:2866)。
结构9.化合物编号1273039
在某些实施方案中，化合物编号1273039的钠盐由以下化学结构表示：
(SEQ ID NO:2866)。
结构10.化合物编号1273039的钠盐
6.化合物编号1273062
在某些实施方案中，化合物编号1273062表征为具有序列(从5’到3’)ACCATTTTGACCTTCTTAGC(SEQ ID NO:2873)的5-10-5MOE缺口聚物，其中核苷1-5和16-20(从5’到3’)中的每一个为2’-MOE核苷且核苷6-15中的每一个为2’-β-D-脱氧核苷，其中核苷2至3、3至4、4至5、5至6、16至17和17至18之间的核苷间键联为磷酸二酯核苷间键联且核苷1至2、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16、18至19和19至20之间的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联，且其中每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物编号1273062由以下化学符号表示：Aes mCeo mCeoAeoTeoTd sTdsTdsGdsAds mCds mCdsTdsTds mCdsTeoTeoAesGes mCe(SEQ ID NO:2873)，其中：
A＝腺嘌呤核碱基，
mC＝5-甲基胞嘧啶核碱基，
G＝鸟嘌呤核碱基，
T＝胸腺嘧啶核碱基，
e＝2’-MOE糖部分，
d＝2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
在某些实施方案中，化合物编号1273062由以下化学结构表示：
(SEQ ID NO:2873)。
结构11.化合物编号1273062
在某些实施方案中，化合物编号1273062的钠盐由以下化学结构表示：
(SEQ ID NO:2873)。
结构12.化合物编号1273062的钠盐
VIII.某些比较化合物
在某些实施方案中，化合物编号1219022用作比较化合物，其替代物(化合物#586_9)提供于WO2017/081223(以引用的方式并入本文)中。化合物编号1219022为混合LNA/DNA寡核苷酸，具有糖基序(从5’到3’)llddldldddddddddllll，其中每个“l”表示LNA糖部分且每个“d”表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分；具有序列(从5’到3’)AAATTATTTATACACCATCA(SEQID NO:2905)，其中每个“C”为5-甲基胞嘧啶；且其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。化合物#586_9在位置13、15和16处具有胞嘧啶，而化合物编号1219022在那些位置处具有5-甲基胞嘧啶。根据Wan和Seth,“[i]ntroduction of the 5-methyl group oncytosine reduces the immunostimulatory profile of certain DNAoligonucleotides and also enhances nuclease stability”(J.Med.Chem.2016,59,9645-9667)。
在某些实施方案中，化合物编号1219023用作比较化合物，其替代物(化合物#572_7)提供于WO2017/081223(以引用的方式并入本文)中。化合物编号1219023为混合LNA/DNA寡核苷酸，其具有糖基序(从5’到3’)lllddldddddddddlll，其中每个“l”表示LNA糖部分且每个“d”表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分；序列(从5’到3’)TTTATCAATATCTTCTCA(SEQ IDNO:2906)，其中每个“C”为5-甲基胞嘧啶；且其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。化合物#572_7在位置12和15处具有胞嘧啶，而化合物编号1219023在那些位置处具有5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物编号1219024用作比较化合物，其替代物(化合物#591_1)提供于WO2017/081223(以引用的方式并入本文)中。化合物编号1219024为混合LNA/DNA寡核苷酸，具有糖基序(从5’到3’)ldldlddddddddddddll，其中每个“l”表示LNA糖部分且每个“d”表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分；具有序列(从5’到3’)GCACATTCTTTCTATACCT(SEQ IDNO:2907)，其中每个“C”为5-甲基胞嘧啶；且其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。化合物#591_1在位置2、4、8、12和17处具有胞嘧啶，而化合物编号1219024在那些位置处具有5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物编号1219025用作比较化合物，其替代物(化合物#169_52)提供于WO2017/081223(以引用的方式并入本文)中。化合物编号1219025为混合LNA/DNA寡核苷酸，具有糖基序(从5’到3’)lldllddddddddddll，其中每个“l”表示LNA糖部分且每个“d”表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分；具有序列(从5’到3’)TTATAGCCATTCTATCT(SEQ ID NO:2908)，其中每个“C”为5-甲基胞嘧啶；且其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。化合物#169_52在7、8和12位置处具有胞嘧啶，而化合物编号1219025在那些位置处具有5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物编号1219026用作比较化合物，其替代物(化合物#624_5)提供于WO2017/081223(以引用的方式并入本文)中。化合物编号1219026为混合LNA/DNA寡核苷酸，具有糖基序(从5’到3’)ldlllddddddddllll，其中每个“l”表示LNA糖部分且每个“d”表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分；具有序列(从5’到3’)CTCAAAGATCATTCTCA(SEQ ID NO:2909)，其中每个“C”为5-甲基胞嘧啶；且其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。化合物#624_5在位置10处具有胞嘧啶，而化合物编号1219026在所述位置处具有5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物编号1219027用作比较化合物，其替代物(化合物#626_8)提供于WO2017/081223(以引用的方式并入本文)中。化合物编号1219027为混合LNA/DNA寡核苷酸，具有糖基序(从5’到3’)ldldldldddddddddldll，其中每个“l”表示LNA糖部分且每“d”表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分；具有序列(从5’到3’)TTACACTTAATTATACTTCC(SEQID NO:2910)，其中每个“C”为5-甲基胞嘧啶；且其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。化合物#626_8在位置4、6和16处具有胞嘧啶，而化合物编号1219027在那些位置处具有5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物编号1219028用作比较化合物，其替代物(化合物#639_5)提供于WO2017/081223(以引用的方式并入本文)中。化合物#1219028为混合LNA/DNA寡核苷酸，具有糖基序(从5’到3’)ldddddddddddlldlll，其中每个“l”表示LNA糖部分且每个“d”表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分；具有序列(从5’到3’)GTTTCCATCTACTATTAA(SEQ ID NO:2911)，其中每个“C”为5-甲基胞嘧啶；且其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。化合物#639_5在位置5、6、9和12处具有胞嘧啶，而化合物编号1219028在那些位置处具有5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物编号1219029用作比较化合物，其替代物(化合物#642_12)提供于WO2017/081223(以引用的方式并入本文)中。化合物编号1219029为混合LNA/DNA寡核苷酸，具有糖基序(从5’到3’)llddlddddddddddll，其中每个“l”表示LNA糖部分且每个“d”表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分；具有序列(从5’到3’)CTGTATACACCATCCCA(SEQ ID NO:2912)，其中每个“C”为5-甲基胞嘧啶；且其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。化合物#642_12在位置8、10、11、14和15处具有胞嘧啶，而化合物编号1219029在那些位置处具有5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物编号1219030用作比较化合物，其替代物(化合物#304_6)提供于WO2017/081223(以引用的方式并入本文)中。化合物编号1219030为混合LNA/DNA寡核苷酸，具有糖基序(从5’到3’)lddllddddddddllll，其中每个“l”表示LNA糖部分且每个“d”表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分；具有序列(从5’到3’)AGTTCTACTATACTTTC(SEQ ID NO:2913)，其中每个“C”为5-甲基胞嘧啶；且其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。化合物#304_6在位置8和13处具有胞嘧啶，而化合物编号1219030在那些位置处具有5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物编号1219031用作比较化合物，其替代物(化合物#573_8)提供于WO2017/081223(以引用的方式并入本文中)中。化合物编号1219031为混合LNA/DNA寡核苷酸，具有糖基序(从5’到3’)llddldldddddddddddll，其中每个“l”表示LNA糖部分且每个“d”表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分；具有序列(从5’到3’)TATACCTTTCTTTAACCCTT(SEQ ID NO:2914)，其中每个“C”为5-甲基胞嘧啶；且其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。化合物#573_8在位置6、10、16、17和18处具有胞嘧啶，而化合物编号1219031在那些位置处具有胞嘧啶。
选择来自WO2017/081223的实施例7的化合物编号1219022-1219031(分别涉及化合物编号#586_9、#572_7、#591_1、#169_52、#624_5、#626_8、#639_5#642_12、#304_6、#573_8)作为比较化合物，所述实施例提供“选用于效力和功效测试”的活性化合物子集。
在某些实施方案中，本文所述的化合物优于WO2017/081223中所述的化合物，因为其显示一种或多种改善的特性，诸如活体内耐受性。
例如，如本文所述，某些化合物化合物编号1263517、化合物编号1263518、化合物编号1263533、化合物编号1273039和化合物编号1273062在小鼠中分别实现1.0(表88)、0.0(表88)、1.0(表88)、1.0(表96)和0.0(表96)的3小时FOB分数，而比较化合物化合物编号1219022、化合物编号1219024、化合物编号1219025、化合物编号1219028、化合物编号1219029、化合物编号1219030和化合物编号1219031中的每一个分别在小鼠中实现7.0、5.3、4.0、6.0、6.3、5.0和5.3(表119)的3小时FOB分数。因此，在此分析中本文所述的某些化合物比比较化合物化合物编号1219022、化合物编号1219024、化合物编号1219025、化合物编号1219028、化合物编号1219029、化合物编号1219030和化合物编号1219031更可耐受。
例如，如本文所述，某些化合物化合物编号1065645、化合物编号1263517、化合物编号1263518、化合物编号1263533、化合物编号1273039和化合物编号1273062各自在小鼠中实现0.0(实施例12，表112)的2周FOB分数，而化合物编号1219023、化合物编号1219024、化合物编号1219025、化合物编号1219026、化合物编号1219028、化合物编号1219029、化合物编号1219030和化合物编号1219031分别在小鼠中实现3.5、6.5、6.0、6.0、6.0、6.0、6.0、5.0和6.0的2周FOB分数(表119)。因此，在此分析中本文所述的某些化合物比比较化合物化合物编号1219023和化合物编号1219026更可耐受。
例如，如本文所述，某些化合物化合物编号1065645、化合物编号1263517、化合物编号1263518、化合物编号1263533、化合物编号1273039和化合物编号1273062在8周研究中未引起与PBS处理的大鼠相比体重的显著差异，而与PBS处理的大鼠相比，用化合物编号1219027处理引起大于10％的体重减轻(p值<0.05，表120)。因此，在此分析中本文所述的某些化合物比比较化合物化合物编号1219027更可耐受。
IX.某些热点区域
在某些实施方案中，以下指定范围内的核碱基包含热点区域UBE3A-ATS。在某些实施方案中，与热点区域UBE3A-ATS互补的修饰的寡核苷酸在标准细胞分析中实现活体外平均多于50％的UBE3A-ATS RNA减少。
1.SEQ ID NO:1的核碱基461,413-461,487
在某些实施方案中，SEQ ID NO:1的核碱基461,413-461,487包含热点区域。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO:1的核碱基461,413-461,487的一部分互补。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸长度为20个核碱基。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸长度为18个核碱基。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸为缺口聚物。在某些实施方案中，所述缺口聚物为MOE缺口聚物。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联和磷酸二酯核苷间键联。在某些实施方案中，磷酸二酯(“o”)和硫代磷酸酯(“s”)核苷间键联从5’到3’以如下次序排列：soooossssssssssooss、sooooossssssssssoss、soooosssssssssoss、sooosssssssssooss、sooossssssssssoooss或soosssssssssoooss。
SEQ ID No:1053、1329、1501、1576、1873、1949、2025、2096、2245、2512,2591,2680-2682和2844的核碱基序列与SEQ ID NO:1的核碱基461,413-461,487的一部分互补。
化合物编号749901-749904、1065641-1065646、1165562-1165563、1165857-1165858和1273001的核碱基序列与SEQ ID NO:1的核碱基461,413-461,487的一部分互补。
在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1的核碱基461,413-461,487的一部分互补的修饰的寡核苷酸在标准细胞分析中实现活体外至少36％的UBE3A-ATS RNA减少。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1的核碱基461,413-461,487的一部分互补的修饰的寡核苷酸在标准细胞分析中实现活体外平均60％的UBE3A-ATS RNA减少。
2.SEQ ID NO:1的核碱基468,968-469,013
在某些实施方案中，SEQ ID NO:1的核碱基468,968-469,013包含热点区域。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO:1的核碱基468,968-469,013的一部分互补。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸长度为20个核碱基。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸长度为18个核碱基。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸为缺口聚物。在某些实施方案中，所述缺口聚物为MOE缺口聚物。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联和磷酸二酯核苷间键联。在某些实施方案中，磷酸二酯(“o”)和硫代磷酸酯(“s”)核苷间键联从5’到3’以如下次序排列：soooossssssssssooss、sooooossssssssssoss、soooosssssssssoss、sooosssssssssooss、sooossssssssssoooss或soosssssssssoooss。
SEQ ID No:376、377、2751-2756、2773-2776、2872、2873、2876-2878的核碱基序列与SEQ ID NO:1的核碱基468,968-469,013的一部分互补。
化合物编号750031-750032、1263408-1263411、1263426、1263441、1263460-1263465、1263486-1263492、1263517-1263523、1273061、1273062和1273065-1273067的核碱基序列与SEQ ID NO:1的核碱基468,968-469,013的一部分互补。
在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1的核碱基468,968-469,013的一部分互补的修饰的寡核苷酸在标准细胞分析中实现活体外至少75％的UBE3A-ATS RNA减少。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1的核碱基468,968-469,013的一部分互补的修饰的寡核苷酸在标准细胞分析中实现活体外平均78％的UBE3A-ATS RNA减少。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1的核碱基468,968-469,013的一部分互补的修饰的寡核苷酸在细胞培养物中6.7μM下实现活体外平均410％的UBE3A-ATS RNA上调。
3.SEQ ID NO:1的核碱基483,965-484,003
在某些实施方案中，SEQ ID NO:1的核碱基483,965-484,003包含热点区域。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO:1的483,965-484,003的一部分互补。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸长度为20个核碱基。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸长度为18个核碱基。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸为缺口聚物。在某些实施方案中，所述缺口聚物为MOE缺口聚物。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联和磷酸二酯核苷间键联。在某些实施方案中，磷酸二酯(“o”)和硫代磷酸酯(“s”)核苷间键联从5’到3’以如下次序排列：soooossssssssssooss、sooooossssssssssoss、soooosssssssssoss、sooosssssssssooss、sooossssssssssoooss或soosssssssssoooss。
SEQ ID No:172、764-770、995、1445、1668、1743、2255、2595、2762-2767的核碱基序列与SEQ ID NO:1的核碱基483,965-484,003的一部分互补。
化合物编号617557、699781、750138-750144、1065918-1065921、1165621、1165878和1263532-1263557的核碱基序列与SEQ ID NO:1的核碱基483,965-484,003的一部分互补。
在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1的核碱基483,965-484,003的一部分互补的修饰的寡核苷酸在标准细胞分析中实现活体外至少24％的UBE3A-ATS RNA减少。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1的核碱基483,965-484,003互补的修饰的寡核苷酸在标准细胞分析中实现活体外平均65％的UBE3A-ATS RNA减少。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1的核碱基468,968-469,013的一部分互补的修饰的寡核苷酸在细胞培养物中6.7μM下实现活体外平均330％的UBE3A-ATS RNA上调。
4.额外热点区域
在某些实施方案中，下表中所述的范围包含热点区域。每个热点区域以“起始位点SEQ ID NO:1”栏中确定的SEQ ID NO:1的核碱基开始，且以“终止位点SEQ ID NO:1”栏中确定的SEQ ID NO:1的核碱基结束。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸在如下表中限定的热点区域1-61中任一个内互补。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸长度为18个核碱基。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸长度为20个核碱基。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸为缺口聚物。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸为4-8-6、6-8-4、5-8-5、4-10-6、6-10-4或5-10-5MOE缺口聚物。
在下表中“以下范围内的化合物ID”栏下所列出的化合物的核碱基序列在指定热点区域内与SEQ ID NO:1互补。在下表中“以下范围内的SEQ ID NO:”栏下所列出的寡核苷酸的核碱基序列在指定热点区域内与靶序列SEQ ID NO:1互补。
在某些实施方案中，在标准细胞分析中与热点区域内的核碱基互补的修饰的寡核苷酸在活体外实现UBE3A-ATS RNA至少“Min.％Red.”(相对于未处理的对照细胞，最小减少％)，如下表中所指示。在某些实施方案中，在标准细胞分析中与热点区域内的核碱基互补的修饰的寡核苷酸在活体外实现UBE3A-ATS RNA平均“Avg.％Red.”(相对于未处理的对照细胞，平均减少％)，如下表中所指示。在某些实施方案中，在标准细胞分析中与热点区域内的核碱基互补的修饰的寡核苷酸在活体外实现UBE3A-ATS RNA最大“Max.％Red.”(相对于未处理的对照细胞，最大减少％)，如下表中所指示。
表1
UBE3A-ATS热点
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#在此部分所述的寡核苷酸与此热点区域在多个位点处互补。这些位点详细描述于下文表4b(实施例1)中。
非限制性公开和以引用的方式并入
本文中列出的每个文献和专利公开以引用的方式整体并入。
虽然本文所述的某些化合物、组合物和方法已根据某些实施方案特定描述，但以下实施例仅仅用于说明本文所述的化合物且不旨在对其进行，本申请中叙述的每个参考文献、GenBank保藏号等以引用的方式整体并入本文。
虽然伴随本申请的序列表根据需要将每个序列确定为“RNA”或“DNA”，但实际上，那些序列可通过化学修饰的任何组合来修饰。本领域的技术人员容易了解诸如“RNA”或“DNA”的描述修饰的寡核苷酸的名称在某些情况下为任意的。例如，包含有包含2’-OH糖部分和胸腺嘧啶碱基的核苷的寡核苷酸可称作具有修饰的糖(2’-OH代替DNA的2’-H)的DNA或称作具有修饰的碱基(胸腺嘧啶(甲基化尿嘧啶)代替RNA的尿嘧啶)的RNA。因此，本文提供的核酸序列，包括(但不限于)序列表中的序列，旨在涵盖含有天然或修饰的RNA和/或DNA的任何组合的核酸，包括(但不限于)具有修饰的核碱基的此类核酸。借助于其他实施例且不受限制，具有核碱基序列“ATCGATCG”的寡聚化合物涵盖具有无论是修饰还是未修饰的此类核碱基序列的任何寡聚化合物，包括(但不限于)包含RNA碱基的此类化合物，诸如具有序列“AUCGAUCG”的化合物，和具有一些DNA碱基和一些RNA碱基诸如“AUCGATCG”的化合物，和具有其他修饰的核碱基，诸如“ATmCGAUCG”的寡聚化合物，其中mC指示在5位包含甲基的胞嘧啶碱基。
本文所述的某些化合物(例如修饰的寡核苷酸)具有一个或多个不对称中心，因此产生对映异构体、非对映异构体和可根据绝对立体化学定义的其他立体异构构型，如(R)或(S)，如诸如糖端基异构体的α或β，或如诸如氨基酸的(D)或(L)等等。描绘或描述为具有某些立体异构构型的本文提供的化合物仅包括所指示的化合物。除非另外指定，否则在立体化学未定义下描绘或描述的本文提供的化合物包括所有此类可能异构体，包括其立体结构无规的和光学纯形式。同样，除非另外指示，否则还包括本文中化合物的互变异构形式。除非另外指示，否则本文所述的化合物旨在包括对应盐形式。
本文所述的化合物包括其中一个或多个原子被非放射性同位素或所指示元素的放射性同位素置换的变化。例如，本文中包含氢原子的化合物涵盖每个1H氢原子的所有可能氘取代。本文中化合物涵盖的同位素取代包括但不限于：2H或3H代替1H，13C或14C代替12C，15N代替14N，17O或18O代替16O，以及33S、34S、35S或36S代替32S。在某些实施方案中，非放射性同位素取代可赋予寡聚化合物有益于用作治疗或研究工具的新特性。在某些实施方案中，放射性同位素取代可使化合物适合于达成研究或诊断目的，诸如成像。
实施例
以下实施例说明本发明的某些实施方案且不具有限制性。此外，在提供特定实施方案的情况下，本发明人已预期那些特定实施方案的一般应用。例如，具有特定基序的寡核苷酸的公开为具有相同或类似基序的其他寡核苷酸提供合理支持。且例如，除非另外指示，否则在特定位置出现特定高亲和力修饰的情况下，相同位置的其他高亲和力修饰视为合适的。
实施例1：在活体外5-10-5MOE缺口聚物修饰的寡核苷酸对人UBE3A-ATS RNA的作用，单剂量
测试与人UBE3A-ATS核酸互补的修饰的寡核苷酸在活体外对UBE3A-ATS RNA水平的作用。
下表中的修饰的寡核苷酸为5-10-5MOE缺口聚物。所述缺口聚物为20个核苷长，其中中央缺口区段由10个2’-β-D-脱氧核苷组成且5’和3’侧翼区段由5个2’-MOE核苷组成。缺口聚物的糖基序为(从5’到3’)：eeeeeddddddddddeeeee；其中‘d’表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，且‘e’表示2’-MOE糖部分。
化合物ID 617441-617596(表2和3中)的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。所有其他化合物(表4-33)的核苷间键联基序为(从5’到3’)：soooossssssssssooss，其中每个“s”表示硫代磷酸酯核苷间键联且每个“o”表示磷酸二酯核苷间键联。
所有胞嘧啶残基均为5-甲基胞嘧啶。
“起始位点”指示人基因序列中修饰的寡核苷酸互补的最5’-核苷。”终止位点”指示靶核酸序列中修饰的寡核苷酸互补的最3’-核苷。下表中列出的每个修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO:1(从核苷酸24821647到25441028截短的GENBANK保藏号NC_000015.10)100％互补。下表中所选的化合物在多于三个特定位点处与靶核酸互补。对于这些化合物，下表中的“起始位点”和“终止位点”值用井号(#)指示，且仅指示化合物互补的第一个位点。以下表4b中指示这些化合物互补的其他位点。
根据制造商说明书，将人IPSC细胞来源的iCell GABANeurons(CellularDynamics)以每孔20,000-60,000个细胞(如表格标题中所示)培养且通过自由吸收，用5,000-10,000nM修饰的寡核苷酸(如表格标题中所示)处理。在大约6天的处理期之后，从细胞分离总RNA且通过定量实时RTPCR测量UBE3A-ATS RNA水平。使用人UBE3A-ATS引物探针集RTS4796(正向序列CTCCCCCAGTTCTGGAATGA，本文中称为SEQ ID NO:2；反向序列TACACAGGGATTTGAGCCTGCTA，本文中称为SEQ ID NO:3；探针序列CCCACAGATCAAGCATTCCCCAAAGA，本文中称为SEQ ID NO:4)测量RNA水平。如通过所测量，根据总RNA含量归一化UBE3A-ATS RNA水平。UBE3A-ATS RNA的减少呈相对于未处理的对照(UTC)细胞的UBE3A-ATS RNA量百分比呈现于下表。每个表表示来自个别分析板的结果。用星号(*)标记的值指示修饰的寡核苷酸与引物探针集的扩增子区域互补。其他分析可用于测量与扩增子区域互补的修饰的寡核苷酸的效力和功效。“N.D.”指示在此实验中由于实验误差而未确定值。然而，在下文的剂量-应答研究中成功地证实包括实施例1中未限定的修饰的寡核苷酸的所选修饰的寡核苷酸的活性。
表2
在活体外由7,000nM具有PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(60,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
表3
在活体外由7,000nM具有PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(60,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表4
在活体外由5,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(35,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表4b
与重复区域互补的修饰的寡核苷酸的SEQ ID NO:1起始位点
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表5
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(35,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表6
在活体外由8,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(40,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表7
在活体外由8,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(40,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
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表8
在活体外由8,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(35,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表9
在活体外由8,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(35,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
/>
表10
在活体外由10,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(40,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
/>
表11
在活体外由8,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(40,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
/>
表12
在活体外由8,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(40,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
表13
在活体外由8,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(40,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
表14
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(37,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表15
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(37,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表16
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(37,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
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表17
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(37,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表18
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(37,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
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/>
表19
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(37,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
表20
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(37,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
表21
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(37,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表22
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(37,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表23
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(37,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表24
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(37,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表25
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(37,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
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表26
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(37,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表27
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(37,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表28
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(37,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表29
在活体外由7,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(37,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
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表30
8,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物在活体外(20,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
表31
在活体外由8,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(20,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
/>
表32
在活体外由8,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(20,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
/>
表33
在活体外由8,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(20,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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实施例2：在活体外5-10-5MOE缺口聚物修饰的寡核苷酸对人UBE3A-ATS RNA的作用，单剂量
测试与人UBE3A-ATS核酸互补的修饰的寡核苷酸在活体外对UBE3A-ATS RNA水平的作用。
下表中的修饰的寡核苷酸为5-10-5缺口聚物。所述缺口聚物为20个核苷长，其中中央缺口区段由10个2’-β-D-脱氧核苷组成且5’和3’侧翼区段各由5个2’-MOE核苷组成。缺口聚物的糖基序为(从5’到3’)：eeeeeddddddddddeeeee；其中‘d’表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，且‘e’表示2’-MOE糖部分。
化合物ID 617456、617457、617460、617461和617557的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。所有其他化合物的核苷间键联基序为：soooossssssssssooss，其中每个“s”表示硫代磷酸酯核苷间键联且每个“o”表示磷酸二酯核苷间键联。
所有胞嘧啶残基均为5-甲基胞嘧啶。
“起始位点”指示靶核酸序列中修饰的寡核苷酸互补的最5’-核苷。“终止位点”指示靶核酸序列中修饰的寡核苷酸互补的最3’-核苷。下表中列出的每个修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO:1 100％互补。以下若干个表中化合物750519的起始位点和终止位点用井号(#)指示。化合物750519的起始位点的完整列表列于表4b中。
根据制造商说明书，将人IPS细胞来源的ReproNeuroTMNeurons(ReproCELL)以每孔40,000个细胞培养且通过自由吸收，用8,000nM修饰的寡核苷酸处理。在大约5天的处理期之后，从细胞分离总RNA且通过定量实时RTPCR测量UBE3A-ATS RNA水平。使用人UBE3A-ATS引物探针集RTS4796(本文在实施例1中描述)测量RNA水平。如通过所测量，根据总RNA含量归一化UBE3A-ATS RNA水平。UBE3A-ATS的减少呈相对于未处理的对照(UTC)细胞的UBE3A-ATS RNA量百分比呈现于下表。每个表表示来自个别分析板的结果。用星号(*)标记的值指示修饰的寡核苷酸与引物探针集的扩增子区域互补。其他分析可用于测量与扩增子区域互补的修饰的寡核苷酸的效力和功效。
表34
在活体外由8,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表35
在活体外由8,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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表36
在活体外由8,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物引起的UBE3A-ATS RNA减少
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表37
在活体外由8,000nM具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
/>
实施例3：在活体外5-10-5MOE缺口聚物修饰的寡核苷酸对人UBE3A-ATS RNA的作用，单剂量
除了使用人UBE3A-ATS引物探针集LTS01075(正向序列GCCCGAAGTGCCTATTCCTT，本文中称为SEQ ID NO:5；反向序列TGGTCAGGAGAACATAGGCATAAA，本文中称为SEQ ID NO:6；探针序列ACTCCCAGGGTTGATGGGCTACATCC，本文中称为SEQ ID NO:7)测量RNA水平以外，基本上如实施例1中所述，测试与人UBE3A-ATS核酸互补的修饰的寡核苷酸在活体外对UBE3A-ATSRNA水平的作用。
下表中的修饰的寡核苷酸为5-10-5缺口聚物。所述缺口聚物为20个核苷长，其中中央缺口区段由10个2’-β-D-脱氧核苷组成且3’和5’侧翼区段各由5个2’-MOE核苷组成。缺口聚物的糖基序为(从5’到3’)：eeeeeddddddddddeeeee；其中‘d’表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，且‘e’表示2’-MOE糖部分。化合物ID 617456、617457、617460、617461和617557的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。所有其他化合物的核苷间键联基序为：soooossssssssssooss，其中每个“s”表示硫代磷酸酯核苷间键联且每个“o”表示磷酸二酯核苷间键联。
所有胞嘧啶残基均为5-甲基胞嘧啶。
“起始位点”指示靶核酸中修饰的寡核苷酸互补的最5’-核苷。“终止位点”指示靶核酸中修饰的寡核苷酸互补的最3’-核苷。下表中列出的每个修饰的寡核苷酸与SEQ IDNO:1 100％互补。
UBE3A-ATS RNA的减少呈相对于未处理的对照(UTC)细胞的UBE3A-ATS RNA量百分比呈现于下表。用星号(*)标记的值指示修饰的寡核苷酸与引物探针集的扩增子区域互补。其他分析可用于测量与扩增子区域互补的修饰的寡核苷酸的效力和功效。
表38
在活体外由7,000nM具有PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物(35,000个细胞/孔)引起的UBE3A-ATS RNA减少
/>
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实施例4：在活体外修饰的寡核苷酸对人UBE3A-ATS RNA的作用，多剂量
在人IPS来源的iCell GABANeurons(Cellular Dynamics)中测试多种剂量的选自以上实施例的修饰的寡核苷酸。将细胞以每孔35,000-60,000个细胞的密度铺板，根据制造商的说明书供养，且通过自由吸收，用如下表中所说明的各种浓度的修饰的寡核苷酸处理。在大约6天的处理期之后，从细胞分离总RNA且通过定量实时PCR测量UBE3A-ATS RNA水平。使用如上所述的人UBE3A-ATS引物探针集RTS4796测量RNA水平。如通过所测量，根据总RNA含量归一化UBE3A-ATS RNA水平。UBE3A-ATS RNA的减少呈相对于未处理的对照(UTC)细胞的UBE3A-ATS RNA量百分比呈现于下表。
可能情况下，对excel中的数据的对数/线性曲线使用线性回归，计算每个修饰的寡核苷酸的半最大抑制浓度(IC50)。在一些情况下，无法可靠地计算IC50，且所述数据点标记为“N.C.”。用“N.D.”标记的值指示在此实验中值未测定。
表39
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(60,000个细胞/孔)
表40
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(60,000个细胞/孔)
表41
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(60,000个细胞/孔)
表42
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(60,000个细胞/孔)
表43
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(35,000个细胞/孔)
表44
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(35,000个细胞/孔)
表45
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(35,000个细胞/孔)
/>
表46
在活体外修饰的寡核苷酸引起的人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(42,000个细胞/孔)
表47
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(42,000个细胞/孔)
表48
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(42,000个细胞/孔)
表49
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(42,000个细胞/孔)
表50
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(42,000个细胞/孔)
/>
表51
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(42,000个细胞/孔)
表52
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(42,000个细胞/孔)
/>
表53
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(40,000个细胞/孔)
实施例5：在活体外修饰的寡核苷酸对人UBE3A-ATS RNA的作用，多剂量
在人IPS来源的ReproNeuroTMNeurons(ReproCELL)中测试多种剂量的选自以上实施例的修饰的寡核苷酸。将细胞以每孔20,000个细胞的密度铺板，根据制造商的说明书供养，且通过自由吸收，用如下表中所说明的各种浓度的修饰的寡核苷酸处理。在大约5天的处理期之后，从细胞分离总RNA且通过定量实时PCR测量UBE3A-ATS RNA水平。使用如上所述的人UBE3A-ATS引物探针集RTS4796测量RNA水平。如通过所测量，根据总RNA含量归一化UBE3A-ATS RNA水平。UBE3A-ATS RNA的减少呈相对于未处理的对照(UTC)细胞的UBE3A-ATS RNA量百分比呈现于下表。
对excel中的数据的对数/线性曲线使用线性回归，计算每个修饰的寡核苷酸的半最大抑制浓度(IC50)。在无法计算IC50的情况下，IC50标记为N.C.(未计算)。
表54
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比
实施例6：在活体外修饰的寡核苷酸对人UBE3A-ATS RNA和UBE3A RNA的作用，多剂量
在来源于安格尔曼氏综合征患者来源的IPS细胞的10周分化人神经元细胞中测试多种剂量的选自以上实施例的修饰的寡核苷酸(Chamberlain SJ.等人,Inducedpluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman andPrader–Willi syndromes.PNAS,2010.41:17668-17673中所述的方案和细胞)。在10周分化期结束时，通过自由吸收，将细胞用如下表中所说明的各种浓度的修饰的寡核苷酸处理。在大约6天的处理期之后，从细胞分离总RNA。通过定量实时PCR测量UBE3A-ATS RNA和UBE3ARNA水平。如上所述，使用人UBE3A-ATS引物探针集RTS4796测量UBE3A-ATS RNA水平。使用人UBE3A引物探针集RTS35984(正向序列CACCCTGATGTCACCGAATG，本文中称为SEQ ID NO:8；反向序列GCGTTCTATTAGATGCTTTGCAG，本文中称为SEQ ID NO:9；探针序列ACTGAGGTTCTCCTGATCTTTTACAAGCTG，本文中称为SEQ ID NO:10)测量UBE3A RNA水平。如通过所测量，根据总RNA含量调整RNA水平。UBE3A-ATS RNA的减少或UBE3ARNA的诱导呈相对于未处理的对照(UTC)细胞的UBE3A-ATS RNA量百分比或UBE3A RNA百分比呈现于下表。用“N.D.”标记的值指示在此实验中值未测定。
发现在安格尔曼氏患者IPS细胞来源的神经元中若干修饰的寡核苷酸减少UBE3A-ATS RNA，同时伴有UBE3A RNA增加。
表55
安格尔曼氏综合征IPS细胞来源的神经元中UBE3A-ATS RNA的减少和UBE3A RNA的增加
表56
安格尔曼氏综合征IPS细胞来源的神经元中UBE3A-ATS RNA的减少和UBE3A RNA的增加
/>
表57
安格尔曼氏综合征IPS细胞来源的神经元中UBE3A-ATS RNA的减少和UBE3A RNA的增加
表58
安格尔曼氏综合征IPS细胞来源的神经元中UBE3A-ATS RNA的减少和UBE3A RNA的增加
/>
表59
安格尔曼氏综合征IPS细胞来源的神经元中UBE3A-ATS RNA的减少和UBE3A RNA的增加
/>
表60
安格尔曼氏综合征IPS细胞来源的神经元中UBE3A-ATS RNA的减少和UBE3A RNA的增加
表61
安格尔曼氏综合征IPS细胞来源的神经元中UBE3A-ATS RNA的减少和UBE3A RNA的增加
实施例7：与人UBE3A-ATS核酸互补的修饰的寡核苷酸的设计和合成
如下表中所示合成修饰的寡核苷酸。
表62中的化合物为4-10-6MOE缺口聚物。所述缺口聚物为20个核苷长，其中中央缺口区段由10个2’-β-D-脱氧核苷组成，5’侧翼区段由四个2’-MOE核苷组成，且3’侧翼区段由六个2’-MOE核苷组成。缺口聚物的糖基序(从5’到3’)：eeeeddddddddddeeeeee；其中‘d’表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，且‘e’表示2’-MOE糖部分。缺口聚物的核苷间键联基序为(从5’到3’)：sooossssssssssoooss；其中“s”表示硫代磷酸酯核苷间键联且“o”表示磷酸二酯核苷间键联。所有胞嘧啶残基均为5-甲基胞嘧啶。
表62
与人UBE3A-ATS互补的具有混合PO/PS核苷间键联的4-10-6MOE缺口聚物
/>
表63中的化合物为5-10-5MOE缺口聚物。所述缺口聚物为20个核苷长，其中中央缺口区段由十个2’-β-D-脱氧核糖核苷组成且5’和3’侧翼区段各由五个2’-MOE核苷组成。缺口聚物的糖基序为(从5’到3’)：eeeeeddddddddddeeeee；其中‘d’表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，且‘e’表示2’-MOE糖部分。缺口聚物的核苷间键联基序为(从5’到3’)：soooossssssssssooss，其中“s”表示硫代磷酸酯核苷间键联且“o”表示磷酸二酯核苷间键联。所有胞嘧啶残基均为5-甲基胞嘧啶。
表63
与人UBE3A-ATS互补的具有混合PO/PS核苷间键联的5-10-5MOE缺口聚物
/>
/>
表64中的化合物为6-10-4MOE缺口聚物。所述缺口聚物为20个核苷长，其中中央缺口区段由10个2’-β-D-脱氧核苷组成，5’侧翼区段由六个2’-MOE核苷组成，且3’侧翼区段由四个2’-MOE核苷组成。缺口聚物的糖基序(从5’到3’)：eeeeeeddddddddddeeee；其中‘d’表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，且‘e’表示2’-MOE糖部分。缺口聚物的核苷间键联基序为(从5’到3’)：sooooossssssssssoss，其中“s”表示硫代磷酸酯核苷间键联且“o”表示磷酸二酯核苷间键联。所有胞嘧啶残基均为5-甲基胞嘧啶。
表64
与人UBE3A-ATS互补的具有混合PO/PS核苷间键联的6-10-4MOE缺口聚物
/>
表65中的化合物为4-8-6MOE缺口聚物。所述缺口聚物为18个核苷长，其中中央缺口区段由8个2’-β-D-脱氧核苷组成，5’区段由四个2’-MOE核苷组成，且3’侧翼区段由六个2’-MOE核苷组成。缺口聚物的糖基序(从5’到3’)：eeeeddddddddeeeeee；其中‘d’表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，且‘e’表示2’-MOE糖部分。缺口聚物的核苷间键联基序为(从5’到3’)：soosssssssssoooss；其中“s”表示硫代磷酸酯核苷间键联且“o”表示磷酸二酯核苷间键联。所有胞嘧啶残基均为5-甲基胞嘧啶。
表65
与人UBE3A-ATS互补的具有混合PO/PS核苷间键联的4-8-6MOE缺口聚物
/>
表66中的化合物为5-8-5MOE缺口聚物。所述缺口聚物为18个核苷长，其中中央缺口区段由8个2’-β-D-脱氧核苷组成且5’和3’侧翼区段由5个2’-MOE核苷组成。缺口聚物的糖基序(从5’到3’)：eeeeeddddddddeeeee；其中‘d’表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，且‘e’表示2’-MOE糖部分。缺口聚物的核苷间键联基序为(从5’到3’)：sooosssssssssooss；其中“s”表示硫代磷酸酯核苷间键联且“o”表示磷酸二酯核苷间键联。所有胞嘧啶残基均为5-甲基胞嘧啶。
表66
与人UBE3A-ATS互补的具有混合PO/PS核苷间键联的5-8-5MOE缺口聚物
表67中的化合物为6-8-4MOE缺口聚物。所述缺口聚物为18个核苷长，其中中央缺口区段由8个2’-β-D-脱氧核苷组成，5’侧翼区段由6个2’-MOE核苷组成，且3’侧翼区段由4个2’-MOE核苷组成。缺口聚物的糖基序(从5’到3’)：eeeeeeddddddddeeee；其中‘d’表示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，且‘e’表示2’-MOE糖部分。缺口聚物的核苷间键联基序为(从5’到3’)：soooosssssssssoss；其中“s”表示硫代磷酸酯核苷间键联且“o”表示磷酸二酯核苷间键联。所有胞嘧啶残基均为5-甲基胞嘧啶。
表67
与人UBE3A-ATS互补的具有混合PO/PS核苷间键联的6-8-4MOE缺口聚物
实施例8：在活体外修饰的寡核苷酸对人UBE3A-ATS RNA的作用，多剂量
如实施例4中所述，在人IPS来源的iCell GABANeurons(Cellular Dynamics)中测试多种剂量的选自以上实施例的修饰的寡核苷酸。UBE3A-ATS RNA的减少呈相对于未处理的对照(UTC)细胞的UBE3A-ATS RNA量百分比呈现于下表。可能情况下，对excel中的数据的对数/线性曲线使用线性回归，计算每个修饰的寡核苷酸的半最大抑制浓度(IC50)。在一些情况下，无法可靠地计算IC50，且所述数据点标记为“N.C.”。用“N.D.”标记的值指示在此实验中值未测定。
表68
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(40,000个细胞/孔)
表69
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(40,000个细胞/孔)
表70
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(40,000个细胞/孔)
表71
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(40,000个细胞/孔)
表72
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(40,000个细胞/孔)
表73
在活体外人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分比(40,000个细胞/孔)
实施例9：在活体外修饰的寡核苷酸对人UBE3A-ATS RNA和UBE3A RNA的作用，多剂量
如以上实施例6中所述，在来源于安格尔曼氏综合征患者来源的IPS细胞的10周分化人神经元细胞中测试多种剂量的选自以上实施例的修饰的寡核苷酸。UBE3A-ATS RNA的减少或UBE3A RNA的诱导呈相对于未处理的对照(UTC)细胞的UBE3A-ATS RNA量百分比或UBE3A RNA百分比呈现于下表。用“N.D.”标记的值指示在此实验中值未测定。
发现在安格尔曼氏患者IPS细胞来源的神经元中若干修饰的寡核苷酸减少UBE3A-ATS RNA，同时伴有UBE3A RNA增加。
表74
安格尔曼氏综合征IPS细胞来源的神经元中UBE3A-ATS RNA的减少和UBE3A RNA的增加
表75
安格尔曼氏综合征IPS细胞来源的神经元中UBE3A-ATS RNA的减少和UBE3A RNA的增加
表76
安格尔曼氏综合征IPS细胞来源的神经元中UBE3A-ATS RNA的减少和UBE3A RNA的增加
表77
安格尔曼氏综合征IPS细胞来源的神经元中UBE3A-ATS RNA的减少和UBE3A RNA的增加
/>
实施例10：在野生型小鼠中与人UBE3A-ATS互补的修饰的寡核苷酸的耐受性，3小时研究
在野生型雌性C57/Bl6小鼠中测试上述修饰的寡核苷酸以评定寡核苷酸的耐受性。野生型雌性C57/Bl6小鼠各接受单一ICV 700μg剂量的下表中所列出的修饰的寡核苷酸。每个处理组由4只小鼠组成。一组4只小鼠接受PBS作为每个实验的阴性对照(以下单独表中确定)。在注射后3小时，根据7个不同标准评估小鼠。标准为(1)小鼠为机灵、警惕和有应答；(2)在无刺激下小鼠站立或弓起；(3)在无刺激下小鼠展示任何移动；(4)小鼠在举起之后展示向前移动；(5)小鼠在举起之后展示任何移动；(6)小鼠对捏尾巴有应答；(7)呼吸均匀。对于7个标准中的每一个，若符合标准，则给予小鼠分项分数0，若不符合，则给予分项分数1(功能观察组合分数或FOB)。在评估所有7个标准之后，将每只小鼠的分数求和且在每个处理组内求平均值。结果呈现在下表中。
表78
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
化合物编号 3小时FOB
PBS 0.0
749860 0.0
749865 4.0
749984 4.8
750006 3.5
750009 3.8
750540 3.5
750544 2.8
750567 5.0
表79
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
化合物编号 3小时FOB
PBS 0
1065272 5.0
1065295 2.0
1065296 5.5
1065324 2.8
1065330 6.8
1065369 6.8
1065438 5.8
1065465 5.0
1065513 5.8
1065576 7.0
1065578 3.2
1065579 3.8
1065582 4.2
1065586 3.0
1065590 6.0
1065591 4.0
1065593 1.0
1065595 4.8
1065597 4.5
1065599 6.0
1065600 4.2
1065605 3.8
1065607 5.2
1065608 3.0
表80
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
/>
表81
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
化合物编号 3小时FOB
PBS 0
1065685 5.0
1065686 4.8
1065690 3.8
1065696 6.2
1065708 5.5
1065709 4.2
1065710 2.8
1065712 6.8
1065713 5.0
1065719 4.0
1065728 1.0
1065735 3.5
1065750 6.2
1065754 3.2
1065765 4.2
1065766 5.2
1065768 5.5
1065785 3.8
1065795 1.0
1065799 1.0
1065810 2.2
1065812 3.8
1065813 5.0
1065817 5.0
表82
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
化合物编号 3小时FOB
PBS 0.0
1065821 6.5
1065823 4.0
1065826 3.0
1065829 4.8
1065840 4.5
1065856 6.2
1065857 6.0
1065858 4.0
1065859 0.0
1065863 4.8
1065868 3.2
1065889 1.0
1065894 3.8
1065899 4.5
1065901 4.0
1065902 4.0
1065903 5.5
1065914 5.0
1065920 2.0
1065932 4.5
1065937 1.0
1065947 1.2
1065953 6.5
1065954 5.5
表83
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
表84
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
/>
表85
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
化合物编号 3小时FOB
PBS 0.0
617456 4.8
617459 7.0
617470 6.5
617473 6.8
617536 6.5
617547 6.8
617557 5.2
617593 6.5
749794 5.0
749796 4.5
749816 5.8
749861 3.0
749863 5.5
749869 3.8
749882 6.8
749885 0.5
749893 1.2
749894 0.0
749907 5.0
749921 6.0
表86
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
化合物编号 3小时FOB
PBS 0.0
1065473 3.2
1065561 6.0
1065592 4.0
1065625 7.0
1065791 1.0
1065924 1.0
1066003 4.0
表87
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
/>
表88
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
/>
表89
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
化合物ID 3小时FOB
PBS 0.0
1263541 1.8
1263542 3.5
1263543 1.0
1263544 1.0
1263545 2.0
1263546 0.0
1263547 1.0
1263548 1.0
1263549 0.0
1263550 1.0
1263551 2.0
1263552 1.0
1263553 5.5
1263554 1.0
1263555 4.0
1263556 1.0
1263557 1.0
表90
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
/>
表91
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
/>
表92
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
化合物ID 3小时FOB
PBS 0
1065786 2.0
1165526 0.7
1165577 3.7
1263454 0.0
1263455 0.0
1263456 3.3
1263457 5.3
1263458 1.3
1263459 1.0
1263460 1.0
1263461 1.0
1263462 1.0
1263463 1.0
1263464 1.3
1263465 1.7
1263466 5.0
1263467 6.0
1263468 4.3
1263469 7.0
1263470 6.7
1272943 2.0
1272944 2.3
1272945 2.7
1272946 0.0
1272947 0.0
1272948 3.3
1272949 4.0
1272950 3.7
1272951 0.7
1272952 2.0
1272953 0.3
1272954 1.0
表93
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
化合物ID 3小时FOB
PBS 0.0
1272955 3.7
1272956 5.3
1272957 4.0
1272958 5.0
1272959 3.3
1272960 1.0
1272961 4.7
1272962 2.0
1272963 4.0
1272964 2.3
1272965 1.0
1272966 2.3
1272967 1.0
1272968 1.0
1272969 0.0
1272970 0.0
1272971 0.0
1272972 0.0
1272973 4.0
1272974 1.0
1272975 1.0
1272976 2.0
1272977 1.0
1272978 2.3
1272979 1.0
表94
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
表95
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
表96
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
/>
表97
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
/>
表98
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
化合物编号 3小时FOB
PBS 0.0
1165521 3.3
1165524 4.7
1165536 4.0
1165545 6.0
1165552 5.7
1165553 6.0
1165554 7.0
1165555 6.0
1165562 5.7
1165588 4.7
1165590 5.7
1165611 6.0
实施例11：在大鼠中与人UBE3A-ATS互补的修饰的寡核苷酸的耐受性，3小时研究
在大鼠中测试上述修饰的寡核苷酸以评定所述寡核苷酸的耐受性。史泊格多利大鼠(Sprague Dawley rat)各自接受单一鞘内(IT)3mg剂量的下表中所列出的寡核苷酸。每个处理组由4只大鼠组成。一组4只小鼠接受PBS作为阴性对照。在注射后3小时，评估每只大鼠身体的7个不同部分的移动。7个身体部分为(1)大鼠尾巴；(2)大鼠背部姿势；(3)大鼠后肢；(4)大鼠后爪；(5)大鼠前爪；(6)大鼠前部姿势；(7)大鼠头部。对于7个不同身体部分中的每一个，若身体部分移动，则给予各大鼠分项分数0，或若身体部分不移动，则给予分项分数1(功能观察组合分数或FOB)。在评估7个身体部分中的每一个之后，将各大鼠的分项分数求和且针对各组求平均值。例如，若在3mg IT给药之后3小时大鼠尾巴、头和所有其他评估身体部分移动，则其得到0的总和分数。若在3mg IT给药之后3小时另一只大鼠不移动其尾巴但所有其他评估身体部分移动，则其得到1的分数。结果呈每个处理组的平均分数呈现。
表99
3mg剂量下大鼠中的耐受性分数
化合物编号 FOB 3小时
PBS 0.0
749860 0.0
749861 4.0
749869 4.8
749885 0.8
749893 0.5
749931 0.5
750006 4.5
表100
3mg剂量下大鼠中的耐受性分数
表101
3mg剂量下大鼠中的耐受性分数
化合物编号 FOB 3小时
PBS 0.0
1065578 4.0
1065586 3.0
1065609 2.0
1065613 3.8
1065635 1.8
1065641 3.3
1065645 3.0
1065646 2.5
表102
3mg剂量下大鼠中的耐受性分数
化合物编号 FOB 3小时
PBS 0.0
750413 0.3
1065669 2.8
1065680 4.0
1065710 5.5
1065754 5.3
1065785 6.0
1065795 3.3
1065799 2.0
1065812 4.0
1065826 2.0
表103
3mg剂量下大鼠中的耐受性分数
表104
3mg剂量下大鼠中的耐受性分数
化合物编号 FOB 3小时
PBS 0.3
1263408 2.0
1263409 2.5
1263410 2.5
1263411 1.3
1263412 3.0
1263419 1.8
1263420 1.8
1263429 2.5
1263434 2.0
表105
3mg剂量下大鼠中的耐受性分数
化合物编号 FOB 3小时
PBS 0.3
1263435 3.0
1263441 2.3*
1263450 2.0
1263451 4.0
1263452 2.0
1263453 1.8
1263454 1.5
1263455 3.3
1263458 0.3
*在手术期间此组中4只大鼠中的一只死亡，因此自此值排除。
表106
3mg剂量下大鼠中的耐受性分数
化合物编号 FOB 3小时
PBS 0.5
1263476 0.3
1263478 1.0
1263488 3.0
1263489 2.3
1263507 2.0
1263517 1.3
1263518 1.8
1263519 1.0
1263521 2.0
1263533 1.3
表107
3mg剂量下大鼠中的耐受性分数
化合物编号 FOB 3小时
PBS 0.0
1165563 3.0
1179841 3.0
1179843 3.3
1263407 3.8
1263413 4.0
1263430 4.3
1263436 2.8
1263540 2.5
1272944 2.0
1272994 1.0
1272996 1.0
表108
3mg剂量下大鼠中的耐受性分数
表109
3mg剂量下大鼠中的耐受性分数
化合物编号 FOB 3小时
PBS 0.0
1263426 2.3
1263462 2.8
1272974 3.8
1272997 0.8
1273020 0.5
1273033 1.8
1273038 3.0
1273039 3.3
1273042 2.0
1273048 3.0
1273104 3.0
1273105 3.0
1273109 3.8
1273110 1.0
1273111 2.7
1065593 1.5
1263547 4.0
1165586 0.0
1263537 1.5
表110
3mg剂量下大鼠中的耐受性分数
化合物编号 FOB 3小时
PBS 0.0
749953 4.5
1065711 3.5
1263417 6.3
1263418 3.3
1263421 5.8
1263443 5.0
1263456 5.0
1263529 2.5
1263538 4.7
1273030 0.0
1273047 4.0
1273085 4.0
表111
3mg剂量下大鼠中的耐受性分数
化合物编号 FOB 3小时
PBS 0.0
749991 1.3
1263460 3.0
1263461 2.0
1263486 3.0
1263532 1.5
1263551 4.0
1273050 1.0
1273090 1.0
1273091 2.0
1273101 3.5
1263522 1.7
实施例12：在野生型小鼠中与人UBE3A-ATS互补的修饰的寡核苷酸的耐受性，2周研究
在野生型雌性C57/Bl6小鼠中测试上述修饰的寡核苷酸以评定所述寡核苷酸的耐受性。野生型雌性C57/Bl6小鼠各自接受单一ICV700μg剂量的下表中所列出的修饰的寡核苷酸。每个处理组由4只小鼠组成。一组4只小鼠接受PBS作为每个实验的阴性对照(以下单独表中确定)。在注射后2周，根据7个不同标准评估小鼠。标准为(1)小鼠为机灵、警惕和有应答；(2)在无刺激下小鼠站立或弓起；(3)在无刺激下小鼠展示任何移动；(4)小鼠在举起之后展示向前移动；(5)小鼠在举起之后展示任何移动；(6)小鼠对捏尾巴有所反应；(7)呼吸均匀。对于7个标准中的每一个，若符合标准，则给予小鼠分项分数0，若不符合，则给予分项分数1(功能观察组合分数或FOB)。在评估所有7个标准之后，将每只小鼠的分数求和且在每个处理组内求平均值。结果呈现在下表中。
表112
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
化合物编号 2周FOB
PBS 0.0
1065645 0.0
1263517 0.0
1263518 0.0
1263533 0.0
1273039 0.0
1273062 0.0
实施例13：在转基因小鼠中与人UBE3A-ATS互补的修饰的寡核苷酸的活性
在UBE3A-ATS BAC转基因小鼠模型中测试上述修饰的寡核苷酸。所述转基因小鼠模型在the University of Michigan Bacterial Artificial ChromosomeRecombineering Core研发且含有来自人染色体15(GRCh38/hg38组件)(来自BAC克隆RP11-664B13)的区域25163935-25348867。UBE3A-ATS表达由ENO2启动子驱动且用BGH poly(A)信号终止。通过原核注射将基因片段引入来自C57BL/6小鼠的受精卵中以产生株系RP11-748，用于以下描述的实验中。
处理
UBE3A-ATS转基因小鼠分成数组，每组2-4只小鼠。每只小鼠接受单一ICV 350μg推注的修饰的寡核苷酸。一组4只小鼠接受PBS用作阴性对照。
RNA分析
在两周之后，处死小鼠且从皮质脑组织、海马体脑组织和脊髓提取RNA以用于实时PCR分析，使用引物探针集RTS4796(上文所述)和/或引物探针集RTS40595(正向序列TCCTTCCCTACCTTAGTCTTGA，本文中称为SEQ ID NO:14；反向序列CCCTCTTGAACCAGGAAACA，本文中称为SEQ ID NO:15；探针序列AGATGGCAGCCCACATTTCTACTGT，本文中称为SEQ ID NO:16)测量UBE3A-ATS的RNA表达。当所述寡核苷酸在远离引物探针结合位点的位点处结合时引物探针集RTS4796不可靠。结果以相对于PBS对照的RNA变化百分比呈现，相对于小鼠GAPDH归一化。使用引物探针集RTS108(正向序列GGCAAATTCAACGGCACAGT，本文中称为SEQID NO:11；反向序列GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT，本文中称为SEQ ID NO:12；探针序列AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC，本文中称为SEQ ID NO:13)扩增小鼠GAPDH。在一些情况下，未确定某一样品的RTPCR值，且标记为N.D.(未确定)。
如下表中所示，与PBS对照相比，用修饰的寡核苷酸处理引起UBE3A-ATS RNA减少。
表113
转基因小鼠中人UBE3A-ATS RNA的减少
/>
/>
表114
转基因小鼠中人UBE3A-ATS RNA的减少
/>
表115
转基因小鼠中人UBE3A-ATS RNA的减少
/>
*组中仅1只动物
表116
转基因小鼠中人UBE3A-ATS RNA的减少
/>
表117
转基因小鼠中人UBE3A-ATS RNA的减少
/>
/>
实施例14：在转基因小鼠中与人UBE3A-ATS互补的修饰的寡核苷酸的活性，多剂量
在UBE3A-ATS BAC转基因小鼠模型RP11-748株系中测试上述修饰的寡核苷酸。
处理
UBE3A-ATS转基因小鼠分成数组，每组3只小鼠。每只小鼠接受单一ICV 10μg、30μg、100μg、300μg或700μg推注的修饰的寡核苷酸，且在两周后处死。一组8只小鼠接受PBS用作阴性对照。
RNA分析
在两周之后，处死小鼠且从皮质脑组织、海马体脑组织和脊髓提取RNA以用于实时PCR分析，使用引物探针集RTS40595(正向序列TCCTTCCCTACCTTAGTCTTGA，本文中称为SEQID NO:14；反向序列CCCTCTTGAACCAGGAAACA，本文中称为SEQ ID NO:15；探针序列AGATGGCAGCCCACATTTCTACTGT，本文中称为SEQ ID NO:16)测量UBE3A-ATS的RNA表达。结果以相对于PBS对照的RNA变化百分比呈现，相对于小鼠GAPDH归一化(通过引物-探针集RTS108测量)。
如下表中所示，与PBS对照相比，用修饰的寡核苷酸处理引起UBE3A-ATS RNA剂量依赖性减少。
表118
转基因小鼠中人UBE3A-ATS RNA的剂量依赖性减少百分
/>
实施例15：在野生型小鼠中与人UBE3A-ATS互补的修饰的寡核苷酸的耐受性，3小时和2周研究
在野生型雌性C57/Bl6小鼠中测试WO2017/081223中所述的与LNA/DNA寡核苷酸密切匹配的修饰的寡核苷酸以评定所述寡核苷酸的耐受性。参见上文所述的某些比较化合物。野生型雌性C57/Bl6小鼠各自接受单一ICV 700μg剂量的下表中所列出的修饰的寡核苷酸。每个处理组由4只小鼠组成。一组4只小鼠接受PBS作为实验的阴性对照。在注射后3小时和注射后2周，根据7个不同标准评估小鼠。标准为(1)小鼠为机灵、警惕和有应答；(2)在无刺激下小鼠站立或弓起；(3)在无刺激下小鼠展示任何移动；(4)小鼠在举起之后展示向前移动；(5)小鼠在举起之后展示任何移动；(6)小鼠对捏尾巴有所反应；(7)呼吸均匀。对于7个标准中的每一个，若符合标准，则给予小鼠分项分数0，若不符合，则给予分项分数1(功能观察组合分数或FOB)。在评估所有7个标准之后，将各小鼠的分数求和且在各处理组内求平均值。结果呈现在下表中。
表119
小鼠中700μg剂量的耐受性分数
下标“l”指示4’-2’LNA修饰糖部分，下标“d”指示2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，下标“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联，且在C之前的下标“m”指示5-甲基胞嘧啶。
n.d.意指无数据；未测试。
实施例16：在大鼠中与人UBE3A-ATS互补的修饰的寡核苷酸的耐受性，8周研究
在大鼠中测试上述修饰的寡核苷酸以评定所述寡核苷酸的耐受性。成组的6-8周龄雄性史泊格多利大鼠各接受单一鞘内(IT)3mg剂量的如下表中所列出的寡核苷酸。每个处理组由4只大鼠组成，起始体重大致相配。一组4只大鼠接受PBS作为阴性对照。在给药前将大鼠称重，且在给药后8周再次称重。预计大鼠在研究过程期间由于生长而体重增加；体重增加太少为化合物毒性的征兆。体重改变的绝对值相对于PBS处理组中观察到的体重改变归一化，以允许大鼠具有不同平均起始体重的两次研究之间进行比较，其中PBS组的体重改变设定为100％。通过在Excel中双尾韦尔奇T检验(Welch’s T-test)(两个样品，不等方差)计算与PBS处理组相比体重改变的统计显著性(p值)。p值<0.05指示观察到的差异由随机取样误差引起的概率小于5％。
表120
在给药后8周大鼠的体重改变
化合物ID 呈％PBS的体重改变 p值
PBS 100 n/a
1219027 87 0.03
1065645 101 0.83
1263517 100 0.91
1263518 103 0.50
1263533 100 0.99
1273039 105 0.26
1273062 100 0.98

Claims (17)

1.一种根据以下化学结构的修饰的寡核苷酸：
(SEQ ID NO:2873)，或其盐。
2.如权利要求1所述的修饰的寡核苷酸，其为钠盐或钾盐。
3.一种根据以下化学结构的修饰的寡核苷酸：
(SEQ ID NO:2873)。
4.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的修饰的寡核苷酸和药学上可接受的稀释剂。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的稀释剂为人工脑脊髓液。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上由所述修饰的寡核苷酸和人工脑脊髓液组成。
7.一种药物组合物，其包含如权利要求3所述的修饰的寡核苷酸和药学上可接受的稀释剂。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的稀释剂为人工脑脊髓液。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上由所述修饰的寡核苷酸和人工脑脊髓液组成。
10.一种化合物，其包含根据以下化学符号的修饰的寡核苷酸：
Aes mCeo mCeoAeoTeoTdsTdsTdsGdsAds mCds mCdsTdsTds mCdsTeoTeoAesGes mCe(SEQ ID NO:2873)，其中：
A＝腺嘌呤核碱基，
mC＝5-甲基胞嘧啶核碱基，
G＝鸟嘌呤核碱基，
T＝胸腺嘧啶核碱基，
e＝2’-O(CH2)2OCH3β-D-核糖基糖部分，
d＝2’-β-D-脱氧核糖基糖部分，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
11.一种药物组合物，其包含如权利要求10所述的化合物和药学上可接受的稀释剂。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的稀释剂为人工脑脊髓液。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上由所述的化合物和人工脑脊髓液组成。
14.如权利要求10所述的化合物，其包含共价连接于结合基团的所述修饰的寡核苷酸。
15.一种药物组合物，其包含如权利要求14所述的化合物和药学上可接受的稀释剂。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的稀释剂为人工脑脊髓液。
17.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上由所述修饰的寡核苷酸和人工脑脊髓液组成。
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