CN113718038A - 中间球海胆脂肪酸含量的分子标记辅助育种引物组及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中间球海胆脂肪酸含量的分子标记辅助育种引物组及应用，属于分子育种领域，本发明提供了4个引物对组合，选取同时满足A007359标记基因型为CC，A012370标记基因型为CC，A012381标记基因型为TT和A012386标记基因型AA的海胆作为亲本，能够选育出生殖腺中脂肪酸含量高的个体。
Description
技术领域
本发明属于分子育种领域，具体涉及一种用于中间球海胆脂肪酸含量的分子标记辅助育种引物组及其应用方法。
背景技术
中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius)是我国最重要海水养殖种类，其主要营养是其生殖腺(俗称海胆黄)中富含高不饱和脂肪酸。其性腺中特征性高不饱和脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)是人体必需的多不饱和脂肪酸，可以调节血脂、降低血液粘稠度，防止动脉粥样硬化的形成和发展、预防脑血栓、脑溢血、高血压等心血管疾病。花生四烯酸(AA或ARA)是全顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸，是***素E2(PGE2)、***环素(PGI2)、血栓烷素A2(TXA2)和白细胞三烯和C4(LTC4)的直接前体。这些生物活性物质对脂质蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用，同时也是大脑发育和视神经发育过程中的重要物质。
如何提高海胆生殖腺中高不饱和脂肪酸含量，特别是特征性高不饱和脂肪酸含量，是海胆遗传育种工作中需要关注的重要课题，由于海胆生殖腺性状属于复杂数量性状，遗产参数难以准确估测，开展传统选择育种困难大，而分子标记辅助育种是利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。被广泛应用于动物遗传育种、资源保护等多个领域。
发明内容
为解决现有技术的问题，本发明基于KASP分型技术提供一种与中间球海胆脂肪酸相关的SNP标记及其开发方法，此SNP标记适用于中间球海胆脂肪酸含量的辅助选种。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种用于中间球海胆脂肪酸的分子标记辅助育种的引物组，所述引物组如表1所示：
表1 基于SNP的用于中间球海胆生殖腺脂肪酸含量的分子标记辅助育种引物
本发明还提供利用所述引物组进行育种的方法，选取同时满足A007359标记基因型为CC，A012370标记基因型为CC，A012381标记基因型为TT和A012386标记基因型AA的海胆作为亲本，进行苗种培育。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明的引物能够将中间球海胆生殖腺脂肪酸含量高的个体进行鉴别出来，作为繁育亲本，从而选育出生殖腺中脂肪酸含量高的个体。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但以任何方式限制本发明。
实施例1
1、中间球海胆生殖腺脂肪酸性状相关SLAF标签的筛选和KASP引物设计。
本发明利用SLAF-seq技术制备中间球海胆高密度遗传连锁图谱，采用MapQTL软件的区间作图(IM)算法和RQTL软件的复合区间作图(CIM)算法进行中间球海胆脂肪酸性状QTL定位(当显著性阈值超过临界值(LOD)时，认为存在一个QTL位点，在实际筛选时设置当LOD>2.5时存在一个QTL位点)，并筛选出与脂肪酸相关的SLAF标签287条。
剔除掉(1)拷贝数>2；(2)SNP位点附近重复序列过多；(3)GC含量过高；(4)存在其它不符合引物设计原则的问题的片段，获得符合设计原则的SLAF标签92条，并设计相应的KASP标记。
2、中间球海胆生殖腺脂肪酸性状相关KASP标记分型
选取160个健康、性腺成熟的中间球海胆(取自大连市龙王塘海域)进行生殖腺脂肪酸性状相关KASP标记分型，利用气相色谱检测海胆脂肪酸含量，获得性腺总脂肪酸含量、多不饱和脂肪酸含量和AA+EPA含量。结果显示，所测海胆性腺脂肪酸总量最高值为131613.81mg/kg，最低值为38990.66mg/kg，平均值为99314.74mg/kg。高不饱和脂肪酸总量最高值为68479.32mg/kg，最低值为15394.45mg/kg，平均值为43056.38mg/kg。AA+EPA含量最高值为20001.81mg/kg，最低值为1349.84mg/kg，平均值为9986.65mg/kg。
按照“海洋动物基因组DNA提取试剂盒”操作规程提取海胆的管足DNA，将DNAMaker为5000bp的作为参照物，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，有单一、清晰主带的DNA可用于后续的KASP分型。
在LGC SNPline平台上，以提取的海胆DNA为模板，设计的KASP引物进行61～55℃梯度PCR扩增，PCR反应程序结束后，将样品分别放置到Omega荧光信号阅读仪和Araya上进行荧光信号转化，并进行数值分析。利用LGC公司提供的分析软件Kraken TM进行基因分型，X:X代表纯合型，包括A:A、C:C、-:-(缺失)三种类型；X:Y代表杂合型，包括A:G、C:T、A:-三种类型；-代表无信号或信号较弱；Uncallable代表有信号但无明确分型；最终成功分型获得与中间球海胆性腺性状相关的25条KASP标记。
结合160个中间球海胆性腺脂肪酸性状数据(不饱和脂肪酸总量、总脂肪酸总量、EPA+AA)，利用线性模型，进行标记与表型数据的关联性分型，对每个性状使用P<0.05的显著关联标记和表型数据建立线性模型，然后使用stepwiseAIC对线性模型进行优化，获得与脂肪酸显著关联的分子标记(P<0.1)，共获得与海胆脂肪酸性状相关标记见表4(共包含9个标记)。最终选取与中间球海胆脂肪酸(不饱和脂肪酸总量、总脂肪酸总量、EPA+AA)有关的9组KASP引物序列，结果见表3。
表3 SNP位点与脂肪酸性状的关联分析结果
注：设P<0.1为关联显著
3.标记验证
另取实验室养殖中间球海胆30只，取其管足并提取DNA，同时利用气相色谱法测定其脂肪酸总量、不饱和脂肪酸总量和EPA+AA含量，分析不同基因分型的海胆性腺脂肪酸性状，结果见表4，其趋势与关联结果一致。其中以A007359、A012370、A012381和A012386标记的差异最为显著，最终以上述3个KASP标记作为中间球海胆生殖腺脂肪酸含量的分子标记。
表4 中间球海胆脂肪酸总量、多不饱和脂肪酸总量和AA+EPA的平均含量与标记相关性(mg/kg)
4.实践应用案例
将预留亲本的100只海胆按上述步骤取其管足并提取DNA，选用A007359、A012370、A012381和A012386KASP引物进行扩增，留取同时满足A007359标记基因型为CC，A012370标记基因型为CC，A012381标记基因型为TT和A012386标记基因型AA的共8只海胆作为亲本(3雄5雌)，进行群体受精繁育；从剩余个体中随机选择8只海胆(3雄5雌)进行群体受精繁殖(作为对照组)，相同环境和饵料条件下饲养，1.5龄后检测其性腺脂肪酸性状发现，与对照组比较，其总脂肪酸含量、多不饱和脂肪酸和AA+EPA含量分别提高12％、18％和23％，标记辅助选择效果较好。
序列表
<110> 大连海洋大学
<120> 中间球海胆脂肪酸含量的分子标记辅助育种引物组及应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgcgacatg gtatcgtttg c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagcgcgaca tggtatcgtt tga 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtctgtcacc agtctgtcag tcata 25
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tgatcacctt gttaccattg ataatctg 48
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tagatcacct tgttaccatt gataatcta 49
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gacactttcc tcttcaataa aaatc 25
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc taggacaggg tcaaaatgtc tgga 44
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat tggacagggt caaaatgtct ggg 43
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgatgtcatt tgacttattt gaactggttt 30
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc tattgtgtta ttccttagtg atgatcatct 50
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat tgtgttattc cttagtgatg atcatcc 47
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtttggttcc tcactggact gtcta 25
Claims (2)
1.一种用于中间球海胆脂肪酸含量的分子标记辅助育种的引物组，其特征在于所述引物组为表1所示：
表1基于SNP的用于中间球海胆生殖腺脂肪酸含量的分子标记辅助育种引物组
2.利用权利要求1所述引物组进行育种的方法，其特征在于选取同时满足A007359标记基因型为CC，A012370标记基因型为CC，A012381标记基因型为TT和A012386标记基因型AA的海胆作为亲本，进行苗种培育。
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Citations (3)
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| CN105925698A (zh) * | 2016-06-03 | 2016-09-07 | 大连海洋大学 | 早期筛选中间球海胆良种的snp引物及筛选方法 |
| CN108660225A (zh) * | 2018-07-18 | 2018-10-16 | 大连海洋大学 | 用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种引物及筛选方法 |
-
2021
- 2021-07-26 CN CN202110846104.4A patent/CN113718038B/zh active Active
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| YAQING CHANG ET AL.: ""SLAF-based high-density genetic map construction and QTL mapping for major economic traits in sea urchin Strongylocentrotus intermedius"", 《SCIENTIFIC REPORTS》 * |
| 赵文飞等: ""中间球海胆脂肪酸含量的QTL 定位及基因注释"", 《2018 年中国水产学会学术年会论文摘要集》 * |
Also Published As
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|---|---|
| CN113718038B (zh) | 2023-05-23 |
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