CN113717988A - 一种用于定向创制植物突变体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物突变的技术领域，具体涉及一种用于定向创制植物突变体的方法，1）浸染植物愈伤组织，导入基因，获取过表达基因的阳性愈伤组织；2）准备纳米材料：包括M2+‑N3+类水滑石纳米材料或纳米管；3）将步骤2）纳米材料的水溶液与带有PAM结构的特异基因gRNA片段混合；4）将获得的混合液浸染过表达基因的阳性愈伤组织，培养获得植物突变体。本发明利用分子技术和纳米技术的结合，通过可用于DNA剪切的编辑基因过表达到愈伤组织中，再将设计特定基因序列的向导RNA利用可装载吸附核酸分子的类水滑石纳米材料混合，通过直接喷洒的方法将混合液导入基因过表达植物里，最终实现植物的定向突变，可实现大量创制且操作简单。

Description

一种用于定向创制植物突变体的方法
技术领域
本发明属于植物突变的技术领域，具体涉及一种用于定向创制植物突变体的方法。
背景技术
突变体创制是研究植物基因功能的重要实验材料，现在主要是通过化学方法、物理诱变或者生物学方法***或者基因编辑等技术手段。
现有突变体创制的方法，均在一定程度上存在缺陷，例如化学诱变和T-DNA突变的方法创制突变体具有不定向性，获得突变体需要鉴定突变位置，工作量巨大；利用基因编辑的方法创制突变体，操作相对简单，但不利于同时创制多种突变体或大量突变体的创制。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于定向创制植物突变体的方法，将基因编辑技术与纳米材料相结合，可实现大量定向突变体的创制，操作简单。
本发明的技术内容如下：
本发明提供了一种用于定向创制植物突变体的方法，包括如下步骤：1）浸染植物愈伤组织，导入基因，获取过表达基因的阳性愈伤组织；
2）准备纳米材料：包括M2+-N3+类水滑石纳米材料或纳米管；
3）将步骤2）纳米材料的水溶液与带有PAM结构的特异基因gRNA片段混合；
4）将步骤3）获得的混合液浸染步骤1）过表达基因的阳性愈伤组织，培养获得小苗，即为植物突变体，提取突变体叶片的DNA进行鉴定。
步骤1）所述植物的品种包括拟南芥、烟草、杨树、樟树、苹果、木荷等物种；
步骤1）所述浸染的操作包括利用农杆菌介导法浸染植物愈伤组织：将编辑基因通过酶切连接或重组酶法构建到植物过表达载体中，再将重组质粒转化至农杆菌感受态，用活化的带有目标载体的农杆菌浸染在分化培养基上预培养的植物叶片，之后转移至抗性相应的抗性培养基上，进行分化以及生长培养，产生愈伤组织，筛选出过表达基因的阳性愈伤组织；
所述编辑基因包括包括Cas 9或Cas 12a基因；
所述抗性培养基为在分化培养基的基础上添加植物过表达载体携带的抗性基因的相应抗生素，所述抗生素包括卡那霉素Kana、潮霉素Hyg；
步骤2）所述M2+-N3+类水滑石纳米材料为采用二价金属离子M2+三价金属离子N3+制得的水滑石纳米材料，包括Mg-Fe类水滑石纳米材料，其制备为：将溶于甲醇的等物质的量的Mg盐和Fe盐，通过NaOH溶液进行滴定，致其全部溶解，之后充入氮气充分混合搅拌，高温处理之后再冷却，最后制成厚度为2~100 nm左右的Mg-Fe类水滑石纳米片层。
所述纳米管包括单壁纳米管、多壁纳米管等；
步骤3）所述纳米材料的水溶液与gRNA片段的混合比例为（2~4）：1，混合之后静置过夜。
本发明的有益效果如下：
本发明的一种用于定向创制植物突变体的方法，利用分子技术和纳米技术的结合，通过可用于DNA剪切的Cas 9或Cas 12a基因过表达到愈伤组织中，再将设计特定基因序列的向导RNA利用可装载吸附核酸分子的类水滑石纳米材料按比例混合，通过直接喷洒的方法将混合液导入Cas 9或Cas 12a过表达植物里，最终实现植物的定向突变，培养一段时间后，提取DNA，通过PCR克隆测序的方法鉴定突变体，大大节约了突变体创制的时间成本；本发明将基因编辑技术与纳米材料相结合，可实现大量定向突变体的创制，操作简单。
附图说明
图1为实施例1中纳米材料吸附DNA的凝胶电泳图；
图2为实施例1中纳米材料侵染木荷茎段分化；
图3为实施例3中纳米材料携带重组质粒转化后烟草愈伤组织分化出小苗。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例1
一种用于定向创制植物突变体的方法
1）浸染植物愈伤组织：选取木荷组培苗茎段，将Cas 9基因通过酶切连接或重组酶法构建到植物过表达载体（pCAMBIA1300）中，得到重组质粒转化至农杆菌GV3101感受态，用活化的带有目标载体的农杆菌浸染在分化培养基上预培养12 h的植物叶片，室温黑暗培养三天后转移至抗性相应的抗性培养基上，进行分化培养（30 d）、选择培养（30 d）及生根培养（30 d），产生愈伤组织，筛选出过表达Cas 9基因的阳性愈伤组织；
所述分化、选择以及生根培养所用的抗性培养基分别为：
分化培养基：WPM+30g/L蔗糖+100μmol/L AS+1.0 mg/L NAA +2.0mg/L ZT+7.6 g/L琼脂；
选择培养基：WPM+30g/L蔗糖+9mg/L Hyg+1.0 mg/L NAA +2.0 mg/L ZT +7.6g/L琼脂；
生根培养基：WPM+30g/L蔗糖+9mg/L Hyg+0.1mg/L NAA + 8.0 g/L琼脂；
2）准备M2+-N3+类水滑石纳米材料：
将溶于甲醇的等物质的量的硝酸镁和硝酸铁，通过1 M NaOH溶液进行滴定，致其全部溶解；
随后充入氮气充分混合搅拌30 min以上，100℃高温处理60 h，再冷却至60℃，最后制成厚度为100 nm的Mg-Fe类水滑石纳米片层；
3）将步骤2）纳米材料的水溶液与带有PAM结构的特异基因gRNA片段混合，混合比例为3：1，混合之后静置过夜；
4）将步骤3）获得的混合液浸泡步骤1）过表达基因的阳性愈伤组织，培养获得小苗，即为植物突变体，提取突变体叶片的DNA进行鉴定。
如图1的凝胶电泳图（木荷）所示，表明获得了能够实现定向突变的突变体植物；
如图2所示，为纳米材料侵染木荷茎段之后的细胞组织分化状态图。
实施例2
一种用于定向创制植物突变体的方法
1）浸染植物愈伤组织：选取烟草幼嫩叶片，将Cas 12a基因通过酶切连接或重组酶法构建到植物过表达载体（PBI21）中，得到重组质粒转化至农杆菌GV3101感受态，用活化的带有目标载体的农杆菌浸染在分化培养基上预培养12 h的植物叶片，室温黑暗培养三天后转移至抗性相应的抗性培养基上，进行分化培养（30 d）、选择培养（30 d）及生根培养（30d），产生愈伤组织，筛选出过表达Cas 12a基因的阳性愈伤组织；
所述分化、选择以及生根培养所用的抗性培养基分别为：
分化培养基：MS+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA；
选择培养基：MS+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+250 mg/L Cb+50 mg/L Kana；
生根培养基：MS+50 mg/L Kana；
2）准备M2+-N3+类水滑石纳米材料：
将溶于甲醇的等物质的量的硝酸镁和硝酸铁，通过1 M NaOH溶液进行滴定，致其全部溶解；
随后充入氮气充分混合搅拌30 min以上，100℃高温处理60 h，再冷却至60℃，最后制成厚度为50 nm的Mg-Fe类水滑石纳米片层；
3）将步骤2）纳米材料的水溶液与带有PAM结构的特异基因gRNA片段混合，混合比例为2：1，混合之后静置过夜；
4）将步骤3）获得的混合液浸泡步骤1）过表达基因的阳性愈伤组织，培养获得小苗，即为植物突变体，提取突变体叶片的DNA进行鉴定。
如图3所示，为纳米材料携带重组质粒转化后烟草愈伤组织分化出小苗的植物状态图。
实施例3
一种用于定向创制植物突变体的方法
1）浸染植物愈伤组织：选取烟草幼嫩叶片，将Cas 12a基因通过酶切连接或重组酶法构建到植物过表达载体中，得到重组质粒转化至农杆菌GV3101感受态，用活化的带有目标载体的农杆菌浸染在分化培养基上预培养12 h的植物叶片，室温黑暗培养三天后转移至抗性相应的抗性培养基上，进行分化培养（30 d）、选择培养（30 d）及生根培养（30 d），产生愈伤组织，筛选出过表达Cas 12a基因的阳性愈伤组织；
所述分化、选择以及生根培养所用的抗性培养基分别为：
分化培养基：MS+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA；
发芽培养基：MS+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+250 mg/L Cb+50 mg/L Kana；
生根培养基：MS+50 mg/L Kana；
抗性培养基：MS+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+植物过表达载体携带的抗性基因的Hyg抗生素，培养之后筛选出过表达Cas 12a的阳性愈伤组织；
2）准备M2+-N3+类水滑石纳米材料：
将溶于甲醇的等物质的量的硝酸镁和硝酸铁，通过1 M NaOH溶液进行滴定，致其全部溶解；
随后充入氮气充分混合搅拌30 min以上，100℃高温处理60 h，再冷却至60℃，最后制成厚度为2 nm的Mg-Fe类水滑石纳米片层；
3）将步骤2）纳米材料的水溶液与带有PAM结构的特异基因gRNA片段混合，混合比例为4：1，混合之后静置过夜；
4）将步骤3）获得的混合液浸泡步骤1）过表达基因的阳性愈伤组织，培养获得小苗，即为植物突变体，提取突变体叶片的DNA进行鉴定。
如图3所示，为纳米材料携带重组质粒转化后烟草愈伤组织分化出小苗的植物状态图。
实施例4
一种用于定向创制植物突变体的方法
1）浸染植物愈伤组织：选取杨树或樟树的幼嫩叶片，将Cas 9基因通过酶切连接或重组酶法构建到植物过表达载体中，得到重组质粒转化至农杆菌GV3101感受态，用活化的带有目标载体的农杆菌浸染在分化培养基上预培养12 h的植物叶片，室温黑暗培养三天后转移至抗性相应的抗性培养基上，进行分化培养（30 d）、选择培养（30 d）及生根培养（30d），产生愈伤组织，筛选出过表达Cas 9基因的阳性愈伤组织；
所述分化、选择以及生根培养所用的抗性培养基分别为：
分化培养基：MS+2.0 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA；
发芽培养基：MS+2.0 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cb+50 mg/L Kana；
生根培养基：MS+50 mg/L Kana；
2）准备单壁纳米管或多壁纳米管；
3）将步骤2）纳米材料的水溶液与带有PAM结构的特异基因gRNA片段混合，混合比例为3：1，混合之后静置过夜；
4）将步骤3）获得的混合液浸泡步骤1）过表达基因的阳性愈伤组织，培养获得小苗，即为植物突变体，提取突变体叶片的DNA进行鉴定。

Claims (9)

1.一种用于定向创制植物突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）浸染植物愈伤组织，导入基因，获取过表达基因的阳性愈伤组织；
2）准备纳米材料：包括M2+-N3+类水滑石纳米材料或纳米管；
3）将步骤2）纳米材料的水溶液与带有PAM结构的特异基因gRNA片段混合；
4）将步骤3）获得的混合液浸染步骤1）过表达基因的阳性愈伤组织，培养获得小苗，即为植物突变体，提取突变体叶片的DNA进行鉴定。
2.由权利要求1所述的用于定向创制植物突变体的方法，其特征在于，步骤1）所述植物的品种包括拟南芥、烟草、杨树、樟树、苹果以及木荷。
3.由权利要求1所述的用于定向创制植物突变体的方法，其特征在于，步骤1）所述浸染的操作包括利用农杆菌介导法浸染植物愈伤组织：将编辑基因通过酶切连接或重组酶法构建到植物过表达载体中，再将重组质粒转化至农杆菌感受态，用活化的带有目标载体的农杆菌浸染在分化培养基上预培养的植物叶片，之后转移至抗性相应的抗性培养基上，进行分化以及生长培养，产生愈伤组织，筛选出过表达基因的阳性愈伤组织。
4.由权利要求3所述的用于定向创制植物突变体的方法，其特征在于，所述编辑基因包括Cas 9或Cas 12a基因。
5.由权利要求3所述的用于定向创制植物突变体的方法，其特征在于，所述抗性培养基为在分化培养基的基础上添加植物过表达载体携带的抗性基因的相应抗生素，所述抗生素包括卡那霉素Kana、潮霉素Hyg。
6.由权利要求1所述的用于定向创制植物突变体的方法，其特征在于，步骤2）所述M2+-N3+类水滑石纳米材料为采用二价金属离子M2+三价金属离子N3+制得的水滑石纳米材料。
7.由权利要求1所述的用于定向创制植物突变体的方法，其特征在于，步骤2）所述M2+-N3+类水滑石纳米材料包括Mg-Fe类水滑石纳米材料，其制备为：将溶于甲醇的等物质的量的Mg盐和Fe盐，通过NaOH溶液进行滴定，致其全部溶解，之后充入氮气充分混合搅拌，高温处理之后再冷却，最后制成厚度为2~100 nm左右的Mg-Fe类水滑石纳米片层。
8.由权利要求1所述的用于定向创制植物突变体的方法，其特征在于，步骤2）所述纳米管包括所述纳米管包括单壁纳米管、多壁纳米管。
9.由权利要求1所述的用于定向创制植物突变体的方法，其特征在于，步骤3）所述纳米材料的水溶液与gRNA片段的混合比例为（2~4）：1，混合之后静置过夜。
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