CN113710799A - 用于在LNP中使用的编码CAS9的优化mRNA - Google Patents

Abstract

本披露总体上涉及新颖的基于脂质纳米颗粒(LNP)的组合物，这些组合物可用于例如将位点特异性核酸内切酶或编码该位点特异性核酸内切酶的核酸分子递送至靶细胞中。本披露的一些实施例涉及用于编辑细胞的基因组的组合物和方法，这些组合物和方法包括使该细胞与如本文所述的LNP组合物接触。

Description

用于在LNP中使用的编码CAS9的优化mRNA

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年11月28日提交的美国临时专利申请序列号62/772,278的优先权权益，该临时专利申请通过援引以其全文(包括任何附图)明确并入本文。

序列表的并入

所附序列表中的材料特此通过援引并入本申请中。名为052984-536001WO_SequenceListing_ST25.txt的所附序列表文本文件于2019年11月21日创建，并且是229,434字节。

技术领域

本披露涉及用于将分子(例如，核酸)递送至靶细胞的组合物和方法。此类颗粒可用于例如递送用于基因组编辑的组分。具体地，本申请涉及RNA-脂质纳米颗粒组合物。

背景技术

基因组测序技术和分析方法的最新进展显著加速了对与不同范围的生物学功能和疾病相关联的遗传元件进行鉴定和映射的能力。需要精确的基因组靶向技术来使得通过允许对个体遗传元件进行选择性干扰而能够进行因果性遗传变异的逆向工程化，以及来推进合成生物学、生物技术应用、以及医疗应用。近年来，使用工程化核酸酶的靶向基因组编辑技术已从小众技术进展至由许多生物学研究人员使用的先进方法。此采用已经受到一类新的位点特异性核酸内切酶(包括设计师锌指、转录激活因子样效应物(TALE)、归巢大范围核酸酶)的出现，以及成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)技术的发展的极大推动。

然而，将大生物活性剂(诸如位点特异性核酸内切酶或编码这些位点特异性核酸内切酶的核酸)递送至靶细胞或组织常常受到这些药剂到达靶活细胞或组织的困难的阻碍。具体地，许多生物活性剂向活细胞的运输可能受到细胞的膜***的限制。事实上，已经广泛报道，一类特别难以递送至细胞的生物活性剂是大生物分子，包括蛋白质、基于核酸的治疗剂、及其衍生物。某些核酸和蛋白质在细胞或血浆中仅在有限的持续时间内是稳定的，并且有时还是高度带电的，这会使跨细胞膜的递送复杂化。

因此，需要用于将位点特异性核酸内切酶递送至靶活细胞的组合物和方法。具体地，需要能够改善此类生物分子的稳定性并且允许将此类生物分子高效递送至特别感兴趣的活细胞和组织中的组合物和方法。

发明内容

本部分提供了对本披露的总体概述，而不是其完全范围或其所有特征的全面披露。

本披露涉及新颖的基于脂质纳米颗粒(LNP)、包含长度为约3.8kb或更小的核酸分子的组合物(在本文中被称为“smLNP组合物”)的发明，这些组合物可用于将编码位点特异性核酸内切酶的核酸递送至靶细胞中。在一些实施例中，本披露提供了用于编辑细胞的基因组的方法，这些方法包括使这种细胞与如本文所述的LNP组合物接触。在一些实施例中，本披露提供了用于使用本文所述的组合物和/或方法治疗疾病的方法。

在一个方面中，本披露的一些实施例涉及一种基于脂质的纳米颗粒(LNP)组合物，该基于脂质的纳米颗粒组合物包含：(a)核酸分子，该核酸分子含有编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列；以及(b)一种或多种脂质部分，该一种或多种脂质部分选自下组，该组由以下项组成：氨基脂质、可电离脂质、中性脂质、PEG脂质、辅助脂质、以及胆固醇或胆固醇衍生物；其中该核酸分子的长度是约3.8kb或更小。这种LNP组合物在下文中被称为“smLNP组合物”。

本披露的smLNP组合物的实施例的实现方式可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施例中，该核酸分子的长度是约3.7kb或更小。在一些实施例中，该核酸分子的长度是约3.5kb或更小。在一些实施例中，该核酸分子是信使RNA(mRNA)。在一些实施例中，该编码该位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列可操作地连接至至少一种另外的核苷酸序列。在一些实施例中，该至少一种另外的核苷酸序列包括非翻译末端区(UTR)、共有科扎克(Kozak)信号、编码核定位信号(NLS)的核苷酸序列、编码接头肽的核苷酸序列、编码标签肽的核苷酸序列、或其任何组合。在一些实施例中，该核定位信号(NLS)包括核质蛋白NLS或SV40 NLS。

在本披露的一些实施例中，该位点特异性核酸内切酶是Cas9蛋白或其功能性衍生物。在一些实施例中，该位点特异性核酸内切酶包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下项组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO 5、以及SEQ IDNO:6。在一些实施例中，该核酸分子包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下项组成：SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、以及SEQ ID NO:12。

在本披露的一些实施例中，该编码该位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列经密码子优化以在宿主细胞中表达。在一些实施例中，该宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，该哺乳动物细胞是人类细胞、鼠类细胞、或非人灵长类动物细胞。

在一些实施例中，本披露的smLNP组合物进一步包含CRISPR***的一种或多种另外的组分。在一些实施例中，该CRISPR***的该一种或多种另外的组分包括指导RNA(gRNA)或编码该gRNA的核酸分子。

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物的这些smLNP包含氨基脂质。在一些实施例中，该氨基脂质包括C12-200。

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物的这些smLNP包含结构脂质。在一些实施例中，该结构脂质包括胆固醇。

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物的这些smLNP包含辅助脂质。在一些实施例中，该辅助脂质包括DOPE。

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物的这些smLNP包含PEG脂质。在一些实施例中，该PEG脂质包括PEG-DMPE。

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物的这些smLNP包含C12-200、胆固醇、DOPE、以及PEG-DMPE中的一种或多种。在一些实施例中，这些smLNP包含C12-200、胆固醇、DOPE、以及PEG-DMPE。

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物的这些smLNP与参考LNP组合物的LNP相比具有较低的理化特性变化速率，该参考LNP组合物包含含有编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子，其中该核酸分子大于约4kb。在一些实施例中，该smLNP组合物的这些smLNP具有的理化特性变化速率比该参考LNP组合物的这些LNP的相应速率小至少约5％。在一些实施例中，该smLNP组合物与参考LNP组合物的功能性能降低速率相比具有较低的功能性能降低速率，该参考LNP组合物包含含有编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子，其中该核酸分子大于约4kb。在一些实施例中，该smLNP组合物具有的功能性能降低速率比该参考LNP组合物的相应速率小至少约5％。

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物的这些smLNP具有的平均颗粒直径大于参考LNP组合物的LNP的平均颗粒直径，该参考LNP组合物包含含有编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子，其中该核酸分子大于约4.4kb。在一些实施例中，该smLNP组合物的该smLNP具有的平均颗粒直径比该参考LNP组合物中的LNP的平均颗粒直径大至少约10％(诸如至少约11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、或更大中的任一个)。在本披露的一些实施例中，该参考LNP组合物包含长度为约4.4kb或更多的核酸分子。

在一个方面中，本披露的一些实施例涉及一种用于将核酸分子递送至细胞中的方法，该方法包括使该细胞与如本文披露的smLNP组合物接触，其中该smLNP组合物包含该核酸分子。

在一个方面中，本披露的一些实施例涉及一种用于编辑细胞的基因组的方法，该方法包括向该细胞提供如本文披露的smLNP组合物。

本披露的方法的实施例的实现方式可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施例中，该smLNP组合物的编辑效率大于参考LNP组合物的编辑效率，该参考LNP组合物包含含有编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子，其中该核酸分子大于约4kb。在一些实施例中，该smLNP组合物的编辑效率比该参考LNP组合物的编辑效率大至少5％。在本文披露的方法的一些实施例中，该细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，该哺乳动物细胞是人类细胞、鼠类细胞、或非人灵长类动物细胞。

前述概述仅是说明性的，并非旨在以任何方式进行限制。除了本文所述的说明性实施例和特征之外，本披露的另外方面、实施例、目的和特征将通过附图和详细描述以及权利要求而变得完全清楚。

附图说明

图1A-1E以图形方式汇总了为了表征基于脂质的纳米颗粒(LNP)而进行的实验的结果，这些结果表明了含有SpCas9(即参考LNP)和smCas9(即smLNP)的LNP之间的大小差异。图1A是示出如通过动态光散射(DLS)测定的LNP的颗粒大小的条形图。图1B是示出如通过多分散性指数(PDI)表征的混合LNP群体不均匀性的条形图。图1C是示出如通过纳米颗粒追踪分析(NTA)确定的LNP的大小的条形图。图1D是示出LNP的mRNA包封效率的条形图。图1E是示出颗粒与RNA的比率与颗粒大小的关系分布的图。

图2以图形方式汇总了为了评价通过使用根据本披露的一些实施例(例如，smLNP组合物)的多种示例性mRNA-LNP组合物递送至鼠类细胞的各种位点特异性核酸内切酶的编辑效率而进行的实验的结果。在这些实验中，在MessengerMAX^TM转染之后，通过若干种核酸内切酶靶向鼠类Hepa 1-6细胞中的内源性白蛋白基因座，这些若干种核酸内切酶包括来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的参考Cas9蛋白(SpCas9)，和小Cas9变体(smCas9)；Gib11Spa3、Gib11Spa1、Slu、F8、E2、以及P2H12。

图3以图形方式汇总了为了证明当使用根据本披露的一些实施例的mRNA-LNP组合物递送至细胞中时含有Gib11Spa1 smCas9或Gib11Spa3 smCas9变体的smLNP组合物比含有体内SpCas9的LNP组合物更强效而进行的实验的结果。

图4是当静脉内施用在C57BL/6小鼠中时含有编码smCas9GST3-K、smCas9 GST3、smCas9 GST3-v1、smCas9 GST1-v1的mRNA的smLNP，或含有参考SpCas9的LNP的编辑效率的图形表示。这些实验的靶基因座是白蛋白基因座。每个点表示一只动物的全肝脏TIDE分析。这些结果证明，当在根据本披露的mRNA-LNP配制品中递送时所有前述smCas9变体均比SpCas9表现更佳。

图5是示出当未修饰或用N1-甲基-假尿苷碱基修饰时，含有编码smCas9 GST3-v1、smCas9 GST1-v1的mRNA的smLNP，或含有编码SpCas9的参考mRNA的LNP的***缺失(INDEL)效率的条形图。在此实验中，将mRNA-LNP以2mpk的单剂量静脉内施用在C57BL/6小鼠中。这些结果证明，(i)N1-甲基-假尿苷修饰改善了SpCas9的性能，但未改善GST3-v1或GST1-v1的性能，并且(ii)未修饰和碱基修饰的mRNA作为smCas9 mRNA-LNP均表现良好。

图6以图形方式汇总了为了评价如通过纳米颗粒追踪分析(NTA)确定的储存期间的mRNA-LNP的理化特性(例如，稳定性)变化而进行的实验的结果。在这些实验中，在2℃-8℃下进行7天储存之后确定mRNA-LNP浓度的变化。该图示出了纳米颗粒数量/mL溶液，其中所测试的纳米颗粒的大小在从约30至约500nm的范围内，并且包含不同的RNA组分。这些结果证明，虽然在2℃-8℃下储存7天之后SpCas9的颗粒浓度减小，但对于含有编码每种smCas9变体的mRNA的smLNP未观察到这种浓度降低。

图7以图片方式汇总了为了评价根据本披露的一些示例性实施例的smLNP的形态均一性而进行的实验的结果。在这些实验中，使用低温透射电子显微镜(低温TEM)捕获含有SpCas9 mRNA或smCas9Gib11Spa3 mRNA的LNP的图像。

图8以图形方式汇总了为了证明根据本披露的一些实施例的mRNA-LNP组合物递送至细胞中的SmCas9与SpCas9相比在9天的2℃-8℃储存之后显示出改善的功能稳定性而进行的实验的结果。

具体实施方式

本文提供了用于将CRISPR/Cas基因编辑组分递送至细胞的新颖的基于脂质的纳米颗粒(LNP)组合物和方法。本披露的一些实施例提供了用于使用LNP体内递送基因组编辑组分的组合物和方法，这些LNP包封编码位点特异性核酸内切酶例如像小Cas9(smCas9)核酸内切酶或衍生自一种或多种smCas9的位点特异性核酸内切酶的mRNA。这种编码smCas9或衍生自一种或多种smCas9的位点特异性核酸内切酶的mRNA在本文中也被称为“smCas9mRNA”。不受任何特定理论的束缚，据信与包含长度大于4.0kb的核酸分子的相应LNP组合物相比，较小大小的，例如长度小于约3.8kb的包封mRNA赋予向smLNP中的包装优势。如下文更详细地描述的，当与相应LNP相比时，根据本披露的一些实施例的smLNP已显示出改善的基因组编辑性能和改善的稳定性两者。

预期本文披露的组合物和方法具有显著的商业和/或临床适用性，因为LNP递送技术是许多体内基因编辑方法的关键组成部分。目前在商业和/或临床应用中的大多数LNP***均携带siRNA有效载荷，这些有效载荷可能比mRNA有效载荷更小、更稳定和/或更安全。开发用于递送被认为是大且复杂的有效载荷的编码位点特异性核酸内切酶(诸如Cas9)的核酸(诸如mRNA)的稳定性LNP仍然是本领域的一个挑战。

利用编码smCas9或衍生自一种或多种smCas9的位点特异性核酸内切酶的mRNA作为LNP递送的有效载荷可以使得LNP技术能够用于体内递送基因组编辑核酸酶。本文披露的组合物和方法的关键优势包括但不限于(1)递送编码smCas9 mRNA或衍生自一种或多种smCas9的位点特异性核酸内切酶的mRNA的LNP到目前为止已显示出比递送编码SpCas9的mRNA的LNP更强效，并且此改善的性能可能使得在患者中的给药更安全；(2)这些LNP比SpCas9 mRNA负载的LNP更稳定，因此它们是更可行的药物配制品；并且(3)由于大小较小，编码smCas9或衍生自一种或多种smCas9的位点特异性核酸内切酶的mRNA比SpCas9 mRNA更容易制造。

如下文更详细描述的，可以对基于LNP的递送***进行工程化以在全身性施用后靶向肝脏中的肝细胞。预期将smCas9 mRNA包封到smLNP中不会对肝细胞靶向产生不利影响；实际上，与SpCas9mRNA LNP相比，smCas9 mRNA LNP可能由于增强的LNP稳定性而具有改善的药代动力学。用于递送smCas9 mRNA的LNP技术的关键属性是核酸内切酶表达的瞬时性质(具有预期在注射后1周达到基线的核酸内切酶水平)以及施用多个LNP剂量以滴定到目标效果的能力。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他科学术语或用辞旨在具有与本披露所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不一定应当被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。本文所述或提及的许多技术和程序是由本领域的技术人员充分理解的，并且通常使用常规方法来采用。

除非上下文另外明确指明，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数个指示物。例如，术语“一个/一种细胞”包括一个/一种或多个/多种细胞，包括其混合物。“A和/或B”在本文中用于包括所有以下替代方案：“A”、“B”、“A或B”以及“A和B”。

如本文所用，术语“约”具有其大约的通常含义。如果近似度根据上下文未另外清楚，则“约”意指在所提供值的加或减10％以内，或四舍五入到最接近的有效数字，在所有情况下均包括所提供的值。若提供范围，则它们包括边界值。

应理解，本文所述的披露内容的方面和实施例包括“包含”方面和实施例、“由方面和实施例组成”以及“基本上由方面和实施例组成”。

如本文所用，术语“增强的递送”意指与通过对照LNP将核酸分子递送至感兴趣的靶细胞或组织的水平相比，通过LNP将更多(例如，多至少1.5倍、多至少2倍、多至少3倍、多至少4倍、多至少5倍、多至少6倍、多至少7倍、多至少8倍、多至少9倍、多至少10倍)的核酸分子递送至感兴趣的靶组织(例如，哺乳动物肝脏)。LNP向组织的递送水平可以通过以下方式来测量：(i)将细胞或组织中产生的蛋白质的量与所述细胞或组织的重量进行比较；(ii)将细胞或组织中核酸分子的量与所述细胞或组织的重量进行比较；(iii)将细胞或组织中产生的蛋白质的量与所述细胞或组织中总蛋白质的量进行比较；(iv)或将细胞或组织中多核苷酸的量与所述细胞或组织中总核酸分子的量进行比较。

术语“个体”、“受试者”、“宿主”、以及“患者”在本文中可互换地使用并且是指需要诊断、治疗、或疗法的任何哺乳动物受试者，诸如人类(例如，人类受试者)、非人哺乳动物以及非人灵长类动物，特别是人类。

术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换地使用，并且是指RNA和DNA分子两者，包括包含cDNA、基因组DNA、合成DNA的核酸分子，以及含有核酸类似物的DNA或RNA分子。核酸分子可以是双链或单链的(例如，有义链或反义链)。核酸分子可以含有非常规或修饰的核苷酸。如本文所用，术语“多核苷酸序列”和“核酸序列”可互换地是指多核苷酸分子的序列。本文使用如37CFR§1.822中阐述的核苷酸碱基的命名法。在本披露的一些实施例中，本文披露的smLNP组合物的核酸分子是信使RNA(mRNA)。

如本文所用，术语“重组”核酸分子是指已通过人为干预改变的核酸分子。作为非限制性实例，cDNA是重组DNA分子，如同是已通过一种或多种体外聚合酶反应产生的、或已被附接有接头的、或已整合到载体(诸如克隆载体或表达载体)中的任何核酸分子。作为非限制性实例，重组核酸分子：1)已在体外例如使用核酸分子的化学或酶促技术(例如，通过使用化学核酸合成，或通过使用用于复制、聚合、核酸外切消化、核酸内切消化、连接、逆转录、转录、碱基修饰(包括例如甲基化)、或重组(包括同源重组和位点特异性重组)的酶)合成或修饰；2)包括在自然界中并非联接的联接核苷酸序列；3)已使用分子克隆技术进行工程化，使得它相对于天然存在的核酸分子序列缺少一个或多个核苷酸；和/或4)已使用分子克隆技术进行操纵，使得它相对于天然存在的核酸序列具有一个或多个序列变化或重排。

如本文所用，术语“可操作地连接”表示两个或多个元件(例如，多肽序列或多核苷酸序列)之间的允许它们以其预期方式操作的物理或功能性连接。例如，感兴趣的多核苷酸与调控序列(例如，启动子)之间的可操作连接是允许感兴趣的多核苷酸表达的功能性连接。在这个意义上，术语“可操作地连接”是指将调控区与待转录的编码序列定位成使得调控区有效地调控感兴趣的编码序列的转录或翻译。在本文披露的一些实施例中，术语“可操作地连接”表示这样的构型，其中将调控序列相对于编码多肽或功能性RNA的序列置于适当的位置处，使得控制序列指导或调控编码多肽的mRNA、多肽、和/或功能性RNA的表达或细胞定位。因此，如果启动子可以介导核酸序列的转录，则该启动子与核酸序列可操作连接。可操作连接的元件是连续的或不连续的。

如本文所用，术语“重组”是指两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程。如本文所用，“同源定向修复(HDR)”是指例如在细胞中双链断裂修复期间发生的特殊化形式的DNA修复。此过程需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子来为“靶”分子(例如，经历双链断裂的分子)的修复提供模板，并且导致遗传信息从供体转移至靶标。如果供体多核苷酸不同于靶分子，并且将供体多核苷酸的部分或全部序列掺入到靶DNA中，则同源定向修复可能导致靶分子序列的改变(例如，***、缺失、突变)。在一些实施例中，将供体多核苷酸、供体多核苷酸的一部分、供体多核苷酸的拷贝、或供体多核苷酸的拷贝的一部分整合到靶DNA中。

术语“非同源末端连接(NHEJ)”是指通过在不需要同源模板的情况下将断裂末端彼此直接连接来修复DNA中的双链断裂(与需要同源序列以指导修复的同源定向修复形成对照)。NHEJ常常导致双链断裂位点附近的核苷酸序列丧失(缺失)。

“核酸酶”和“核酸内切酶”在本文中可互换地用于意指对多核苷酸裂解具有核苷酸内切催化活性的酶。该术语包括位点特异性核酸内切酶，诸如设计者锌指、转录激活因子样效应物(TALE)、归巢大范围核酸酶、以及成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)***的位点特异性核酸内切酶(例如像Cas蛋白)。

如本文所用，术语“位点特异性修饰酶”或“RNA结合位点特异性修饰酶”是指结合RNA并且靶向至特定DNA序列的多肽，诸如Cas9多肽。如本文所述的位点特异性修饰酶通过其结合的RNA分子靶向至特定DNA序列。RNA分子包含与靶DNA内的靶序列结合、杂交、或互补的序列，从而将结合的多肽靶向至靶DNA内的特定位置(靶序列)。

所谓“裂解”意指DNA分子的共价主链的断裂。裂解可以通过多种方法起始，这些方法包括但不限于对磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链裂解和双链裂解两者都是可能的，并且作为两个不同的单链裂解事件的结果可以发生双链裂解。DNA裂解可以导致产生平头末端或交错末端。在一些实施例中，将包含指导RNA和位点特异性修饰酶的复合体用于靶向的双链DNA裂解。

所谓核酸酶的“裂解结构域”或“活性结构域”或“核酸酶结构域”意指核酸酶内对DNA裂解具有催化活性的多肽序列或结构域。裂解结构域可以包含在单一多肽链中，或者裂解活性可以由两个(或更多个)多肽的缔合产生。单一核酸酶结构域可以由给定多肽内的多于一个分离的氨基酸段组成。

如本文所用，术语“治疗(treatment/treating)”等通常意指获得所期望的药理学和/或生理学效应。该效应就完全或部分预防疾病或其症状而论是预防性的，和/或就对于疾病和/或可归因于该疾病的不良影响的部分或完全治愈而论是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物中疾病或症状的任何治疗，并且包括：(a)预防该疾病或症状在有获得该疾病或症状的倾向但尚未被诊断为患有该疾病或症状的受试者中发生；(b)抑制该疾病或症状，例如，遏制其发展；或(c)减轻该疾病，例如引起该疾病的消退。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。特别感兴趣的是正在发生的疾病的治疗，其中治疗稳定或减少患者的不期望的临床症状。期望在受影响的组织中完全丧失功能之前进行这种治疗。将期望在疾病的有症状阶段期间以及在一些情况下在疾病的有症状阶段之后施用疗法。

标题例如(a)、(b)、(i)等仅仅是为了便于阅读说明书和权利要求。说明书或权利要求中标题的使用不要求步骤或元素按字母或数字顺序或者它们呈现的顺序进行。

本披露的基于脂质的纳米颗粒组合物

在一个方面中，本文提供了一种基于脂质的纳米颗粒(LNP)组合物，该基于脂质的纳米颗粒组合物包含：(a)核酸分子，该核酸分子含有编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列；以及(b)一种或多种脂质部分，该一种或多种脂质部分选自下组，该组由以下项组成：氨基脂质、可电离脂质、中性脂质、PEG脂质、辅助脂质、以及胆固醇或胆固醇衍生物；其中该核酸分子的长度是约3.8kb或更小(smLNP)。在一些实施例中，该编码该位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列可操作地连接至至少一种另外的核苷酸序列。在本披露的一些实施例中，该位点特异性核酸内切酶是Cas9蛋白或其功能性衍生物。在本披露的一些实施例中，该编码该位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列经密码子优化以在宿主细胞中表达。在一些实施例中，本披露的smLNP组合物进一步包含CRISPR***的一种或多种另外的组分。在一些实施例中，该CRISPR***的该一种或多种另外的组分包括指导RNA(gRNA)或编码该gRNA的核酸分子。

核酸分子

根据本披露的smLNP组合物的一些实施例的核酸分子的长度是约3.8kb、约3.7kb、约3.6kb、约3.5kb、约3.4kb、约3.3kb、约3.2kb、约3.1kb、或约3.0kb，包括这些值之间的任何范围。在一些实施例中，核酸分子的长度是约2.9kb、约2.8kb、约2.7kb、约2.6kb、约2.5kb、约2.4kb、约2.3kb、约2.2kb、约2.1kb、或约2.0kb，包括这些值之间的任何范围。在一些实施例中，核酸分子的长度少于约3.8kb、少于约3.7kb、少于约3.6kb、少于约3.5kb、少于约3.4kb、少于约3.3kb、少于约3.2kb、少于约3.1kb、或少于约3.0kb。在一些实施例中，核酸分子的长度少于约2.9kb、少于约2.8kb、少于约2.7kb、少于约2.6kb、少于约2.5kb、少于约2.4kb、少于约2.3kb、少于约2.2kb、少于约2.1kb、或少于约2.0kb。在一些实施例中，smLNP组合物的核酸分子的长度在约3.8kb与约2.0kb之间，例如在约3.7kb与约2.5kb之间、在约3.5kb与约2.6kb之间、在约3.2kb与约2.4kb之间，或在约3.0kb与约2.0kb之间，例如在约2.9kb至2.2kb之间、在约2.8kb与约2.3kb之间、在约2.7kb与约2.4kb之间、在约2.6kb与约2.5kb之间、或在约3.0kb与约2.5kb之间。在一些实施例中，smLNP组合物的核酸分子的长度是约3.5kb。

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列可操作地连接至至少一种另外的核苷酸序列。在一些实施例中，至少一种另外的核苷酸序列包括非翻译末端区(UTR)、共有科扎克信号、编码核定位信号(NLS)的核苷酸序列、编码接头肽的核苷酸序列、编码标签肽的核苷酸序列、或其任何组合。在一些实施例中，共有科扎克信号促进mRNA与核糖体的初始结合，从而增强其向多肽产物的翻译。

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，smLNP组合物的核酸分子进一步包含3'和/或5'非翻译区(UTR)。在一些实施例中，3'或5'UTR衍生自人基因序列。非限制性示例性3'和5'UTR包括a-和β-球蛋白、白蛋白、HSD17B4、以及真核延伸因子la。此外，也可以使用病毒衍生的5'和3'UTR并且这些UTR包含正痘病毒和巨细胞病毒UTR序列。在一些实施例中，5’UTR包含SEQ ID NO:20的多核苷酸序列。在一些实施例中，3’UTR包含SEQ IDNO:21的多核苷酸序列。在一些实施例中，mRNA包含5'帽，诸如m7G(5')ppp(5')N。此外，此帽是其中核苷酸N不含有2'OMe的帽-0、或其中核苷酸N含有2'OMe的帽-1、或其中核苷酸N和N+l含有2'OMe的帽-2。此帽还可以具有如通过抗反向帽类似物(ARCA)掺入的结构m2 7'3“G(5')N，并且还可以包括相似的帽-0、帽-1、以及帽-2等结构。在一些实施例中，5'帽可以调控核输出；防止核酸外切酶的降解；促进翻译；以及促进5'近侧内含子切除。帽的稳定化元件包括硫代磷酸酯键联、硼烷磷酸酯修饰、以及亚甲基桥。此外，帽还可以含有作为真核翻译起始因子4E(eIF4E)的结合元件发挥作用的非核酸实体。在一些实施例中，mRNA包含多聚(A)尾。此尾的长度可以是约40至约300个核苷酸。在一些实施例中，尾的长度是约40至约100个核苷酸。在一些实施例中，尾的长度是约100至约300个核苷酸。在一些实施例中，尾的长度是约100至约200个核苷酸。在一些实施例中，尾的长度是约50至约200个核苷酸。在一些实施例中，尾的长度是约50至约250个核苷酸。在一些实施例中，尾的长度是约100、150、或200个核苷酸。多聚(A)尾可以含有防止核酸外切酶降解的修饰，包括硫代磷酸酯键联和对核碱基的修饰。此外，多聚(A)尾可以含有3'“帽”，该帽可以包含修饰的或非天然的核碱基或其他合成部分。

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，smLNP组合物的核酸分子包含编码核定位信号(NLS)的核苷酸序列。在一些实施例中，NLS包括核质蛋白NLS或SV40NLS。在一些实施例中，核质蛋白NLS包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施例中，核质蛋白NLS由SEQ ID NO:22的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，SV40 NLS包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列。在一些实施例中，SV40 NLS由SEQ ID NO:24的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，核酸分子包含编码核质蛋白NLS的核苷酸序列和编码SV40 NLS的核苷酸序列。

如本文所用，术语“定点核酸内切酶”是指在基因组编辑中用于裂解基因组DNA的核酸酶。

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，smLNP组合物的核酸分子(例如，RNA，诸如mRNA)包含编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列，该位点特异性核酸内切酶是Cas蛋白(诸如Cas9)或其功能性衍生物。在一些实施例中，Cas蛋白是天然存在的Cas蛋白的“功能性衍生物”。术语天然序列多肽的“功能性衍生物”是指与天然序列多肽具有共同的定性生物学特性的化合物。如本文所用，“功能性衍生物”包括但不限于天然序列的片段和天然序列多肽及其片段的衍生物，条件是它们与相应的天然序列多肽具有共同的生物学活性。本文设想的非限制性示例性生物学活性是功能性衍生物将DNA底物水解成片段的能力。术语“衍生物”涵盖多肽的氨基酸序列变体、共价修饰、及其融合体。

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，本文披露的smLNP组合物的核酸分子组分(例如，RNA，诸如mRNA)包含编码衍生自一种或多种smCas9的位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列。Gib11Spa1核酸内切酶，该Gib11Spa1核酸内切酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的变体。在一些实施例中，位点特异性核酸内切酶是Gib11Spa3核酸内切酶，该Gib11Spa3核酸内切酶包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的变体。在一些实施例中，位点特异性核酸内切酶是E2Cas9核酸内切酶，该E2Cas9核酸内切酶包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的变体。在一些实施例中，位点特异性核酸内切酶是F8Cas9核酸内切酶，该F8Cas9核酸内切酶包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的变体。在一些实施例中，位点特异性核酸内切酶是P2H12Cas9核酸内切酶，该P2H12Cas9核酸内切酶包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其与SEQID NO:5具有至少90％序列同一性的变体。在一些实施例中，位点特异性核酸内切酶是SluCas9核酸内切酶，该SluCas9核酸内切酶包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其与SEQ IDNO:6具有至少90％序列同一性的变体。

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，smLNP组合物的核酸分子是编码Cas核酸酶的mRNA，该mRNA在本文中也称为Cas核酸酶mRNA。可以修饰mRNA以改善稳定性和/或免疫原性特性。可以对mRNA内的一个或多个核苷进行修饰。对mRNA核碱基的化学修饰的实例包括假尿苷、1-甲基-假尿苷(或N1-甲基假尿苷)、5-甲氧基尿苷、以及5-甲基-胞苷。在一些实施例中，mRNA含有N1-甲基假尿苷碱基修饰。在一些实施例中，mRNA含有假尿苷碱基修饰。设想了另外的已知改善稳定性、表达、以及免疫原性的修饰。编码Cas核酸酶的mRNA可以经密码子优化以在特定细胞类型(诸如真核细胞、哺乳动物细胞、或更具体地人类细胞)中表达。在一些实施例中，mRNA编码人密码子优化的Cas9核酸酶。在一些实施例中，通过尿苷耗尽进一步修饰mRNA。在一些实施例中，通过尿苷耗尽和密码子优化(例如，使用

软件平台)两者修饰mRNA。在一些实施例中，纯化mRNA。在一些实施例中，使用沉淀法纯化mRNA。在一些实施例中，使用基于色谱的方法，诸如基于HPLC的方法或等同方法纯化mRNA。在一些实施例中，用沉淀方法和基于HPLC的方法两者纯化mRNA。

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，位点特异性核酸内切酶包含与具有选自下组的氨基酸序列的位点特异性核酸内切酶具有至少95％同一性的氨基酸序列，该组由以下项组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO 5、以及SEQ ID NO:6。如在两种或更多种核酸或蛋白质的上下文中使用的术语“百分比同一性”是指如使用具有下文所述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法，或通过手动比对和目视检查所测量的，两个或更多个序列或亚序列相同或具有规定百分比的相同核苷酸或氨基酸(例如，当在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应性时，在规定区域上约60％序列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高同一性)。参见例如ncbi.nlm.nih.gov/BLAST处的NCBI网站。此类序列然后被说成是“基本上相同的”。此定义还是指、或适用于测试序列的互补序列。此定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。序列同一性典型地存在于长度为至少约20个氨基酸或核苷酸的区域上，或存在于长度为10-100个氨基酸或核苷酸的区域上，或存在于给定序列的整个长度上。

如果必要，可以使用公开的技术和广泛可用的计算机程序计算序列同一性，这些计算机程序诸如GCS程序包(Devereux等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]12:387,1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人,J.Molecular Biol.[分子生物杂志]215:403,1990)。可以使用序列分析软件，诸如威斯康星大学生物技术中心(University ofWisconsin Biotechnology Center)(大学大街1710号(1710University Avenue)，威斯康星州麦迪逊(Madison，Wis.)53705)处的遗传学计算机组的序列分析软件包，以其默认参数来测量序列同一性。

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，位点特异性核酸内切酶包含与选自下组的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98、或至少99％同一性的氨基酸序列，该组由以下项组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO 5、以及SEQ ID NO:6。在一些实施例中，位点特异性核酸内切酶包含与选自下组的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列，该组由以下项组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO 5、以及SEQ ID NO:6。

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，smLNP组合物的核酸分子包含与选自下组的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列，该组由以下项组成：SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、以及SEQ ID NO:12。在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物的核酸分子包含与选自下组的核苷酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的核苷酸序列，该组由以下项组成：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、以及SEQ IDNO:12。在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物的核酸分子包含与选自下组的核苷酸序列具有100％同一性的核苷酸序列，该组由以下项组成：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、以及SEQ ID NO:12。

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，smLNP组合物的核酸分子编码包含SEQ ID NO:35、37、39、41、43、45、47、以及49中任一个的氨基酸序列的多肽。

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，smLNP组合物的核酸分子包含SEQ ID NO:34、36、38、40、42、44、46、以及48中任一个的多核苷酸序列。

核苷酸序列的序列优化

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，smLNP组合物的核酸分子(例如，RNA，诸如mRNA)包含经序列优化的核苷酸序列。在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物的核酸分子包含编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列，该核苷酸序列经序列优化以在靶细胞中表达。编码位点特异性核酸内切酶的序列优化的核苷酸序列(例如，密码子优化的mRNA序列)典型地是相对于参考序列(例如，编码位点特异性核酸内切酶的野生型核苷酸序列)包含至少一个同义核碱基取代的序列。序列优化的核苷酸序列可以在序列上与参考序列部分或完全不同。例如，编码由TCT密码子统一编码的聚丝氨酸的参考序列可以通过使其100％的核碱基被取代来进行序列优化(对于每个密码子，位置1中的T被A替代，位置2中的C被G替代，并且位置3中的T被C替代)以产生编码将由AGC密码子统一编码的聚丝氨酸的序列。从参考聚丝氨酸核酸序列与序列优化的聚丝氨酸核酸序列之间的全局成对比对获得的序列同一性百分比将是0％。然而，来自两个序列的蛋白质产物将是100％相同的。一些序列优化(有时也被称为密码子优化)方法在本领域中是已知的，并且可用于实现一种或多种所期望的结果。这些结果可以包括例如匹配某些组织靶标和/或宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠；尿苷耗尽；偏向G/C含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；使可能损害基因构建或表达的串联重复序列密码子或碱基运行最小化；定制转录和翻译控制区；***或除去蛋白质运输序列；在编码的蛋白质中除去/添加翻译后修饰位点(例如，糖基化位点)；添加、除去或改组蛋白质结构域；***或缺失限制性位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调整翻译速率以使蛋白质的各个结构域正确折叠；和/或减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。

序列优化工具、算法以及服务在本领域中是已知的。非限制性实例包括来自GeneArt(生命技术公司(Life Technologies))、DNA2.0(加州门洛帕克公司(Menlo ParkCA))、

和/或专有方法的服务。在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物的核酸分子(例如，RNA，诸如mRNA)包含编码位点特异性核酸内切酶或其功能衍生物的序列优化的核苷酸序列(例如，ORF)，其中由序列优化的核苷酸序列编码的位点特异性核酸内切酶或其功能衍生物具有改善的特性(例如，与由未经序列优化的参考核苷酸序列编码的位点特异性核酸内切酶或其功能衍生物相比)，例如改善的与体内施用之后的表达功效相关的特性。此类特性可以包括但不限于改善核酸稳定性(例如，mRNA稳定性)、增加靶组织中的翻译功效、减少表达的截短蛋白质的数量、改善表达的蛋白质的折叠或防止其错误折叠、降低表达的产物的毒性、减少由表达的产物引起的细胞死亡、以及增加和/或减少蛋白质聚集。在一些实施例中，序列优化的核苷酸序列经密码子优化以在人类受试者中表达，具有避免或减少本领域中已知的一个或多个问题的结构和/或化学特征，例如可用于优化基于核酸的治疗剂的配制和递送同时保留结构和功能完整性的特征；克服表达的阈值；改善表达率、半衰期和/或蛋白质浓度；优化蛋白质定位；并且避免有害的生物应答，诸如免疫应答和/或降解途径。在一些实施例中，对序列优化的核苷酸序列进行尿苷耗尽。在一些实施例中，对序列优化的核苷酸序列进行密码子优化和尿苷耗尽。

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，smLNP组合物的核酸分子(例如，RNA，诸如mRNA)包含选自下组的优化序列，该组由以下项组成：SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、以及SEQ ID NO:19。

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，smLNP组合物的核酸分子(例如，RNA，诸如mRNA)包含经密码子优化以在哺乳动物中表达的核苷酸序列。在一些实施例中，该哺乳动物细胞是人类细胞、鼠类细胞、或非人灵长类动物(NHP)细胞。

CRISPR/Cas***的另外组分

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，smLNP组合物进一步包含CRISPR/Cas***的一种或多种另外的组分。原则上，关于CRISPR/Cas***的一种或多种另外的组分没有特别限制，因此该一种或多种另外的组分可以选自CRISPR***的任何已知组分。在一些实施例中，CRISPR***的该一种或多种另外的组分包括指导RNA(gRNA)。在一些实施例中，CRISPR***的该一种或多种另外的组分包括编码gRNA的核酸分子。

gRNA至少具有与感兴趣的靶核酸序列杂交的间隔子序列、和CRISPR重复序列(这种CRISPR重复序列也被称为“tracr伴侣序列”)。在II型***中，gRNA还具有称为tracrRNA序列的第二RNA。在II型指导RNA(gRNA)中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列彼此杂交形成双链体。双链体结合位点特异性多肽，使得指导RNA和位点特异性核酸内切酶形成复合体。在这种情况下，指导RNA和位点特异性核酸内切酶可以形成核糖核蛋白复合体(例如，经由非共价相互作用结合)。复合体的指导RNA通过包含与靶DNA序列互补的核苷酸序列而为复合体提供靶特异性，并且复合体的位点特异性核酸内切酶提供核酸酶内切活性。换句话讲，位点特异性核酸内切酶借助于其与指导RNA的蛋白结合区段的缔合被指导至靶DNA序列(例如，染色体核酸中的靶序列；染色体外核酸中的靶序列，例如游离型核酸、小环等；线粒体核酸中的靶序列；叶绿体核酸中的靶序列；质粒中的靶序列；等等)。

指导RNA可以是单分子指导RNA，在本文中也称为单指导RNA(sgRNA)。在一些实施例中，指导RNA可以包含两个RNA分子，并且被称为“双指导RNA”或“dgRNA”。在一些实施例中，dgRNA可以包含含有CRISPR RNA(crRNA)的第一RNA分子和含有tracr RNA的第二RNA分子。第一RNA分子和第二RNA分子可以经由crRNA与tracr RNA上的旗杆之间的碱基配对形成RNA双链体。双分子指导RNA具有两条RNA链。第一条链在5'至3'方向上具有任选的间隔子延伸序列、间隔子序列以及最小CRISPR重复序列。第二条链具有最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3'tracrRNA序列以及任选的tracrRNA延伸序列。

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，指导RNA包含单RNA分子并且被称为“单指导RNA”或“sgRNA”。在一些实施例中，sgRNA包含与tracr RNA共价连接的crRNA。在一些实施例中，crRNA和tracr RNA经由接头共价连接。在一些实施例中，单分子指导RNA经由crRNA与tracr RNA上的旗杆之间的碱基配对包含茎-环结构。

II型***中的单分子指导RNA(sgRNA)在5'至3'方向上具有任选的间隔子延伸序列、间隔子序列、最小CRISPR重复序列、单分子指导接头、最小tracrRNA序列、3'tracrRNA序列以及任选的tracrRNA延伸序列。任选的tracrRNA延伸序列可以具有为指导RNA贡献另外的功能(例如，稳定性)的元件。单分子指导接头将最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列连接起来以形成发夹结构。任选的tracrRNA延伸序列具有一个或多个发夹。

在一些实施例中，根据本文所述的任一种smLNP组合物，如本文披露的smLNP组合物的核酸分子是编码Cas核酸酶的mRNA，该mRNA在本文中也称为Cas核酸酶mRNA。可以修饰mRNA以改善稳定性和/或免疫原性特性。可以对mRNA内的一个或多个核苷进行修饰。对mRNA核碱基的化学修饰的实例包括假尿苷、1-甲基-假尿苷(或N1-甲基假尿苷)、5-甲氧基尿苷、以及5-甲基-胞苷。在一些实施例中，mRNA含有N1-甲基假尿苷碱基修饰。在一些实施例中，mRNA含有假尿苷碱基修饰。设想了另外的已知改善稳定性、表达、以及免疫原性的修饰。编码Cas核酸酶的mRNA可以经密码子优化以在特定细胞类型(诸如真核细胞、哺乳动物细胞、或更具体地人类细胞)中表达。在一些实施例中，mRNA编码人密码子优化的Cas9核酸酶。在一些实施例中，通过尿苷耗尽进一步修饰mRNA。在一些实施例中，通过尿苷耗尽和密码子优化(例如，使用

软件平台)两者修饰mRNA。在一些实施例中，纯化mRNA。在一些实施例中，使用沉淀方法(例如，LiCl沉淀、醇沉淀、或等同方法，例如，如本文所述的)纯化mRNA。在一些实施例中，使用基于色谱的方法，诸如基于HPLC的方法或等同方法(例如，如本文所述的)纯化mRNA。在一些实施例中，用沉淀方法(例如，LiCl沉淀)和基于HPLC的方法两者纯化mRNA。

氨基脂质

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物可以包含一种或多种氨基脂质。术语“氨基脂质”和“阳离子脂质”在本文中可互换地用于包括具有一个、两个、三个、或更多个脂肪酸或脂肪烷基链和pH可滴定的氨基头部基团(例如，烷基氨基或二烷基氨基头部基团)的那些脂质及其盐。原则上，关于本文披露的smLNP组合物的氨基脂质没有特别限制。阳离子脂质典型地在低于阳离子脂质的pKa的pH下质子化(即带正电)，并且在高于pKa的pH下基本上是中性的。本披露的阳离子脂质也可以称为可滴定的阳离子脂质。在一些实施例中，该一种或多种阳离子脂质包括：可质子化叔胺(例如，pH可滴定的)头部基团；烷基链，其中每个烷基链独立地具有0至3(例如，0、1、2、或3)个双键；以及头部基团与烷基链之间的醚、酯、或缩酮键联。此类阳离子脂质包括但不限于DSDMA、DODMA、DOTMA、DLinDMA、DLenDMA、γ-DLenDMA、DLin-K-DMA、DLin-K-C2-DMA(也称为DLin-C2K-DMA、XTC2、以及C2K)、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLen-C2K-DMA、y-DLen-C2-DMA、C12-200、cKK-E12、cKK-A12、cKK-O12、DLin-MC2-DMA(也称为MC2)、以及DLin-MC3-DMA(也称为MC3)。

辅助脂质

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物包含一种或多种辅助脂质。如本文所用，术语“辅助脂质”是指增强转染(例如，包含含有编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子的纳米颗粒的转染)的脂质。原则上，关于本文披露的smLNP组合物的辅助脂质没有特别限制。不受任何特定理论的束缚，据信辅助脂质增强转染的机制包括增强颗粒稳定性。在一些实施例中，辅助脂质增强膜融合性(fusogenicity)。通常，本文披露的smLNP组合物的辅助脂质可以是本领域中已知的任何辅助脂质。适于本披露的组合物和方法的辅助脂质的非限制性实例包括类固醇、甾醇、以及烷基间苯二酚。特别适用于本披露的辅助脂质包括但不限于饱和的磷脂酰胆碱(PC)诸如二硬脂酰基-PC(DSPC)和二棕榈酰基-PC(DPPC)、二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)、胆固醇、5-十七烷基间苯二酚、以及胆固醇半琥珀酸酯。在一些实施例中，smLNP组合物的辅助脂质包括胆固醇。

结构脂质

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物可以包含一种或多种结构脂质。如本文所用，术语“结构脂质”是指甾醇并且也是指含有甾醇部分的脂质。不受任何特定理论的束缚，据信本披露的smLNP中结构脂质的掺入可以有助于缓和颗粒中其他脂质的聚集。结构脂质可以选自下组，该组包括但不限于胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、番茄苷、熊果酸、α-生育酚、霍烷、植物甾醇、类固醇及其混合物。在一些实施例中，结构脂质是胆固醇。

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物中结构脂质(例如，甾醇诸如胆固醇)的量在从约10mol％至约80mol％、从约20mol％至约70mol％、从约30mol％至约60mol％、或从约40mol％至约50mol％的范围内。在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物中结构脂质的量在从约25mol％至约30mol％、从约30mol％至约35mol％、或从约35mol％至约40mol％的范围内。在一些实施例中，本文披露的脂质组合物中结构脂质(例如，甾醇诸如胆固醇)的量是约24mol％、约29mol％、约34mol％、或约39mol％。在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物中结构脂质的量是至少约10mol％、20mol％、25mol％、30mol％、35mol％、40mol％、45mol％、50mol％、55mol％、60mol％、65mol％、70mol％、75mol％、或80mol％。

磷脂

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物包含一种或多种磷脂。在一些实施例中，磷脂选自下组，该组由以下项组成：1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油基-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(ME16:0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂、及其任何混合物。

可电离脂质

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物包含一种或多种可电离脂质。原则上，关于本文披露的smLNP组合物的可电离脂质没有特别限制。在一些实施例中，该一种或多种可电离脂质选自下组，该组由以下项组成：3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三十二烷基-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油烯基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8-[

-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[

-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))、以及(2S)-2-({8-[

-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。

PEG-脂质

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物包含一种或多种聚乙二醇(PEG)脂质。术语“PEG-脂质”是指聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。此类脂质也被称为PEG化脂质。PEG-脂质的非限制性实例包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺以及PEG修饰的1,2-二酰氧基丙-3-胺。例如，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、或PEG-DSPE脂质。在一些实施例中，PEG-脂质包括但不限于1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二甾基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈酰基、PEG-二油烯基、PEG-二硬脂酰基、PEG-二酰基甘油酰胺(diacylglycamide)(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)、或PEG-l,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在一个实施例中，PEG-脂质选自下组，该组由以下项组成：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油、及其混合物。在一些实施例中，PEG-脂质的脂质部分包括具有从约C₁₄至约C₂₂、优选地从约C₁₄至约C₁₆的长度的那些。在一些实施例中，PEG部分(例如mPEG-NH₂)具有约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿的大小。在一些实施例中，PEG-脂质是PEG2k-DMG。在一些实施例中，smLNP组合物的该一种或多种PEG脂质包括PEG-DMPE。在一些实施例中，smLNP组合物的该一种或多种PEG脂质包括PEG-DMG。

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物中PEG-脂质的量在从约0.1mol％至约5mol％、从约0.5mol％至约5mol％、从约1mol％至约5mol％、从约1.5mol％至约5mol％、从约2mol％至约5mol％mol％、从约0.1mol％至约4mol％、从约0.5mol％至约4mol％、从约1mol％至约4mol％、从约1.5mol％至约4mol％、从约2mol％至约4mol％、从约0.1mol％至约3mol％、从约0.5mol％至约3mol％、从约1mol％至约3mol％、从约1.5mol％至约3mol％、从约2mol％至约3mol％、从约0.1mol％至约2mol％、从约0.5mol％至约2mol％、从约1mol％至约2mol％、从约1.5mol％至约2mol％、从约0.1mol％至约1.5mol％、从约0.5mol％至约1.5mol％、或从约1mol％至约1.5mol％的范围内。在一些实施例中，本文披露的脂质组合物中PEG-脂质的量是约2mol％。在一些实施例中，本文披露的脂质组合物中PEG-脂质的量是约1.5mol％。

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物中PEG-脂质的量是至少约0.1mol％、0.2mol％、0.3mol％、0.4mol％、0.5mol％、0.6mol％、0.7mol％、0.8mol％、0.9mol％、1.0mol％、1.1mol％、1.2mol％、1.3mol％、1.4mol％、1.5mol％、1.6mol％、1.7mol％、1.8mol％、1.9mol％、2.0mol％、2.1mol％、2.2mol％、2.3mol％、2.4mol％、2.5mol％、2.6mol％、2.7mol％、2.8mol％、2.9mol％、3.0mol％、3.1mol％、3.2mol％、3.3mol％、3.4mol％、3.5mol％、3.6mol％、3.7mol％、3.8mol％、3.9mol％、4.0mol％、4.1mol％、4.2mol％、4.3mol％、4.4mol％、4.5mol％、4.6mol％、4.7mol％、4.8mol％、4.9mol％、5.0mol％、5.1mol％、5.2mol％、5.3mol％、5.4mol％、5.5mol％、5.6mol％、5.7mol％、5.8mol％、5.9mol％、或6mol％。PEG-脂质在本领域中是已知的，其另外的信息可见于例如美国专利号8158601和国际公开号WO 2015/130584 A2中。

在一些具体实施例中，本文所述的smLNP组合物包含以下脂质：C12-200氨基脂质；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；胆固醇；以及PEG-DMPE。在一些实施例中，本文所述的LNP组合物包含以下脂质：DLin-M-C3-DMA(也称为MC3)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、和/或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。

本文披露的smLNP组合物的脂质组分与编码位点特异性核酸内切酶的核酸分子之间的比率可以在从约10:1至约100:1(wt/wt)，例如像从10:1至约90:1、从20:1至约80:1、从30:1至约70:1、从40:1至约60:1、或从10:1至约50:1，例如像从10:1至约45:1、从15:1至约40:1、从20:1至约35:1、从25:1至约30:1、或从10:1至约40:1、从15:1至约50:1、从20:1至约30:1、或从10:1至约30:1的范围内。在一些实施例中，脂质组分与编码位点特异性核酸内切酶的核酸分子之间的比率是约10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1、100:1。在一些实施例中，脂质组分与编码位点特异性核酸内切酶的核酸分子的wt/wt比是约20:1或约15:1。

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物可以含有各自编码位点特异性核酸内切酶的多于一种的核酸分子。例如，本文披露的药物组合物可以含有各自编码位点特异性核酸内切酶的两种或更多种核酸分子(例如，RNA，例如mRNA)。在一些实施例中，本文所述的smLNP组合物可以以下述脂质:多核苷酸重量比包含核酸分子(例如，mRNA)：5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1或70:1，或这些比率的范围或这些比率中的任一种，诸如但不限于5:1至约10:1、从约5:1至约15:1、从约5:1至约20:1、从约5:1至约25:1、从约5:1至约30:1、从约5:1至约35:1、从约5:1至约40:1、从约5:1至约45:1、从约5:1至约50:1、从约5:1至约55:1、从约5:1至约60:1、从约5:1至约70:1、从约10:1至约15:1、从约10:1至约20:1、从约10:1至约25:1、从约10:1至约30:1、从约10:1至约35:1、从约10:1至约40:1、从约10:1至约45:1、从约10:1至约50:1、从约10:1至约55:1、从约10:1至约60:1、从约10:1至约70:1、从约15:1至约20:1、从约15:1至约25:1、从约15:1至约30:1、从约15:1至约35:1、从约15:1至约40:1、从约15:1至约45:1、从约15:1至约50:1、从约15:1至约55:1、从约15:1至约60:1或从约15:1至约70:1。

在一些实施例中，本文所述的脂质纳米颗粒以下述浓度包含核酸分子：从大约0.1mg/mL至2mg/mL，诸如但不限于0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL、2.0mg/mL或大于2.0mg/mL。

LNP的制备

本披露的脂质纳米颗粒(其中核酸分子(例如，mRNA)包埋在颗粒的脂质部分内并且受到保护而免于降解)可以通过本领域中已知的任何方法形成，该任何方法包括但不限于连续混合方法、直接稀释方法、以及在线稀释方法。适于制备本文所述的脂质纳米颗粒的另外技术和方法包括凝聚、微乳液、超临界流体技术、相转变温度(PIT)技术。

在一些实施例中，本披露的smLNP经由连续混合方法产生，该连续混合方法例如是包括以下步骤的过程：在第一贮存器中提供包含核酸分子(例如，mRNA)的水性溶液，在第二贮存器中提供有机脂质溶液(其中有机脂质溶液中存在的脂质溶解在有机溶剂，例如低级烷醇诸如乙醇中)，并且将水性溶液与有机脂质溶液混合，使得有机脂质溶液与水性溶液混合以基本上瞬时产生脂质囊泡(例如，脂质体)，从而将核酸分子包封在脂质囊泡内。用于进行此方法的此过程和设备在本领域中是已知的。在这方面更多的信息可见于例如美国专利公开号20040142025中，该专利的披露内容通过援引并入本文。将脂质和缓冲溶液连续引入至混合环境中(诸如引入在混合室中)的动作导致用缓冲溶液连续稀释脂质溶液，从而在混合时基本上瞬时产生脂质囊泡。通过将包含核酸分子的水性溶液与有机脂质溶液混合，有机脂质溶液在缓冲溶液(例如，水性溶液)的存在下经历连续逐步稀释，从而产生核酸-脂质颗粒。

在一些实施例中，本披露的smLNP经由直接稀释方法产生，该直接稀释方法包括形成脂质囊泡(例如，脂质体)溶液，并且立即直接将脂质囊泡溶液引入至含有受控量的稀释缓冲液的收集容器中。在一些实施例中，收集容器包括一个或多个元件，该一个或多个元件被配置成用于搅拌收集容器的内容物以促进稀释。在一些实施例中，收集容器中存在的稀释缓冲液的量基本上等于引入至其中的脂质囊泡溶液的体积。

在一些实施例中，本披露的smLNP经由在线稀释方法产生，其中含有稀释缓冲液的第三贮存器流体联接至第二混合区。在这些实施例中，将在第一混合区中形成的脂质囊泡(例如，脂质体)溶液立即直接与稀释缓冲液在第二混合区中混合。用于进行直接稀释和在线稀释方法的这些过程和设备在本领域中是已知的。在这方面更多的信息可见于例如美国专利公开号20070042031中，该专利的披露内容通过援引并入本文。

本披露的smLNP的理化特性

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物的smLNP与参考LNP组合物的LNP相比具有较低的理化特性变化速率，该参考LNP组合物包含含有编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子，其中核酸分子大于约4kb。在一些实施例中，如本文披露的smLNP组合物的smLNP的理化特性变化速率比参考LNP组合物的LNP的相应速率小至少约5％。在一些实施例中，如本文披露的smLNP组合物的smLNP的理化特性变化速率比参考LNP组合物的LNP的相应速率小至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约100％。在一些实施例中，理化特性的变化是smLNP组合物的smLNP的降解速率，该降解速率如通过smLNP组合物中smLNP随时间推移的浓度和/或大小来测定。在一些实施例中，如本文披露的smLNP组合物的smLNP的降解速率比参考LNP组合物的LNP的相应速率小至少约5％。在一些实施例中，如本文披露的smLNP组合物的smLNP的降解速率比参考LNP组合物的LNP的相应速率小至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约100％。

本披露的LNP的功能性能

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物的smLNP与参考LNP组合物的功能性能降低速率相比具有较低的功能性能降低速率，该参考LNP组合物包含含有编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子，其中核酸分子大于约4kb。在一些实施例中，如本文披露的smLNP组合物的smLNP的功能性能降低速率比参考LNP组合物的LNP的相应速率小至少约5％。在一些实施例中，如本文披露的smLNP组合物的smLNP的功能性能降低速率比参考LNP组合物的LNP的相应速率小至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约100％。

在一些实施例中，功能性能降低速率通过含有位点特异性核酸内切酶的smLNP的基因组编辑效率来确定。在一些实施例中，如本文披露的smLNP组合物的smLNP的编辑效率比参考LNP组合物的LNP的相应效率小至少约5％。在一些实施例中，如本文披露的smLNP组合物的smLNP的编辑效率比参考LNP组合物的LNP的相应效率小至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约100％。

在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物的smLNP具有的平均颗粒直径大于参考LNP组合物的LNP的平均颗粒直径，该参考LNP组合物包含含有编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子，其中核酸分子大于约4.0kb。在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物的smLNP的平均颗粒直径比参考LNP组合物中LNP的平均颗粒直径大至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％。

药物组合物

在一个方面中，将如本文所述的smLNP掺入至组合物，例如药物组合物中。此类组合物典型地包含smLNP和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括但不限于与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。补充性活性化合物(例如，抗癌剂)也可以掺入至组合物中。因此，本披露的一些实施例涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的smLNP组合物和药学上可接受的载体。

本披露的一些实施例涉及一种包含本文所述的smLNP组合物的药物组合物，用于在将生物分子(诸如位点特异性核酸内切酶或编码该位点特异性核酸内切酶的核酸分子)递送至靶细胞中使用。在相关方面中，本披露的一些实施例涉及一种包含本文所述的smLNP组合物的药物组合物，用于在编辑细胞的基因组中使用。在又一个相关方面中，本披露的一些实施例提供了一种smLNP或组合物(例如，药物组合物)，用于在治疗哺乳动物(例如，人类)的健康状况或疾病中使用。

本披露的方法

一旦形成，本披露的smLNP特别可用于将包含例如编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子引入至受试者或生物体中的一个或多个细胞中。因此，本披露的一些实施例涉及一种用于将核酸分子递送至细胞中的方法，该方法包括使细胞与如本文披露的smLNP组合物或药物组合物接触，其中LNP组合物包含核酸分子。该方法可以通过以下方式在体外或体内进行：首先形成如上所述的smLNP，并且然后使smLNP与细胞接触足够使将核酸分子至细胞的递送发生的时间段。

在一些实施例中，该方法包括在适于将生物活性分子组分(例如，核酸分子)递送至受试者或生物体的一个或多个细胞的条件下施用本文披露的smLNP或药物组合物。在一些实施例中，使smLNP或药物组合物与如本领域中通常已知的受试者或生物体的一个或多个细胞接触，该接触诸如经由肠胃外施用(例如，静脉内、肌内、皮下施用)在具有或不具有促进施用的赋形剂的情况下配制的分子组合物来进行。

在另一个方面中，本披露的一些实施例涉及一种用于编辑细胞的基因组的方法，该方法包括向细胞提供如本文披露的smLNP组合物或药物组合物。在一些实施例中，本文披露的smLNP或组合物改善宿主细胞或生物体中的基因编辑效率。在一些实施例中，本披露的LNP组合物赋予的基因编辑效率大于参考LNP组合物的基因编辑效率，该参考LNP组合物包含含有编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子，其中核酸分子大于约4kb。在一些实施例中，smLNP组合物的编辑效率比参考LNP组合物的编辑效率大至少约5％。在一些实施例中，smLNP组合物的编辑效率比参考LNP组合物的编辑效率大至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约100％。在一些实施例中，smLNP组合物的编辑效率比参考LNP组合物的编辑效率大至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、或至少七倍。在一些实施例中，smLNP组合物的编辑效率比参考LNP组合物的编辑效率大至少八倍、至少九倍、或至少十倍。

本披露的方法可以在多种宿主细胞和生物体中实践。适合的宿主包括动物物种，包括哺乳动物物种，诸如灵长类动物(例如，人类和黑猩猩以及其他非人灵长类动物)、犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物、牛科动物、啮齿动物(例如，大鼠和小鼠)、兔类动物、以及猪。在本文披露的方法的一些实施例中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，该哺乳动物细胞是人类细胞、鼠类细胞、或非人灵长类动物细胞。

治疗方法

在一个方面中，本披露的一些实施例涉及用于在有需要的哺乳动物(例如，人类)中治疗与健康状况或疾病相关的一种或多种症状、预防该一种或多种症状、降低发展该一种或多种症状的风险或可能性(例如，降低其易感性)、延迟该一种或多种症状的发作、和/或改善该一种或多种症状的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的smLNP组合物，该smLNP组合物包含编码如本文所述的靶向感兴趣的基因的位点特异性核酸内切酶的核酸分子。

如本文所用，术语“施用(administration/administering)”是指通过包括但不限于以下项的施用途径来递送生物活性组合物或配制品：口服、静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、皮下、肌内、以及局部施用、或其组合。该术语包括但不限于通过医疗专业人员施用或自我施用。

在一些实施例中，健康状况或疾病是血友病A。在一些实施例中，健康状况或疾病是心血管疾病。

血友病A

本披露的一些实施例涉及用于在有需要的哺乳动物(例如，人类)中治疗与健康状况或疾病相关的一种或多种症状、预防该一种或多种症状、降低发展该一种或多种症状的风险或可能性、延迟该一种或多种症状的发作、和/或改善该一种或多种症状的方法，其中健康状况或疾病是血友病A。

血友病A(HemA)是由因子VIII(FVIII)基因的遗传缺陷引起的，该遗传缺陷导致血液中FVIII蛋白水平低或检测不到。这导致组织损伤位点处的无效凝块形成，经常随时间推移导致关节损伤和血友病性关节病(hemarthropathy)。其他潜在的严重出血问题包括颅内出血和可能无法控制的出血，这些问题如果不治疗可能是致命的。

FVIII基因主要在存在于肝脏中的肝窦内皮细胞以及身体其他位点中表达。外源性FVIII可以在肝脏的肝细胞中表达并从其分泌，从而在循环中产生FVIII，并且因此实现疾病的治愈。

通过基因组编辑解决血友病A疾病的基本原理

尽管多种基因疗法方法目前正在开发或临床中，但它们具有不期望的特征。使用腺相关病毒(AAV)的基于病毒的基因疗法已在临床前动物模型和患者中显示出前景，但它具有多个缺点。基于AAV的基因疗法使用包封在AAV病毒衣壳(典型地使用血清型AAV5、AAV8、AAV9或AAVrh10等)内、由肝脏特异性启动子驱动的FVIII基因。用于基因疗法的所有AAV病毒均将包装的基因盒递送至转导细胞的细胞核中，在那里基因盒几乎只保持为游离型并且它是治疗性基因的产生治疗性蛋白质的游离型拷贝。AAV没有将其包封的DNA整合到宿主细胞的基因组中的机制，而是作为游离体保持，该游离体因此在宿主细胞***时不复制。游离型DNA也可能随时间推移而经受降解。已证明，当含有AAV游离体的肝脏细胞被诱导***时，AAV基因组不复制而是被稀释。因此，预期基于AAV的基因疗法在给予至肝脏尚未达到成人大小的儿童时不会有效。此外，目前尚不知道基于AAV的基因疗法在给予至成人时将持续多久，但动物数据已证明在长达10年的时段内治疗效果仅有较小的丧失。HemA的永久治愈是非常期望的，尤其是如果可以实现正常范围内的FVIII水平。然而，目前可用的HemA治疗法具有多个局限性。例如，替代缺少的FM蛋白是HemA患者的有效治疗法，并且是目前的护理标准。然而，蛋白质替代疗法需要频繁静脉内注射FVIII蛋白，这对成人来说不方便、对儿童来说成问题、成本过高、并且如果不严格遵循治疗方案可能导致突破性出血事件。在另一个实例中，新颖双特异性抗体Hemlibra最近已被批准，并且代表第一种基于抗体的用于治疗HemA的治疗剂。此分子充当FVIIIa模拟物，并且可以皮下递送，其潜在治疗持续时间为1个月。在临床试验期间，当将

与FEIBA旁路剂组合用于治疗突破性出血时，有死亡。另外，在一名患者中有了抗药抗体的新近报道。

因此，迫切需要为HemA开发新的有效且持久的治疗法，该治疗法可以通过基因组编辑来实现。申请人设想进行实验以靶向人白蛋白基因座处的基因组编辑。人白蛋白内含子1-白蛋白(位于染色体4q13.3上)是由肝细胞表达的丰富肝脏蛋白质，并且是血浆中发现的最高度表达的蛋白质。不受任何特定理论的束缚，据信靶向整合到1％的白蛋白基因中不会影响白蛋白表达水平，同时提供足够的FVIII表达以使活性正常化。

在一些实施例中，根据本披露的一些实施例的smLNP组合物被部署用于将FVIII基因***在肝脏肝细胞中。在这些情况下，smLNP组合物优先被肝脏细胞(例如，肝细胞)摄取。在一些实施例中，用于治疗血友病A的方法中的smLNP组合物是可生物降解的，因为它们在治疗有效剂量下不在体内积累至细胞毒性水平。在一些实施例中，用于治疗血友病A的方法中的smLNP组合物在治疗剂量水平下不引起导致显著不利影响的先天性免疫应答。在一些实施例中，smLNP组合物在治疗剂量水平下不引起毒性。在一些实施例中，本文披露的smLNP组合物与血液中的载脂蛋白(诸如载脂蛋白E(ApoE))特异性结合。载脂蛋白是在血浆中循环的蛋白质，这些蛋白质是调控脂质转运的关键。ApoE代表在脂蛋白摄取期间与肝脏中的细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖相互作用的一类载脂蛋白。

心血管疾病

本披露的一些实施例涉及用于在有需要的哺乳动物(例如，人类)中治疗与健康状况或疾病相关的一种或多种症状、预防该一种或多种症状、降低发展该一种或多种症状的风险或可能性、延迟该一种或多种症状的发作、和/或改善该一种或多种症状的方法，其中健康状况或疾病是心血管疾病。

高水平的脂蛋白颗粒Lp(a)与心血管疾病、或发展心血管疾病的风险相关。例如，高血浆水平的Lp(a)是钙化性主动脉瓣疾病、冠心病、动脉粥样硬化、血栓形成、以及中风的独立风险因素。令人感兴趣的是人类中血浆Lp(a)水平的范围，该水平在个体之间变化1000倍。此宽范围表明，显著降低血浆Lp(a)可能不是有害的并且因此潜在的抗Lp(a)药物可能具有广泛的治疗窗口。

由于缺乏可靠且稳定地降低Lp(a)水平的治疗法，因此非常期望永久性降低Lp(a)水平的疗法。由于肝细胞是apo(a)的主要来源，因此被指导在肝脏处以进行apo(a)的“靶向敲除”的基因编辑方法将是一种有吸引力的方法。

与LDL不同，Lp(a)水平不能通过环境、饮食、或现有降脂药物(如他汀类药物)调节，从而使其成为严格遗传驱动的疾病风险因素。针对apo(B)的反义寡核苷酸能够将Lp(a)降低25％(Santos等人,Arterioscler Thromb Vasc Biol.[动脉硬化、血栓与血管生物学]2015年3月；35(3):689-699)。随后，在临床试验中测试了特异性地针对apo(a)mRNA的反义疗法，并且显示出将血浆Lp(a)水平显著降低超过80％(Viney等人,Lancet[柳叶刀]2016；388:2239-53)。遗憾的是，反义疗法需要频繁给药才能有效。

因此，迫切需要为心血管疾病开发新的有效且持久的治疗法，该治疗法能够通过基因组编辑来实现。在本披露的一些实施例中，申请人设想进行实验以靶向位于染色体6q25.3-q26上的人脂蛋白(a)(LPA)基因座处的基因组编辑。脂蛋白(a)是致动脉粥样化的脂蛋白，该脂蛋白由与低密度脂蛋白(LDL)颗粒的载脂蛋白B-100(apoB)组分共价结合的蛋白质载脂蛋白(a)[apo(a)]组成。apo(a)蛋白由LPA基因编码、在肝细胞中产生并且分泌到循环中。Lp(a)的致病机制是通过其促动脉粥样化、促炎症、以及促血栓形成特性介导的。apo(a)和Lp(a)的LDL组分的组合对心血管***产生复合效应。LDL单独可以通过以下方式引起表征动脉粥样硬化的免疫应答和炎症应答：LDL进入血管壁中，在那里磷脂被氧化。Lp(a)循环并且与血浆中的氧化磷脂结合，从而引起促炎症应答。Apo(a)本身含有可以与受损血管壁上的暴露表面结合的位点，从而介导其在这些位置处的进入和积累。已显示apo(a)的小同种型通过抑制纤维蛋白溶解促进血栓形成。在一些实施例中，根据本披露的一些实施例的LNP组合物被设计用于缺失肝脏肝细胞中的LPA基因。

本披露的方法的实施例的实现方式可以包括以下特征中的一个或多个。

如本文所用，“施用(administration/administering)”是指通过包括但不限于以下项的施用途径来递送生物活性组合物或配制品：口服、静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、皮下、肌内、以及局部施用、或其组合。该术语包括但不限于通过医疗专业人员施用或自我施用。因此，在本文披露的方法的一些实施例中，本文所述的LNP或组合物(例如，药物组合物)通过以下施用途径之一进行施用：口服、鼻内、静脉内、腹膜内、肌内、关节内、病灶内、气管内、皮下、以及皮内。在一些实施例中，本文披露的LNP或组合物例如经由肠或肠胃外施用途径进行全身性施用。

典型地将本文披露的smLNP或组合物配制为与其预期的施用途径相容。将本披露的smLNP和组合物口服或通过吸入给予，但是它们更可能通过肠胃外途径施用。肠胃外施用途径的实例包括例如静脉内、皮内、皮下、经皮(局部)、经粘膜、以及直肠施用。用于肠胃外应用的溶液或悬浮液可以包含以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调整张力的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱(诸如一碱式磷酸钠和/或二碱式磷酸氢、盐酸或氢氧化钠)调整pH(例如，至约7.2-7.8，例如7.5的pH)。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

可以在细胞培养物或实验动物中通过标准药学程序来确定本披露的此类主题smLNP或组合物的剂量、毒性以及治疗功效，例如用于确定LD₅₀(对群体的50％致死的剂量)和ED₅₀(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且它可表示为比率LD₅₀/ED₅₀。优选展现出高治疗指数的化合物。虽然使用展现出有毒副作用的化合物，但应小心设计将此类化合物靶向至受影响组织的位点的递送***，以便使对未受影响的细胞的潜在损伤最小化，并且从而减少副作用。

可以在配制用于人类的剂量范围中使用从细胞培养测定和动物研究获得的数据。此类化合物的剂量优选地处于包括ED₅₀且具有很少或没有毒性的循环浓度的范围内。剂量可以根据所采用的剂型和所利用的施用途径而在此范围内变化。对于在本披露的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量最初可以从细胞培养测定中估计。在动物模型中配制剂量以实现包括如在细胞培养物中确定的IC₅₀(即，实现症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这种信息可以用于更准确地确定在人类中的有用剂量。例如通过高效液相色谱测量血浆中的水平。

如本文所定义，本披露的主题smLNP或组合物的“治疗有效量”(例如，有效剂量)取决于所选择的LNP或组合物。例如，可以施用在大约0.001至0.1mg/kg患者体重的范围内的单剂量量；在一些实施例中，施用约0.005、0.01、0.05mg/kg。在一些实施例中，施用600,000IU/kg(IU可以通过淋巴细胞增殖生物测定来确定并且以由世界卫生组织第一国际标准针对白介素-2(人类)建立的国际单位(IU)表示)。smLNP或组合物可以每天一次或多次至每周一次或多次施用；包括每隔一天一次。熟练技术人员将了解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，包括但不限于疾病或障碍的严重程度、先前的治疗、受试者的总体健康状况和/或年龄、以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的本披露的主题smLNP或组合物治疗受试者可以包括单一治疗，或者可以包括一系列治疗。在一些实施例中，将组合物每8小时施用持续5天，之后是2至14天(例如，9天)的休息期，之后再进行5天的每8小时施用。

在一些实施例中，将smLNP组合物配制用于体内递送。在一些实施例中，将smLNP组合物配制用于离体递送。本披露的LNP可以吸附至与它们混合或接触的几乎任何细胞类型上。一旦被吸附，smLNP可以被部分细胞内吞、与细胞膜交换脂质、或与细胞融合。颗粒的核酸分子部分的转移或掺入可以经由这些途径中的任一种发生。具体地，当发生融合时，颗粒膜被整合到细胞膜中，并且颗粒的内容物与细胞内液合并。

体内施用

用于将编码如本文所述的位点特异性核酸酶的核酸分子经由身体***(诸如循环)体内递送至远端靶细胞的全身性递送可以使用本文披露的smLNP组合物实现。另外，一种或多种核酸分子可以在本披露的smLNP组合物中单独施用，或者与包含肽、多肽、或小分子(诸如常规药物)的一种或多种另外的smLNP组合物组合施用(例如，共施用)。

对于体内施用，施用可以是以本领域中已知的任何方式，例如通过注射、口服施用、吸入(例如，鼻内或气管内)、经皮应用、或直肠施用。体内施用可以经由单剂量或分剂量来完成。smLNP组合物可以肠胃外施用，即关节内、静脉内、腹膜内、皮下、或肌内施用。在一些实施例中，smLNP组合物通过推注来静脉内或腹膜内施用。在一些实施例中，本披露的smLNP组合物肠胃外或腹膜内施用。此外或替代性地，单独的或与其他适合的组分组合的本披露的smLNP组合物可以制成气雾剂配制品(即，它们可以“喷雾化”)以经由吸入(例如，鼻内或气管内)施用。气雾剂配制品可以置于加压的可接受的推进剂，诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。

本领域技术人员将了解，所施用的颗粒量将取决于核酸分子与脂质的比率、所使用的具体核酸分子，但将通常在约0.01与约50mg/千克体重之间，优选地在约0.1与约5mg/kg体重之间、或是约10-10个颗粒/次施用(例如，注射)。

离体施用

对于离体应用，可以将本披露的smLNP组合物的递送施用至培养物中生长的任何细胞。在一些实施例中，细胞是动物细胞、更优选地哺乳动物细胞、并且最优选地人类细胞。当离体进行时，细胞与smLNP之间的接触发生在生物相容的介质中。smLNP组合物中smLNP的浓度根据具体应用而变化，但通常在约1μmol与约10mmol之间。用smLNP处理细胞可以通常在生理温度(约37℃)下进行从约1至72小时，优选地从约2至约5小时、从约2至约4小时、或从约1至约3小时的时间段。

基因改组的位点特异性核酸内切酶

Gib11SpaCas9是使用以下方式产生的合成的RNA指导型核酸内切酶(RGEN)：对四种不同的葡萄球菌属物种(路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)、田鼠葡萄球菌(Staphylococcus microti)、以及猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus))的CRISPR-Cas9核酸内切酶序列片段进行基于同源性的基因家族改组。简而言之，比较所有四种Cas9核酸内切酶的序列以鉴定具有高同源性的区域来充当锚定点，从而将Cas9核酸内切酶中的每一种分解为8个相应的微型结构域。通过以下方式制备基因家族改组的合成Cas9核酸内切酶文库：将每个微型结构域随机分配为衍生自四种原始Cas9核酸内切酶之一，除了被选择为来自路邓葡萄球菌Cas9的PAM相互作用(PI)结构域的C末端微型结构域。所得的文库具有8192的理论复杂度。最初使用细菌活/死测定筛选文库的Cas9核酸内切酶活性，并且使用BFP破坏测定在HEK细胞中进一步筛选候选物合成Cas9核酸内切酶。这使得将Gib11Cas9鉴定为具有高Cas9核酸内切酶活性的候选物合成Cas9核酸内切酶。通过以下方式产生Gib11SpaCas9：用包含来自巴氏葡萄球菌的PI结构域的多肽替代包含PI结构域的Gib11Cas9的C末端部分。

F8Cas9是使用以下方式产生的合成的RNA指导型核酸内切酶(RGEN)：对四种不同的葡萄球菌属物种(路邓葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、田鼠葡萄球菌、以及猪葡萄球菌)的CRISPR-Cas9核酸内切酶序列片段进行基于同源性的基因家族改组。简而言之，比较所有四种Cas9核酸内切酶的序列以鉴定具有高同源性的区域来充当锚定点，从而将Cas9核酸内切酶中的每一种分解为12个相应的微型结构域。通过以下方式制备基因家族改组的合成Cas9核酸内切酶文库：将每个微型结构域随机分配为衍生自四种原始Cas9核酸内切酶之一，除了被选择为来自路邓葡萄球菌Cas9的PAM相互作用(PI)结构域的C末端微型结构域。所得的文库具有1.3x 10⁵的理论复杂度。最初使用细菌活/死测定筛选文库的Cas9核酸内切酶活性，并且使用BFP破坏测定在HEK细胞中进一步筛选候选物合成Cas9核酸内切酶。这使得将F8Cas9鉴定为具有高Cas9核酸内切酶活性的候选物合成Cas9核酸内切酶。

E2Cas9是使用以下方式产生的合成的RNA指导型核酸内切酶(RGEN)：对四种不同的葡萄球菌属物种(路邓葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、田鼠葡萄球菌、以及猪葡萄球菌)的CRISPR-Cas9核酸内切酶序列片段进行基于同源性的基因家族改组。简而言之，比较所有四种Cas9核酸内切酶的序列以鉴定具有高同源性的区域来充当锚定点，从而将Cas9核酸内切酶中的每一种分解为8个相应的微型结构域。通过以下方式制备基因家族改组的合成Cas9核酸内切酶文库：将每个微型结构域随机分配为衍生自四种原始Cas9核酸内切酶之一，除了被选择为来自路邓葡萄球菌Cas9的PAM相互作用(PI)结构域的C末端微型结构域。所得的文库具有8192的理论复杂度。最初使用细菌活/死测定筛选文库的Cas9核酸内切酶活性，并且使用BFP破坏测定在HEK细胞中进一步筛选候选物合成Cas9核酸内切酶。这使得将E2Cas9鉴定为具有高Cas9核酸内切酶活性的候选物合成Cas9核酸内切酶。

P2H12Cas9是使用以下方式产生的合成的RNA指导型核酸内切酶(RGEN)：对四种不同的葡萄球菌属物种(路邓葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、田鼠葡萄球菌、以及猪葡萄球菌)的CRISPR-Cas9核酸内切酶序列片段进行基于同源性的基因家族改组。简而言之，比较所有四种Cas9核酸内切酶的序列以鉴定具有高同源性的区域来充当锚定点，从而将Cas9核酸内切酶中的每一种分解为8个相应的微型结构域。通过以下方式制备基因家族改组的合成Cas9核酸内切酶文库：将每个微型结构域随机分配为衍生自四种原始Cas9核酸内切酶之一，除了被选择为来自路邓葡萄球菌Cas9的PAM相互作用(PI)结构域的C末端微型结构域。所得的文库具有8192的理论复杂度。最初使用细菌活/死测定筛选文库的Cas9核酸内切酶活性，并且使用BFP破坏测定在HEK细胞中进一步筛选候选物合成Cas9核酸内切酶。这使得将P2H12Cas9鉴定为具有高Cas9核酸内切酶活性的候选物合成Cas9核酸内切酶。

本披露中所提到的所有出版物和专利申请均通过援引并入本文，并入程度如同指示每个单独出版物或专利申请明确且单独地通过援引并入一般。

不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。参考文献的论述内容陈述了其作者所主张的观点，并且本发明人保留对所引用文件的准确性和相关性提出质疑的权利。应清楚理解，虽然本文提及了许多信息来源，包括科学期刊文章、专利文件、以及教科书；但是此引用并不构成以下承诺：这些文件中的任何文件形成本领域的一般常识的一部分。

本文给出的一般方法的论述内容仅旨在用于说明性目的。其他替代性方法和替代方案在审阅本披露后对于本领域技术人员将是清楚的，并且将被包括在本申请的精神和范围内。

实例

在以下实例中进一步详细披露了另外的实施例，这些实施例仅以说明方式提供，而并非旨在以任何方式限制本披露或权利要求的范围。

实例1：一般实验程序

除非另外指明，否则本披露的实践将采用分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学、以及免疫学的技术，这些技术是本领域的技术人员已知的。此类技术解释于诸如以下的文献中：Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第四版(Sambrook等人,2012)和Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第三版(Sambrook和Russel,2001)(在本文中合称为“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验室指南](F.M.Ausubel等人编辑,1987，包括直至2014年的增刊)；PCR:The Polymerase Chain Reaction[PCR：聚合酶链式反应](Mullis等人编辑,1994)；Beaucage等人编辑,Current Protocols in NucleicAcid Chemistry[核酸化学实验室指南],John Wiley&Sons,Inc.[约翰威利父子公司],NewYork[纽约],2000(包括直至2014年的增刊)；Gene Transfer and Expression inMammalian Cells[哺乳动物细胞中的基因转移和表达](Makrides编辑,ElsevierSciences B.V.[爱思唯尔科学公司],Amsterdam[阿姆斯特丹],2003)；以及CurrentProtocols in Immunology[免疫学实验室指南](Horgan K和S.Shaw(1994)，包括直至2014年的增刊)。除非另外说明，否则适当时，通常根据制造商定义的方案和/或参数进行涉及使用可商购获得的试剂盒和试剂的程序。

实例2：对含有编码示例性位点特异性核酸内切酶的mRNA的基于脂质的纳米颗粒 的表征

本实例描述了为了表征根据本披露的一些实施例的示例性LNP组合物的物理特性而进行的实验。在这些实验中，评价了各自含有编码定点核酸内切酶的mRNA分子的十一种LNP组合物的颗粒大小，并且将该颗粒大小与含有SpCas9编码mRNA的参考LNP组合物进行比较。如图1A-1E中所展示，观察到本披露的smCas9 mRNA-LNP具有如通过动态光散射(DLS)测定的略微增加的大小(图1A)。简而言之，将LNP在PBS中稀释至1μg/mL RNA浓度并且然后在384孔板中按2倍稀释度进行系列稀释。然后使用怀雅特公司(Wyatt)DynaPro板读取器II分析样品的颗粒直径的z平均测量。

还观察到一些smCas9 mRNA-LNP具有如通过多分散性指数(PDI)确定的增加的混合LNP群体不均匀性，这表明了包括一些较大LNP的更不均匀大小群体(图1B)。将LNP在PBS中稀释至1μg/mL RNA浓度并且然后在384孔板中按2倍稀释度进行系列稀释。然后使用怀雅特公司DynaPro板读取器II分析样品的多分散性测量。

此外，纳米颗粒追踪分析(NTA)的结果表明了当与参考SpCas9-LNP比较时smCas9GST3-K-LNP的更不均匀大小分布。通过以下方式进行NTA：将LNP在PBS中稀释至适当的工作浓度，并且然后使用马尔文公司(Malvern)Nanosight仪器测量样品的平均颗粒大小(参见图1C)。通过以下方式计算颗粒与RNA的比率与颗粒大小的关系分布的进一步表征：将如通过NTA测量的LNP大小针对如通过Ribogreen测试确定的包封RNA的浓度进行归一化，参见图1E。最后，如图1D中所示，在这些实验中未观察到mRNA向LNP中的包封效率的变化。通过使用Quant-iT Ribogreen RNA测定试剂盒(生命技术公司(Life Technologies)目录号R11490)的Ribogreen分析来确定包封效率。简而言之，将LNP在

X-100(在1％最终稀释度下)的存在或不存在下稀释至1μg/mL的浓度。然后将用于测量RNA含量的Ribogreen荧光染料(该荧光染料对于LNP是不可透过的)添加至样品中并且根据制造商的建议相对于适当的标准曲线进行评估。通过以下方式来计算包封效率：减去不具有

X-100的样品中的Ribogreen荧光信号与具有

X-100的样品的Ribogreen荧光信号的比率。

呈mRNA形式的smCas9变体的体外测试

本实例描述了为了评估根据本披露的一些实施例的示例性LNP组合物的体外编辑效率而进行的实验。在这些实验中，评价了各自含有编码定点核酸内切酶的mRNA分子的六种LNP组合物的体外编辑效率，并且将该体外编辑效率与含有SpCas9编码mRNA的参考LNP组合物进行比较。这些实验中使用的定点核酸内切酶是Gib11Spa3、Gib11Spa1、Slu、F8、E2、以及P2H12(参见图2)。在这些实验中，按照制造商的说明书(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)目录号LMRNA003)，使用可商购获得的***lipofectamineMessengerMax将mRNA转染到鼠类Hepa 1-6细胞中。所靶向的基因座是白蛋白基因座。在所示出的所有细胞实验中使用的靶向白蛋白基因的gRNA是以下序列的100聚体：5’-ugcCAGUUCCCGAUCGUUACGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUGAAACAAGACAAUAUGUCGUGUUUAUCCCAUCAAUUUAUUGGUGGGAUuuu-3’(SEQ ID NO:50)，其中小写字母表示硫代磷酸酯键联。通过以下方式计算编辑效率：使用凯杰公司(Qiagen)DNeasy血液和组织试剂盒(目录号69506)进行细胞裂解和基因组DNA提取，之后对白蛋白基因座的靶向区进行PCR扩增、进行测序、以及TIDE分析，如通过Brinkman等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]2014年12月16日；42(22):e168所述的。观察到所测试的LNP组合物的基因编辑效率与参考LNP组合物的基因编辑效率相当。引人注目地，包含定点核酸内切酶Gib11Spa3和Gib11Spa1的至少两种LNP组合物相比于参考多肽SpCas9看起来具有显著优异的效率。

作为mRNA-LNP递送的smCas9变体的体内测试

本实例描述了为了评估根据本披露的一些实施例的示例性LNP组合物在C57BL/6小鼠中的体内编辑效率而进行的实验。在这些实验中，评价了各自含有编码定点核酸内切酶的mRNA分子的两种LNP组合物的体外编辑效率，并且将该体外编辑效率与含有SpCas9编码mRNA的参考LNP组合物进行比较。将LNP组合物通过静脉内施用作为单剂量以不同剂量施用至C57BL/6小鼠。在图3中，剂量以mg施用的包封RNA/kg体重、或“mpk”表示。由此实验靶向的基因座是白蛋白基因座。观察到Gib11Spa3在以1.5mpk剂量或2mpk剂量施用时具有显著大于SpCas9的编辑效率。此外，观察到两种剂量(即1.5和2mpk)的Gib11Spa1均具有大于2mpk剂量的SpCas9的编辑效率。通过以下方式计算所有小鼠实验的编辑效率：使用凯杰公司DNeasy血液和组织试剂盒(目录号69506)进行肝脏组织匀浆化和基因组DNA提取，之后对白蛋白基因座的靶向区进行PCR扩增、进行测序、以及TIDE分析，如通过Brinkman等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]2014年12月16日；42(22):e168所述的。

对mRNA序列和化学修饰的评价

本实例描述了为了展示当以2mpk的剂量在C57BL/6小鼠中静脉内施用时，各自含有编码以下位点特异性核酸内切酶的mRNA分子的示例性LNP样品的编辑效率而进行的实验：smCas9 GST3(GST3mRNA，SEQ ID NO:34；GST3多肽，SEQ ID NO:35)、smCas9 GST3-K(GST3-K mRNA，SEQ ID NO:36；GST3-K多肽，SEQ ID NO:37)、smCas9 GST3-v1(GST3-v1mRNA，SEQ ID NO:38；GST3-v1多肽，SEQ ID NO:39)、smCas9 GST1-v1(GST1-v1 mRNA，SEQID NO:40；GST1-v1多肽，SEQ ID NO:41)、或参考核酸酶SpCas9。这些实验的靶基因座是C57BL/6小鼠的白蛋白基因座。在所示出的所有体内小鼠实验中使用的靶向白蛋白基因的gRNA是以下序列的100聚体：5’-ugcCAGUUCCCGAUCGUUACGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUGAAACAAGACAAUAUGUCGUGUUUAUCCCAUCAAUUUAUUGGUGGGAUuuu-3’(SEQ ID NO:50)，其中小写字母表示硫代磷酸酯键联。GST3变体是前述的Gib11Spa3变体。GST3-K是具有共有科扎克共有序列的Gib11Spa3变体。GST3-v1是具有SpCas9NLS(核定位序列)/接头的Gib11Spa3变体。GST1-v1是具有SpCas9NLS/接头的Gib11Spa1变体。参见图6。观察到在mRNA-LNP形式中，所测试的所有smCas9变体均比SpCas9表现更佳。结果还表明，Gib11Spa3构建体设计的变型看起来未对功能性能具有显著影响。参见图4。这些实验中使用的所有实验参数与上文针对体内小鼠测试所述的所有实验参数相似。

此实例进一步描述了展示当通过单一静脉内2mpk剂量作为mRNA-LNP体内递送在C57BL/6小鼠中时，N1-甲基假尿苷碱基修饰关于编辑效率(如通过***缺失频率指示的)对smCas9和SpCas9mRNA的影响的实验。参见图5。这些实验中使用的所有实验参数与上文针对体内小鼠测试所述的所有实验参数相似。在此，将针对SpCas9、smCas9 GST3-v1、以及smCas9 GST1-v1的mRNA用N1-甲基假尿苷碱基修饰，并且测量含有这些mRNA的LNP的编辑效率并将其与含有未修饰形式的相同mRNA的LNP的编辑效率进行比较。N1-甲基假尿苷碱基修饰看起来仅对SpCas9 mRNA-LNP的编辑效率具有影响，其中它导致改善的性能。

改善的LNP稳定性

此实例描述了为了测量在2℃-8℃下储存之前和储存一周之后的mRNA-LNP数量/mL溶液而进行的实验，其中mRNA编码SpCas9或smCas9变体。在此实验中，观察到虽然当mRNA编码SpCas9时mRNA-LNP的数量显著减少，但对于其他组合物(即，具有编码smCas9变体的mRNA)未观察到显著变化。LNP浓度的变化指示颗粒聚集和融合。参见图6。在储存之前和储存后1周，通过使用马尔文公司Nanosight仪器对样品的NTA分析来测量LNP浓度。在第1天与第7天时的测量之间，将LNP在2℃-8℃下储存。

此实例进一步描述了为了通过低温透射电子显微镜(低温TEM)观察当用SpCas9mRNA或smCas9 Gib11Spa3 mRNA制备时的mRNA-LNP而进行的实验。参见图7。观察到与携带编码SpCas9的mRNA的mRNA-LNP相比，携带smCas9 mRNA的LNP呈现出较少的形态不规则性。通过以下方式进行低温TEM分析：使用半Cryoplunge 3***快速冷冻LNP并且在JEOL 2100F200kV场发射电子显微镜上成像。

本实例进一步描述了为了测量当在将配制品制备并在2℃-8℃下储存后1天或9天，以2mpk的剂量静脉内注射在C57BL/6小鼠中时，携带编码SpCas9或smCas9变体Gib11Spa3的mRNA的mRNA-LNP配制品的编辑效率而进行的实验(在每个组中使用同一LNP批次)。参见图8。观察到作为mRNA有效载荷的smCas9比SpCas9产生更稳定的LNP：对于SpCas9观察到在制备后一天和九天注射的配制品之间编辑效率的约3.6倍降低，而对于smCas9的降低仅为约1.3倍。这些实验中使用的所有实验参数与上文针对体内小鼠测试所述的所有实验参数相似。

实例3：在治疗血友病A和心血管疾病的方法中对LNP的评价

申请人设想使用以下动物模型来评估smCas9 mRNA LNP的有效性和安全性：C57BL/6小鼠、HemA敲除小鼠、sprague Dawley大鼠、以及食蟹猴。不受任何特定理论的束缚，据信smCas9 mRNA LNP在所有这些临床前模型中可以至少与SpCas9 mRNA LNP一样有效。

在这些实验中，smCas9 mRNA LNP、特别是Gib11Spal和Gib11Spa3变体可以有效地在C57BL/6小鼠中的白蛋白基因座处产基因编辑。此模型中的另外实验包括在各种类型的LNP配制品中测试smCas9 mRNA，评估Slu、E2、F8和P2H12变体，评价碱基和序列修饰对smCas9 mRNA有效性的影响，评价剂量应答和多剂量性能，以及在稳定性测试期间进一步评价smCas9 mRNA LNP功能。

申请人还设想使用HemA敲除小鼠来评价FVIII向白蛋白基因座中的靶向整合；使用Sprague Dawley大鼠来通过评估肝脏毒性和免疫应答评估smCas9 mRNA LNP的安全性；并且使用食蟹猴来评估基因编辑功效、生物分布、以及安全性。设想将原代人肝细胞中的指导序列测试用于评估smCas9 mRNA LNP的脱靶效应。

LNP技术在临床上具有被证实的安全性概况，并且据信与具有spCas9 mRNA的目前LNP配制品相比，具有smCas9 mRNA的LNP配制品可以具有改善的治疗指数。可以例如通过测试以下项中的一种或多种来评价smCas9 mRNA LNP的临床安全性和功效：血清临床化学、CBC、针对Cas9和LNP的中和抗体、注射位点炎症反应、细胞因子诱导、以及靶标生物标志物活性。

实例4：在非人灵长类动物细胞中对含有编码smCas9的mRNA的LNP组合物的评价

为了进一步评估实例2和3中所述的smCas9-mRNA-LNP配制品的基因编辑有效性、生物分布、以及安全性，使用食蟹猴(cyno)模型。

在这些实验中，将本文例如在实例2和3中所述的smCas9-mRNA-LNP配制用于施用。将配制品经由静脉内(IV)输注以在从1-2mg/kg范围内的剂量施用至大约3kg雄性食蟹猴。随后监测食蟹猴的安全性问题，在接受输注的8天内对其实施安乐死，并且评估其肝脏和脾脏基因编辑、生物分布、以及耐受性读出。预期已被证明在小鼠中实现高编辑效率的递送smCas9 mRNA的LNP配制品可以跨物种(诸如非人灵长类动物物种)表现同样良好。无意于受任何特定理论的束缚，据信在本披露的smCas9-mRNA-LNP的情况下观察到的递送和稳定性优势不是特定测试模型所独有的。

实例5：含有编码smCas9的mRNA的LNP组合物在大鼠中的体内安全性

为了评估根据本披露的一些实施例的示例性smCas9-mRNA-LNP配制品的安全性，进行大鼠毒性研究。

在这些实验中，向大鼠注射2mg/kg的smCas9 GST1 mRNA-LNP或SpCas9 mRNA-LNP(对于每种条件n＝3)，其中LNP配制品之间的唯一差异是它们的核酸组分。用SpCas9 mRNA-LNP注射的大鼠展示出急性毒性应答，在剂量施用的12小时内在该群组中未观察到存活。相比之下，用smCas9 GST1 mRNA-LNP注射的大鼠展现出改善的耐受性，如通过此群组中的所有大鼠均存活到在注射后第7天的研究终止所证明的。鉴于在SpCas9 mRNA-LNP的情况下观察到的迅速毒性发作，这不太可能是由于LNP的基因组编辑的任何影响，预期这些任何影响将需要长于12小时才能显现。这些结果表明，对于其他类似配制的LNP，含有smCas9 mRNA的LNP的毒性低于含有较大SpCas9 mRNA的LNP。这些结果是令人惊讶的，因为发现许多smCas9-mRNA-LNP中的脂质与mRNA重量比大于相应的SpCas9-mRNA-LNP中的脂质与mRNA重量比，并且总LNP脂质含量被认为是LNP毒性的驱动因素。

实例6：含有具有各种碱基修饰的mRNA的LNP组合物的体内编辑效率

为了进一步评估不同碱基修饰对smCas9和SpCas9 mRNA-LNP的影响，进行在小鼠中的体内***缺失分析。

向C57BL/6小鼠注射单剂量1mg/kg的以下mRNA-LNP之一：Gib11Spa3(N1-甲基假尿苷；进行或不进行

尿苷耗尽/密码子优化)和Gib11Spa1(未修饰、N1-甲基假尿苷、假尿苷、或5-甲氧基尿苷；进行或不进行

尿苷耗尽/密码子优化)。LNP含有靶向小鼠基因组中的不同基因座的以下两种不同gRNA之一：gRNA T1(所有修饰)或gRNA T2(仅N1-甲基假尿苷修饰)。***缺失频率的结果示出在表1中。当对mRNA进行尿苷耗尽和密码子优化时，大多数Gib11Spa1 mRNA-LNP显示出改善的编辑效率。与未修饰的条件相比，假尿苷修饰导致Gib11Spa1 mRNA-LNP的编辑效率改善，但当对mRNA进行尿苷耗尽和密码子优化时，此效应降低。相比之下，在进行和不进行尿苷耗尽和密码子优化下，5-甲氧基尿苷均导致Gib11Spa1 mRNA-LNP的编辑效率降低。

表1

虽然已经披露了本披露的特定替代方案，但是应理解，各种修改和组合是可能的并且在所附权利要求的真实精神和范围内设想到。因此，无意限制在本文中呈现的确切摘要和披露内容。

序列表

Claims (32)

1.一种基于脂质的纳米颗粒(LNP)组合物，该基于脂质的纳米颗粒组合物包含：

核酸分子，该核酸分子含有编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列；以及

一种或多种脂质部分，该一种或多种脂质部分选自下组，该组由以下项组成：氨基脂质、可电离脂质、中性脂质、PEG脂质、辅助脂质、以及胆固醇或胆固醇衍生物；

其中该核酸分子的长度是约3.8kb或更小。

2.如权利要求1所述的LNP组合物，其中该核酸分子的长度是约3.7kb或更小。

3.如权利要求1至2中任一项所述的LNP组合物，其中该核酸分子的长度是约3.5kb或更小。

4.如权利要求1至3中任一项所述的LNP组合物，其中该核酸分子是信使RNA(mRNA)。

5.如权利要求1至4中任一项所述的LNP组合物，其中该编码该位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列可操作地连接至至少一种另外的核苷酸序列。

6.如权利要求5所述的LNP组合物，其中该至少一种另外的核苷酸序列包含非翻译末端区(UTR)、共有科扎克信号、编码核定位信号(NLS)的核苷酸序列、编码接头肽的核苷酸序列、编码标签肽的核苷酸序列、或其任何组合。

7.如权利要求6所述的LNP组合物，其中该核定位信号(NLS)包含核质蛋白NLS或SV40NLS。

8.如权利要求1至7中任一项所述的LNP组合物，其中该位点特异性核酸内切酶是Cas9蛋白或其功能性衍生物。

9.如权利要求1至7中任一项所述的LNP组合物，其中该位点特异性核酸内切酶包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下项组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO 5、以及SEQ ID NO:6。

10.如权利要求1至7中任一项所述的LNP组合物，其中该核酸分子包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下项组成：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、以及SEQ ID NO:12。

11.如权利要求1至10中任一项所述的LNP组合物，其中该核苷酸序列经密码子优化以在宿主细胞中表达。

12.如权利要求11所述的LNP组合物，其中该宿主细胞是哺乳动物细胞。

13.如权利要求12所述的LNP组合物，其中该哺乳动物细胞是人类细胞、鼠类细胞、或非人灵长类动物(NHP)细胞。

14.如权利要求1至13中任一项所述的LNP组合物，该LNP组合物进一步包含CRISPR***的一种或多种另外的组分。

15.如权利要求14所述的LNP组合物，其中该CRISPR***的该一种或多种另外的组分包含指导RNA(gRNA)或编码该gRNA的核酸分子。

16.如权利要求1至15中任一项所述的LNP组合物，其中该LNP组合物的这些LNP包含C12-200。

17.如权利要求1至16中任一项所述的LNP组合物，其中该LNP组合物的这些LNP包含胆固醇。

18.如权利要求1至17中任一项所述的LNP组合物，其中该LNP组合物的这些LNP包含DOPE。

19.如权利要求1至18中任一项所述的LNP组合物，其中该LNP组合物的这些LNP包含PEG-DMPE。

20.如权利要求1至19中任一项所述的LNP组合物，其中该LNP组合物的这些LNP与参考LNP组合物的LNP相比具有较低的理化特性变化速率，该参考LNP组合物包含含有编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子，其中该核酸分子大于约4kb。

21.如权利要求20所述的LNP组合物，其中该LNP组合物的这些LNP具有的理化特性变化速率比该参考LNP组合物的这些LNP的相应速率小至少约5％。

22.如权利要求1至21中任一项所述的LNP组合物，其中该LNP组合物与参考LNP组合物的功能性能降低速率相比具有较低的功能性能降低速率，该参考LNP组合物包含含有编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子，其中该核酸分子大于约4kb。

23.如权利要求22所述的LNP组合物，其中该LNP组合物具有的功能性能降低速率比该参考LNP组合物的相应速率小至少约5％。

24.如权利要求1至23中任一项所述的LNP组合物，其中该LNP组合物的这些LNP具有的平均颗粒直径大于参考LNP组合物的LNP的平均颗粒直径，该参考LNP组合物包含含有编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子，其中该核酸分子大于约4.0kb。

25.如权利要求24所述的LNP组合物，其中该LNP组合物的这些LNP具有的平均颗粒直径比该参考LNP组合物中的LNP的平均颗粒直径大至少约10％。

26.如权利要求20至25中任一项所述的LNP组合物，其中该参考LNP组合物包含长度为约4.0kb或更多的核酸分子。

27.一种用于将核酸分子递送至细胞中的方法，该方法包括使该细胞与根据权利要求1至26中任一项所述的LNP组合物接触，其中该LNP组合物包含该核酸分子。

28.一种用于编辑细胞的基因组的方法，该方法包括向该细胞提供根据权利要求1至26中任一项所述的LNP组合物。

29.如权利要求28所述的方法，其中该LNP组合物的编辑效率大于参考LNP组合物的编辑效率，该参考LNP组合物包含含有编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子，其中该核酸分子大于约4kb。

30.如权利要求29所述的方法，其中该LNP组合物的编辑效率比该参考LNP组合物的编辑效率大至少5％。

31.如权利要求27至30中任一项所述的方法，其中该细胞是哺乳动物细胞。

32.如权利要求31所述的方法，其中该哺乳动物细胞是人类细胞、鼠类细胞、或非人灵长类动物细胞。

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