CN113699268B

CN113699268B - 小麦千粒重性状相关snp位点及其应用

Info

Publication number: CN113699268B
Application number: CN202111027769.9A
Authority: CN
Inventors: 刘西岗; 赵丹; 郭琳; 李永鹏; 景瑞莲
Original assignee: Hebei Normal University
Current assignee: Hebei Normal University
Priority date: 2021-09-02
Filing date: 2021-09-02
Publication date: 2022-09-30
Anticipated expiration: 2041-09-02
Also published as: CN113699268A

Abstract

本发明公开了一种小麦千粒重性状相关SNP位点及其应用，包括用于鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的试剂盒、引物、相关的分子标记，以及上述元素在鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状中的用途。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种和研究中具有重要意义。

Description

小麦千粒重性状相关SNP位点及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种与小麦千粒重相关的SNP位点及其应用。

背景技术

小麦(Triticum aestivum L)是我国乃至全世界着重要的粮食作物之一，提升小麦产量来满足日渐增长的粮食需求。千粒重是小麦单株产量构成的三大要素之一，对小麦产量有重要的影响，因此粒重是小麦高产稳产的关键性状之一,有复杂的数量遗传特征，其相关基因的克隆和鉴定是分子遗传改良的基础。因此，挖掘调控千粒重的优异等位变异并开发功能标记在小麦千粒重改良和小麦高产稳产中具有重要的应用价值。

目前，研究者已经定位了大量调控千粒重的QTL。胡文静等利用重组自交系共检测到2个与粒重相关的QTL,分别位于1BL和6AL上。张亚伦等利用春小麦Avocet/Sujata重组自交系群体，在4个环境下共检测到11个与千粒重相关的QTL，分别位于2AL、5AL、6AL、3BL、4BL。杨莉等利用中麦871/中麦895RIL群体266份家系为材料在1AL、2BS、3AL和5B染色体上发现了与千粒重及其相关性状显著关联的位点。关攀峰等利用普通冬小麦农大3338(ND3338)和京冬6号(JD6)衍生的DH群体,在4A染色体长臂上定位了一个多环境稳定表达的千粒重主效QTL。

尽管目前已经定位了如此大量的与小麦千粒重相关的QTL，但大多QTL的遗传效应仍不清楚。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种小麦千粒重性状相关SNP位点及其应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种鉴定或辅助鉴定小麦千粒重的方法，该方法包括如下步骤：

A、对待测小麦基因组DNA中任意一段包含如下SNP位点的DNA片段进行PCR扩增和鉴定；所述SNP位点对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第2666位碱基；

B、基于步骤A中的扩增产物确定待测小麦的基因型；

C、根据待测小麦的基因型鉴定或辅助鉴定待测小麦的千粒重性状。

作为本发明的一种优选技术方案，该方法包括如下步骤：

A、对待测小麦基因组DNA中任意一段包含如下SNP位点的DNA片段进行PCR扩增，并将该PCR扩增产物进行酶切鉴定；所述SNP位点对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第2666位碱基；

B、确定待测小麦的基因型，所述SNP位点处的核苷酸为G/G纯合时，相对应的基因型是甲；所述SNP位点处的核苷酸为A/A纯合时，相对应的基因型是乙；

C、根据待测小麦基因型按照如下标准确定待测小麦的千粒重性状：基因型甲纯合小麦的千粒重小于/候选小于基因型乙纯合小麦的千粒重。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，所述的PCR扩增的DNA片段为SEQ IDNO.1中5’末端2636-2877bp。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，所述的PCR扩增的特异性引物对为SEQID NO.2、SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，和/或SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5组成的引物对2F和2R。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，所述的酶切包括以下步骤：以小麦基因组DNA为模板，以引物1F和1R为引物对扩增得到PCR产物；将此PCR产物稀释10倍，以其作为模板，以引物2F和2R为引物对扩增得到PCR产物；用限制性内切酶SalI酶切PCR产物。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，若PCR产物不能被切开，则该核苷酸多态性位点为G/G，基因型为甲；若PCR产物可以被切开，则该核苷酸多态性位点为A/A，基因型为乙。

一种小麦育种方法，基于所述的小麦千粒重鉴定方法进行小麦育种，以获得与对照小麦相比具有更高千粒重的小麦新品种。

一种与小麦千粒重相关的基因检测试剂盒，用于检测小麦基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性，所述SNP位点对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第2666位碱基。

作为本发明的一种优选技术方案，所述基因检测试剂盒包含序列表中SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，和/或序列表中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对2F和2R；所述基因检测试剂盒中还包含有PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs中的任一种或任意多种组合。

一种与小麦千粒重相关的引物，用于检测小麦基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性，所述的SNP位点对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第2666位碱基，所述SNP位点处的核苷酸为G或A；所述引物为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，和/或序列表中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对2F和2R。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明通过对小麦自然变异群体中TabHLH92基因启动子、内含子、外显子、3'UTR的遗传变异分析，发现有9个SNP，根据TabHLH92-5B两种单倍型在2666bp位点处的SNP(G/A)，设计CAPS和dCAPS引物，该SNP存在两种基因型：基因型甲(G)、基因型乙(A)。通过关联分析证明，这两种单倍型的纯合类型中，千粒重大小为：基因型乙纯合的小麦>基因型甲纯合的小麦。实验证明，通过检测所述SNP，即可找到千粒重相对较高的小麦。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产稳产小麦品种和研究中具有重要意义。

附图说明

图1是本发明的SNP开发dCAPS标记酶切产物电泳检测结果；其中，泳道M为分子量标准；泳道A为被SalI切开的条带，泳道G为不能被SalI切开的条带。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。

应当理解，当在本申请说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素的存在或添加。

还应当理解，在本申请说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。

如在本申请说明书和所附权利要求书中所使用的那样，术语“如果”可以依据上下文被解释为“当...时”或“一旦”或“响应于确定”或“响应于检测到”。类似地，短语“如果确定”或“如果检测到[所描述条件或事件]”可以依据上下文被解释为意指“一旦确定”或“响应于确定”或“一旦检测到[所描述条件或事件]”或“响应于检测到[所描述条件或事件]”。

另外，在本申请说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。

下述实施例中所用的小麦材料均来自国家作物种质库(http://icscaas.com.cn/jiguoku/zhongzhiku.htm)，材料信息见中国作物种质信息网，网址：http://icgr.caas.net.cn。

实施例1、与小麦千粒重相关的SNP及其PCR-酶切多态性检测

1、扩增含小麦该SNP的基因组片段的特异引物及序列分析

在小麦基因组上的基因TabHLH92-5B内含子区发现1个SNP，对应于序列表中SEQID NO：1自5’末端的第2666位，该位点在小麦自然变异群体中存在两种基因型：

基因型甲：G

基因型乙：A

根据小麦不同基因组的序列差异，设计特异性引物PCR扩增分别包含该SNP位点在内的DNA片段：

F1：GGATAACGACGAGGATTCTAAAATTAGTTCT(SEQ ID NO：2)；

R1：AGTGCGAGTAGACCCCCTTCAAATTTC(SEQ ID NO：3)；

F2：AATTGCTGAAGGGACATATTAATTCAGTCG(SEQ ID NO：4)；

R2：TGGCCCTGCAGATTTTATAACATGTAAACT(SEQ ID NO：5)。

以F1和R1为引物对PCR扩增的靶序列如序列表的序列1所示的2497-3553位序列；以F2和R2为引物对PCR扩增的靶序列如序列表的序列1所示的2636-2877位序列。酶切分析显示，该多态性可分别被SalI识别。

2、PCR-酶切多态性检测及基因分型方法的建立

1)提取待测小麦的基因组DNA；

2)以步骤1)的基因组DNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR扩增的体系(10μL)为：ddH₂O 7.4μL、10×PCR Buffer 1μL、引物F1(5μmol/L)和引物R1(5μmol/L)各0.2μL、dNTP(2.5μmol/L)0.6μL，Taq酶0.1μL、模板(20ng/μL)0.5μL。

PCR扩增条件为94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30次循环；72℃10min，16℃保存。

3)将步骤2)的PCR产物稀释10倍，以其为模板，用引物F2和R2进行PCR扩增，PCR扩增的体系(10μL)为：ddH₂O 7.4μL、10×PCR Buffer 1μL、引物F2(5μmol/L)和引物R2(5μmol/L)各0.2μL、dNTP(2.5μmol/L)0.6μL，Taq酶0.1μL、模板(20ng/μL)0.5μL。

PCR扩增条件为94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃10s，32次循环；72℃10min，16℃保存。

4)将步骤3)得到的PCR产物用SalI酶切，获得酶切产物，进行4％琼脂糖凝胶电泳检测，记录PCR产物是否被切为两个片段，并根据如下方法判断并记录待测小麦在所述位点的情况：

若所述酶切产物为两个片段，则待测小麦在所述位点为A纯合(表示为A/A)的小麦(图1中的泳道A)；

若所述酶切产物为一个片段，则待测小麦在所述位点为G纯合(表示为G/G)的小麦(图1中的泳道G)。

5)根据步骤4)的结果，将小麦分为在所述位点的情况为如下I、II两种类型：

I：G/G(即基因型甲纯合)；

II：A/A(即基因型乙纯合)；

所述“/”前为一条同源染色体上的情况，所述“/”后为另一条同源染色体上的情况。

3、利用dCAPs标记对自然群体进行分型并与千粒重数性状进行关联分析

以323份六倍体小麦组成的自然群体中各小麦分别作为待测小麦，按照步骤2的方法进行分型，随机对部分小麦的扩增产物进行测序验证，结果如表1所示。

表1小麦自然群体中所述多态性位点的情况

实施例2

2015年，在中国农业科学院作物科学研究所实验农场(北京顺义)的旱地、水地、旱热、水热，2016年在中国农业科学院作物科学研究所实验农场(北京顺义和昌平)的旱地、水地、旱热、水热种植上述自然群体小麦，调查各小麦品种的千粒重，用Tassel2.1软件对千粒重和所述多态性位点的情况进行关联分析，选择混合线性模型+群体结构(MLM+(Q+K))方法进行分析，以P<0.05为显著性水平，结果如表2所示。

表2自然群体中TabHLH92-5B基因多态性位点的情况与千粒重的关联分析结果

表2的关联分析结果表明，表1所示的323份六倍体小麦组成的自然群体形成的两种类型的千粒重差异均达到显著水平(P<0.05)。其中，类型II的小麦千粒重高于类型I的小麦千粒重。10个环境中，类型II的小麦材料的千粒重分别较I的小麦高4.3243g、3.8245g、3.9125g、3.8632g、4.0036g、4.0252g、4.1502g、3.8526g、4.5885g、3.3481g。对自然群体的研究表明，类型II是提高小麦千粒重的优异基因型。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。

综上实施例可见，本发明通过对小麦自然变异群体中TabHLH92基因启动子、内含子、外显子、3'UTR的遗传变异分析，发现有9个SNP，根据TabHLH92-5B两种单倍型在2666bp位点处的SNP(G/A)，设计CAPS和dCAPS引物，该SNP存在两种基因型：基因型甲(G)、基因型乙(A)。通过关联分析证明，这两种单倍型的纯合类型中，千粒重大小为：基因型乙纯合的小麦>基因型甲纯合的小麦。实验证明，通过检测所述SNP，即可找到千粒重相对较高的小麦。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产稳产小麦品种和研究中具有重要意义。

以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河北师范大学

<120> 小麦千粒重性状相关SNP位点及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3929

<212> DNA

<213> 普通小麦(Triticum aestivum L)

<400> 1

atctgttaac tcctggtttt tgggtatttg gggcttttta tcgggctctc aggccaagct 60

tcgactagaa tactaagcga gagcctggcc tgaccacccg actttcttgc tagggcagtc 120

cgaccgggcg gtccatgcat agacctagcc ccatccatga gataaaaaaa taagggttaa 180

tttgataaca cctcaaaatc aaaaaatgcc actgcaaaaa taggcttgaa aaaatgctgc 240

tctaattttt tggatactaa tatagagata ttttaacact ttcagcgtag taaatacatg 300

tcaaaacagt taatgtatgt gtgcccgtcg aaccaaccca agcttgtgaa acaattggta 360

tttcaattaa tgaagtgaag ctgcttgctt cacgtagaga ttaattaagg atgtgctgga 420

ctacaataac cccgtttgct caatcctctt ctggctattt ttagtactgt atttgcttag 480

cgcttattgc ccacttttgt atctgatttt atatggtagg ttatgagata ctcatagtgc 540

aacattgttc atgaaccgaa aatcggtcca gtgttgttat atgggatggt agtttcccca 600

aaaaaatctc gaactcctga ggataggttg ggcgaaggaa gttttaaaac ccatgtgcgg 660

cgctttcaat ttatattcag tgtaaaaaaa gttcaagaac ggtgaaaatc ttgatatcaa 720

aataggcgca tacgtctgtt tcttaaacac agggaaagac aaagccaaac accccatgag 780

tatagatttc acggaattat agatatcaaa ataggcgcat acgtctgttt cttaaaaaaa 840

aaagctgctt ttgctaaaga aatcaaaaag gaaataaaac gcggtgctgt ttgggacgga 900

agaagttaag acgaacgctc gctcgctgtg aaaaaagaag ttgggataaa tcggcatgcc 960

aacgaacgag gttgacgtcc cggcggttgc cagccgcaag cgaagtgcta ccgcgagagc 1020

gagctgcgca ctttgtcagc cgggctcccg cgtggaacct tctgcgtttg cctttgccta 1080

agtgtgcgac gccatcgccc caatcgcgta ccgcgttgcc gcgagtaggc ccatcactac 1140

ctcgtgctca ttccgactcg cgcccctggc cgagctcaca ataaacgaga aaaaaataat 1200

tcgtcccggc tttgaccgtc tcgcctcttt tagccctctc cgcctctctc tcagaccgta 1260

cgggtccatt tgaccacgtg acccaaatcc gccacttggg ccccatggct ccctctcccc 1320

ctcccgccgc ggctatataa ccgcgtccgg acattttccc gacaaacact tcaccttcac 1380

caagcaagca cacacacagc gcccagcagc gactcatcga cgcagagcag aggagcgaag 1440

gaggccggcc ggcgggatcg acgcaaatgc agatggactc ctactacttc cacgacgacg 1500

cccacctctt cgccggctgc ggcgtccccg gctcgccgga cctgcccttc gccgacctca 1560

ttgcgtcgct ctcggagccg ctgcctgcgg tggtagagag ccagagcgcg ttccgggagt 1620

accgcggcgt cggcctggag cttccgggga cggcccgggg aggaaccggg aacgggatca 1680

acatccaccg gaggatgatg ggcgtgctgg gcaggatggg gccggccgct gaggaggagg 1740

agcggccgca gcaccagcag cagcaggcgg ccggcgccgt cgagagcagc cgcgggttcc 1800

ggcacatgat gcgcgagcgc cagcgccgcg agaagctcag ccagagctac gccgacctct 1860

acgccatggt ctcctcccgc tccaaggtac ccaacattcc acattccatc tcactgaatg 1920

atcgattccc tgtgctgaat tcggcaagcg ctcgaatgcc acgtgctgaa cgaatgaatg 1980

ggtgatgcca ttgcagcagg acaagaactc gatcgtgcag tccgcggccg tctacatcca 2040

cgagctcaag gtcgccaagg agcagctcca gaggaggaac gacgagctca aggccaagat 2100

cctggggcac gacgagcagc agcagtgcgt caaggtccag ttcgaggtgg acgagccctc 2160

gtcctccgtc gactccatga tcggggccct cacgcgcctc aagagcatga atgtcaagac 2220

cagggggatc cactccatct tgtccggcca gcggttgacg acggagatga atgtcgaaac 2280

cacggtgagc tagcttcatt tttcttacct tagtcctcct acctgctttg ttgacaataa 2340

taaacccgac taaacttcag gttagaaaat acacaacagt tgagtcaccc acaagatttt 2400

ttcggaattt ccgtgttctt ttagtacact actacatcat cgatatccat tactagtaca 2460

tcattgcgct gttcgatagg gactgcatca tcgataggat aacgacgagg attctaaaat 2520

tagttctaga aatgactgca atatgtttta aatcttgtgt ttttgttgaa agctacaaaa 2580

catcttggtt gtgagaatcc ggattaagcc atgtgaggat caaagtatac tataaaattg 2640

ctgaagggac atattaattc attcggccgt ttacactttt catcaaaatt tgacactcgg 2700

tcttttctaa tacaaatcac gagaaagcac agcttaaaat ttgagcaaga caaataaaaa 2760

atttgactat cgccgaggaa tctgtgtcaa aagttgtgtt agaaaccctc tgactgatga 2820

agacatcatt tgaacatatc ctttgccagt ttacatgtta taaaatctgc agggccaatc 2880

cttgtcgaat taatccgcat ccgctgttac tgtcaaacaa aataaattct gcagctactg 2940

ttaggtcaat tttttccgca agaatcgaac aatcttgccc tttttaagaa ctacaccaaa 3000

atgaatcaag tcaacggatc cccaatctga ataatgcggt gtcaagctta acatttactc 3060

aaggttcaat gcatgattga tcagtatcat attatatata gtaagccgct tgtacactct 3120

taactaacca tgctgctttc ctcacgtgtc ctattcacag attgcggcct gcgaggtaga 3180

aaaggcagtg gaggaggctc tccaggaagt agagaggaat cagctgcctg acagcgaggc 3240

cccgtttccc ggaagcagga gcgcctggcc tcaaacatca cacgtgcaaa atgtgttctg 3300

agaggtttct aaccacaaga gtcatgagac ccatctgttc attgtttttt ctcctctctt 3360

tttttcttgt tcttctgatg atggagcaaa tgaatacctc caccagctta ttgtgctctc 3420

gaccctcgtg tcttggtcct ggtggtcttt tttagaggct gtgaagatgt aagtagctcc 3480

tcagatgtgt agctagtgag gtcaacttgg aatcaaatgg gttggagaaa tttgaagggg 3540

gtctactcgc actgtttggc ctggcgctta cgtgtggccg tagcaaggaa gagaaaagga 3600

tctgacaagt tgagaaggat tgtcaaacgt ttggaagaag agggaccagc aagccttggc 3660

tgctgagact gtaaatttgc aaccacccaa tgttcgaaat cgagtatata tttttcctct 3720

aaacaggatc gttgtgtttc gagcaacctt ttcactaaaa tctcattgaa atttgttata 3780

gttgttataa actacattta aactttctcg tgtttgtaac ctaggagcat tgcaaggagc 3840

tcaactattc tcgtgttttt acctgacaac attgtaagga gctcaacgcg agaactttca 3900

acaacaaatc ttcacccttg gccattgtc 3929

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggataacgac gaggattcta aaattagttc t 31

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtgcgagta gacccccttc aaatttc 27

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aattgctgaa gggacatatt aattcagtcg 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggccctgca gattttataa catgtaaact 30

Claims

1.一种鉴定或辅助鉴定小麦千粒重的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

C、根据待测小麦基因型按照如下标准确定待测小麦的千粒重性状：基因型甲纯合小麦的千粒重小于或候选小于基因型乙纯合小麦的千粒重；

步骤A中，所述的PCR扩增的特异性引物对为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5组成的引物对2F和2R；

步骤A中，所述的酶切包括以下步骤：以小麦基因组DNA为模板，以引物1F和1R为引物对扩增得到第一PCR产物；将此第一PCR产物稀释10倍，以其作为模板，以引物2F和2R为引物对扩增得到第二PCR产物；用限制性内切酶SalI酶切第二PCR产物；

步骤B中，若第二PCR产物不能被切开，则核苷酸多态性位点为G/G；若第二PCR产物可以被切开，则核苷酸多态性位点为A/A。

2.根据权利要求1所述的鉴定或辅助鉴定小麦千粒重的方法，其特征在于：步骤A中，所述的PCR扩增的DNA片段为SEQ ID NO.1中5’末端2636-2877bp。

3.权利要求1或2任一项所述方法的用途，用于小麦育种。

4.一种与小麦千粒重相关的基因检测试剂盒，用于检测小麦基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性，所述SNP位点对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第2666位碱基；所述基因检测试剂盒包含SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，和SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对2F和2R；所述基因检测试剂盒中还包含有PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs中的任一种或任意多种组合。

5.一种与小麦千粒重相关的引物，用于检测小麦基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性，所述的SNP位点对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第2666位碱基，所述SNP位点处的核苷酸为G或A；所述引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，和SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对2F和2R。