CN113694258A - 一种生物活性骨水泥复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生物活性骨水泥复合材料及其制备方法和应用，属于医用骨组织再生材料制备技术领域。本发明首先采用水热共沉淀法制备镁铝水滑石微片，然后以该镁铝水滑石微片作为改良掺杂剂，将甲基丙烯酸甲酯与聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥聚合，同时与镁铝水滑石和I型胶原蛋白结合，制备得到镁铝水滑石修饰的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥复合材料，镁铝水滑石微片可在骨再生过程中持续释放镁离子，促进细胞外基质中钙结节的形成，并能通过影响多种关键的成骨信号通路促进骨缺损部位骨的再生，所以具有优异的成骨性能。

Description

一种生物活性骨水泥复合材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医用骨组织再生材料制备技术领域，尤其涉及一种生物活性骨水泥复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
虽然骨组织具有足够的天然再生能力，足以修复小的损伤部位，如裂缝和某些类型的骨折，但超过临界大小阈值(通常>2厘米，取决于解剖部位)的骨缺损将不会在没有辅助的情况下愈合。创伤、退行性疾病、先天性缺陷或肿瘤的手术切除可能导致大的骨缺损或缺失，如果要实现功能恢复和完全愈合，则需要临床干预，使用生物惰性金属装置或自体骨移植进行骨固定。
目前，骨水泥是很好的临床填充修复骨缺损材料，在世界范围内临床主要使用的骨水泥是聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。但是聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥还是存在一些局限性，例如聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥的生物惰性、不可降解性和潜在的细胞毒性限制了骨的再生长，以及较高的聚合温度则会导致周围相关成骨细胞死亡，随后形成的纤维化膜会阻碍聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥与骨的结合。因此，聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥由于上述缺点而无法在植入部位形成生物骨整合，并且还会导致骨水泥无菌性松动，这已成为75％以上全髋/膝关节置换手术失败的主要因素。
到目前为止，为了提高聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥的生物安全性和成骨性能，已经添加了如羟基磷灰石或掺锶羟基磷灰石、可生物降解的壳聚糖和透明质酸钠等材料。然而上述材料的添加并没有带来有效的成骨性能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物活性骨水泥复合材料及其制备方法和应用，所制备的生物活性骨水泥复合材料具有优异的成骨性能。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种生物活性骨水泥复合材料的制备方法，包括以下步骤：
将镁盐、铝盐、尿素和水混合，将所得混合液进行水热共沉淀，得到镁铝水滑石微片；
将所述镁铝水滑石微片、I型胶原蛋白、聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥和甲基丙烯酸甲酯单体混合，进行聚合反应，得到生物活性骨水泥复合材料。
优选的，所述镁盐包括硝酸镁、硫酸镁或氯化镁；所述铝盐包括硝酸铝、氯化铝或硫酸铝；所述镁盐中镁离子与铝盐中铝离子的摩尔比为(2～4):1。
优选的，所述尿素与铝盐中铝离子的摩尔比为12:1；所述混合液中镁盐和铝盐的总浓度为0.04～0.5mol/L。
优选的，所述水热共沉淀的温度为80～120℃，反应时间为24～48h。
优选的，所述镁铝水滑石微片的直径为6±2μm，形貌为六方纳米片。
优选的，以所述镁铝水滑石微片、I型胶原蛋白和聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥总质量百分数为100％计，所述镁铝水滑石微片、I型胶原蛋白和聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥的质量百分比为10～20％:10～20％:70％。
优选的，所述甲基丙烯酸甲酯单体与镁铝水滑石微片、I型胶原蛋白和聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥总质量的用量比为5mL:10g。
优选的，所述聚合反应的温度为室温，时间为15～25min。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的生物活性骨水泥复合材料，包括共混的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥、镁铝水滑石微片和I型胶原蛋白。
本发明提供了上述技术方案所述生物活性骨水泥复合材料在制备骨缺损再生修复材料中的应用。
本发明提供了一种生物活性骨水泥复合材料的制备方法，首先采用水热共沉淀法制备镁铝水滑石微片，然后以该镁铝水滑石微片作为改良掺杂剂，将甲基丙烯酸甲酯与聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥聚合，同时与镁铝水滑石微片和I型胶原蛋白结合，制备得到镁铝水滑石修饰的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥复合材料，其中，镁铝水滑石微片可在骨再生过程中持续释放镁离子，促进细胞外基质中钙结节的形成，并能通过影响多种关键的成骨信号通路促进骨缺损部位骨的再生，所以具有优异的成骨性能。实施例的结果表明，本发明制备的生物活性骨水泥复合材料可以激活P38MAPK、ERK/MAPK、FGF-18、TGF-β成骨信号通路，显著促进成骨基因P-p38/p38、Runx2、Alp的表达。
本发明的制备方法简单，易于操作，所需原料廉价易得，具有良好的生物相容性及降解性能，使所制备的生物活性骨水泥复合材料具有良好的生物相容性，且与纯聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥相比成骨性能更加优异，在相关骨科手术中具有潜在的应用前景。
聚甲基丙烯酸甲酯属于生物惰性材料，不能与宿主骨组织形成有机的化学界面结合，本发明制备的生物活性骨水泥复合材料包括镁铝水滑石微片，富镁的微环境可以刺激干细胞成骨分化，促进血管化骨再生，增强组织再生，镁铝水滑石中镁离子的适度释放可以激活成骨信号通路，促进成骨基因的表达，促进了蛋白吸附、成骨细胞附着、铺展及随后的增殖，从而提高骨髓间充质干细胞的成骨分化，提高PMMA的生物活性，有效赋予生物惰性聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥生物活性，促进体内骨形成，改善骨与骨水泥的界面骨结合，有望成为骨科手术的一种很有前途的生物材料。
附图说明
图1为实施例1和对比例1～3制备的材料的SEM图、实施例1制备的材料实物图和实施例1和对比例1～3制备的材料原子力显微镜图；
图2为实施例1和对比例1～3制备的复合材料及对照组用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测的生物相容性图；
图3为实施例1和对比例1～3制备的复合材料的细胞碱性磷酸酶(ALP)染色图；
图4为实施例1和对比例1～3制备的复合材料在不同形式下培养所得细胞茜素红S(Alizarin red S)染色图；
图5为直观显示上调基因(红点)和下调基因(绿点)的数量的火山图；
图6为基因本体(GO)富集分析图；
图7为基因组百科全书(KEGG)分析图；
图8为独创性路径分析软件生成的前18条典型路径图；
图9为由Invenuity Pathway Analysis软件生成的与成骨相关信号通路有关的差异表达基因的分子相互作用网络和亚细胞定位图；
图10为采用定量聚合酶链式反应(qPCR)和免疫蛋白印迹法(WB)验证实施例1和对比例1～3制备的材料的转录组测序和IPA的结果图；
图11为实施例1和对比例1～3制备的复合材料植入兔子颅骨的手术图及0周、4周和8周后颅骨的Micro-CT图；
图12为实施例1和对比例1～3制备的复合材料及在植入兔子颅骨后0周、4周和8周的酸性品红染色图；
图13为实施例1和对比例1～3制备的复合材料聚合反应温度的测定结果图；
图14为实施例1和对比例2制备的复合材料成骨化培养基中，培养第1、3、5、7、9、11、13天的镁离子释放浓度的测定结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种生物活性骨水泥复合材料的制备方法，包括以下步骤：
将镁盐、铝盐、尿素和水混合，将所得混合液进行水热共沉淀，得到镁铝水滑石微片；
将所述镁铝水滑石微片、I型胶原蛋白、聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥和甲基丙烯酸甲酯单体混合，进行聚合反应，得到生物活性骨水泥复合材料。
在本发明中，若无特殊说明，所需制备原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。
本发明将镁盐、铝盐、尿素和水混合，将所得混合液进行水热共沉淀，得到镁铝水滑石微片。在本发明中，所述镁盐优选包括硝酸镁、硫酸镁或氯化镁；在本发明的实施例中，具体为Mg(NO3)2·6H2O；所述铝盐优选包括硝酸铝、氯化铝或硫酸铝，在本发明的实施例中，具体为Al(NO3)3·9H2O；所述镁盐中镁离子与铝盐中铝离子的摩尔比优选为(2～4):1，更优选为(2.5～3.5):1。在本发明中，所述尿素与铝盐的摩尔比优选为12:1；所述混合液中镁盐和铝盐的总浓度为0.04～0.5mol/L，更优选为0.1～0.4mol/L，进一步优选为0.2～0.3mol/L。
本发明对所述镁盐、铝盐、尿素和水混合的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程将物料混合均匀即可。
在本发明中，所述水热共沉淀优选在100mL特氟龙内衬不锈钢高压釜中进行，所述水热共沉淀的温度优选为80～120℃，更优选为100℃，反应时间优选为24～48h，更优选为36h。
完成所述水热共沉淀后，本发明优选将所得产物自然冷却至室温，离心后，收集所得产物分别采用乙醇和去离子水洗涤三次，干燥后，得到镁铝水滑石微片；所述干燥优选在烘箱中进行，所述干燥的温度优选为60℃，本发明对所述干燥的时间没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程实现干燥即可。本发明对所述冷却和离心的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可。
在本发明中，所述水滑石微片的组成为M2+ 1-xM3+ x(OH)2·An- x/n·zH2O，其中M2+代表Mg2+，M3+代表Al3+，An-为层间阴离子；A为CO3 2-、NO3 -、Cl-、OH-、SO4 2-或PO4 3-；x＝0.17～0.33，n＝1～3。
在本发明中，所述镁铝水滑石微片的直径优选为6±2μm，形貌为六方纳米片。本发明采用尿素法合成的镁铝水滑石具有较低的过饱和度，且镁铝水滑石纳米片生长完整，结晶度较高，并且得到的晶粒尺寸较大，在聚甲基丙烯酸甲酯表面形成一定数量的孔隙，有利于骨修复。
得到镁铝水滑石微片后，本发明将所述镁铝水滑石微片、I型胶原蛋白、聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥和甲基丙烯酸甲酯单体混合，进行聚合反应，得到生物活性骨水泥复合材料(PMMA&COL-I&LDH)。
在本发明中，以所述镁铝水滑石微片、I型胶原蛋白和聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥总质量百分数为100％计，所述镁铝水滑石微片、I型胶原蛋白和聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥的质量百分比优选为10～20％:10～20％:70％，更优选为15％:15％:70％。
本发明利用Ⅰ型胶原蛋白修复受损组织，且与脂肪干细胞具有良好的体外生物相容性，为组织工程种子细胞的生长提供适宜的三维空间，作为脂肪组织工程种子细胞的载体材料。
在本发明中，所述甲基丙烯酸甲酯单体与镁铝水滑石微片、I型胶原蛋白和聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥总质量的用量比优选为5mL:10g。
在本发明中，所述镁铝水滑石微片、I型胶原蛋白、聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥和甲基丙烯酸甲酯单体混合的过程优选为将镁铝水滑石微片、I型胶原蛋白和聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥(粉末)混合后，向所得混合物中加入甲基丙烯酸甲酯单体(液态)。
在本发明中，所述聚合反应的温度优选为室温，时间优选为15～25min，更优选为20min。在所述聚合反应过程中，聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥粉末与甲基丙烯酸甲酯单体发生聚合反应，生成聚甲基丙烯酸甲酯，并且与粉末状镁铝水滑石微片、I型胶原蛋白混合掺杂到一起，形成复合材料。
完成所述聚合反应后，本发明优选无需进行后处理，即可得到生物活性骨水泥复合材料。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的生物活性骨水泥复合材料，包括共混的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥、镁铝水滑石微片和I型胶原蛋白。在本发明中，所述共混的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥、镁铝水滑石微片和I型胶原蛋白的存在方式为物理共混。
本发明提供了上述技术方案所述生物活性骨水泥复合材料在制备骨缺损再生修复材料中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，按照本领域熟知的方法应用即可。在本发明中，所述生物活性骨水泥复合材料优选可压制为特定形状的材料，便于其应用。所述压制的方法优选包括将所述生物活性骨水泥复合材料填充至相应形状的模具中，进行压制；本发明对所述模具和压制的过程没有特殊的限定，选用本领域熟知的模具按照本领域熟知的过程进行压制即可。在本发明中，所述模具优选为直径6毫米、高度12毫米的圆柱形试件，或者优选为长75毫米、宽10毫米和厚3.3毫米的平板试件。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
镁铝(镁铝元素摩尔比为2:1)水滑石(MgAl-LDH)的合成：
将2mmol Mg(NO3)2·6H2O、1mmol Al(NO3)3·9H2O和12mmol尿素溶于70mL去离子水中，得到混合液；
将70mL所述混合液转移到100mL特氟龙内衬不锈钢高压釜中，在100℃进行水热共沉淀24h；将所得产物体系自然冷却至室温，离心收集所得产物，然后用乙醇和去离子水分别洗涤三次，放入60℃烘箱中干燥，得到镁铝水滑石微片粉末，记为MgAl-LDH；
将聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥粉末(7g)、I型胶原蛋白粉末(1.5g)和镁铝水滑石微片粉末(1.5g)混合后，向所得混合物中加入5mL液态甲基丙烯酸甲酯单体，充分混合后，在室温(25℃)进行聚合反应20min，得到生物活性骨水泥复合材料，总质量为10g，记为PMMA&COL-I&LDH。
对比例1
将聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥粉末(8.5g)和I型胶原蛋白粉末(1.5g)加入到5mL液态甲基丙烯酸甲酯单体中，充分混合后，在室温(25℃)下进行聚合反应20min，得到聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥与I型胶原蛋白的混合材料，质量为10g，记为PMMA&COL-I。
对比例2
按照实施例1的方法制备镁铝水滑石微片粉末；
将聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥粉末(8.5g)和镁铝水滑石微片粉末(1.5g)加入到5mL液态甲基丙烯酸甲酯单体中，充分混合后，在室温(25℃)下引发甲基丙烯酸甲酯聚合反应20min，得到聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥与镁铝水滑石微片的混合材料，质量为10g，记为PMMA&LDH。
对比例3
将聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥粉末(10g)加入到5mL液态甲基丙烯酸甲酯单体中，充分混合后，在室温(25℃)下进行聚合反应20min，得到聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥，质量为10g，记为PMMA。
表征及测试
1)对实施例1制备的镁铝水滑石、复合材料以及对比例1～3制备的材料分别进行SEM测试，对实施例1和对比例1～3制备的材料进行透射电镜测试，结果见图1，其中，a～e分别为实施例1制备的LDH、对比例1～3和实施例1制备的材料的SEM图，g为实施例1和对比例1～3制备的材料的原子力显微镜图；由图1可知，MgAl-LDHs由直径分布为6±2μm的六边形纳米片组成；PMMA&LDH和PMMA&COL-I&LDH表面存在微孔，有利于成骨。
图1中f为实施例1制备的生物活性骨水泥复合材料的实物照片，由图1中f可知，生物活性骨水泥复合材料可以压缩为直径为6mm大小的圆形材料。
2)对实施例1、对比例1～3制备的材料进行体外生物相容性测试，方法为：将PMMA、PMMA&Col-I、PMMA&LDH和PMMA&Col-I&LDH分别制成直径为6mm、厚度为2.5mm的圆盘状试样，所有试样在细胞试验前均用环氧乙烷消毒。首先，将10000个人骨髓间充质干细胞接种在孔径为3μm的24孔板中12h，以使细胞完全粘附，然后将一个圆盘状样品添加到上室。此外，将一个圆盘状试样用胶原蛋白固定在24孔板的底部1h，将10000个细胞直接接种在盘状试样的表面，每组设3个平行孔。这些孔板被放置在37℃、5％二氧化碳和95％相对湿度的大气中。空白对照组仅含细胞。分别于第1、3、5、7天进行CCK-8测定，用多功能全波长微板仪(Varioskan Flash；Thermo Fisher Science，USA)测定450±5nm处的OD值，第3天用美国BDBiosciences公司的FACSCanto plus进行流式细胞仪检测；所得结果见图2，其中，a为实施例1和对比例1～3制备的材料通过间接接触培养1、3、5和7天后的细胞存活率；b为实施例1和对比例1～3制备的材料通过直接接触培养1、3、5和7天后的细胞存活率。
由图2可知，培养1、3、5、7天后，用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)比色法测定PMMA、PMMA&COL-I、PMMA&LDH和PMMA&COL-I&LDH间接(图2中a)和直接接触(图2中b)处理的人骨髓间充质干细胞存活率。如图2所示，随着孵育时间的延长，四组细胞的光密度值(OD)值逐渐增加，并呈现与空白对照组相似的趋势。而且，PMMA&COL-I、PMMA&LDH和PMMA&COL-I&LDH的细胞存活率分别是PMMA的1.55倍、1.43倍和1.48倍(图2中a)，图2中c为流式细胞仪测定的四组材料的细胞存活率，由图2中c可知，PMMA、PMMA&COL-I、PMMA&LDH和PMMA&COL-I&LDH的活细胞百分率分别为80.6％和90.5％和84.6％和89.9％，PMMA&Col-I&LDH组比PMMA&LDH组活细胞存活率更高，这说明PMMA&COL-I、PMMA&LDH和PMMA&COL-I&LDH与单独的PMMA相比生物相容性提高很多，改善了PMMA的生物惰性。而且材料的生物相容性好，说明材料毒性较低，但除了生物相容性还要考虑材料的力学性能、成骨能力，促成骨基因的表达，综合考虑PMMA&COL-I&LDH的成骨能力更优异。
3)对实施例1、对比例1～3制备的材料进行碱性磷酸酶(ALP)染色实验，研究不同材料诱导人骨髓间充质干细胞的成骨分化情况，方法为：将PMMA、PMMA&Col-I、PMMA&LDH和PMMA&Col-I&LDH分别制成直径为6mm、厚度为2.5mm的圆盘状试样，所有试样在细胞试验前均用环氧乙烷消毒。选择成骨分化培养基和孔径为3μm的6孔跨孔板进行间接培养。将3万个人骨髓间充质干细胞细胞接种到下室，12h后在每个上室分别加入PMMA、PMMA&Col-I、PMMA&LDH和PMMA&Col-I&LDH试样(每个上室3个试样)。此外，将每组3个试样固定在6孔板的底部，然后在试样表面直接种植3万个细胞。第14天，全部取出上室和ODM(成骨分化培养基)，每孔细胞用2m磷酸盐洗涤2次。然后，用2mL质量浓度为4％的多聚甲醛固定细胞15min，每孔用蒸馏水冲洗3次后，用2mL碱性磷酸酶(ALP)染色液孵育20min；随后，所有细胞用PBS洗涤3次，并用Eclipse80i显微镜观察，所得结果见图3。
如图3所示，在第14天通过碱性磷酸酶(ALP)染色试验评估不同材料的成骨分化能力，PMMA&LDH以及PMMA&COL-I&LDH组的ALP阳性细胞明显大于PMMA和PMMA&COL-I组。
对图3中不同材料的新生骨体积进行三维重建和骨体积定量分析，结果发现，术后2个月PMMA&LDH和PMMA&Col-I&LDH成骨体积分别是PMMA组的18.34倍和17.29倍，这是因为Col-I的存在占据了PMMA&Col-I&LDH的部分表面，与PMMA&LDH相比，暴露在表面的LDH颗粒数量减少，从而削弱了LDH微片诱导的成骨作用。LDH改性PMMA和Col-I&LDH改性PMMA骨水泥在体内均有明显的成骨作用。由于Col-I的存在占据了PMMA&Col-I&LDH的部分表面，与PMMA&LDH相比，暴露在表面的LDH颗粒数量减少，从而削弱了LDH微片诱导的成骨作用，使PMMA&Col-I&LDH的成骨体积小于PMMA&LDH。
4)对实施例1、对比例1～3制备的材料进行茜素红S染色实验，方法为：将PMMA、PMMA&Col-I、PMMA&LDH和PMMA&Col-I&LDH分别制成直径为6mm、厚度为2.5mm的圆盘状试样。所有试样在细胞试验前均用环氧乙烷消毒。选择成骨分化培养基和孔径为3μm的6孔跨孔板进行间接培养：将3万个人骨髓间充质干细胞接种到下室，12h后在每个上室分别加入PMMA、PMMA&Col-I、PMMA&LDH和PMMA&Col-I&LDH试样(每个上室3个试样)。此外，将每组3个试样固定在6孔板的底部，然后在试样表面直接种植3万个细胞。第14天，全部取出上室和ODM，每孔细胞用2m磷酸盐洗涤2次。然后，用2mL质量浓度为4％多聚甲醛固定细胞15min。每孔用蒸馏水冲洗3次后，用2mL茜素红S染色液孵育15min。随后，所有细胞用PBS洗涤3次，并用Eclipse80i显微镜观察，所得结果见图4；其中，a为实施例1和对比例1～3的材料在500μm条件下的染色效果图，b为实施例1和对比例1～3的材料在200μm条件下的染色效果图。
由图4可知，经PMMA&LDH和PMMA&COL-I&LDH间接处理的细胞外基质的红色区域(茜素红S染色的钙结节)比PMMA和PMMA&COL-I组更明显(图4中a)。此外，直接在PMMA&LDH和PMMA&COL-I&LDH表面培养的人骨髓间充质干细胞细胞外基质中的钙结节也比PMMA和PMMA&COL-I组更明显(图4中b)。因此，PMMA&LDH组和PMMA&Col-I&LDH组直接和间接培养的hBMSCs细胞外基质中的钙结节都比较明显，说明成骨细胞数量较多，即LDH改性PMMA具有良好的成骨能力。
利用原子力显微镜对实施例1和对比例1～3的材料的表面粗糙度进行定量分析，所得结果见图4中c。如图4中c所示，PMMA、PMMA&COL-I、PMMA&LDH和PMMA&COL-I&LDH的表面粗糙度分别为0.38±0.02μm、0.82±0.02μm、1.57±0.09μm和1.93±0.07μm，其中PMMA&Col-I&LDH的表面粗糙度最高，更有利于成骨。
根据ISO 5833-2002的方法对实施例1和对比例1～3制备的材料的抗弯强度进行测试，根据试验机记录的位移-荷载曲线得到的应力-应变曲线线性区域的斜率，以及材料的高度和直径，计算各材料的压缩模量，所得结果见图4中d。如图4中d所示，COL-I或LDH的加入使PMMA的抗弯强度降低了17.72％和23.66％，PMMA&COL-I&LDH的抗弯强度不符合IOS5833的标准。因此，添加COL-I或LDH可能减轻应力屏蔽性骨溶解，并间接促进骨整合。
4)对对比例2～3制备的材料进行转录组基因测序，然后对测序结果和独创性途径进行分析，揭示聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥和镁铝水滑石微片诱导成骨分化的机制，并与聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥进行比较，所得结果见图5～9；图5为直观显示上调基因(红点)和下调基因(绿点)的数量的火山图；图6为基因本体(GO)富集分析图；图7为基因组百科全书(KEGG)分析图；图8为独创性路径分析软件生成的前18条典型路径图；图9为由InvenuityPathway Analysis软件生成的与成骨相关信号通路有关的差异表达基因的分子相互作用网络和亚细胞定位图。
由图5可知，差异表达基因总数为739个，其中上调基因367个，下调基因372个；通过基因本体论(GO)富集分析上述差异表达基因，其中大部分与成骨和血管生成有关，包括细胞外基质组织、细胞粘附、胶原蛋白分解代谢过程、胶原蛋白纤维组织、血管发育、细胞区域、细胞外基质、细胞外基质结构成分、核受体活性和E-box结合(图6)；在前20个信号通路中，有4个与成骨有关(图7)；图8显示PMMA&LDH激活了p38 MAPK、细胞外信号调节激酶(ERK)/MAPK、FGF和转化生长因子-β(TGF-β)信号通路，所有这些都促进了人骨髓间充质干细胞的成骨分化；此外，图9展示了参与成骨相关信号通路的差异表达基因的分子相互作用网络和亚细胞定位。
6)采用定量聚合酶链式反应(qPCR)和免疫蛋白印迹法(WB)检验来验证实施例1和对比例1～3制备的材料的转录组测序和独创性途径分析(IPA)的结果，所得结果如图10所示，其中，a为qPCR测定第7天人骨髓间充质干细胞成骨标志物(Runx2、ALP、p38和P-p38)的相对基因转录水平；b为蛋白质印记分析Runx2、ALP基因的表达，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为对照基因；c为ImageJ 1.52q 1.52v软件分析Runx2基因的表达；d为ImageJ 1.52q1.52v软件分析ALP基因的表达；e为蛋白质印记分析p38和P-p38基因的表达，GAPDH作为对照基因；f为ImageJ 1.52q 1.52v软件分析p38/P-p38比值的表达。
从图10中a可以看出，PMMA&COL-I、PMMA&LDH和PMMA&COLI&LDH处理的人骨髓间充质干细胞的RUNX2转录水平分别是PMMA处理组的1.16倍、2.01倍和2.06倍。PMMA&COL-I、PMMA&LDH、PMMA&COL-I&LDH处理的人骨髓间充质干细胞的ALP转录水平分别是PMMA组的1.51倍、2.40倍和2.55倍。此外，PMMA&COL-I组、PMMA&LDH组、PMMA&COL-I&LDH组的P-p38与p-38的比值分别是PMMA组的2.17倍、7.37倍和7.46倍。除转录水平外，还通过WB法还检测了翻译水平；PMMA&COL-I组、PMMA&LDH组以及PMMA&COL-I&LDH组中人骨髓间充质干细胞的RUNX2的翻译水平分别比PMMA组高1.99倍、3.00倍和3.01倍(图10中b和c)。PMMA&COL-I组、PMMA&LDH组和PMMA&COL-I&LDH组人骨髓间充质干细胞的ALP翻译水平分别是PMMA组的2.01倍、2.95倍和3.23倍(图10中b和d)。图10中e通过蛋白质印记分析，测定P-p38与p-38基因的表达水平，PMMA&COL-I组、PMMA&LDH组和PMMA&COL-I&LDH组人骨髓间充质干细胞的P-p38/p-38翻译水平分别是PMMA组的2.62倍、6.34倍和7.66倍(图10中e和f)。以上结果表明，LDH通过激活p38MAPK、ERK/MAPK、FGF18和转化生长因子-β信号通路，显著促进成骨基因的表达。
7)将实施例1和对比例1～3制备的材料植入兔子颅骨，同时通过Micro-CT检测0周、4周和8周的颅骨的再生状态，植入过程如图11所示，其中，a～d为植入过程：对手术区域进行消毒，切开兔子皮肤，制造4个直径为6mm的骨缺损，将不同测试材料放入相应位置(图11中e为实施例1和对比例1～3材料的对应植入位置)，显微CT扫描术后0个月、1个月和2个月的三维结构(左)、矢状面(右上)和冠状面(右下)的代表性横断面图，结果见图11。根据图11中1个月和2个月的Micro-CT图像可以得出，PMMA&LDH组和PMMA&COL-I&LDH组的骨与种植体之间的骨结合明显优于PMMA组和PMMA&COL-I组，且矢状面和冠状面上的骨结合均随时间的延长而增加。
8)将上述7)中在对应位置植入不同材料的兔子颅骨0周、4周和8周后分别进行酸性品红染色，所得结果见图12。由图12可知，酸性品红染色分析种植体骨生长的程度，结果与Micro-CT结果相似。PMMA&LDH比PMMA&COL-I和PMMA&COL-I和PMMA&COL-I&LDH具有更强的促成骨能力的原因有两个：对于PMMA&COL-I和PMMA&LDH，LDH释放的镁离子比COL-I更能促进成骨。对于PMMA&LDH和PMMA&COL-I&LDH，COL-I的存在占据了PMMA&COL-I&LDH的部分表面，与PMMA&LDH相比，暴露在表面的LDH颗粒数量减少，从而削弱了LDH微片诱导的成骨作用。
通过转录组测序、成骨基因表达的测定，结果表明，PMMA&Col-I&LDH中水滑石与Col-I的加入与单独的PMMA相比，激活p38MAPK、ERK/MAPK、FGF18和转化生长因子-β信号通路，相关骨基因的表达水平更高，综合考量PMMA&Col-I&LDH的成骨性能更好。
9)聚合反应温度测定：
测试的材料分别为：PMMA(100％)、PMMA和COL-I(85％和15％)、PMMA和LDH(85％和15％)和PMMA和COL-I和LDH(70％和15％和15％)，材料的总重量均为10g，材料的具体制备过程为：按照实施例1和对比例1～3的方案，在聚甲基丙烯酸甲酯粉末和COL-I和/或LDH充分混合后，将液态甲基丙烯酸甲酯单体加入聚甲基丙烯酸甲酯粉末中以引发甲基丙烯酸甲酯的聚合反应。20mL的注射器筒用作甲基丙烯酸甲酯聚合的反应容器。FLUKE红外成像仪(美国华盛顿FLUKE)用于测定不同材料的聚合反应温度变化，所得结果见图13。
由图13可知，与PMMA相比，LDH改性PMMA(PMMA&LDH)的最高温度降低了7.0℃，这可归因于LDH具有一定的绝热作用，加入后可以降低MMA聚合反应的最高温度，从而减轻LDH改性PMMA周围成骨相关细胞的热损伤；其次添加LDH会减轻应力屏蔽性骨溶解，间接促进骨整合。
10)将实施例1和对比例2制备的PMMA&COL-I&LDH和PMMA&LDH在成骨化培养基中培养第1、3、5、7、9、11、13天，测试其镁离子释放浓度，所得结果见图14；从图14中可以看到，随着培养时间的延长，PMMA&LDH和PMMA&COL-I&LDH释放的镁离子浓度分别约为1.60和1.31μmol/mL，小于合成水滑石中总的镁离子浓度，且浓度基本是恒定不变的，说明实施例1制备的材料在成骨化培养基中适度释放镁离子。
由以上实施例和对比例可知，由于Col-I的存在占据了PMMA&Col-I&LDH的部分表面，与PMMA&LDH相比，暴露在表面的LDH颗粒数量减少，从而削弱了LDH微片诱导的成骨作用，使PMMA&Col-I&LDH的成骨体积小于PMMA&LDH。但是MMA&Col-I&LDH与PMMA&LDH相比，它的表面粗糙度更高，更有利于成骨；Col-I的加入降低了PMMA的弯曲强度，减轻应力屏蔽性骨溶解，间接促进骨整合；通过流式细胞仪检测可以发现PMMA&Col-I&LDH组比PMMA&LDH组活细胞存活率更高，生物相容性更好；通过转录组测序、成骨基因表达的测定，PMMA&Col-I&LDH的加入激活p38MAPK、ERK/MAPK、FGF18和转化生长因子-β信号通路，相关骨基因的表达水平更高，综合考量力学性能、生物相容性、基因表达促进成骨分化等多方面，PMMA&Col-I&LDH的成骨性能更好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种生物活性骨水泥复合材料的制备方法，包括以下步骤：
将镁盐、铝盐、尿素和水混合，将所得混合液进行水热共沉淀，得到镁铝水滑石微片；
将所述镁铝水滑石微片、I型胶原蛋白、聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥和甲基丙烯酸甲酯单体混合，进行聚合反应，得到生物活性骨水泥复合材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述镁盐包括硝酸镁、硫酸镁或氯化镁；所述铝盐包括硝酸铝、氯化铝或硫酸铝；所述镁盐中镁离子与铝盐中铝离子的摩尔比为(2～4):1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述尿素与铝盐中铝离子的摩尔比为12:1；所述混合液中镁盐和铝盐的总浓度为0.04～0.5mol/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水热共沉淀的温度为80～120℃，反应时间为24～48h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述镁铝水滑石微片的直径为6±2μm，形貌为六方纳米片。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以所述镁铝水滑石微片、I型胶原蛋白和聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥总质量百分数为100％计，所述镁铝水滑石微片、I型胶原蛋白和聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥的质量百分比为10～20％:10～20％:70％。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸甲酯单体与镁铝水滑石微片、I型胶原蛋白和聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥总质量的用量比为5mL:10g。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚合反应的温度为室温，时间为15～25min。
9.权利要求1～8任一项所述制备方法制备得到的生物活性骨水泥复合材料，包括共混的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥、镁铝水滑石微片和I型胶原蛋白。
10.权利要求9所述生物活性骨水泥复合材料在制备骨缺损再生修复材料中的应用。
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