CN113694209A - 一种递送体系及在制备抗感染药物中的应用 - Google Patents
一种递送体系及在制备抗感染药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113694209A CN113694209A CN202111049590.3A CN202111049590A CN113694209A CN 113694209 A CN113694209 A CN 113694209A CN 202111049590 A CN202111049590 A CN 202111049590A CN 113694209 A CN113694209 A CN 113694209A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polymyxin
- neutrophils
- azithromycin
- delivery system
- delivery
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 49
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 39
- MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N azithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)N(C)C[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N 0.000 claims abstract description 55
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims abstract description 54
- 229960004099 azithromycin Drugs 0.000 claims abstract description 53
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 claims abstract description 37
- XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N polymyxin E1 Natural products CCC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 108010078777 Colistin Proteins 0.000 claims description 28
- JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N n-[(2s)-4-amino-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-4-amino-1-oxo-1-[[(3s,6s,9s,12s,15r,18s,21s)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1r)-1-hydroxyethyl]-12,15-bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-h Polymers CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O.CCC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N 0.000 claims description 28
- YKQOSKADJPQZHB-YNWHQGOSSA-N n-[(2s)-4-amino-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-4-amino-1-oxo-1-[[(3s,6s,9s,12s,15r,18s,21s)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1s)-1-hydroxyethyl]-12,15-bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-h Polymers CCC(C)CCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O YKQOSKADJPQZHB-YNWHQGOSSA-N 0.000 claims description 28
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 20
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 claims description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 claims description 5
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 claims description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 10
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 10
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 241000588626 Acinetobacter baumannii Species 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 3
- 101000971513 Homo sapiens Natural killer cells antigen CD94 Proteins 0.000 description 3
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 3
- 102100021462 Natural killer cells antigen CD94 Human genes 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960005475 antiinfective agent Drugs 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N carbapenem Chemical compound C1C=CN2C(=O)C[C@H]21 YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 208000027096 gram-negative bacterial infections Diseases 0.000 description 1
- 244000000058 gram-negative pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
- A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供了一种递送体系及在制备抗感染药物中的应用,涉及生物医药技术领域。本发明提供了中性粒细胞在制备阿奇霉素和多粘菌素的共同递送载体中的应用以及中性粒细胞在制备抗感染药物中的应用,还提供了递送体系及其制备方法和应用,实验证实所述递送体系对抗生素阿奇霉素和多粘菌素进行感染部位的靶向递送,并增强抑菌活性,降低炎症反应,能够实现低剂量药物产生高疗效的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种递送体系及在制备抗感染药物中的应用。
背景技术
目前细菌耐药性问题的日趋恶化严重威胁到公众健康。鉴于目前严重的细菌耐药问题,2017年世界卫生组织将耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌,铜绿假单胞菌和肠杆菌科细菌列为对人类健康构成极大威胁的细菌之一,亟需新型药物。
多粘菌素类药物包括多粘菌素B和E,是临床上作为治疗革兰氏阴性菌感染的最后一道防线。然而多粘菌素具有较高的毒副作用,限制了其应用。阿奇霉素是大环内酯类抗生素,能够抑制细菌蛋白合成,同时,阿奇霉素具有免疫调节作用,并可以降低铜绿假单胞菌毒力因子表达。有研究表明,阿奇霉素与多粘菌素E具有协同杀菌作用。中性粒细胞在抗细菌感染中起重要作用,在感染时由血液中快速募集到感染部位,杀灭入侵细菌,因此是天然高效的药物递送载体。然而中性粒细胞杀伤病原菌的能力有限,且其引起的炎症反应有可能造成组织损伤,使病人状况恶化。目前并没有一种可同时将多粘菌素类药物、阿奇霉素和中性粒细胞共同作用的方法。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种递送体系及在制备抗感染药物中的应用,针对细菌耐药问题和治疗感染中的免疫调节问题,建立了以中性粒细胞递送阿奇霉素和多粘菌素的***,同时克服了两个药物在药代动力学上的差异,使药物能够在感染部位同时释放,提升杀菌效果。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了中性粒细胞在制备阿奇霉素和多粘菌素的共同递送载体中的应用。
本发明还提供了中性粒细胞在制备抗感染药物中的应用,所述抗感染药物包括以中性粒细胞为阿奇霉素和多粘菌素递送载体的递送体系。
本发明还提供了一种递送体系,所述递送体系以中性粒细胞为递送载体,共同递送阿奇霉素和多粘菌素。
优选的,所述多粘菌素包括多粘菌素B和多粘菌素E。
优选的,所述中性粒细胞的来源包括鼠骨髓中性粒细胞或人血中性粒细胞。
本发明还提供了上述递送体系的制备方法,包括以下步骤:将中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素混合,在RPMI培养基中孵育2h;所述RPMI培养基中含有质量百分含量为20%的胎牛血清;
所述中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素的比例为106个:100~200μg:0.1~1.2μg。
优选的,所述多粘菌素以脂质体形式添加。
优选的,所述孵育的温度为37℃。
优选的,在所述孵育后还包括离心收集细胞沉淀,所述离心的离心力为300g,时间为5min。
本发明还提供了上述递送体系在制备抗感染药物中的应用。
有益效果:本发明针对细菌耐药问题和治疗感染中的免疫调节问题,建立了以中性粒细胞递送阿奇霉素和多粘菌素的***,整合了以下优点:(1)中性粒细胞快速募集到感染部位;(2)多粘菌素的高效杀菌活性和目前临床革兰氏阴性病原体的低耐药率;(3)多粘菌素与阿奇霉素的协同杀菌作用;(4)阿奇霉素的免疫调节和抗菌毒力活性;(5)在没有病原体的情况下稳定保留药物;(6)同时递送药物以克服药代动力学差异。本发明所述递送体系以中性粒细胞为载体,对抗生素阿奇霉素和多粘菌素进行感染部位的靶向递送,能够实现低剂量药物产生高疗效的效果。
附图说明
图1为小鼠中性粒细胞与阿奇霉素和带有多粘菌素E的脂质体孵育后,检测细胞携带的药量,其中AZM表示阿奇霉素,CST表示多粘菌素E,下同;
图2为携带阿奇霉素和多粘菌素E的中性粒细胞对PA14菌株的杀菌能力,其中Cell表示中性粒细胞,CST0.4-NPs和CST0.8-NPs表示携带有不同量多粘菌素E的脂质体,下同;
图3为携带阿奇霉素和多粘菌素E的小鼠中性粒细胞对多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株26、71(A),150、195(B)和肺炎克雷伯菌KP43、鲍曼不动杆菌AB224(C)的杀菌效果;
图4为携带阿奇霉素和多粘菌素E的小鼠中性粒细胞与耐药铜绿假单胞菌孵育后,炎症因子基因的表达水平;
图5为携带阿奇霉素和多粘菌素E的人中性粒细胞对铜绿假单胞菌标准菌株PA14。多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株150。肺炎克雷伯菌KP43和鲍曼不动杆菌AB224的杀菌效果;
图6为采用小鼠急性肺炎模型,感染后2小鼠尾静脉注射2×106中性粒细胞或同等剂量的阿奇霉素和多粘菌素E;A:12小时后,取出肺进行细菌计数;B:连续观察小鼠存活率;C:感染后12小时,检测肺中炎症因子基因表达水平。
具体实施方式
本发明提供了中性粒细胞在制备阿奇霉素和多粘菌素的共同递送载体中的应用。
在本发明中,中性粒细胞在感染时被大量募集到感染部位,是抗感染反应中重要的免疫细胞,因此,选择中性粒细胞作为药物靶向递送载体,从而达到清除病原细菌的作用;阿奇霉素与多粘菌素对多种临床革兰氏阴性多重耐药菌具有协同杀伤作用。中性粒细胞能够富集阿奇霉素,并稳定维持胞内浓度。以脂质体为媒介可以使中性粒细胞吸收多粘菌素,并稳定维持胞内浓度。以中性粒细胞为载体递送阿奇霉素和多粘菌素同时克服了两个药物在药代动力学上的差异,使药物能够在感染部位同时释放,提升杀菌效果。所以可将中性粒细胞作为阿奇霉素和多粘菌素的共同递送载体,从而满足抗生素阿奇霉素和多粘菌素进行感染部位的靶向递送的目的,实现低剂量药物产生高疗效的效果。
本发明还提供了中性粒细胞在制备抗感染药物中的应用,所述抗感染药物包括以中性粒细胞为阿奇霉素和多粘菌素递送载体的递送体系。
本发明所述应用优选与上述相同,在此不再赘述。
本发明还提供了一种递送体系,所述递送体系以中性粒细胞为递送载体,共同递送阿奇霉素和多粘菌素。
本发明所述多粘菌素优选包括多粘菌素B和多粘菌素E,由于多粘菌素B和多粘菌素E的结构和功能高度相似,所以实施例中以多粘菌素E为例进行实验,但不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明对所述中性粒细胞的来源并没有特殊限定,优选包括鼠骨髓中性粒细胞或人血中性粒细胞。本发明对所述中性粒细胞的分离方法并没有特殊限定,利用本领域的常规分离方法即可。
本发明还提供了上述递送体系的制备方法,包括以下步骤:将中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素混合,在RPMI培养基中孵育2h;所述RPMI培养基中含有质量百分含量为20%的胎牛血清;
所述中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素的比例为106个:100~200μg:0.1~1.2μg。
本发明所述多粘菌素优选以脂质体形式添加,所述脂质体的添加量以多粘菌素的量计。本发明将中性粒细胞与阿奇霉素和脂质体混合后,优选在含有20%(w/w)胎牛血清(FBS)的RPMI中于37℃孵育2h,离心去除细胞外阿奇霉素和脂质体后,得到所述递送体系。本发明所述离心的离心力优选为300g,时间优选为5min。
本发明还提供了上述递送体系在制备抗感染药物中的应用。
本发明所述递送体系,经实施例证实,每106个中性粒细胞可携载0.88μg阿奇霉素和0.952μg多粘菌素,并显著提高对铜绿假单胞菌标准菌株和临床多重耐药菌的杀菌能力,并减少促炎因子的产生。
下面结合实施例对本发明提供的一种递送体系及在制备抗感染药物中的应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
多粘菌素E采用脂质体进行包装,脂质体载药量为40mg/ml。提取小鼠骨髓中性粒细胞,以106/ml细胞与100μg/ml阿奇霉素和20μl含多粘菌素E的脂质体在含有20%胎牛血清(FBS)的RPMI中于37℃孵育2小时。以300g离心5分钟去除细胞外阿奇霉素和脂质体后,可用于体外杀菌实验和小鼠尾静脉注射抗感染实验。
1、中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素E脂质体孵育后,细胞内累积的药物量。以300g离心5分钟收集细胞,用1ml超纯水裂解细胞,以10000g离心2分钟去除细胞碎片。采用ELISA试剂盒(江苏维赛科技生物发展有限公司)检测上清中阿奇霉素和多粘菌素E的浓度。
结果如图1和表1所示,中性粒细胞可同时携载阿奇霉素和多粘菌素E。
表1 中性粒细胞的载药量
2、携带阿奇霉素和多粘菌素E的中性粒细胞杀菌能力显著增强
小鼠中性粒细胞与阿奇霉素和带有多粘菌素E的脂质体孵育后,与铜绿假单胞菌标准菌株PA14共孵育(细胞与细菌比例为1:10)。每隔1小时,检测活细菌浓度。AZM,阿奇霉素;CST0.4-NPs,CST0.8-NPs,指10和20μl携带多粘菌素E的脂质体:
(1)划线:从-80℃冰箱挑取临床菌在LB平板上进行分区划线,将划线平板放置在37℃进行培养。挑取平板上的单菌落进行后续杀菌实验。
(2)挑取平板上形成的单菌落在LB液体培养基中培养过夜。过夜培养后的菌液按照1:100用4ml LB液体培养基稀释,稀释后37℃,200rpm摇床培养。
(3)对数期杀菌实验,摇床培养2.5h左右,OD600为0.8。
(4)12000rpm离心1分钟收集菌体用1ml PBS洗一次。
(5)用RMPI培养基重悬菌体至107CFU/ml,与106中性粒细胞混合,37℃孵育。
(6)每隔1小时,取0.1ml混合物进行梯度稀释,每个梯度取10μl稀释液滴于LB平板上。平板放置37℃培养24小时后进行菌落计数,根据结果计算细菌活菌数。
结果如图2和表2所示,携带阿奇霉素和多粘菌素E的中性粒细胞杀菌能力显著增强。
表2 携带阿奇霉素和多粘菌素E的中性粒细胞杀菌能力
3、携带药物的中性粒细胞对临床多重耐药菌的杀菌能力显著增强
实验方法同2。
结果如图3和表3所示,携带阿奇霉素和多粘菌素E的小鼠中性粒细胞对多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株26、71(图3中A),150、194(图3中B)和肺炎克雷伯菌KP43、鲍曼不动杆菌AB224(图3中C)的杀菌效果。
表3 携带药物的中性粒细胞对临床多重耐药菌的杀菌能力
4、携带药物的中性粒细胞产生较少的促炎因子
设计特异性引物,分别测定促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表达量,以β-actin为内参基因,设计的引物序列分别为:
IL-1β-F(SEQ ID NO.1):GAGCACCTTCTTTTCCTTCATCTT
IL-1β-R(SEQ ID NO.2):TCACACACCAGCAGGTTATCATC
IL-6-F(SEQ ID NO.3):TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC
IL-6-R(SEQ ID NO.4):TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC
IL-8-F(SEQ ID NO.5):CACCTCAAGAACATCCAGAGCT
IL-8-R(SEQ ID NO.6):CAAGCAGAACTGAACTACCATCG
TNF-α-F(SEQ ID NO.7):CCCTCACACTCAGATCATCTTCT
TNF-α-R(SEQ ID NO.8):GCTACGACGTGGGCTACAG
β-actin-F(SEQ ID NO.19):GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC
β-actin-R(SEQ ID NO.10):GACTCATCGTACTCCTGCTTGC
细菌培养方法同2中的(1)~(4);
(5)用RMPI培养基重悬菌体至106CFU/ml,与106中性粒细胞混合,37℃孵育。
(6)1小时后,2500rpm离心3分钟离心收集细胞。
(7)用1ml TRIzol试剂重悬细胞,按照说明书提取总RNA。
(8)利用反转录试剂盒(Takara,货号:RR036A)配制20μL反转录体系,在PCR仪器上运行(37℃,30min,85℃,5s)程序。
(9)实时定量(Real-Time)PCR
配制Real-Time PCR体系:2×ChamQ Universal SYBR 8μl、RNase-free水6μl、cDNA模板1μl、上下游引物各0.5μl。
运行程序:95℃预变性3min;95℃变性10s,55℃退火10s,72℃延伸30s,40个循环;95℃变性10s,55℃退火10s、72℃延伸30s。
结果如图4和表4所示,携带阿奇霉素和多粘菌素E的小鼠中性粒细胞与耐药铜绿假单胞菌孵育后,炎症因子基因的表达水平显著降低。
表4 携带药物的中性粒细胞产生较少的促炎因子
5、携带药物的人中性粒细胞对临床多重耐药菌的杀菌能力显著增强
(1)菌悬液制备:以PA14为例,过夜培养的菌液1:100转接至LB液体培养基中,培养至OD600为1左右,准确测定OD600。取1ml菌液12000rpm离心2min收集菌体,加入1ml生理盐水重悬菌体,再离心。如此用生理盐水将菌液洗涤2次以去除残留培养基,最终根据之前测得的OD600加入相应量的生理盐水重悬菌体,使菌液浓度为2×108CFU/ml。
(2)麻醉:每只小鼠腹腔注射100μl 7.5%水合氯醛。
(3)感染:小鼠麻醉后,单手固定小鼠,将上述菌液滴入小鼠鼻腔,每个鼻孔10μl,相应接种量PA14菌株为4×106CFU/小鼠。
(4)给药:感染2小时后尾静脉注射的方式给每只小鼠注射2×106中性粒细胞或同等剂量的阿奇霉素和多粘菌素E。
(5)指标测定:小鼠的细菌载量和小鼠存活率。
测定方法如下:
1)细菌载量:
感染12h后在鼠笼内通入CO2处死小鼠,取小鼠的肺分别放入离心管中,加入1ml生理盐水,用研磨仪将组织研磨,研磨后稀释滴板,进行菌落计数。
2)小鼠存活率:
给药后持续观察小鼠的生存状况,记下小鼠的死亡时间,连续观察5天,绘制生存曲线。
结果如图5和表5所示,携带药物的人中性粒细胞对临床多重耐药菌的杀菌能力显著增强。
表5 携带药物的人中性粒细胞对临床多重耐药菌的杀菌能力
6、与同等剂量的药物相比,以中性粒细胞为药物载体显著提高杀菌效果,降低炎症反应
采用小鼠急性肺炎模型,感染后2小鼠尾静脉注射2×106中性粒细胞或同等剂量的阿奇霉素和多粘菌素E。
结果如图6和表6~表8所示,与同等剂量的药物相比,以中性粒细胞为药物载体显著提高杀菌效果,降低炎症反应。
表6 12小时后,取出肺进行细菌计数
表7 小鼠存活率(每组7只小鼠)
表8 肺中炎症因子基因表达水平
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南开大学
<120> 一种递送体系及在制备抗感染药物中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gagcaccttc ttttccttca tctt 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
tcacacacca gcaggttatc atc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
tagtccttcc taccccaatt tcc 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
ttggtcctta gccactcctt c 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
cacctcaaga acatccagag ct 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
caagcagaac tgaactacca tcg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
ccctcacact cagatcatct tct 23
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
gctacgacgt gggctacag 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
gattactgct ctggctccta gc 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
gactcatcgt actcctgctt gc 22
Claims (10)
1.中性粒细胞在制备阿奇霉素和多粘菌素的共同递送载体中的应用。
2.中性粒细胞在制备抗感染药物中的应用,所述抗感染药物包括以中性粒细胞为阿奇霉素和多粘菌素递送载体的递送体系。
3.一种递送体系,其特征在于,所述递送体系以中性粒细胞为递送载体,共同递送阿奇霉素和多粘菌素。
4.根据权利要求3所述递送体系,其特征在于,所述多粘菌素包括多粘菌素B和多粘菌素E。
5.根据权利要求3所述递送体系,其特征在于,所述中性粒细胞的来源包括鼠骨髓中性粒细胞或人血中性粒细胞。
6.权利要求3~5任一项所述递送体系的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:将中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素混合,在RPMI培养基中孵育2h;所述RPMI培养基中含有质量百分含量为20%的胎牛血清;
所述中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素的比例为106个:100~200μg:0.1~1.2μg。
7.根据权利要求6所述制备方法,其特征在于,所述多粘菌素以脂质体形式添加。
8.根据权利要求6所述制备方法,其特征在于,所述孵育的温度为37℃。
9.根据权利要求6或8所述制备方法,其特征在于,在所述孵育后还包括离心收集细胞沉淀,所述离心的离心力为300g,时间为5min。
10.权利要求3~5任一项所述递送体系在制备抗感染药物中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111049590.3A CN113694209B (zh) | 2021-09-08 | 一种递送体系及在制备抗感染药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111049590.3A CN113694209B (zh) | 2021-09-08 | 一种递送体系及在制备抗感染药物中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113694209A true CN113694209A (zh) | 2021-11-26 |
CN113694209B CN113694209B (zh) | 2024-07-26 |
Family
ID=
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114699370A (zh) * | 2022-02-17 | 2022-07-05 | 中山大学·深圳 | 一种共载多粘菌素e和姜黄素的脂质体的制备方法及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017181831A1 (zh) * | 2016-04-18 | 2017-10-26 | 丹诺医药(苏州)有限公司 | 一种用于治疗革兰氏阴性菌感染的抗菌药物组合物 |
CN110124012A (zh) * | 2019-05-23 | 2019-08-16 | 中国科学技术大学 | 一种颗粒溶素作为多粘菌素类抗生素增效剂的应用 |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017181831A1 (zh) * | 2016-04-18 | 2017-10-26 | 丹诺医药(苏州)有限公司 | 一种用于治疗革兰氏阴性菌感染的抗菌药物组合物 |
CN110124012A (zh) * | 2019-05-23 | 2019-08-16 | 中国科学技术大学 | 一种颗粒溶素作为多粘菌素类抗生素增效剂的应用 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114699370A (zh) * | 2022-02-17 | 2022-07-05 | 中山大学·深圳 | 一种共载多粘菌素e和姜黄素的脂质体的制备方法及其应用 |
CN114699370B (zh) * | 2022-02-17 | 2023-11-17 | 中山大学·深圳 | 一种共载多粘菌素e和姜黄素的脂质体的制备方法及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2010095463A1 (ja) | 免疫増強組成物及びそれを製造する方法 | |
CN111557951A (zh) | 一种间充质干细胞治疗病毒性感染患者的新方法 | |
AU2010204269B2 (en) | Pharmaceutical composition to protect an animal against a disorder arising from an infection with a bacterium that belongs to the group of nocardioform actinomycetes | |
CN106822092B (zh) | 一种抑制嗜水气单胞菌感染的药物组合物 | |
Li et al. | The use of albendazole and diammonium glycyrrhizinate in the treatment of eosinophilic meningitis in mice infected with Angiostrongylus cantonensis | |
Hoddinott et al. | Determination of bone and fat concentrations following systemic cefamandole and regional cefuroxime administration in patients undergoing knee arthroplasty | |
CN113694209B (zh) | 一种递送体系及在制备抗感染药物中的应用 | |
Pyrgos et al. | Pulmonary zygomycosis | |
Pérez-Martínez et al. | High-dose chemotherapy with autologous stem cell rescue as first line of treatment in young children with medulloblastoma and supratentorial primitive neuroectodermal tumors | |
CN113694209A (zh) | 一种递送体系及在制备抗感染药物中的应用 | |
CN110151761B (zh) | 一种替代抗生素的药物--褪黑素抵抗患儿脑膜炎大肠杆菌病原感染的应用 | |
Sculier et al. | Successful treatment with liposomal amphotericin B in two patients with persisting fungemia | |
WO2005004789A2 (fr) | Methode de traitement de maladies s'accompagnant d'alterations de la composition qualitative ou quantitative de l'adn extracellulaire du sang | |
EP2196533B9 (en) | Novel microorganism having gastric juice promoting action and composition secreted by the same | |
CN104434908B (zh) | 山奈酚在抑制受体对器官移植排斥反应药物中的应用 | |
CN110484537B (zh) | 一种miR-92促进剂及其注射剂的制备方法和应用 | |
JP2024504263A (ja) | 敗血症を治療するための薬物組成物及びその使用 | |
CN108815239B (zh) | 一种药物组合物在制备抗菌药物中的应用 | |
CA2751751A1 (en) | Compositions comprising reduced genome bacteria for use in treatment of sepsis | |
Wang et al. | Oncospheres of Taenia solium and T. saginata asiatica develop into metacestodes in normal and immunosuppressed mice | |
CN107617101B (zh) | 含唑来膦酸和白细胞介素2的药物组合及其应用 | |
CN116042432B (zh) | 一种具有广谱抑菌性的新菌种及其抑菌物质的提纯 | |
Rakhmanova et al. | Complicated BCG vaccination during chemotherapy in infant acute leukemia patients | |
Bose et al. | Scedosporium apiospermum peritonitis in a patient undergoing peritoneal dialysis. | |
CN103243098B (zh) | 靶向治疗结核的RelA切割并TLR7激活基序修饰的锁核酸脱氧核酶及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant |