CN113687068A - 肿瘤单细胞双荧光标记检测试剂盒、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肿瘤单细胞双荧光标记检测试剂盒、制备方法及其应用，其中，检测试剂盒包括：试剂A和试剂B，所述试剂A包括由缓冲液配置而成的浓度大于10mg/mL的脱氧葡萄糖‑2‑(7‑硝基苯并‑2‑氧杂‑1，3‑二唑‑4‑氨基)溶液，所述试剂B包括浓度大于1mg/mL的Rox‑EpCAM‑mAb冻干粉溶液。本发明具有双重特异性指示肿瘤细胞，该检测试剂盒标记的循环肿瘤细胞可被肿瘤单细胞计数分离装置***(TuSEP)精准识别及分离，保证了循环肿瘤细胞的高效准确分离获取，并可为进一步开展肿瘤病人个性化精准治疗奠定了基础。

Description

肿瘤单细胞双荧光标记检测试剂盒、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种肿瘤单细胞双荧光标记检测试剂盒、制备方法及其应用。
背景技术
肿瘤严重威胁人类的健康，目前主要的治疗手段有手术、放疗、化疗和免疫生物治疗等，然后这些治疗方式均需要早期精准诊断，才能精准治疗，由于人类当前缺乏对肿瘤早期的精准诊断技术，大多数癌症患者被发现时已是晚期，无法根治，5年生存率很低。
目前肿瘤直径达1cm以上才能通过CT、核磁共振等物理学方法发现，但确诊仍然需要对活检及手术后肿瘤组织细胞的病理观察才能确诊，即使这样，诊断还没有达到分子水平；由于肿瘤的高度复杂性和细胞及其基因的高度异质性，对肿瘤的个性化精准治疗尤其重要。
肿瘤具有无限生长和转移的特性，由于缺乏早期精准诊断方法，难以及时开展针对个体化的精准治疗，因此绝大多数(90％以上)肿瘤病人死于肿瘤的转移。肿瘤生长在突破早期原位癌基底膜后，据推测，每克肿瘤组织每天可以向血液和周围组织液中释放近10万个肿瘤细胞(循环肿瘤细胞，CTC)，这为早期精准诊断提供了可能的病理材料和物质基础，然而每毫升血有几十亿个细胞，经过大量稀释后的每毫升仅有几个肿瘤细胞，难以被分离和检测到，这是全世界共同面对的医学难点和科学问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种肿瘤单细胞双荧光标记检测试剂盒、制备方法及其应用，具有可精准地对肿瘤细胞进行分离和计数检测的优点。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种肿瘤单细胞双荧光标记检测试剂盒，包括：试剂A和试剂B，所述试剂A包括由缓冲液配置而成的浓度大于10mg/mL的脱氧葡萄糖-2-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-氨基)溶液，所述试剂B包括浓度大于1mg/mL的Rox-EpCAM-mAb冻干粉溶液。
作为本发明的一种优选方案，所述试剂A中的缓冲液选用磷酸缓冲液，所述Rox-EpCAM-mAb冻干粉溶液由50％甘油配置而成。
作为本发明的一种优选方案，所述Rox-EpCAM-mAb冻干粉包括0.01M磷酸缓冲液、1％BSA和0.1％叠氮化钠。
另一方面，本发明还提供一种制备上述任一技术方案所述的检测试剂盒的方法，包括：
称取10mg脱氧葡萄糖-2-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-氨基)，使用1mL磷酸盐缓冲液溶解，配制成终浓度为10mg/mL的试剂A；
取1mg Rox-EpCAM-mAb冻干粉溶解于1mL 50％甘油溶液，制成终浓度为1mg/mL的试剂B；
将试剂A和试剂B于-20℃温度条件下冷藏保存。
作为本发明的一种优选方案，所述Rox-EpCAM-mAb冻干粉包括0.01M磷酸缓冲液、1％BSA和0.1％叠氮化钠。
另一方面，本发明还提供一种上述任一技术方案所述的检测试剂盒在人组织和血液循环肿瘤细胞荧光检测中的应用。
作为本发明的一种优选方案，所述应用包括：
取肿瘤病人或动物的原发灶/转移灶部分组织或抽取3-4mL外周血，肿瘤组织经胰酶消化为单细胞悬液备用，外周血添加抗凝剂备用；
将试剂A以1:100的比例和试剂B以1:1000的比例添加至人肿瘤组织单细胞悬液或外周血样本中后，置含5％二氧化碳、温度为37℃的细胞培养箱中避光培养染色0.5-1h，然后加入3-5倍样本体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温处理2分钟，取500g离心5min，弃上清，添加1mL磷酸缓冲液重悬细胞，在共聚焦显微镜下检测人肿瘤组织或外周血中细胞荧光染色情况。
作为本发明的一种优选方案，还包括将试剂A和试剂B按照10：1配比混合,取25-50μL,微静脉注射荷瘤小鼠,3h后对小鼠进行荧光活体成像观察。
另一方面，本发明还提供一种上述任一技术方案所述的检测试剂盒配合肿瘤单细胞基因测序技术鉴定基因突变及表达信息的应用。
作为本发明的一种优选方案，所述应用基于经检测试剂盒染色标记人组织和血液循环肿瘤细胞后分离出的肿瘤单细胞实施。
综上所述，本发明具有如下有益效果：
本发明实施例通过提供一种肿瘤单细胞双荧光标记检测试剂盒、制备方法及其应用，检测试剂盒(TuSTA Kit)其中一主要组分脱氧葡萄糖-2-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-氨基)为绿荧光标记葡萄糖类衍生物(FG)，分子量小，容易被肿瘤细胞高效吸收，而另一主要成分Rox-EpCAM-mAb为红荧光基团ROX标记的EpCAM特异性IgG单克隆抗体分子,是肿瘤细胞特异性标记分子，两者结合使用可指示肿瘤细胞，具有双重特异性；该检测试剂盒标记的循环肿瘤细胞可被肿瘤单细胞计数分离装置***(TuSEP)精准识别及分离，保证了循环肿瘤细胞的高效准确分离获取；该检测试剂盒TuSTA与TuSEP、TuSEQ组成的3TS***，从识别鉴定、分离获取、测序分析各阶段实现了针对早期循环肿瘤细胞的高效率检测，建立了一套完善的肿瘤精准化检测***，为进一步开展肿瘤病人个性化精准治疗奠定了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例二中的Rox-EpCAM-mAb的分子结构示意图。
图2为本发明实施例三中利用检测试剂盒进行双荧光标记肿瘤细胞结果图。
图3为本发明实施例三中荧光标记动物(小鼠)体内肿瘤的活体荧光观察结果。
图4为本发明实施例四中肿瘤单细胞计数分离装置的操作流程图。
图5为本发明实施例四中TuSTA Kit检测循环肿瘤细胞经过TuSEP装置分离出的癌细胞检出结果。
图6为本发明实施例四中TuSEP分析TuSTA标记后血循环胰腺癌细胞(CTC)信号检测计数图。
图7为本发明实施例五中TuSEQ技术平台的操作流程图。
图8为本发明实施例五中TuSEQ测序鉴定结肠癌CTC及高频基因突变位点结果；其中，A为表达量热图，B为基因突变位点信息。
图9为本发明实施例五中TuSEQ测序鉴定胰腺癌CTC及高频基因突变位点结果；其中，A为表达量热图，B为基因突变位点信息。
图10为本发明实施例五中结肠癌肿瘤个性化疫苗***效果；其中，A图红线和B图最下行显示经过个性肿瘤基因疫苗免疫后肿瘤体积显著缩小。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一种肿瘤单细胞双荧光标记检测试剂盒，包括：试剂A和试剂B，所述试剂A包括由缓冲液配置而成的浓度大于10mg/mL的脱氧葡萄糖-2-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-氨基)溶液，所述试剂B包括浓度大于1mg/mL的Rox-EpCAM-mAb冻干粉溶液。
其中，试剂A中的缓冲液选用磷酸缓冲液，所述Rox-EpCAM-mAb冻干粉溶液由50％甘油配置而成，Rox-EpCAM-mAb冻干粉包括0.01M磷酸缓冲液、1％BSA和0.1％叠氮化钠。
本发明实施例通过提供一种肿瘤单细胞双荧光标记检测试剂盒、制备方法及其应用，检测试剂盒(TuSTA Kit)其中一主要组分脱氧葡萄糖-2-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-氨基)为绿荧光标记葡萄糖类衍生物(FG)，分子量小，容易被肿瘤细胞高效吸收，而另一主要成分Rox-EpCAM-mAb为红荧光基团ROX标记的EpCAM特异性IgG单克隆抗体分子,是肿瘤细胞特异性标记分子，两者结合使用可指示肿瘤细胞，具有双重特异性；该检测试剂盒标记的循环肿瘤细胞可被肿瘤单细胞计数分离装置***(TuSEP)精准识别及分离，保证了循环肿瘤细胞的高效准确分离获取；该检测试剂盒TuSTA与TuSEP、TuSEQ组成的3TS***，从识别鉴定、分离获取、测序分析各阶段实现了针对早期循环肿瘤细胞的高效率检测，建立了一套完善的肿瘤精准化检测***，为进一步开展肿瘤病人个性化精准治疗奠定了基础。
实施例二
一种制备如实施例一所述的检测试剂盒的方法，包括：
步骤一、称取10mg脱氧葡萄糖-2-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-氨基)，使用1mL磷酸盐缓冲液溶解，配制成终浓度为10mg/mL的试剂A；
步骤二、取1mg Rox-EpCAM-mAb冻干粉溶解于1mL 50％甘油溶液，制成终浓度为1mg/mL的试剂B，Rox-EpCAM-mAb冻干粉包括0.01M磷酸缓冲液、1％BSA和0.1％叠氮化钠，其分子结构图如图1所示；
步骤三、将试剂A和试剂B于-20℃温度条件下冷藏保存。
实施例三
一种实施例一所述的检测试剂盒(TuSTA Kit)在人组织和血液循环肿瘤细胞荧光检测中的应用，该应用具体包括：
取肿瘤病人或动物的原发灶/转移灶部分组织或抽取3-4mL外周血，肿瘤组织经胰酶消化为单细胞悬液备用，外周血添加抗凝剂备用；
将试剂A以1:100的比例和试剂B以1:1000的比例添加至人肿瘤组织单细胞悬液或外周血样本中后，置含5％二氧化碳、温度为37℃的细胞培养箱中避光培养染色0.5-1h，然后加入3-5倍样本体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温处理2分钟，取500g离心5min，弃上清，添加1mL磷酸缓冲液重悬细胞，在共聚焦显微镜下检测人肿瘤组织或外周血中细胞荧光染色情况。
脱氧葡萄糖-2-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-氨基)为绿荧光标记葡萄糖类衍生物(FG)，Rox-EpCAM-mAb为红荧光基团ROX标记的EpCAM特异性IgG单克隆抗体分子,如图1结果显示，肿瘤组织裂解液中总计89个细胞中被FG单标记的细胞有82个(绿色荧光，检出率92.1％)，Rox-EpCAM-mAb单标记的有87个细胞(红色荧光，检出率97.8％)，两个颜色共有的细胞为78个(准确率95.1％)；而外周血样品中总计128个细胞中被FG绿色荧光标记的有118个细胞(绿色荧光，检出率92.2％)，Rox-EpCAM-mAb红色荧光标记的有124个细胞(红色荧光，检出率96.9％)，两个颜色共有的细胞为110个(准确率93.2％)，说明TuSTA Kit在标记循环肿瘤细胞方面具有高度特异性和准确度。
进一步的，本实施例还包括将试剂A和试剂B按照10：1配比混合,取25-50μL,微静脉注射荷瘤小鼠,3h后对小鼠进行荧光活体成像观察，其结果如图3所示。
实施例四
一种实施例一所述的检测试剂盒结合肿瘤单细胞计数分离装置进行肿瘤细胞进行计数和分离的应用。
其中，肿瘤单细胞计数分离装置(TuSEP)主要包括：控制箱、微量注射泵、直线导轨、电磁铁、芯片位置调整装置、微流控分选芯片、微流控检测芯片、断电按钮、控制面板和荧光检测装置。
经前述检测试剂盒的试剂A和试剂B染色的细胞液，进一步通过肿瘤单细胞计数分离装置(TuSEP)进行精准计数和分离，TuSEP进行循环肿瘤细胞(CTC)检测和分选具体操作步骤如图4所示，包括：
A、将双通道循环肿瘤细胞检测仪中控制箱上的电源插头***220V网电源，打开控制箱上的主电源(绿色船形)开关，同时，主电源开关指示灯亮。
B、将微流控分选芯片与微流控检测芯片安装到芯片位置调整装置上。
注：微流控芯片安装方法：
将与tygon软管连接的钢针***微流控芯片的样本出口与样本入口。
C、打开上位机控制软件、CCD相机软件，同时使用芯片位置调整装置调整微流控检测芯片的位置，使芯片流道在CCD相机软件的成像界面中清晰成像。
注：调整芯片位置的方法：
使用左右微调旋钮调整芯片的位置，使芯片的流道出现在CCD相机软件成像界面中；使用上下微调旋钮调整芯片到荧光检测装置的焦距，达到最佳成像效果。
D、在离心管中装入纯净水，使用纯净水进行工作流程，检查设备各部分是否正常工作。
E、准备好待测样本，将样本装入离心管中。
F、启动软件，首先登记样品和病人信息；随后进入CTCs分选模块，在界面中设置进样速度、样本容量等参数，点击开始工作按钮开始CTCs分选；分选结束后进入CTCs检测模块，在界面中设置进样速度、样本容量等参数，点击开始工作按钮开始CTCs检测；待CTCs检测结束后,进入报告打印，打印病人检测报告。
如图5和图6的结果所示：检测试剂盒染色后细胞经肿瘤单细胞计数分离装置分析发现，肿瘤组织中总计96个细胞中被脱氧葡萄糖-2-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-氨基)标记的有89个细胞(绿色荧光，检出率92.7％)，Rox-EpCAM-mAb标记的有92个细胞(红色荧光，检出率95.8％)，两个颜色共有的细胞为82个(准确率92.1％)；而外周血中总计156个细胞中被脱氧葡萄糖-2-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-氨基)标记的有145个细胞(绿色荧光，检出率92.9％)，Rox-EpCAM-mAb标记的有151个细胞(红色荧光，检出率96.8％)，两个颜色共有的细胞为134个(准确率92.4)，说明TuSTA Kit标记后的肿瘤细胞可以被TuSEP***精准捕获计数进而被分选(分离)，供下一步肿瘤单细胞基因测序技术(TuSEQ技术平台)进行细胞性质鉴定和基因测序分析。
实施例五
一种实施例一所述的检测试剂盒配合肿瘤单细胞基因测序技术(TuSEQ技术平台)鉴定基因突变及表达信息的应用，该应用基于经检测试剂盒染色标记人组织和血液循环肿瘤细胞后分离出的肿瘤单细胞实施。
如图7所示，图7示出了TuSEQ技术平台的操作流程图，具体操作实施步骤如下：
1、单细胞反转录
用毛细管吸取约0.3μL的CTC，加入2μL的血红细胞裂解液，按照下表配制单细胞反转录条件1：
Figure BDA0003226353900000081
处理时，放置于72℃温度条件下反应3min(热盖调至72℃)，完成反应后置于冰上。
接着，按下表所列得单细胞反应体系混匀后加入单细胞反转录条件1中，得到单细胞反转录条件2，
Figure BDA0003226353900000082
将上述10μL反应总体积放置于并迅速开始单细胞反转录反应。
打开PCR仪(Biorad CFX96 PCR)，关闭热盖温度，并设定：
1)42℃反应90分钟；
2)(50℃反应2分钟+42℃反应2分钟)*10次；
3)70℃反应15分钟；
4)4℃结束反应。
2、单细胞PCR扩增反应1
配制PCR反应体系如下(含单细胞反转录反应产物)：
Figure BDA0003226353900000091
迅速开始单细胞PCR扩增反应1：
打开PCR仪(Biorad CFX96 PCR)，热盖温度105℃，并设定：
1)98℃反应3分钟；
2)(98℃反应20秒+67℃反应15秒+72℃反应6分钟)*16次；
4)72℃反应5分钟；
4)4℃结束反应。
3、单细胞PCR扩增反应产物1纯化
注：该步骤需要在96孔板进行反应
1)加入25uL磁珠(V磁珠/V产物＝1:1)，上下吹打10次，充分混匀咖啡色磁珠，并放室温静置8分钟。
2)将96孔板置于磁力加上，静置5分钟，待溶液变成透明状，吸出并弃去所有上清液(避免碰到磁珠)。
3)将96孔板置于磁力加上，加入80％乙醇200uL，静置30秒，吸出并弃去所有上清液(避免碰到磁珠)。
4)重复上述步骤。
5)将96孔板置于磁力架上，在室温下晾干5-10分钟，期间利用10μL枪头吸去所有残余乙醇。
6)待管壁上磁珠聚集区产生细微裂痕后，将96孔板从磁力架上取下，并加入17.5uL的EB(1mM Tris-HCl，或纯水)溶液。吹打10次，使充分混匀至咖啡色，并放置室温静置2分钟。
7)将96孔板置于磁力加上，静置2分钟，待溶液变成透明状，收集所有上清(约17uL，注意避免碰到磁珠)。
4、阶段性质控1
1)对上述样本进行Qubit HS DNA试剂盒定量，纯化后的单细胞PCR扩增反应1产物正常范围在0.2ng/uL～2ng/uL。
2)并进行1uL的2100QC或8uL的电泳QC，纯化后的单细胞PCR扩增反应1产物合理分布为500-3000bp弥散条带(代表转录本平均分布范围)。
5、Tn5转座酶碎片化反应
加入1ng的上述纯化后单细胞PCR扩增反应1产物至下列反应体系，完成配置Tn5转座酶碎片化反应。
Figure BDA0003226353900000101
放置于55℃反应5分钟(热盖关闭)，完成反应后离心管壁上残液，并置于冰上。
迅速加入5μL的NT Buffer,并在室温反应5分钟，后放置于冰上。
6、单细胞PCR扩增反应2
Figure BDA0003226353900000102
迅速开始单细胞PCR扩增反应2：
打开PCR仪(Biorad CFX96 PCR)，热盖温度105℃，并设定：
1)72℃反应3分钟；
2)95℃反应30秒；
3)16循环x(95℃反应10秒+55℃反应30秒+72℃反应30秒)；
4)72℃反应5分钟；
5)10℃结束反应。
7、单细胞PCR扩增反应产物2纯化
注：该步骤需要在96孔板进行反应
1)加入30uL磁珠(V磁珠/V产物＝0.6:1)，上下吹打10次，充分混匀咖啡色磁珠，并放室温静置8分钟。
2)将96孔板置于磁力加上，静置5分钟，待溶液变成透明状，吸出并弃去所有上清液(避免碰到磁珠)。
3)将96孔板置于磁力加上，加入80％乙醇200uL，静置30秒，吸出并弃去所有上清液(避免碰到磁珠)。
4)重复上述步骤。
5)将96孔板置于磁力架上，室温下晾干5-10分钟，期间利用10uL枪头吸去所有残余乙醇。
6)待管壁上磁珠聚集区产生细微裂痕后，将96孔板从磁力架上取下，并加入15uL的EB(1mM Tris-HCl，或纯水)溶液。吹打10次，使充分混匀至咖啡色，并放置室温静置2分钟。
7)将96孔板置于磁力加上，静置2分钟，待溶液变成透明状，收集所有上清(约14uL，注意避免碰到磁珠)。
8、阶段性质控2
1)对上述样本进行Qubit HS DNA试剂盒定量，纯化后的单细胞PCR扩增反应2产物正常范围在0.5ng/uL～10ng/uL。
2)并进行1uL的2100QC或8uL的电泳QC，纯化后的单细胞PCR扩增反应2产物合理分布为250-1000bp弥散条带(代表转座酶消化后加接头的文库长度范围)。
9、测序
1)将上述样本进行摩尔数换算，每个样本稀释浓度至2nM，按照每个样本1:1混合。混合后总量取10uL送测序公司最最终2100QC测序。
2)测序仪采用Hiseq2500或Hiseq2000，测序模式为1x50bp读长，250M读段数。
10、肿瘤单细胞基因测序技术(TuSEQ技术)实施结果:
如图8和图9所示，利用上述方法针对病人血液样本经TuSTA标记、TuSEP分离的CTC进行TuSEQ，测序分析鉴定特异表达基因和基因突变结果成功鉴定了肿瘤细胞的性质和组织来源,证明了肿瘤细胞及CTC分别来自结肠癌与胰腺癌病人，进一步根据高频突变基因信息，参考《化疗药物毒副性基因检测位点》分别给出化疗敏感性分析和用药指导，针对上述结肠癌病人建议使用长春花碱类、伊立替康类、铂类、嘧啶类似物及抗***类等，而胰腺癌病人建议使用鬼臼素类、嘧啶类似物、紫杉烷类及抗***类等。此外针对CTC特异突变基因开发的个性化肿瘤疫苗,并在结肠癌小鼠模型上实现了肿瘤细胞的有效杀伤,如图10所示，结果显示经过个性肿瘤基因过程疫苗免疫后肿瘤体积显著缩小，有效的指导了肿瘤精准免疫治疗。
综上所述，本发明具有如下有益效果：
本发明实施例通过提供一种肿瘤单细胞双荧光标记检测试剂盒、制备方法及其应用，检测试剂盒(TuSTA Kit)其中一主要组分脱氧葡萄糖-2-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-氨基)为绿荧光标记葡萄糖类衍生物(FG)，分子量小，容易被肿瘤细胞高效吸收，而另一主要成分Rox-EpCAM-mAb为红荧光基团ROX标记的EpCAM特异性IgG单克隆抗体分子,是肿瘤细胞特异性标记分子，两者结合使用可指示肿瘤细胞，具有双重特异性；该检测试剂盒标记的循环肿瘤细胞可被肿瘤单细胞计数分离装置***(TuSEP)精准识别及分离，保证了循环肿瘤细胞的高效准确分离获取；该检测试剂盒TuSTA与TuSEP、TuSEQ组成的3TS***，从识别鉴定、分离获取、测序分析各阶段实现了针对早期循环肿瘤细胞的高效率检测，建立了一套完善的肿瘤精准化检测***，为进一步开展肿瘤病人个性化精准治疗奠定了基础。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种肿瘤单细胞双荧光标记检测试剂盒，其特征在于，包括：试剂A和试剂B，所述试剂A包括由缓冲液配置而成的浓度大于10mg/mL的脱氧葡萄糖-2-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-氨基)溶液，所述试剂B包括浓度大于1mg/mL的Rox-EpCAM-mAb冻干粉溶液。
2.根据权利要求1所述的肿瘤单细胞双荧光标记检测试剂盒，其特征在于，所述试剂A中的缓冲液选用磷酸缓冲液，所述Rox-EpCAM-mAb冻干粉溶液由50％甘油配置而成。
3.根据权利要求2所述的肿瘤单细胞双荧光标记检测试剂盒，其特征在于，所述Rox-EpCAM-mAb冻干粉包括0.01M磷酸缓冲液、1％BSA和0.1％叠氮化钠。
4.一种制备如权利要求1-3中任一项所述的检测试剂盒的方法，其特征在于，包括：
称取10mg脱氧葡萄糖-2-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-氨基)，使用1mL磷酸盐缓冲液溶解，配制成终浓度为10mg/mL的试剂A；
取1mg Rox-EpCAM-mAb冻干粉溶解于1mL 50％甘油溶液，制成终浓度为1mg/mL的试剂B；
将试剂A和试剂B于-20℃温度条件下冷藏保存。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述Rox-EpCAM-mAb冻干粉包括0.01M磷酸缓冲液、1％BSA和0.1％叠氮化钠。
6.权利要求1-3中任一项所述的检测试剂盒在人组织和血液循环肿瘤细胞荧光检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括：
取肿瘤病人或动物的原发灶/转移灶部分组织或抽取3-4mL外周血，肿瘤组织经胰酶消化为单细胞悬液备用，外周血添加抗凝剂备用；
将试剂A以1:100的比例和试剂B以1:1000的比例添加至人肿瘤组织单细胞悬液或外周血样本中后，置含5％二氧化碳、温度为37℃的细胞培养箱中避光培养染色0.5-1h，然后加入3-5倍样本体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温处理2分钟，取500g离心5min，弃上清，添加1mL磷酸缓冲液重悬细胞，在共聚焦显微镜下检测人肿瘤组织或外周血中细胞荧光染色情况。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，还包括将试剂A和试剂B按照10：1配比混合,取25-50μL,微静脉注射荷瘤小鼠,3h后对小鼠进行荧光活体成像观察。
9.权利要求1-3中任一项所述的检测试剂盒配合肿瘤单细胞基因测序技术鉴定基因突变及表达信息的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用基于经检测试剂盒染色标记人组织和血液循环肿瘤细胞后分离出的肿瘤单细胞实施。
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