CN113686643A - 类器官组织石蜡切片的包埋试剂盒及石蜡切片制备方法 - Google Patents

类器官组织石蜡切片的包埋试剂盒及石蜡切片制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种类器官组织石蜡切片的包埋试剂盒及石蜡切片制备方法，其方法操作简单，不需要裂解基质胶回收细胞球，能够避免类器官组织样本的丢失和结构损坏，并且还能防止抗原蛋白的抗原以及相关酶的丢失，防止基因（RNA、DNA）的降解，大幅缩短类器官样本的包埋时间，使最终得到的石蜡切片能够满足免疫荧光蛋白检测、原位基因检测（原位杂交、RNAscope）、病理染色、特殊染色等实验要求。

Description

类器官组织石蜡切片的包埋试剂盒及石蜡切片制备方法
技术领域
本发明涉及类器官组织的包埋技术领域，特别涉及一种类器官组织石蜡切片的包埋试剂盒及石蜡切片制备方法。
背景技术
类器官是应用体外 3D 培养技术建立的结构和功能上类似于器官的小型组织（LANCASTER M A，KNOBLISH J A. Organogenesis in a dish: modeling developmentand disease using organoid technologies［J］. Science，2014，345（6194）:1247125.），具有细胞自我更新（Self- renewing）、细胞自组装（cell self- assembly）、器官生理活性、长期培养及遗传稳定等特征，与传统体外模型相比更接近体内器官的生理状态，在生命科学研究领域中具有巨大的应用前景，由于类器官的基因遗传、细胞增殖，以及细胞分化都由干细胞群控制，在药物、细胞因子、病毒、细菌等刺激下类器官的内部结构、表型、细胞种类均有所差异，因此类器官的形态学病理组织学检测，显得尤为重要。
石蜡切片（paraffin section）是组织学常规制片技术中应用最广泛的一种方法，不仅可用于观察正常细胞组织的形态结构，还是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，并已广泛地用于其它学科领域的研究中，其优势在于细胞定位准确，细胞形态结构保存完好，可以在室温下长期保存，可作为永久性显微玻片标本。
类器官的培养依赖于细胞黏附和细胞骨架，需要相应环境的支持，其中基质胶是类器官培养中使用最为广泛的细胞外基质。基质胶在-20℃以下时为固态，4-8℃时为液态，37℃以上固化为果冻状，而类器官在基质胶中的培养环境是37℃的二氧化碳培养箱，因此培养在基质胶中的类器官混合物为果冻状，这样特殊的相态导致直接原位在基质胶中制备石蜡切片非常困难。
其主要存存在以下几个问题：
目前，现有类器官石蜡切片制备方法，仅用于病理检测（HE染色），并不能满足免疫荧光、原位杂交、特殊染色等实验的制片要求，并且在实验操作中通常会先用柔性的消化酶和细胞回收液（cell recovery solution）等方法溶解类器官上的基质胶，然后用EP管收集解离后的类器官，并对收集有类器官的EP管进行离心，再收集离心后的类器官沉淀，然后在EP管中进行类器官的固定，琼脂糖包裹，最后切开EP管取出固化的琼脂-类器官，才能进行石蜡包埋。在进行这些步骤过程中，由于类器官的固定试剂通常会导致基质胶发生溶胶，且没有合适的预包埋模具，因此必须使用细胞回收液先溶解包裹在类器官上的基质胶，然后还需要对裸露的类器官进行多次离心和重悬洗涤，极易造成类器官样本数量的损失和类器官球体的损伤，并且由于需要裂解基质胶，进行多次离心洗涤，才固定类器官，实验过程大约需要3-4个小时，均在室温操作，活体的类器官均处于缺氧，缺乏营养的状态，极其容易导致类器官样本的凋亡、蛋白消融、基因（DNA、RNA）降解，无法客观反映蛋白与基因的真实表达；并且类器官支撑的基质胶被溶解后，还会破坏类器官在基质胶中的原位结构；因此采用此方法制备的类器官石蜡切片无法满足免疫荧光蛋白检测、原位基因检测（原位杂交、RNAscope）、特殊染色等实验要求。
第二，由于基质胶的主要成分包括粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等，因此在部分常规固定液的固定下会导致基质胶出现溶胶现象，一旦出现溶胶现象，就会导致基质胶类器官的培养混合物发生塌陷，从而破坏类器官的球体结构。
第三、琼脂糖的溶解温度太高，若直接用刚溶解的琼脂糖与类器官混合，则会极大地增加类器官的RNA降解风险，从而导致制成的石蜡切片原位基因检测变得十分困难。
第四，由于基质胶本身没有颜色，因此用包埋固定试剂固定后无法确定类器官的所在位置，切片时只能盲目进行连续切片，不但浪费实验时间，增加实验成本，还很难获取结构完整的类器官样本切片，甚至导致实验失败。
因此在类器官在石蜡切片样本制备中，培养后类器官的原位固定，类器官组织固定液的选择，包埋琼脂糖熔点的选择，基质胶着色，抗原蛋白的抗原消融以及相关酶的丢失，防止基因（RNA、DNA）的降解都是导致类器官，石蜡切片预制备是否成功的关键因素，也是迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种类器官组织石蜡切片的包埋试剂盒及石蜡切片制备方法，其不需要裂解基质胶回收细胞球，能够避免类器官组织样本的丢失和结构损坏，并且还能防止抗原蛋白的抗原以及相关酶的丢失，防止基因（RNA、DNA）的降解，使最终得到的石蜡切片均能够满足免疫荧光蛋白检测、原位基因检测（原位杂交、RNAscope）、特殊染色等实验要求。
本发明的一种技术方案是：一种类器官组织石蜡切片的包埋试剂盒，包括一外盒，多个包埋盒、一个碳粉标记笔、一个试剂吸管，以及多个瓶装试剂，所述外盒的盒体内设置泡沫垫，所述泡沫垫上设置包埋盒固定槽、标记笔固定槽、吸管固定槽、瓶装试剂固定槽，所述包埋盒由底盒和上盖构成，所述底盒中设置一样本存放槽，该样本存放槽的槽深为1~1.2cm，所述样本存放槽的槽宽为1.4~1.6cm，样本存放槽的长度为1.5~1.7cm，所述样本存放槽的槽口与底盒的盒口齐平，所述样本存放槽的下端设置50~100目的筛网，所述上盖和样本存放槽四周的底盒底部均设置若干过孔，所述碳粉标记笔包括用于储存碳粉的笔管和***笔管内的推杆，所述笔管的笔尖为直径逐渐缩小的空心锥管，所述空心锥管上套有一笔帽；所述瓶装试剂包括Biowest agarose、丙酮；所述试剂吸管的后端设置气囊；所述多个包埋盒、一个碳粉标记笔、一个试剂吸管，以及瓶装凝固剂均放置在外盒的盒体内，盖上盒盖形成封闭。
进一步的，所述包埋盒的上盖一侧与底盒铰接，上盖另一侧通过卡子与底盒上设置的卡槽卡接。
进一步的，所述包埋盒的底盒侧面为磨砂塑料。
进一步的，所述笔管的后端设置凸缘。
进一步的，所述推杆伸入笔管的一端设置橡胶套与笔管滑动配合。
进一步的，所述碳粉标记笔的空心锥管最小孔径为0.3~0.5cm。
采用上述技术方案的有益效果：在包埋盒中设置样本存放槽，该样本存放槽与基质胶类器官混合物相适配，方便对类器官进行预包埋固型，且包埋盒的样本存放槽的下端设置50~100目的筛网，能够防止预包埋所用的溶解Biowest agarose渗出，同时保证后期能顺利进行脱水等操作，使类器官组织样本能够在包埋盒中完成预包埋、脱水、透明、浸蜡等操作，操作过程中不需要频繁转移样本，从而最大程度保证类器官组织结构的完整性。此外，使用碳粉标记笔可以通过碳粉对类器官组织样本的位置进行标记，保证标记位置的可靠性，便于后期进行石蜡切片时修片，降低切片难度，且采用碳粉标记不会影响样本的结构和特性。本包埋试剂盒中放置有包埋盒、装有碳粉的碳粉标记笔、试剂吸管，以及实验所需的瓶装凝固剂，因此实验人员在制备类器官组织石蜡切片时，可以直接利用包埋试剂盒中的工具和试剂进行操作，便于实验操作，大幅缩短实验时间，提高实验的成功率。
本发明的另一种技术方案是：一种类器官组织石蜡切片的制备方法，包括以下步骤：
1）配置Biowest agarose：用蒸馏水配置20%的Biowest agarose，40℃水浴溶解20min，并使Biowest agarose在37℃恒温下保持溶解状态；
2）放置第一层Biowest agarose：用试剂吸管吸取700μL的Biowest agarose，放置在样本存放槽的筛网上，并置于4~6℃下凝固10~25min；
3）固定样本：去除细胞培养玻片孔中类器官组织的培养基，用PBS缓冲液清洗三次，每次清洗3min，然后加入丙酮，并置于4℃下固定20min；
4）转移样本：去除细胞培养玻片孔中的丙酮，并用PBS缓冲液清洗两次，每次清洗3min，从细胞培养玻片孔中取出混合有基质胶的类器官组织样本，放置在步骤2）已凝固的Biowest agarose上；
5）标记样本：按压碳粉标记笔，用碳粉对类器官组织样本的四个角进行标记；
6）预包埋：用试剂吸管吸取溶解的Biowest agarose到样本存放槽中，使Biowestagarose完全覆盖类器官组织样本，并置于4~6℃下凝固30min，盖上包埋盒的上盖，形成Biowest agarose-类器官组织样本-Biowest agarose的预包埋结构；
7）脱水及透明处理：将存放有类器官组织样本的包埋盒，依次放入75%、85%、90%、95%（Ⅰ）、95%（Ⅱ）、100%（Ⅰ）、100%（Ⅱ）的乙醇中梯度脱水各1h，然后放入氯仿中进行透明处理2h；
8）石蜡包埋：将存放有类器官组织样本的包埋盒依次放入60℃熔蜡Ⅰ、60℃熔蜡Ⅱ中分别浸蜡1h，然后从包埋盒中取出Biowest agarose包埋的类器官组织样本，用石蜡包埋机包埋成蜡块，置于常温下保存；
9）样本切片：将步骤8）得到的类器官组织蜡块，以类器官组织样本的碳粉标记点为界，去除没有类器官组织样本的多余部分，从标记点起按3~5μm的厚度对类器官组织样本进行石蜡切片。
进一步的，所述Biowest agarose采用的品牌为Biowest，且凝胶温度为37±1.5℃。
进一步的，所述丙酮加入的体积为类器官组织样本的3~5倍。
采用上述技术方案的有益效果：本制备方法采用丙酮固定类器官组织，由于丙酮不会使与基质胶发生反应，不能造成溶胶，因此可以直接在细胞培养玻片孔（八腔室培养板）中对类器官组织进行原位固定，且丙酮不但具有固定和脱水双重作用还有很强的穿透力，能很好的保护细胞蛋白抗原、RNA的完整性和组织中酶的活性，而且，本制备方法采用的Biowest agarose为低熔点琼脂糖，其在40℃下即可熔化，该熔化温度低于大多数双链DNA的熔点，能防止高温导致类器官组织样本的基因发生降解，因此可以直接将溶解状态的Biowest agarose覆盖在类器官组织样本上，使Biowest agarose和类器官组织样本形成Biowest agarose-类器官组织样本-Biowest agarose的三层夹心结构，即Biowestagarose能够完全覆盖住类器官组织样本，保证预包埋的可靠性。而且，本制备方法可以在包埋盒中对类器官组织样本完成Biowest agarose预包埋、脱水、透明、浸蜡这些操作，不需要频繁转移样本，无论是细胞培养玻片还是包埋盒都可以完整取出包裹在类器官组织上的基质胶，因此不需要用细胞回收液溶解基质胶，从而最大程度保持类器官组织的完整性，提高石蜡切片的制备成功率，以及能极大地提高制备效率，缩短类器官组织样本的包埋时间。
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为本发明的包埋盒的结构示意图；
图2为图1的A-A剖视图；
图3为本发明的碳粉标记笔的结构示意图；
图4为本发明的试剂吸管的结构示意图；
图5为本发明的外盒的布局示意图；
图6为本发明的外盒剖视图；
图7为本发明实施例3肺类器官病理检测（HE染色）观察示意图；
图8为本发明实施例4肺类器官免疫荧光染色观察示意图；
图9为本发明实施例5肺类器官RNAscope染色观察示意图。
具体实施方式
参见图1至图6，实施例1，一种类器官组织石蜡切片的包埋试剂盒，包括一外盒1，多个包埋盒2、一个碳粉标记笔3、一个试剂吸管4，以及多个瓶装试剂。所述外盒1的盒体6内设置泡沫垫7，所述泡沫垫7上设置包埋盒固定槽8、标记笔固定槽9、吸管固定槽10、瓶装试剂固定槽11，通过泡沫垫7对各器具起到固定保护作用，防止运输过程中因发生碰撞而损坏，多个包埋盒2可重叠的放置在包埋盒固定槽8中。所述包埋盒2由底盒12和上盖13构成，所述包埋盒2的上盖13一侧与底盒12铰接，上盖13另一侧通过卡子13-1与底盒12上设置的卡槽12-1卡接。所述底盒12中设置一样本存放槽14，用于存放样本，该样本存放槽14的槽深为1~1.2cm，所述样本存放槽14的槽宽为1.4~1.6cm，样本存放槽14的长度为1.5~1.7cm，使样本存放槽14的体积与6腔室或8腔室的细胞培养玻片孔的体积相适配，在类器官组织样本预包埋时起到塑形作用，所述样本存放槽14的槽口与底盒12的盒口齐平。所述样本存放槽14的下端设置50~100目的筛网15，防止溶解Biowest agarose渗出，该筛网15可采用粘接的方式与底盒12连接固定，所述上盖13和样本存放槽14四周的底盒底部均设置若干过孔16，使试剂能够通过过孔16与样本接触发生反应，则后期可以将样本直接放置在包埋盒2中完成脱水、透明等操作。所述包埋盒2的底盒12侧面为磨砂塑料，便于实验人员在记录样本名称、实验日期等。所述碳粉标记笔3包括用于储存碳粉的笔管17和***笔管17内的推杆18，所述笔管17的后端设置凸缘17-1，方便实验人员握持，从而能更好控制碳粉的出粉量，所述推杆18伸入笔管17的一端设置橡胶套21与笔管17滑动配合，增大推杆18与笔管17之间摩擦力，防止碳粉标记笔3出粉过多，所述笔管17的笔尖为直径逐渐缩小的空心锥管19，所述碳粉标记笔3的空心锥管19最小孔径为0.3~0.5cm，使碳粉标记笔3的出粉量较小，使用时，只需轻轻推动碳粉标记笔3的推杆18推出少量碳粉即可，单手就能完成操作，操作简单方便，所述空心锥管19上套有一笔帽5，使碳粉标记笔3在使用完后不会有碳粉泄露。所述瓶装试剂包括Biowest agarose、丙酮。所述试剂吸管4的后端设置气囊4-1，按压气囊4-1就可吸取液体试剂，所述多个包埋盒2、一个碳粉标记笔3、一个试剂吸管4，以及瓶装凝固剂均放置在外盒1的盒体6内，盖上盒盖20形成封闭。
使用本包埋试剂盒进行类器官组织石蜡切片的制备时，可以在包埋盒2中完成类器官组织样本的预包埋、脱水、透明、浸蜡等一系列操作，操作过程中不需要频繁转移样本，从而最大程度保证类器官组织结构的完整性，且在完成操作后方便完整取出样本。而且，可以使用碳粉标记笔3通过碳粉对样本的位置和区域进行标记，保证标记位置的可靠性，便于后期进行石蜡切片时修片，降低切片难度，提高石蜡切片的制备成功率，且采用碳粉标记不会影响样本的结构和特性。此外，本包埋试剂盒中放置有包埋盒2、装有碳粉的碳粉标记笔3、试剂吸管4，以及实验所需的瓶装凝固剂，因此实验人员在制备类器官组织石蜡切片时，可以直接利用包埋试剂盒中的工具和试剂进行操作，便于实验操作，提高实验的成功率。而实验过程中所需的其它试剂如PBS缓冲液、无水乙醇、石蜡等，采用日常实验室所配备的即可。
一种类器官组织石蜡切片的制备方法的实施例
试剂：PBS缓冲液：品牌：Solarbio ，货号：P10102，AR分析纯；
无水乙醇：品牌：川东化工，AR分析纯；
Biowest agarose：品牌：Biowest，货号：BY-R0100，AR分析纯；
二甲苯：品牌：川东化工，AR分析纯；
石蜡：品牌：世泰，AR分析纯；
氯仿：品牌：川东化工，AR分析纯；
苏木素：品牌：Sigma，货号：H3136，AR分析纯；
伊红：品牌：Sigma，货号：45260-25G-F，AR分析纯；
枸橼酸钠缓冲液：品牌：Solarbio ，货号：C1010,AR分析纯；
TritonX-100：品牌：Sigma，货号：X100-100ML，AR分析纯；
驴血清：品牌:Solarbio，货号：YZ-017-000-121，生物制剂；
一抗SPC：品牌:abcam，货号：ab40879，生物制剂；
二抗驴抗兔594：品牌:abcam，货号：ab150064，生物制剂；
DAPI：品牌:Solarbio，货号：C0060，生物制剂；
RNAscope试剂盒: 品牌：ACD，货号323110，生物制剂。
实施例2，小鼠肺干祖细胞AEC2s培养的肺类器官石蜡切片的制备方法，包括以下步骤：
1）配置Biowest agarose：用蒸馏水配置20%的Biowest agarose，高浓度的Biowest agarose便于实验人员能准确切片，所述Biowest agarose采用的品牌为Biowest，且凝胶温度为37±1.5℃，40℃水浴溶解20min，并使Biowest agarose在37℃恒温下保持溶解状态。
2）放置第一层Biowest agarose：用试剂吸管吸取700μL的Biowest agarose，放置在样本存放槽的筛网上，并置于4~6℃下凝固10~25min，这一层Biowest agarose可以在类器官组织样本的底部形成包裹，防止类器官组织样本粘连在筛网上，便于从样本存放槽中完整取出类器官组织样本。
3）固定样本：去除细胞培养玻片孔中类器官组织的培养基，用PBS缓冲液清洗三次，每次清洗3min，然后加入丙酮，并置于4℃下固定20min，所述丙酮加入的体积为类器官组织样本的3~5倍，保证丙酮对类器官组织的固定效果；
由于丙酮的渗透力很强，能够使蛋白质沉淀凝固，同时不影响蛋白质的功能基团，而且具有固定和脱水的双重作用，穿透力快，可以很好的保护类器官组织样本RNA的完整性，使类器官组织块收缩明显，硬化力强，能很好的保存酶的活性，用于固定类器官组织的磷酸酶和氧化酶效果很好。
4）转移样本：去除细胞培养玻片孔中的丙酮，并用PBS缓冲液清洗两次，每次清洗3min，轻轻掰开细胞培养玻片的左右固定点，取出培养有类器官组织的玻片，完整取出玻片上混合有基质胶的类器官组织样本，放置在步骤2）已凝固的Biowest agarose上。
5）标记样本：按压碳粉标记笔，用碳粉对类器官组织样本的四个角进行标记。
6）预包埋：用试剂吸管吸取溶解的Biowest agarose到样本存放槽中，使Biowestagarose完全覆盖类器官组织样本，在类器官组织样本的上端和四周覆盖第二层Biowestagarose，并置于4~6℃下凝固10min，盖上包埋盒的上盖，形成Biowest agarose-类器官组织样本-Biowest agarose的三层夹心式预包埋结构。
7）脱水及透明处理：将存放有类器官组织样本的包埋盒，依次放入75%、85%、90%、95%（Ⅰ）、95%（Ⅱ）、100%（Ⅰ）、100%（Ⅱ）的乙醇中梯度脱水各1h，去除类器官组织、基质胶、Biowest agarose中的水分，使后续进行石蜡包埋时，石蜡能够渗入类器官组织内部；然后放入氯仿中进行透明处理2h，作为透明剂的氯仿既能与脱水剂乙醇混合，也能与石蜡混合，使用氯仿取代脱水剂，便于石蜡能顺利渗入类器官组织内部。
8）石蜡包埋：将存放有类器官组织样本的包埋盒依次放入60℃熔蜡Ⅰ、60℃熔蜡Ⅱ中分别浸蜡1h，石蜡浸入类器官组织间隙，取代透明剂氯仿，然后从包埋盒中取出Biowestagarose包埋的类器官组织样本，用石蜡包埋机包埋成蜡块，置于常温下保存。
9）样本切片：将步骤8）得到的类器官组织蜡块，以类器官组织样本的碳粉标记点为界，去除没有类器官组织样本的多余部分，从标记点起按3~5μm的厚度对类器官组织样本进行石蜡切片。
实施例3，如图 7所示，采用实施例2制备的肺类器官石蜡切片，进行病理学检测（HE染色），结果如下：
将培养13天的肺类器官，去除培养基，用本发明的石蜡切片制备方法，制备厚度3~5μm的肺类器官石蜡切片，置于烘箱中用58℃烤3h，然后在二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）分别处理25min，再依次置于无水乙醇（Ⅰ）、无水乙醇（Ⅱ）、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各脱水5min，然后置于新的切片盒中，用于无菌水浸洗5min，苏木素染色10min，随后用自来水冲洗，盐酸酒精分化，蒸馏水洗涤，伊红染色5min，蒸馏水洗涤，吹干，二甲苯透明，最后用中性树脂封片，并通过体视学显微镜采集图片。
HE染色结果：能观察到肺类器官的球体结构，实心球体和空心球体，结构完整，有肺泡样解构，包膜完整。
实施例4，如图8所示，采用实施例2制备的肺类器官石蜡切片，进行免疫荧光染色，实验结果如下：
将培养13天的肺类器官，去除培养基，用本发明的石蜡切片制备方法，制备厚度3-5μm类器官石蜡切片，置于烘箱58℃下烤3h，然后在二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）中分别处理25min，再依次置于无水乙醇（Ⅰ）、无水乙醇（Ⅱ）、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各脱水5min。
然后PBS洗涤2次，在高压锅中加入1000ml浓度为10mM的枸橼酸钠缓冲液（PH6.0），高压修复2.5mn，安全阀落下后，将高压锅放到自来水下冲淋降温，使切片逐步降温。
0.2%TritonX-100细胞穿孔10min，驴血清封闭1h，加入一抗（SPC）在4℃下过夜孵育，次日，在室温下平衡30min，PBS清洗3次，每次清洗5min，再加入二抗（驴抗小鼠488），并置于37℃下孵育1h，再次用PBS洗涤，DAPI染核，最后用抗荧光淬灭机封片，并通过激光共聚焦采集图片。
免疫荧光结果：能观察到SPC特异表达，并且肺类器官结构形态完整，采用本发明制备的肺类器官石蜡切片，能很好的保持样本蛋白，防止抗原丢失。
实施例5，如图9所示，采用实施例2制备的肺类器官石蜡切片，进行RNAscope染色，实验结果如下：
将培养13天的肺类器官，去除培养基，用本发明的石蜡切片制备方法，制备厚度3-5μm类器官石蜡切片，置于烘箱58℃下烤3h，然后在二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）中分别处理25min，再依次置于无水乙醇（Ⅰ）、无水乙醇（Ⅱ）、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各脱水5min。
然后PBS洗涤2次，将已脱蜡的载玻片放置在 HybEZ ™ 载玻片架上，滴加约 5-8滴RNAscope®双氧水，使其覆盖样本，室温下孵育载玻片10 min，蒸馏水洗涤2min;RNAscope® 1X靶标修复试剂，加热至沸腾修复10-15min，即刻取出样本放入蒸馏水中洗涤2min，使切片逐步降温;100%乙醇处理3min，组化笔画出样本的位置；滴加约5滴RNAscope®蛋白酶Plus试剂，以完全覆盖切片，杂交炉（40℃）中孵育30min，蒸馏水清洗2min。
根据ACD品牌RNAscope多通道荧光检测试剂盒步骤，依次探针杂交、荧光染料结合、DAPI染核、抗荧光淬灭机封片、激光共聚焦采集图片。
RNAscope多通道荧光检测结果显示：能观察到单细胞上原位RNA基因的表达，染色结果均为散点或成簇的荧光点，为典型的原位RNA杂交染色结果，采用本发明试剂盒制备的类器官石蜡切片，不但能防止样本RNA降解，并且保证了RNA片段的完整性。
本制备方法采用丙酮固定类器官组织，由于丙酮不会使基质胶发生溶胶，因此可以直接在细胞培养玻片孔中对类器官组织进行原位固定，且丙酮具有固定和脱水双重作用，能很好的保护RNA的完整性，以及保存类器官组织中酶的活性，而且，本制备方法采用的Biowest agarose为低熔点琼脂糖，其在40℃下即可熔化，该熔化温度低于大多数双链DNA的熔点，本发明的Biowest agarose溶解温度不会损坏类器官组织样本的基因，因此可直接将溶解的Biowest agarose覆盖在类器官组织样本上，形成Biowest agarose-类器官组织样本-Biowest agarose的三层夹心结构，即Biowest agarose能够完全覆盖住类器官组织样本，保证预包埋的可靠性。而且，本制备方法可以在包埋盒中对类器官组织样本完成Biowest agarose预包埋、脱水、透明、浸蜡这些操作，不需要频繁转移样本，无论是细胞培养玻片孔还是包埋盒都可以完整取出包裹在类器官组织上的基质胶，因此不需要用细胞回收液溶解基质胶，从而最大程度保持类器官组织的完整性，提高石蜡切片的制备成功率，以及能极大地提高制备效率。由于本制备方法制得的类器官组织石蜡切片的结构完整、可以最大程度保护类器官组织的基因和蛋白抗原，能够满足免疫荧光、原位杂交、特殊染色等实验的制片要求，因此可适用于病理检测（HE染色）、特殊染色、免疫荧光染色检测、RNAscope染色检测等，极大地提高了类器官组织石蜡切片使用广泛性。

Claims (9)

1.一种类器官组织石蜡切片的包埋试剂盒，其特征在于：包括一外盒（1），多个包埋盒（2）、一个碳粉标记笔（3）、一个试剂吸管（4），以及多个瓶装试剂，所述外盒（1）的盒体（6）内设置泡沫垫（7），所述泡沫垫（7）上设置包埋盒固定槽（8）、标记笔固定槽（9）、吸管固定槽（10）、瓶装凝固剂固定槽（11），所述包埋盒（2）由底盒（12）和上盖（13）构成，所述底盒（12）中设置一样本存放槽（14），该样本存放槽（14）的槽深为1~1.2cm，所述样本存放槽（14）的槽宽为1.4~1.6cm，样本存放槽（14）的长度为1.5~1.7cm，所述样本存放槽（14）的槽口与底盒（12）的盒口齐平，所述样本存放槽（14）的下端设置50~100目的筛网（15），所述上盖（13）和样本存放槽（14）四周的底盒底部均设置若干过孔（16），所述碳粉标记笔（3）包括用于储存碳粉的笔管（17）和***笔管（17）内的推杆（18），所述笔管（17）的笔尖为直径逐渐缩小的空心锥管（19），所述空心锥管（19）上套有一笔帽（5）；所述瓶装试剂包括Biowest agarose、丙酮；所述试剂吸管（4）的后端设置气囊（4-1）；所述多个包埋盒（2）、一个碳粉标记笔（3）、一个试剂吸管（4），以及瓶装试剂均放置在外盒（1）的盒体（6）内，盖上盒盖（20）形成封闭。
2.根据权利要求1所述的类器官组织石蜡切片的包埋试剂盒，其特征在于：所述包埋盒（2）的上盖（13）一侧与底盒（12）铰接，上盖（13）另一侧通过卡子（13-1）与底盒（12）上设置的卡槽（12-1）卡接。
3.根据权利要求1所述的类器官组织石蜡切片的包埋试剂盒，其特征在于：所述包埋盒（2）的底盒（12）侧面为磨砂塑料。
4.根据权利要求1所述的类器官组织石蜡切片的包埋试剂盒，其特征在于：所述笔管（17）的后端设置凸缘（17-1）。
5.根据权利要求1所述的类器官组织石蜡切片的包埋试剂盒，其特征在于：所述推杆（18）伸入笔管（17）的一端设置橡胶套（21）与笔管（17）滑动配合。
6.根据权利要求1所述的类器官组织石蜡切片的包埋试剂盒，其特征在于：所述碳粉标记笔（3）的空心锥管（19）最小孔径为0.3~0.5cm。
7.一种类器官组织石蜡切片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）配置Biowest agarose：用蒸馏水配置20%的Biowest agarose，40℃水浴溶解20min，并使Biowest agarose在37℃恒温下保持溶解状态；
2）放置第一层Biowest agarose：用试剂吸管吸取700μL的Biowest agarose，放置在样本存放槽的筛网上，并置于4~6℃下凝固10~25min；
3）固定样本：去除细胞培养玻片孔中类器官组织的培养基，用PBS缓冲液清洗三次，每次清洗3min，然后加入丙酮，并置于4℃下固定20min；
4）转移样本：去除细胞培养玻片孔中的丙酮，并用PBS缓冲液清洗两次，每次清洗3min，从细胞培养玻片孔中取出混合有基质胶的类器官组织样本，放置在步骤2）已凝固的Biowest agarose上；
5）标记样本：按压碳粉标记笔，用碳粉对类器官组织样本的四个角进行标记；
6）预包埋：用试剂吸管吸取溶解的Biowest agarose到样本存放槽中，使Biowestagarose完全覆盖类器官组织样本，并置于4~6℃下凝固10min，盖上包埋盒的上盖，形成Biowest agarose-类器官组织样本-Biowest agarose的预包埋结构；
7）脱水及透明处理：将存放有类器官组织样本的包埋盒，依次放入75%、85%、90%、95%（Ⅰ）、95%（Ⅱ）、100%（Ⅰ）、100%（Ⅱ）的乙醇中梯度脱水各1h，然后放入氯仿中进行透明处理2h；
8）石蜡包埋：将存放有类器官组织样本的包埋盒依次放入60℃熔蜡Ⅰ、60℃熔蜡Ⅱ中分别浸蜡1h，然后从包埋盒中取出Biowest agarose包埋的类器官组织样本，用石蜡包埋机包埋成蜡块，置于常温下保存；
9）样本切片：将步骤8）得到的类器官组织蜡块，以类器官组织样本的碳粉标记点为界，修掉没有类器官组织样本的多余部分，从标记点起按3~5μm的厚度对类器官组织样本进行石蜡切片。
8.根据权利要求8所述的类器官组织石蜡切片的制备方法，其特征在于：所述Biowestagarose采用的品牌为Biowest，且凝胶温度为37±1.5℃。
9.根据权利要求8所述的类器官组织石蜡切片的制备方法，其特征在于：所述丙酮加入的体积为类器官组织样本的3~5倍。
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