CN113684225A

CN113684225A - 番茄SlHMGA3基因在培育果实延迟成熟的番茄中的应用

Info

Publication number: CN113684225A
Application number: CN202110592538.6A
Authority: CN
Inventors: 吴寒; 李治飞; 皮颖
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-05-28
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2041-05-28
Also published as: CN113684225B

Abstract

本发明公开了一种番茄SlHMGA3基因在培育果实延迟成熟的番茄中的应用，属于番茄基因工程技术领域，该应用方法先构建出番茄SlHMGA3基因CRISPR/Cas9表达载体；设计SlHMGA3基因的2个靶序列，然后将启动子连同包含2个靶点的sgRNA序列进行基因合成后，***到载体的两个酶切位点之间，得到SlHMGA3基因突变载体。构建的测序正确载体转入宿主细胞中，再利用其侵染番茄的子叶外植体，在阳性转基因番茄后代中筛选SlHMGA3基因突变但不包含基因敲除载体序列的番茄植株，获得果实延迟成熟的番茄植株。为了便于对番茄植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物等。

Description

番茄SlHMGA3基因在培育果实延迟成熟的番茄中的应用

技术领域

本发明属于番茄基因工程技术领域，特别是番茄SlHMGA3基因在培育果实延迟成熟的番茄中的应用。

背景技术

番茄富含多种维生素，营养价值高，具有特殊风味，农业经济价值高。番茄为二倍体、其基因组小；生长周期短，果实生长发育阶段容易区分，成熟表型易观察；番茄种质资源、突变体库、高密度遗传图谱、EST资源丰富；遗传转化***成熟；栽培番茄全基因组精细测序已经完成，因此番茄成为研究肉质果实成熟的模式植物。番茄为呼吸跃变型果实，成熟过程中颜色味道、气味、果实质地及生理生化代谢物等发生一系列变化。在转录水平上，果实成熟代谢变化受多种相关的转录因子进行精密的转录调控。因此，转录因子调控网络成为了研究果实成熟分子机制的热点。

HMGA蛋白是一种结构转录因子，属于HMG蛋白(The high mobility groups)家族，HMG蛋白为非组蛋白染色质结合蛋白，在组装重构染色体和调控基因转录方面发挥重要作用，包括HMGA、HMGB和HMGN三个亚家族。HMG家族的结构和功能已在哺乳动物中进行了大量的研究，但植物中的研究很少。HMGA蛋白在植物各个组织器官中普遍表达，由具有GH1结构域(组蛋白H1中央球状结构域)的N末端结构域和包含AT-hook基序的C末端结构域组成。拟南芥中的HMGA-like蛋白质家族包括三种蛋白质：GH1-HMGA1，GH1-HMGA2和GH1-HMGA3。与哺乳动物的HMGA蛋白相比，这些蛋白通常在组蛋白H1中存在一个额外的高度保守的H1/H5连接结构域。作为经典的HMGA蛋白，GH1-HMGA3具有四个已明确识别的AT-hook基序。玉米HMGA蛋白与富含AT的DNA有很强的结合力，并且可以被SUC1相关激酶强烈磷酸化，从而在体外降低了其与富含AT的DNA的结合力。AtHMGA(最近更名为GH1-HMGA3)位于细胞核中，在细胞核中极为活跃。HMGA作为结构转录因子，每种蛋白质均具有三个保守的AT-hook DNA结合基序，可***到DNA小沟中并与富含AT碱基的区域相互作用。HMGA蛋白可以在体内与大量其他蛋白发生特异性相互作用，抑制和激活这些蛋白的转录。

充分利用生物技术手段改变转录因子在植物中的表达水平，能够为植物优势育种、农业生产稳定发展奠定基础。因此，通过对SlHMGA3基因的克隆、转基因技术培育SlHMGA3突变的番茄材料，在培育晚熟番茄品种工作方面提供了很好的基因种质资源，具有很好的应用前景。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供了番茄SlHMGA3基因在培育果实延迟成熟的番茄中的应用，具体通过以下技术实现。

番茄SlHMGA3基因在培育果实延迟成熟的番茄中的应用，所述番茄SlHMGA3基因包含以下任意一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

(2)从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸，且具有不改变原核苷酸序列的功能的，并具有相同功能的核苷酸序列；

(3)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的DNA分子。

上述列举的四种番茄SlHMGA3基因，第(2)种是指虽然SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中某些核苷酸被取代、缺失和/或增加，但是仍然能够正常编码表达实现原番茄SlHMGA3基因实际功能的序列。第(3)种是指虽然有部分(不超过10％)碱基(核苷酸)的差异，但是仍能够正常转录翻译获得与原番茄SlHMGA3基因转录翻译相同的蛋白质。

一种果实延迟成熟的番茄的培育方法，包括如下步骤：

S1、构建含有番茄SlHMGA3基因敲除载体的宿主细胞工程菌；

S2、将步骤S1获得的根癌农杆菌工程菌转染番茄叶片外植体中，筛选番茄SlHMGA3基因突变且不含步骤S1所述番茄SlHMGA3基因敲除载体序列的番茄植株；

S3、将步骤S2获得的突变番茄植株种植于温室中，培育得到果实延迟成熟的番茄；

所述番茄SlHMGA3基因包含以下任意一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

上述果实延迟成熟的番茄的培育方法，先构建出番茄SlHMGA3基因CRISPR/Cas9表达载体；利用CRISPR-P网站设计SlHMGA3基因的2个靶序列，然后将AtU3d和AtU3b启动子连同包含2个靶点的sgRNA序列AtU3d-sgRNA1-AtU3b-sgRNA2进行基因合成后，***到载体2300GN-Ubi-Cas9的SbfI和SmaI酶切位点之间，得到SlHMGA3基因突变载体。构建的测序正确载体转入宿主细胞(例如根癌农杆菌EHA105)中，再利用其侵染番茄(品种例如Micro-Tom)的子叶外植体，在阳性转基因番茄后代中筛选SlHMGA3基因突变但不包含基因敲除载体序列的番茄植株，获得果实延迟成熟的番茄植株。为了便于对基因突变的番茄植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物等。

上述果实延迟成熟的番茄的培育方法，就是将番茄SlHMGA3基因通过基因编辑技术敲除部分碱基(核苷酸)，获得突变的载体，然后转染获得相应基因突变的番茄植株，这种番茄植株中即含有番茄SlHMGA3基因突变体，达到延迟果实成熟的目的。

优选地，上述果实延迟成熟的番茄培育方法中，步骤S1所述的番茄SlHMGA3基因敲除是通过CRISPR/Cas9的基因编辑技术实现的，所述的番茄SlHMGA3基因敲除载体是2300GN-Ubi-Cas9-AtU3d-sgRNA1-AtU3b-sgRNA2。

优选地，上述培育方法中，步骤S1具体包括如下步骤：

S11、在SlHMGA3基因外显子上设计2个靶序列，2个靶序列的核苷酸序列如SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示；然后将AtU3d启动子和AtU3b启动子连同包含2个所述靶序列的sgRNA序列AtU3d-sgRNA1-AtU3b-sgRNA2进行基因合成后，***到载体2300GN-Ubi-Cas9的SbfI和SmaI酶切位点之间，得到SlHMGA3基因突变载体；

S12、将步骤S11的SlHMGA3基因突变载体转染到宿主细胞中，得到宿主细胞工程菌。

更优选地，上述培育方法中，步骤S11的序列AtU3d-sgRNA1-AtU3b-sgRNA2如SEQID No.5所示。

优选地，步骤S1中所用的宿主细胞为大肠杆菌菌株或根癌农杆菌菌株。一般情况下采用根癌农杆菌为EHA105。

上述培育方法可以广泛应用于培育培育果实延迟成熟的番茄中。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

1、本发明首次构建了番茄SlHMGA3基因敲除的植株，并进行功能研究。通过表型观察、数据统计、果实成熟相关指标的测定、乙烯相关基因表达分析及成熟相关转录因子基因表达分析，发现敲除SlHMGA3基因的突变能够起到延迟番茄果实成熟的作用，同时并没有明显影响植株生长。

2、本发明提供的SlHMGA3基因为培育晚熟番茄新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值，为研究番茄植物成熟相关转录因子调控网络奠定理论基础。

附图说明

图1为实施例1中SlHMGA3基因在野生型番茄(Micro Tom)不同组织(根Root，茎Shoot，叶Leaf，花Flower)及果实发育不同阶段(开花后5天果实IMG，开花后15天果实IMG，开花后30天果实MG，开花后39天破色果实BR，黄熟果实O，红熟果实RR)中的表达模式分析；

图2为实施例2中SlHMGA3基因敲除的靶点1(Taget1)和靶点2(Taget2)；

图3为实施例3番茄纯合突变株系slhmga3突变靶点的测序结果；

图4为实施例4中野生型与slhmga3突变体(slhmga3-1和slhmga3-2)的番茄的果实延迟成熟表型；

图5为实施例4中野生型和slhmga3-1、slhmga3-2的果实成熟时间统计；

图6为实施例4中野生型和slhmga3-1、slhmga3-2的果实成熟过程中颜色记录；图6中，Hue表示颜色的相位角，180°表示纯绿色，90°表示橙色，45°表示橘红色，0°表示纯红色；

图7为实施例5中果实成熟过程野生型与slhmga3-1、slhmga3-2突变体在果实成熟过程中叶绿素含量的变化；

图8为实施例5中果实成熟过程野生型与slhmga3-1、slhmga3-2突变体在果实成熟过程中类胡萝卜素含量的变化；

图9为实施例6中果实成熟过程野生型与slhmga3-1、slhmga3-2突变体在果实成熟过程中乙烯含量的变化；

图10为实施例7中果实成熟过程野生型与slhmga3-1、slhmga3-2突变体的乙烯合成基因表达模式分析；

图11为实施例7中果实成熟过程野生型与slhmga3-1、slhmga3-2突变体的乙烯信号响应基因表达模式分析；

图12为实施例7中果实成熟过程野生型与slhmga3-1、slhmga3-2突变体的调控成熟相关转录基因表达模式分析；

图13为合成的sgRNA包括两个20bp的寡核苷酸靶位点(深色加粗)和保守结构序列(下划直线)，以及相应的启动子序列，AtU3d在第一个靶位点之前，At3Ub在第二个靶位点(未划线浅色)；

图14为2300GN-Ubi-Cas9载体的图谱。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、组织培养、分子生物学、生物生理生化、DNA重组及生物信息学技术。这些技术在现有文献中进行了充分解释。

实施例1：野生型番茄SlHMGA3基因表达模式

取5个相同组织或发育阶段番茄(品种Micro-Tom)组织作为生物学重复，提取野生型番茄根、茎、叶、花及不同发育阶段的果实的植物组织RNA。不同发育阶段的果实是指：开花后5天的果实IMG(immature green)，开花后15天的果实IMG(immature green)，开花后30天的果实MG(mature green)，破色BR(breaker)，黄熟O(orange)，红熟RR(red ripen)。并将上述植物组织RNA反转录成cDNA作为模板，利用qRT-PCR检测番茄果实中SlHMGA3基因表达量，以Actin为内参基因，采用2^-ΔCT方法，引物信息见下表1。

表1本试验所用的引物信息

基因名称	基因编号	上游引物(5'-3')	下游引物(5'-3')
				ACTIN	Solyc11g005330	TGTCCCTATCTACGAGGGTTAT	AGTTAAATCACGACCAGCAAGA
SlHMGA3	Solyc04g007890	GCAAGCTGGGCAATTAGTTATG	ACTGAACTTTTCGGCTTCGG
				SlACS2	Solyc01g095080	TGTTAGCGTATGTATTGACAAC	TCATAACATAACTTCACTTTTGC
SlACO1	Solyc07g049530	GCCAAAGAGCCAAGATTTGA	TTTTTAATTGAATTGGGATCTAA
				SlACS4	Solyc05g050010	CTCCTCAAATGGGGAGTACG	TTTTGTTTGCTCGCACTACG
SlE4	Solyc03g111720	GACCACTCTAAATCGCCAGG	TTCCTGAGCGGTATTGCTTT
				SlE8	Solyc09g089580	TGGCTCCGAATCCTCCCAGTCT	GTCCGCCTCTGCCACTGAGC
SlETR3	Solyc09g075440	TGCTGTTCGTGTACCGCTTT	TCATCGGGAGAACCAGAACC
				SlTAGL1	Solyc07g055920	ACTTTCTGTTCTTTGTGATGCT	TTGGATGCTTCTTGCTGGTAG
SlETR4	Solyc06g053710	TGGAGGAGTGAGTGTGGATGC	ATGGCTGTCGTTCTTGGGC
				SlEIN2	Solyc09g007870	GTGTGCTGAATAAGTTTAGTGG	TGCTGTACAATAGAAGAATGGA
SlEIL3	Solyc01g096810	ACAGGACTTCAAGAAACAACC	GTGTTGTGCTCATAGTTGATCTG

结果如图1所示，采用Qrt-PCR分析，根据图1发现SlHMGA3在番茄各组织中均有表达，其中，花和果实表达量较高，且随着果实成熟，表达量增加，在番茄果实到达红熟阶段时表达量最高。

实施例2：SlHMGA3基因敲除载体和相应的宿主细胞工程菌的构建

S11、利用CRISPR-P网站，在SlHMGA3基因外显子上设计2个靶序列，2个所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3(GGTACACTACCACCAGCGCA)和SEQ ID No.4(GATGGGTATCCTAGACCACG)所示，见附图2；然后将AtU3d启动子和AtU3b启动子连同包含2个所述靶序列的sgRNA序列AtU3d-sgRNA1-AtU3b-sgRNA2(如SEQ ID No.5所示)进行基因合成后，***到载体2300GN-Ubi-Cas9的SbfI和SmaI酶切位点之间，得到SlHMGA3基因突变载体；上述方法具体操作是在南京金斯瑞公司合成sgRNA及其相应的启动子片段，并将其克隆到2300GN-Ubi-Cas9双元载体的Sbf I和Sma I双酶切位点之间，得到的SlHMGA3基因突变载体送到擎科公司测序确认；

S12、将经过测序确认正确的步骤S11的SlHMGA3基因突变载体转染到宿主细胞根癌农杆菌为EHA105中，得到宿主细胞工程菌。

实施例3：番茄SlHMGA3突变材料的构建与检测

利用实施例2制备的宿主细胞工程菌侵染番茄品种Micro-Tom的子叶外植体，通过诱导愈伤，抗性诱导分化以及生根培养，获得组培苗，利用PCR和测序技术验证，筛选出阳性SlHMGA3基因突变番茄植株。

经过测序发现，上述突变番茄植株中slhmga3-1在靶点1处缺失6个碱基、靶点2处缺失4个碱基，slhmga3-2在靶点1处***1个碱基、靶点2处缺失2个碱基(如图3所示)。

实施例4：SlHMGA3基因突变材料的延迟成熟性状观察

在实施例3制备的番茄SlHMGA3突变材料(即果实延迟成熟的番茄植株)开花期间进行标花，注明开花时间，在果实即将进入成熟时期给果实拍照，记录成熟过程(如图4所示)，统计野生型及突变材料到达果实破色时间(如图5所示)，并用日本柯尼卡美能达色差仪CR-400测量果实颜色变化(如图6所示)。

突变番茄的果实成熟相比野生型显著延迟，slhmga3-1延迟了3天，slhmga3-2延迟了6天。

实施例5：番茄果实叶绿素总含量和类胡萝卜素总含量测定

番茄果实颜色主要与果皮与果肉中叶绿素、类胡萝卜素及类黄酮等色素物质的积累及相对比例有关,叶绿素含量的下降和类胡萝卜素含量的升高导致番茄由绿变红。

取5个同一阶段番茄果皮作为生物学重复，称取0.75g样品，加少量石英砂和碳酸钙粉及95％乙醇2mL，研成均浆，再加乙醇10mL，继续研磨至组织变白，静置5min。过滤到25mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至25mL，摇匀，把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。

类胡萝卜素在470nm测定吸光度。将测定得到的吸光值代入下面的公式：

Ca＝13.95A₆₆₅-6.88A₆₄₉；

Cb＝24.96A₆₄₉-7.32A₆₆₅；

C(X.C)＝(1000A₄₇₀-2.05Ca-114.8Cb)/245。

据此即可得到叶绿素a和叶绿素b和类胡萝卜素的浓度(mg/L)，叶绿素a与叶绿素b二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素或类胡萝卜素的含量：

叶绿素的含量(mg/L)＝(叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数)/样品鲜重(或干重)。

结果表明敲除SlHMGA3后，果实中叶绿素降解(如图7所示)以及类胡萝卜素积累(如图8所示)过程被延迟，进一步证明果实成熟过程被延迟。

实施例6：番茄果实乙烯释放的测定

采用Thermo Trace Ultra GC气相色谱仪乙烯释放量测定，新鲜果实摘取后室温静置2小时，避免摘取造成胁迫应激性的乙烯释放，同阶段的5个的果实为一组生物学重复，分别称重后放入50mL离心管中，封口膜密封，静置8小时后进行测定。色谱条件：进样温度130℃，柱温80℃，FID温度230℃，N₂ 0.2Mpa，空气0.2Mpa，H₂ 0.2Mpa，进样量10μl。待基线稳定后注入10μL乙烯标准品，制作标准曲线，标准曲线制作完成后用1ml的注射器抽取密闭离心管瓶里的气体注入机器进行测定，每个样品3次技术重复。

结果(如图9所示)与实施例5相似，相比于野生型，slhmga3-1和slhmga3-2突变体乙烯释放高峰时间延后，且最高峰峰值低于野生型。这一结果证明SlHMGA3基因可以通过乙烯来调控果实成熟。

实施例7：乙烯合成基因、乙烯信号响应基因和成熟相关转录因子表达模式分析

提取野生型和slhmga3-1、slhmga3-2突变体番茄果实成熟过程不同时间点(32dap、36dap、38dap、42dap、46dap、50dap)的果实RNA，并将其反转录成cDNA作为模板，并利用qRT-PCR检测番茄果实中乙烯合成基因、信号响应基因以及成熟相关转录因子表达量的变化(如图10-12所示)，以Actin为内参基因，采用2^-ΔCT方法，引物信息见上表1。slhmga3-1和slhmga3-2突变体中乙烯合成基因ACS2、ACS4、ACO1的表达延后且最高表达量低于WT最高表达量(如图10所示)；slhmga3-1和slhmga3-2突变体中乙烯信号响应基因ETR3、ETR4、CTR1、EIL3和EIN2的表达延后,与乙烯合成基因表达趋势一致(如图11所示)；从野生型果实36dpa开始，成熟相关转录因子E4和E8的表达急剧增加，而在slhmga3突变体中，这种增加被延迟至38dpa，突变体果实中成熟相关转录因子的诱导延迟大约3至6天，并且在WT和突变体中的最大差异出现在38dpa(如图12所示)。这些结果表明SlHMGA3通过调控乙烯合成及信号相关基因来调控乙烯的传导和一些成熟相关关键转录因子，从而调控果实成熟。

另外，作为本领域的公知常识，在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具备上述作用的情况下，通过常规的手段对其进行一定的改变不会影响其功能作用，例如经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有不改变原核苷酸序列功能的，具有相同功能的核苷酸序列；或具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 番茄SlHMGA3基因在培育果实延迟成熟的番茄中的应用

<141> 2021-05-28

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 974

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 1

tatatctgaa acgaattacc aactgtacga tcattctccc attgttgatt tcatccattt 60

aaatcctctt cttcctctgc catttttttc acagattttt gtttttctct gtaacaaaaa 120

tggctactga agaacataat ctaactttgc ctagttatcc tgatgttagt cacaattttt 180

tcaatttttt tttgctagtt ttggtaattt ttttttgtta acaattttgg taatttttgt 240

ttgtagatga ttatggaagc tatagatgcg ttgaatgaag aagaagggtc gaataaatca 300

gctatatgga agcaaattga agcgactcat ggtacactac caccagcgca tggtacactc 360

cttgcacatc atttgaatca aatgaagcaa gctgggcaat tagttatgtt gaagaacaac 420

tacatgaagc caaatccaaa cgcgccgccg cgccgtggta gaggccgtcc gccgaagccg 480

aaaagttcag ttccggtacc ggatgggtat cctagaccac gtggaaggcc accgaaggag 540

cgggatccgt acgcgccgat aacggtacct atgaagaaga cgagtgaggg tagctctggg 600

ggaagtggga agaagcgtgg aaggccaagg aagtatccga tgacggagga tacgccggtg 660

gtgaagccaa ttggtgctcc gagaggaaga ggaaggccgc cgaaggtgaa aactccggta 720

gctgcaactg taggggctta attgaagaaa gacgaattaa attagggact tgtatggcaa 780

aatatgctaa cttgttgttt ttcacttttt atctgttttg aattttcatg tttagtccct 840

gtagttttgt tttaattaca atttgtagga agaattgtgt gactttgtga gtgattttta 900

tcatgtaatt gggccaatgt aaatccaaat tgagggcttt ttatttatat ataaaaaaaa 960

aggttcagta ttat 974

<210> 2

<211> 179

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 2

Met Ala Thr Glu Glu His Asn Leu Thr Leu Pro Ser Tyr Pro Asp Met

1 5 10 15

Ile Met Glu Ala Ile Asp Ala Leu Asn Glu Glu Glu Gly Ser Asn Lys

20 25 30

Ser Ala Ile Trp Lys Gln Ile Glu Ala Thr His Gly Thr Leu Pro Pro

35 40 45

Ala His Gly Thr Leu Leu Ala His His Leu Asn Gln Met Lys Gln Ala

50 55 60

Gly Gln Leu Val Met Leu Lys Asn Asn Tyr Met Lys Pro Asn Pro Asn

65 70 75 80

Ala Pro Pro Arg Arg Gly Arg Gly Arg Pro Pro Lys Pro Lys Ser Ser

85 90 95

Val Pro Val Pro Asp Gly Tyr Pro Arg Pro Arg Gly Arg Pro Pro Lys

100 105 110

Glu Arg Asp Pro Tyr Ala Pro Ile Thr Val Pro Met Lys Lys Thr Ser

115 120 125

Glu Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Lys Lys Arg Gly Arg Pro Arg Lys

130 135 140

Tyr Pro Met Thr Glu Asp Thr Pro Val Val Lys Pro Ile Gly Ala Pro

145 150 155 160

Arg Gly Arg Gly Arg Pro Pro Lys Val Lys Thr Pro Val Ala Ala Thr

165 170 175

Val Gly Ala

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 3

ggtacactac caccagcgca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 4

gatgggtatc ctagaccacg 20

<210> 5

<211> 633

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ataagcttat gatttctttt ttcttacgaa ttttgcgtcc cacatcggta agcgagtgaa 60

gaaataactg ctttatatat ggctacaaag caccattggt caggtacact accaccagcg 120

cagttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa 180

gtggcaccga gtcggtgctt ttttttttac tttaaatttt ttcttatgca gcctgtgatg 240

gataactgaa tcaaacaaat ggcgtctggg tttaagaaga tctgttttgg ctatgttgga 300

cgaaacaagt gaacttttag gatcaacttc agtttatata tggagcttat atcgagcaat 360

aagataagtg ggctttttat gtaatttaat gggctatcgt ccatagattc actaataccc 420

atgcccagta cccatgtatg cgtttcatat aagctcctaa tttctcccac atcgctcaaa 480

tctaaacaaa tcttgttgta tatataacac tgagggagca acattggtca cgtggtctag 540

gatacccatc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 600

ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 633

Claims

1.敲除番茄SlHMGA3基因在培育果实延迟成熟的番茄中的应用，其特征在于，所述番茄SlHMGA3基因包含以下任意一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

2.一种果实延迟成熟的番茄的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、构建含有番茄SlHMGA3基因敲除载体的宿主细胞工程菌；

所述番茄SlHMGA3基因包含以下任意一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

3.根据权利要求2所述的果实延迟成熟的番茄的培育方法，其特征在于，步骤S1所述的番茄SlHMGA3基因敲除载体是2300GN-Ubi-Cas9-AtU3d-sgRNA1-AtU3b-sgRNA2。

4.根据权利要求2或3所述的果实延迟成熟的番茄的培育方法，其特征在于，步骤S1具体包括如下步骤：

S11、在SlHMGA3基因外显子上设计2个靶序列，2个靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；然后将AtU3d启动子和AtU3b启动子连同包含2个所述靶序列的sgRNA序列AtU3d-sgRNA1-AtU3b-sgRNA2进行基因合成后，***到载体2300GN-Ubi-Cas9的SbfI和SmaI酶切位点之间，得到SlHMGA3基因突变载体；

5.根据权利要求4所述的果实延迟成熟的番茄的培育方法，其特征在于，步骤S11中，序列AtU3d-sgRNA1-AtU3b-sgRNA2如SEQ ID No.5所示。

6.根据权利要求2所述的果实延迟成熟的番茄的培育方法，其特征在于，步骤S1中所用的宿主细胞为大肠杆菌菌株或根癌农杆菌菌株。

7.权利要求2-6任一项所述的培育方法在培育果实延迟成熟的番茄中的应用。