CN113679849A - 一种高靶向低毒性肿瘤微环境智能响应型纳米载体及其制备方法 - Google Patents

一种高靶向低毒性肿瘤微环境智能响应型纳米载体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高靶向低毒性肿瘤微环境智能响应型纳米载体及其制备方法，是由粒径为30‑200nm的胶束组成，所述的胶束是由多嵌段聚合物在水中自组装而成。多嵌段聚合物含有疏水端DSPE以及亲水端PEG，在亲水端PEG上偶联酸响应嵌段PAE以及肿瘤血管靶向肽。在中性PH的血液环境中PAE是疏水的，可以将c(RGDyc)包藏在胶束中，避免c(RGDyc)与血液中的调理素相作用，减少网状内皮***的清除。同时所述胶束的亲水端PEG以及疏水端DSPE通过二硫键相连接，在肿瘤细胞中受到谷胱甘肽还原性的影响，二硫键断裂将药物释放，杀伤肿瘤细胞。增强了肿瘤细胞对载体的内吞，防止胶束从肿瘤组织中外逃。由于二硫键在肿瘤组织内还原响应，特异性释放化疗药物减少化疗药物的毒副作用。

Description

一种高靶向低毒性肿瘤微环境智能响应型纳米载体及其制备 方法
技术领域
本发明属于生物医药和纳米医学技术领域，特别的是一种高靶向低毒性的智能响应型纳米载体。
背景技术
癌症是一种影响人类健康的恶性疾病，近三十年来，世界癌症发病率以每年3％-5％的速度增加，严重危害人们的身心健康。目前，手术、放疗和化疗是临床癌症治疗的主要方法。传统的抗肿瘤药物选择性差，杀死肿瘤细胞的同是也杀伤正常细胞，并且普遍存在溶解性低、半衰期短等问题。
纳米药物载体在输送药物的过程中面临诸多的障碍，会在体内经历一个复杂的过程： 1)在血液中循环并且停留较长的时间2)当药物到达肿瘤组织后，会在肿瘤组织中蓄积(EPR 效应)3)纳米药物在肿瘤组织中渗透到达肿瘤细胞4)快速地进入肿瘤细胞中5)在肿瘤细胞内快速将药物释放。例如，一些药物载体表面修饰亲水性较好的聚合物以避免网状内皮***的快速清除，获得较好的长循环性能并提高肿瘤部位的富集量。但是研究表明，这些载体不易被肿瘤细胞内吞，降低肿瘤治疗效果。于此同时，一些具有良好应用前景的靶向药物载体具有良好的肿瘤细胞内吞能力。陈等人[陈王彦.RGD肽介导PEG-DSPE胶束及其肿瘤靶向作用的研究.上海中医药大学,2013.]设计了靶向肽连接DSPE-PEG嵌段，靶向***。但c(RGDyc)直接暴露在纳米粒子的表面，易于与血液中的调理素相互作用，使得纳米粒子在调理素作用下，促使其被网状内皮***快速清除，并可能会引起免疫反应，大大降低了纳米药物的抗肿瘤疗效。
目前解决长循环和细胞内吞的研究主要集中于亲疏水转变以及靶向基团的隐藏。这种纳米载体进入血液循环后，利用载体表面的亲水材料增加载体在血液循环中的循环时间，减少网状内皮***对载体的清除作用，提高生物利用度。同时利用肿瘤微环境不同于正常组织将靶向基团暴露，增强肿瘤细胞对载体的内吞作用。高等人(高红军.功能协同的复合胶束作为抗肿瘤纳米药物载体的研究[D].南开大学,2014.)利用PEG-PCL与RGD-PAE-PCL两种嵌段聚合物组合成为混合胶束。在血液环境中，亲水的PEG发生长循环的作用，当到达肿瘤组织后PAE发生亲疏水转换暴露出靶向基团，发挥嵌段聚合物的靶向作用。但同时混合胶束的制备工艺复杂，需要进行大量试验摸索嵌段聚合物的比例。
发明内容
本发明在高等人的思路上，基于现有的背景，为简化混合胶束的制备工艺，创造性地利用丙烯酰氯修饰PEG，合成了一种未经报导的聚合物长链，将带有RGD的酸响应嵌段PAE与PEG连接。同时利用磷脂作为嵌段聚合物的疏水端，具有良好的生物相容性。长链聚合物利用亲疏水转换材料PAE、靶向基团c(RGDyc)，通过二硫键连接合成了聚合物用以形成胶束。可以同时实现良好的生物相容性和靶向肿瘤，到达肿瘤细胞内特异性释放化疗药物，表现出对肿瘤细胞较高的靶向性以及杀伤作用。
为了实现该方案，本发明的技术方案为：一种具有包藏靶向配体，对肿瘤组织具有高靶向的还原响应型载体，其结构式为：
Figure BDA0003231620650000021
其中n≥2，x≥2；
式Ⅰ所述的化合物为cRGD-PAE-PEG-SS-DSPE，中文名为cRGD-聚β氨基酯-聚乙二醇-SS-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，所述的嵌段聚合物为一整条长链,其中n≥2，x≥2进一步优选为n在30-100、x在8-15范围内，作为一整条聚合物可以快速酸响应。
一种高靶向低毒性肿瘤微环境智能响应型纳米载体，由粒径为30-200nm的均匀分布的胶束组成，所述的胶束由多嵌段聚合物在水中自组装形成。这种多嵌段聚合物为cRGD-聚β氨基酯-聚乙二醇-SS-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(cRGD-PAE-PEG-SS-DSPE),其亲水端为带有靶向基团连接PH响应嵌段(PAE)的PEG,式中c(RGDyc)为肿瘤新生血管靶向肽(其氨基酸序列为Ary-Gly-Asp-D-Tyr-Cys)，疏水端为DSPE。在PH为7.4的介质中是核壳结构，核为疏水端DSPE,壳是带有靶向基团cRGD的亲水性嵌段。
将所制备的嵌段聚合物DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD与药物共同溶解在甲醇中，超声涡旋促进溶解，然后在室温的条件下旋蒸，除去有机溶剂，形成均匀的薄膜。用中性水溶解水化并超声，最后过0.45μm有机滤膜得到胶束。
本发明设计创造性地利用PAE(聚β氨基酯)在血液循环中包藏c(RGDyc)，减少了血液循环对载体的清除作用，同时在PH7.4的血液环境中，亲水PAE可以延长纳米药物的血液循环时间，当到达肿瘤组织时PAE发生亲疏水转换，暴露c(RGDyc)又可以发挥靶向肿瘤细胞的作用，可谓是一举两得。当进入肿瘤细胞内，载体又可以在高浓度的谷胱甘肽还原条件下断裂二硫键，特异性释放药物杀伤肿瘤细胞，加强化疗药物的治疗效果。
本发明纳米载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD在不同PH环境下的粒径如图6所示，当pH高于7.5时，粒径变化不明显；在7.5-6.5之间，粒径出现了明显的增加，这是由于PAE 中的叔胺基团发生了质子化，使其亲疏水性发生变化，从而使得载体结构发生膨胀，导致粒径的增大，说明本材料具有pH响应的性能。
在中性PH的血液环境中PAE是疏水的，可以将c(RGDyc)包藏在胶束中，避免 c(RGDyc)与血液中的调理素相作用，减少网状内皮***的清除。同时所述胶束的亲水端PEG以及疏水端DSPE通过二硫键相连接，在肿瘤细胞中受到谷胱甘肽还原性的影响，二硫键断裂将药物释放，杀伤肿瘤细胞。本发明中嵌段长链聚合物将c(RGDyc) 包藏在胶束的疏水内核PAE中，到达肿瘤酸环境中暴露c(RGDyc)、体积变大，增强了肿瘤细胞对载体的内吞，防止胶束从肿瘤组织中外逃。同时长链聚合物制备胶束，工艺也比较简单。由于二硫键在肿瘤组织内还原响应，特异性释放化疗药物减少化疗药物的毒副作用。
本发明载体可以将化疗药物如DOX等药物包裹于纳米载体中，尤其适用于水溶性较差、毒副作用大的的药物，载体将化疗药物包载于聚合物的疏水内核中，增加的药物的水溶性与生物利用度。当药物在血液循环时，不容易泄露减少了化疗药物对正常组织的毒副作用。
所述的高靶向低毒性肿瘤微环境智能响应型纳米载体的制备方法，包括如下步骤：
1)HO-PEG-SS-NH2的合成
取1-50份HO-PEG-COOH、1-80份NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、1-60份DCC(二环己基碳二酰亚胺)、1-30份DMAP(4-二甲氨基吡啶)溶解在含有DMF(N,N-二甲基甲酰胺) 的三口瓶中，在N2保护的条件下冰水浴反应3-8h，用以活化羧基。称取1-800份的胱胺盐酸盐与1-1500份的三乙胺溶于DMF中，用以除盐。将溶有胱胺的DMF缓慢地滴入三口瓶中，在N2保护条件下室温反应18-36h。反应结束后经冰***沉淀，真空干燥获得式Ⅱ所述结构聚合物，式Ⅱ所述结构聚合物缩写为HO-PEG-SS-NH2。
Figure BDA0003231620650000031
其中n≥2；
2)DSPE-SS-PEG-OH的合成
取上述所合成的1-40份OH-PEG-SS、1-45份DCC(N,N-二环己基碳二亚胺)、1-40份DSPE-COOOH(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺改性羧基)1-35份NHS溶于氯仿中，在室温条件下反应2-6h，反应结束后用水洗涤反应液，经无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，粗品经阴离子交换柱经氨水洗脱得到式Ⅲ所述结构聚合物，式Ⅲ所述结构聚合物缩写为DSPE-SS--PEG-OH。
Figure BDA0003231620650000032
其中n≥2；
3)DSPE-SS-PEG-AC的合成
取上述反应得到的1-30份DSPE-SS-PEG-OH、1-60份三乙胺、1-50份丙烯酰氯冰浴条件下溶于二氯甲烷中，室温条件反应2-6小时后，反应结束后过滤除去白色沉淀，滤液以1mol/L稀盐酸萃取三次，有机相加入无水硫酸钠和碳酸钠经过滤后得到式Ⅳ所述结构聚合物，式Ⅳ所述结构聚合物缩写为DSPE-SS-PEG-AC。
Figure BDA0003231620650000033
其中n≥2；
4)DSPE-PEG-SS-PAE-NHS的合成
取上述所合成的1-20份DSPE-SS-PEG-AC、1-600份1,6-己二醇二丙烯酸酯(HDD)、1-480份1,3-二(4-哌啶基)丙烷(TDP)溶于二氯甲烷中，在N2保护的条件下30-60℃反应2-4天，再加入1-45份N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺反应18-36h，经***沉淀后即得式Ⅴ所述结构聚合物，式Ⅴ所述结构聚合物缩写为DSPE-SS-PEG-PAE-NHS。
Figure BDA0003231620650000041
其中n≥2，x≥2；
5)DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD的合成
将上述反应所得到的1-15份DSPE-SS-PEG-PAE-NHS、1-40份cRGD、1-50份三乙胺溶解在氯仿和DMSO的混合溶液中，20-50℃条件下反应8-10h，结束后旋蒸除去氯仿，在超纯水中透析，每天换水3-5次，透析三天后，冷冻干燥即可得式Ⅰ所述结构聚合物，式Ⅰ所述结构聚合物缩写为DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD。
作为上述技术方案的进一步改进，所述的合成步骤优选条件如下：
所述步骤1)中所述的HO-PEG-COOH：NHS：DCC：DMAP：胱氨酸：三乙胺的投料比是10：12：12：3：120：240。活化羧基时间为5h，活化温度为0℃，反应时间为24h。所述HO-PEG-COOH与所述DMF的料液比为0.025mmol/ml。
所述步骤2)中HO-PEG-SS：DSPE-COOH：DCC：NHS的投料比为1：1：1：1，室温条件下反应3h，所述HO-PEG-SS与所述氯仿的料液比为0.024mmol/ml，氨水的体积分数为0.1％。
所述步骤3)中DSPE-SS-PEG-OH：三乙胺：丙烯酰氯的投料比为10：15：15，室温条件下反应3h，所述HOOC-PEG-SS与所述二氯甲烷的料液比为0.179mmol/ml。
所述步骤4)中DSPE-SS-PEG-AC：1,6-己二醇二丙烯酸酯(HDD)：1，3-二(4-哌啶基)丙烷(TDP)：N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的投料比为1：11：11：1.5，反应时间为72h，反应温度为40℃,加入N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺后继续反应24h，所述DSPE-PEG-SS与所述二氯甲烷的料液比为0.0125mmol/ml。
所述步骤5)中DSPE-PEG-SS-PAE-NHS：三乙胺：c(RGDyc)的投料比为10：25： 15，反应时间为9h，反应温度为45℃，每天换水4次，DSPE-PEG-SS-PAE-NHS与氯仿和 DMSO的混合溶液的料液比为1.25μmol/ml。
DSPE-PEG-SS-PAE-RGD合成的方程式为：
Figure BDA0003231620650000051
本发明的工作机理：
嵌段聚合物载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD包载药物，进入血液循环中，在PH7.4的条件下PAE显现疏水性，将cRGD包藏在聚合物的疏性嵌段中，在胶束的疏水性内核中。当载药纳米载体进入肿瘤组织中，PAE中的叔氨在酸性的条件下发生质子化，进行亲疏水转换，将cRGD暴露，增强肿瘤细胞对纳米载体的内吞作用。载药纳米载体进入肿瘤细胞内后，由于肿瘤细胞内较高的谷胱甘肽水平，促进嵌段聚合物中的二硫键断裂，释放药物。这样极大地降低了化疗药物对正常组织的毒性，增强了化疗药物的治疗效果。
有益效果：
该抗肿瘤靶向纳米药物载体，靶向基团针对肿瘤细胞具有特异性靶向作用；载药***具有响应性释放能力，在还原条件下释放相对较快，而在正常组织中几乎不释放。对肿瘤细胞具有较好的靶向作用以及杀伤作用。
通过本专利采用较少的合成步骤，与较为温和的反应条件制备了一整条聚合物长链，合成的聚合物长链可以极为轻松地制备胶束，制备工艺简单。同时制备的聚合物胶束具有较高的酸响应性能，在PH＜7.5时孵育30min即发生粒径变化释放药物，相较于其他包藏靶向肽技术路线可以快速响应。
附图说明
图1为本发明纳米载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD的红外图谱。
图2为本发明纳米载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD的1HNMR。
图3为本发明纳米载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD的滴定曲线。
图4为本发明纳米载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD所形成的胶束的粒径图。
图5为本发明纳米载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD所形成的胶束在DTT还原条件下的粒径图。
图6为本发明纳米载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD胶束在不同PH环境下的粒径图。
图7为本发明纳米载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD胶束对4T1细胞的细胞毒性实验。
图8为本发明纳米载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD胶束对正常细胞L929细胞毒性实验。
图9为4T1细胞对本发明纳米载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD胶束的摄取电镜图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。
实施例1
本实施例提供一种纳米载体的合成方法，依次包括以下步骤：
1)取1份HO-PEG-COOH、1.2份NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、1.2份DCC(二环己基碳二酰亚胺)、0.3份DMAP(4-二甲氨基吡啶)溶解在含有DMF的三口瓶中，冰水浴在 N2保护的条件下反应5h，用以活化羧基。称取6份的胱胺盐酸盐与12份的三乙胺溶于DMF 中，用以除盐。将溶有胱胺的DMF缓慢地滴入三口瓶中，在N2保护条件下室温反应24h。反应结束后经冰***沉淀，真空干燥获得聚合物HO-PEG-SS-NH2。所述HO-PEG-COOH与所述DMF的料液比为0.025mmol/ml。
2)取上述所合成的1份OH-PEG-SS-NH2、1份DCC(N,N-二环己基碳二亚胺)、1份DSPE-COOOH(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺改性羧基)1份NHS溶于氯仿中，在室温条件下反应3h，反应结束后用水洗涤反应液，经无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，粗品经阴离子交换柱经氨水洗脱得到聚合物DSPE-SS--PEG-OH。所述OH-PEG-SS-NH2与所述氯仿的料液比为0.024mmol/ml，氨水的体积分数为0.1％。
3)取上述所合成的1份DSPE-SS-PEG-OH、1.5份三乙胺、1.5份丙烯酰氯冰浴条件下溶于二氯甲烷中，室温条件反应3小时后，反应结束后过滤除去白色沉淀，滤液以1mol/L 稀盐酸萃取三次，有机相加入无水硫酸钠和碳酸钠经过滤后得到聚合物DSPE-SS-PEG-AC。所述DSPE-SS-PEG-OH与所述二氯甲烷的料液比为0.179mmol/ml。
4)取上述所合成的1份DSPE-SS-PEG-AC、11份1,6-己二醇二丙烯酸酯(HDD)、11 份1,3-二(4-哌啶基)丙烷(TDP)、溶于二氯甲烷中，在N2保护的条件下40℃反应3天，再加入1.5份N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NHS)继续反应1天，经***沉淀后即得聚合物D SPE-SS-PEG-PAE-NHS，所述DSPE-SS-PEG-AC与所述二氯甲烷的料液比为0.0125mmol/m l。
5)将上述反应所得到的1份DSPE-SS-PEG-PAE-NHS、1.5份cRGD、2..5份三乙胺(TEA)溶解在氯仿和DMSO的混合溶液中，45℃条件下反应9h，结束后旋蒸除去氯仿，在超纯水中用分子量为8000的透析袋透析，每天换水4次，透析三天后，冷冻干燥即可得聚合物DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD，DSPE-SS-PEG-PAE-NHS与氯仿和DMSO的混合溶液的料液比为1.25μmol/ml。制备得到的高靶向低毒性肿瘤微环境智能响应型纳米载体结构式如下所示：
Figure BDA0003231620650000071
本实施例中n＝50，x＝10。n的大小会严重影响聚合物的溶解度n与x的比例会影响聚合物胶束的载药能力，本发明实例中亲水端与疏水端比例为1:2。
载体DSPE-SS-PEG-PAE-cGRD的红外图谱如图1所示。
图1为本发明纳米载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD的红外图谱，进行红外出峰的标注。其中PEG的C-H伸缩振动在2919、2851cm-1，C-O伸缩振动在1112cm-1,PBAE的C-N伸缩振动在1184cm-1,酰胺的羰基以及C-N振动分别在1727、1560cm-1。
载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD的1HNMR分析图如图2所示。
图2为本发明纳米载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD1HNMR,图中DSPE甲基、亚甲基化学位移在δ＝0.85、1.23ppm，二硫键化学位移在δ＝2.88ppm，PEG甲基亚甲基化学位移在δ＝3.51、 3.36ppm，PAE与表征羰基临近的两个亚甲基化学位移分别在δ＝4.02、1.61ppm以及与叔氨临近的两个亚甲基的化学位移分别在δ＝2.88、1.90ppm。
实施例2载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD的酸碱滴定实验
将5mg共聚物溶于10ml去离子水中，用0.1mol·L-1HCL调节到pH3.0。采用0.1mol·L-1的NaOH溶液进行滴定，每次加5μL，使用PH计测定溶液的pH变化，记录每次的pH值变化，绘制滴定曲线。空白对照组NaCL，操作方法同上。图3为发明纳米载体 DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD的滴定曲线，由图可知在相较于NaCl纳米载体在pH6.8-9.7范围内曲线斜率明显减小，在此范围内载体具有明显的缓冲作用。
实施例3载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD制备胶束
精密称取载体5mg，药物DOX1mg于20ml茄形瓶中，加入5ml甲醇超声5min溶解, 随后常温下旋蒸除去有机溶剂，再放入真空干燥箱内。随后加入10ml纯化水，100rpm条件下水化30min，过0.45μm有机滤膜得到载药胶束。图4为纳米载体通过薄膜水化法制得的胶束，由马尔文粒度仪测定可知嵌段聚合物在水中形成了平均粒径为113.2nm的胶束，PDI 为0.228，粒径合理并且分布均匀。
实施例4载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD胶束的还原响应
用含有10mMDTT的PH6.8醋酸缓冲液配置0.5mg/ml的胶束溶液，在24h后用DLS测粒径分布。
图5为本发明纳米载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD所形成的胶束在DTT还原条件下的粒径图。相较于图4可以发现在还原条件下形成了新的小粒径胶束，证明了二硫键的存在。
实施例5载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD在不同PH下的粒径变化
将刚制备好的空白胶束于不同pH值的PBS缓冲液中孵育30min后，测量其粒径的变化。图6为本发明纳米载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD在不同PH环境下的粒径变化。结果表明，当pH高于7.5时，粒径变化不明显；在7.5-6.5之间，粒径出现了明显的增加，这是由于PAE中的叔胺基团发生了质子化，使其亲疏水性发生变化，从而使得载体结构发生膨胀，导致粒径的增大。说明本材料具有pH响应的性能
实施例6载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD的细胞毒性实验
实验分组分别为：A：阿霉素溶液组(DOX)；B：包载阿霉素的聚合物胶束组(PEG-SS-DSPE/DOX)；C：RGD肽介导的包载阿霉素的聚合物胶束(RGD-PAE-PEG-SS-DSPE/D OX)。
将处于对数生长期的4T1细胞以及L929细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后，用RPMI16 40培养基制备成单细胞悬液，然后接种到96孔板中，每孔细胞数约为1×104，设置三个复孔。孵育24小时待细胞贴壁后，将培养液换成不同浓度的上述物理混合溶液或胶束溶液并继续孵育4h。孵育4h后将溶液换为MTT溶液(0.5mg/ml，200ul/孔)并继续孵育4h；待细胞和MTT溶液共孵育4h后，除去孔中的溶液，然后往每孔中加入150μlDMSO，振荡5mi n溶解甲瓒晶体。用酶标仪测定每个孔在630nm出的吸光度并按照下式计算细胞存活率：
Figure BDA0003231620650000081
其中，Asample为各实验组的吸光度值，Acontrol为PBS空白对照组的吸光度值。
图7的结果表明本发明纳米载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD包载DOX相较于游离DOX和非靶向载体组对4T-1细胞的杀伤效果更强，5μg剂量组的靶向载体组的细胞存活率只有30％，相对于非靶向载体组大大降低，载体增强了药物的化疗效果。
图8的结果表明相较于游离阿霉素组与非靶向载体组载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD包载DOX对于正常的细胞毒性较小没有杀伤效果，表明载体不易泄露，同时载体本身安全无毒，生物相容性好。
实施例7载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD细胞摄取实验
选用乳腺癌4T1细胞作为细胞摄取实验的模型细胞。取对数生长期的4T1细胞，用0.25％的胰酶消化，离心弃去上清液之后加入RPMI1640培养液制备成细胞悬液，以每孔200μL(约 1×104)细胞悬液加入96孔板中，于37℃培养箱中孵育24h后，弃去原有的培养基，分别加入游离阿霉素和载药胶束(阿霉素等效浓度为5μg/mL L)继续孵育24h。弃去上清液，用4℃PBS清洗细胞三遍除去残留的药物，再用4％多聚甲醛固定细胞，用hoechst染料染色15min。利用CLSM观察细胞的摄取情况并拍照。
图9为本发明纳米载体DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD对细胞的靶向作用电镜图，在电镜图中靶向载体组相较于游离阿霉素与非靶向载体组众多细胞含有阿霉素的红色荧光，故可知本发明纳米载体对肿瘤细胞具有良好的靶向作用。

Claims (10)

1.一种高靶向低毒性肿瘤微环境智能响应型纳米载体，其特征在于，所述纳米载体由多嵌段聚合物在水中自组装形成的胶束组成，所述多嵌段聚合物为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-SS-聚乙二醇-聚β氨基酯-靶向基团,其亲水端为PEG，疏水端为DSPE通过二硫键连接；所述亲水端带有靶向基团连接pH响应嵌段PAE。
2.根据权利要求1所述的一种高靶向低毒性肿瘤微环境智能响应型纳米载体，其特征在于，所述胶束在中性环境中粒径为30-200nm，酸性环境中体积变大。
3.根据权利要求1所述的一种高靶向低毒性肿瘤微环境智能响应型纳米载体，其特征在于，所述靶向基团为肿瘤新生血管靶向肽c(RGDyc)，其氨基酸序列为Ary-Gly-Asp-D-Tyr-Cys。
4.根据权利要求1所述的一种高靶向低毒性肿瘤微环境智能响应型纳米载体，其特征在于，所述纳米载体为式Ⅰ所述结构聚合物，
Figure FDA0003231620640000011
其中n≥2，x≥2。
5.根据权利要求4所述的一种高靶向低毒性肿瘤微环境智能响应型纳米载体，其特征在于，所述的嵌段聚合物为一整条长链，n在30-100之间,x在8-15范围内。
6.权利要求1-5中任意一项所述高靶向低毒性肿瘤微环境智能响应型纳米载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)HO-PEG-SS-NH2的合成
取1-50份HO-PEG-COOH、1-80份NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、1-60份DCC(二环己基碳二酰亚胺)、0.1-30份DMAP(4-二甲氨基吡啶)溶解在含有DMF(N,N-二甲基甲酰胺)的三口瓶中，在N2保护的条件下冰水浴反应3-8h，用以活化羧基；
称取1-800份的胱胺盐酸盐与1-1500份的三乙胺溶于DMF中，用以除盐；将溶有胱胺的DMF缓慢地滴入三口瓶中，在N2保护条件下室温反应18-36h；反应结束后经冰***沉淀，真空干燥获得式Ⅱ所述结构聚合物，式Ⅱ所述结构聚合物缩写为HO-PEG-SS-NH2；
Figure FDA0003231620640000012
其中，n≥2；
2)DSPE-SS-PEG-OH的合成
取上述所合成的1-40份OH-PEG-SS-NH2、1-45份DCC、1-40份DSPE-COOOH(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺改性羧基)、1-35份NHS溶于氯仿中，在室温条件下反应2-6h，反应结束后用水洗涤反应液，经无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，粗品过阴离子交换柱经氨水洗脱得到式Ⅲ所述结构聚合物，式Ⅲ所述结构聚合物缩写为DSPE-SS--PEG-OH；
Figure FDA0003231620640000021
其中，n≥2；
3)DSPE-SS-PEG-AC的合成
取上述所合成的1-30份DSPE-SS-PEG-OH、1-60份三乙胺、1-50份丙烯酰氯冰浴条件下溶于二氯甲烷中，室温条件反应2-6小时后，反应结束后过滤除去白色沉淀，滤液以1mol/L稀盐酸萃取三次，有机相加入无水硫酸钠和碳酸钠经过滤后得到式Ⅳ所述结构聚合物，式Ⅳ所述结构聚合物缩写为DSPE-SS-PEG-AC；
Figure FDA0003231620640000022
其中，n≥2；
4)DSPE-PEG-SS-PAE-NHS的合成
取上述所合成的1-20份DSPE-SS-PEG-AC、1-600份1,6-己二醇二丙烯酸酯(HDD)、1-480份1,3-二(4-哌啶基)丙烷(TDP)溶于二氯甲烷中，在N2保护的条件下30-60℃反应2-4天，再加入1-45份N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺反应18-36h，经***沉淀后即得式Ⅴ所述结构聚合物，式Ⅴ所述结构聚合物缩写为DSPE-SS-PEG-PAE-NHS；
Figure FDA0003231620640000023
其中，n≥2，x≥2；
5)DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD的合成
取上述所合成的1-15份DSPE-SS-PEG-PAE-NHS、1-40份c(RGDyc)、1-50份三乙胺溶解在氯仿和DMSO的混合溶液中，20-50℃条件下反应8-10h，结束后旋蒸除去氯仿，在超纯水中透析，每天换水3-5次，透析三天后，冷冻干燥即可得式Ⅰ所述结构聚合物，式Ⅰ所述结构聚合物缩写为DSPE-SS-PEG-PAE-cRGD。
7.根据权利要求6所述的纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中所述的HO-PEG-COOH：NHS：DCC：DMAP：胱氨酸：三乙胺的投料比是10：12：12：3：120：240；活化羧基时间为5h，活化温度为0℃，反应时间为24h；所述HO-PEG-COOH与所述DMF的料液比为0.025mmol/ml。
8.根据权利要求6所述的纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中HO-PEG-SS：DSPE-COOH：DCC：NHS的投料比为1：1：1：1，室温条件下反应3h，所述HO-PEG-SS与所述氯仿的料液比为0.024mmol/ml，氨水的体积分数为0.1％；
所述步骤3)中DSPE-SS-PEG-OH：三乙胺：丙烯酰氯的投料比为10：15：15，室温条件下反应3h，所述HOOC-PEG-SS与所述二氯甲烷的料液比为0.179mmol/ml。
9.根据权利要求6所述的纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中DSPE-SS-PEG-AC：1,6-己二醇二丙烯酸酯(HDD)：1，3-二(4-哌啶基)丙烷(TDP)：N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的投料比为1：11：11：1.5，反应时间为72h，反应温度为40℃,加入N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺后继续反应24h，所述DSPE-PEG-SS与所述二氯甲烷的料液比为0.0125mmol/ml。
10.根据权利要求6所述的纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中DSPE-PEG-SS-PAE-NHS：三乙胺：c(RGDyc)的投料比为10：25：15，反应时间为9h，反应温度为45℃，每天换水4次，DSPE-PEG-SS-PAE-NHS与氯仿和DMSO的混合溶液的料液比为1.25μmol/ml。
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