CN113671187A

CN113671187A - 一种用于检测mycn蛋白的ihc检测试剂盒

Info

Publication number: CN113671187A
Application number: CN202110922034.6A
Authority: CN
Inventors: 李彦欣; 杨怡; 冯海忠
Original assignee: Shanghai Childrens Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Shanghai Childrens Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2021-08-12
Filing date: 2021-08-12
Publication date: 2021-11-19

Abstract

本发明涉及一种用于检测MYCN蛋白的IHC检测试剂盒，包括MYCN的蛋白杂交抗体。所述的MYCN的蛋白杂交抗体购自Cell Signaling Technology公司，货号为#84406s。本发明发现Cell Signaling Technology公司的货号是#84406s的MYCN的抗体可以用于神经母细胞瘤组织样本的免疫组化技术；其与FISH的吻合度在75％以上，与预后的吻合度较FISH的显著升高；其更有利于临床MYCN的检测与预后的判断；解决了国际上MYCN没有商业抗体进行免疫组化检测的问题。并且提高了其对MYCN的检测的精准性与对预后的判断性。

Description

一种用于检测MYCN蛋白的IHC检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，具体是一种用于检测MYCN蛋白的IHC(蛋白免疫组化)检测试剂盒。

背景技术

神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤，占儿童癌症死亡率约12％。其病程具有2极分化，一些病人不需要治疗可以自愈，一些病人经过各种治疗还是不能挽回生命。因此探寻预测预后的指标在儿童神经母细胞瘤中至关重要。神经母细胞瘤的MYCN扩增率约为22％，是神经母细胞瘤具有重要临床和预后价值的第一个遗传标记。目前国际神经母细胞瘤风险分组(INRG)和儿童肿瘤分组(COG)使用的分组指标中MYCN的扩增都占有很大分量。

迄今为止，由于缺乏可靠的MYCN的IHC抗体，临床和实验室检测方法主要局限于核酸水平，如常规聚合酶链式反应(PCR)、定量实时定量PCR(qRT-PCR)、半定量差异PCR(sq-PCR)、数字PCR(ddPCR)、荧光原位杂交(FISH)、染色体原位杂交(CISH)、多重连接依赖探针扩增(MLPA)等。目前已将FISH检测的MYCN基因状况整合到风险分类中。然而，一些研究已经证实，在DNA水平MYCN无扩增的病例中也可见MYCN蛋白的高表达，而DNA水平MYCN基因扩增的病人也有发现在蛋白水平表达不高的现象。即目前临床上广泛应用的MYCN的FISH检测，检测的是DNA水平的MYCN的COPY数，一般情况下，DNA水平COPY数高，RNA水平和蛋白水平会高。但还是有一定量的病人因为转录和翻译以及翻译后修饰，泛素化降解的问题，而不一致。从而影响其对预后的判定。

MYCN是在蛋白水平发挥其生物学效应，蛋白水平的检测，免疫组化检测时应用非常广泛的一个检测细胞内蛋白水平的方法。但很多MYCN的抗体灵敏性达不到，其与FISH结果以及预后的吻合度都很差，达不到用于临床的要求。因此寻找一种快速、可靠、经济的检测MYCN蛋白表达的方法具有重要意义。目前在国际上还没有一个MYCN的IHC商业抗体可以用于临床检测。

发明内容

本发明的目的是：提供了一种MYCN的蛋白杂交抗体作为儿童神经母细胞瘤的MYCN蛋白的IHC临床检测试剂中的应用。

本发明采用的技术方案为：

本发明提供了一种MYCN的蛋白杂交抗体作为儿童神经母细胞瘤的MYCN蛋白的临床检测试剂中的应用。在该应用中，所述试剂通过免疫组织化学检测样本中MYCN的表达水平。

进一步，所述的MYCN的蛋白杂交抗体购自Cell Signaling Technology公司，货号为#84406s。

进一步，在所述的应用中，所述的样本为组织样本。

本发明还提供了一种预测儿童神经母细胞瘤预后的IHC试剂盒，包括MYCN的蛋白杂交抗体。

进一步，所述的IHC试剂盒还包括二抗anti-rabbit-IgG，HRP linked，购自CellSignaling公司，货号为#7074。

本发明还提供了一种预测儿童神经母细胞瘤预后的试剂盒，包括上述IHC检测试剂盒和MYCN的FISH检测试剂盒。

本发明儿童神经母细胞瘤预后预测的判断方法为：

用兔抗MYCN抗体(#84406s，Cell Signaling Technology)免疫组织化学方法检测MYCN蛋白的表达。MYCN染色强度分级为0-3级(0＝负，1＝弱，2＝中，3＝强)，阳性比例分级为0-4级(0为0％，1级为<25％，25％≤2级＜50％，50％≤3级＜75％，75％≤4级≤100％)。免疫组化分级由两位病理学家独立评分，取平均值，最终得分＝染色强度*阳性比例。0分级为阴性，1-4分级为低表达，5-8分级为中位表达，9-12分级为高表达。

如果用FISH和免疫组化结合，诊断标准：

当该病人的FISH是阳性，IHC是在9以上(≥9)，预示其预后不良，如果IHC在0-8之间，说明预后会好；如果该病人的FISH为阴性，IHC的值等于0，预后好，IHC大于0，预后差。

本发明其免疫组化评级用大于0和等于0，指导预后比用FISH显著准确；如果用FISH和免疫组化结合：FISH+的IHC小于9以及FISH-，IHC等于0的病人为一组，预后好，FISH+的IHC大于等于9，以及FISH-的IHC大于0的病人为一组，预后差。较单独利用FISH和免疫组化与预后更相关。

本发明所具有的有益效果：

本发明发现Cell Signaling Technology公司的货号是#84406s的MYCN的抗体(已公开的其商业应用技术领域为蛋白质印记，免疫沉淀，免疫荧光，流式细胞，染色质免疫沉淀技术)，本发明发现其还可以用于神经母细胞瘤组织样本的免疫组化技术。其与FISH的吻合度在75％以上，与预后的吻合度较FISH的显著升高。其更有利于临床MYCN的检测与预后的判断。解决了国际上MYCN没有商业抗体进行免疫组化检测的问题。并且提高了其对MYCN的检测的精准性与对预后的判断性。

附图说明

图1.IHC与FISH结果的一致性比较，其中a)利用IHC检测MYCN蛋白表达并对结果进行综合评分；b)分析IHC和FISH检测MYCN表达的一致性；c-e)根据FISH检测结果(c、d)、INSS分期((c、d)和临床结局(e)对IHC结果进行归类分组。

图2联合IHC和FISH检测方法能更好的预测预后分析图；其中a-b)根据IHC结果分别对MYCN-amp(a)和MYCN-non(b)群体进行进一步分组及Kaplan-Meier生存分析；c)同时纳入FISH和IHC结果作为分组标准，并利用Kaplan-Meier生存分析比较各组间差异；d)利用色阶图谱归纳总结各临床因素与患者预后之间的关系(无*，表示P>0.05，差异不具有统计学意义，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001，差异具有统计学意义)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

样本采集

2010年至2019年，病理检测证实有332名NB初诊患者于我院诊断治疗，其中有41名患者存在MYCN-amp。由于肿瘤样本保存时间过长导致肿瘤组织遭严重破坏、或肿瘤细胞过少，不利于蛋白检测等因素，仅28例MYCN-amp患者的肿瘤组织参与本试验。作为对照，我们另外选择了28名MYCN-non患者的肿瘤样本进行IHC检测，其中7名发生疾病相关死亡，19名患者末次随访时状态良好。所有患者确诊时年龄均不超过12岁，其中男性30例，女性26例。表3列出了患者年龄、性别、临床分期、危险分组、原发部位、FISH检测结果、MYCN免疫组化评分、预后、目前状态、随访时间等信息。按照伦理审查委员会规定的制度，每个病人在取样前均签署了知情同意书。

组织样本制备：

手术切出的肿瘤样本，半小时内切成小块，放在10％的***中固定，进行标准的石蜡包埋，切成2-3μm厚的薄片进行后续分析。

试验方法

1.IHC的实验方法

石蜡切片预处理：

a.室温保存的石蜡切片置65℃孵育1h，使石蜡熔化；

b.将切片依次于3个装有二甲苯的染缸内浸泡脱蜡，每次15min；

c.将切片依次于梯度酒精内浸泡复水：无水乙醇2次，3-5min/次；90％乙醇2次，3-5min/次；70％乙醇2次，3-5min/次；自来水1次，3min/次；

将切片置于3％H₂O₂内室温避光浸泡10min后，于自来水内室温浸泡5min；

将切片置于1×柠檬酸抗原修复液中，使用高火(98℃-100℃)微波加热至沸腾(可在染缸下垫纸，若纸巾浸湿即表示沸腾，一般约3min-4min)，断电后于微波炉内静置10min；

从微波炉内取出染缸，冰上冷却至室温(注：期间勿打开染缸)；

待柠檬酸抗原修复液冷却至室温后，取出切片，使用1×PBS洗片3次，3-5min/次；

用纸巾拭去多余液体，使用免疫组化笔在目标区域上画出疏水隔离区，滴加一抗(anti-MYCN，Cell Signaling公司，84406s，1:200稀释)，于潮湿暗盒中4℃孵育过夜；将湿盒自4℃取出后，室温静置10min，使用1×PBS洗片3次，3-5min/次；

用纸巾拭去多余液体，滴加二抗(anti-rabbit-IgG,HRP linked，Cell Signaling公司，#7074，不用稀释)，于室温内孵育20-25min；

使用1×PBS洗片3次，3-5min/次；

用纸巾拭去多余液体，滴加适量按比例配置的DAB显色剂，于室温内反应，显微镜下观察显色变化，适时于自来水中终止显色反应；

使用苏木素复染约1-2min、盐酸酒精分化1-2s后，于自来水中浸泡返蓝10-15min；

将切片依次于梯度酒精内浸泡脱水：70％乙醇2次，3-5min/次；90％乙醇2次，3-5min/次；无水乙醇2次，3-5min/次；

将切片依次于3个装有二甲苯的染缸内浸泡，每次5min；

将树胶与纯净二甲苯按照2：1比例稀释，作为封片剂封片，于室温下自然晾干玻片,至二甲苯完全挥发后可镜检。

2石蜡切片荧光免疫原位杂交(FISH)，试剂盒名称LSI N-MYC SpectrumOrangeProbe：

1)石蜡切片预处理：

a.室温保存的石蜡切片置65℃孵育1h，使石蜡熔化；

c.将切片依次于梯度酒精内浸泡复水：无水乙醇2次，3-5min/次；90％乙醇2次，3-5min/次；70％乙醇2次，3-5min/次；

d.将切片置于0.2M HCl内，室温孵育10min；

e.使用1×PBS洗片3次，3-5min/次；

f.将切片置于0.01M枸橼酸盐缓冲液(PH＝6.0)内80℃孵育1h；

g.使用2×SSC缓冲液洗片2次，3-5min/次；

h.使用DDW洗片，3-5min/次；

i.将0.5mg/ml pepsin及0.02M HCl溶液于37℃内预热5min后按1:1等比例混合，配制为0.25mg pepsin/ml 0.01M盐酸溶液；

j.在切片上滴加300μl pepsin/HCL溶液，盖上盖玻片，37℃孵育10min；

k.使用2×SSC缓冲液洗片2次，3-5min/次；

l.使用0.4％多聚甲醛室温固定切片10min；

m.使用1×PBS洗片3次，3-5min/次；

n.将切片依次于梯度酒精内浸泡脱水：70％乙醇2次，3-5min/次；90％乙醇2次，3-5min/次；无水乙醇2次，3-5min/次

o.于室温下自然晾干玻片；

2)探针预处理：

将探针于75℃孵育5min后立即置于0℃内5-10min，使双链DNA探针变性；

3)杂交：

在已变性脱水的切片上滴加10μl探针混合液，盖上盖玻片，封片后置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜(约15-17h)；

4)洗脱：

a.次日，将切片取出后轻轻揭下盖玻片，放入4×SSPE中，47℃孵育5min；

b.再次将玻片放于4×SSPE中，55-72℃孵育10min；

c.将切片依次于梯度酒精内浸泡脱水：70％乙醇2次，3-5min/次；90％乙醇2次，3-5min/次；无水乙醇2次，3-5min/次；

d.将切片放入己烷/异丙醇混合液内室温浸泡10min(己烷：异丙醇按6：4比例混合)；

e.将切片放入异丙醇内室温浸泡5min；

f.将切片放入无水乙醇内室温浸泡5min；

g.于室温下自然晾干玻片至乙醇完全挥发；

h.使用DAPI复染后盖上盖玻片，轻轻挤压出多余液体，封片后4℃避光保存；

2MYCN表达水平的判定

1)MYCN免疫组化(IHC)评分：

①MYCN染色强度分为0-3分，其中0＝阴性，1＝弱，2＝中，3＝强；

②MYCN染色阳性比例分为0-4分，其中0％＝0分，<25％＝1分，25％≤2分＜50％，50％≤3分＜75％，75％≤4分≤100％；

③最终评分＝染色强度×阳性比例。0分为“阴性”，1-4分为“低表达”，5-8分为“中位表达”，9-12分为“高表达”。

2)MYCN的FISH结果判定

MYCN/PAX3比值>5为阳性，即MYCN扩增；MYCN/PAX3比值≤1为阴性，即MYCN非扩增

实验结果

1检测本发明IHC检测所用抗体的有效性：

为验证在本发明中所用抗体(MYCN#84406s,Cell Signaling)的有效性，我们纳入更多的样本(n＝56)进行IHC检测。实验所用肿瘤样本均经FISH检测，其中1/2确诊为MYCN-amp(表1)。结果显示，不同肿瘤组织间，在恶性细胞阳性比例和染色强度方面存在较大差异。为了便于后续分析，我们基于以上两点对染色结果进行综合评分(图1a)。在此基础上，我们对FISH和IHC结果的一致性进行了分析(表2)。结果显示，无论MYCN-amp与否，≥75％的IHC结果与FISH结果一致(表4，图1b)。而对于两种检测结果不一致的患者，我们纳入患者的临床信息进行综合分析，以确认哪种方法与预后更加相关(为了确保个人预后的准确性，涉及到随访时间时，我们只纳入2016年及之前确诊的患者)。结果显示，IHC评分随INSS分期升高而升高，并与患者临床预后高度相关(图1c-e)。在MYCN-amp患者中，11例MYCN蛋白高表达(IHC评分≥9)患者中7例预后不良，而5例无表达或低表达患者均无不良事件发生；在MYCN-non患者中，所有(4例)检测到MYCN蛋白表达的患者均预后不良，而17例预后良好的患者，均无MYCN蛋白表达(表3)。所有这些数据均表明，该MYCN抗体具有良好的灵敏度和特异性，与FISH结果具有较高的一致性，而对于FISH未检出的患者，IHC具有补充作用，能提高MYCN检出率，临床应用价值大。

表1患者临床信息

性别:0＝女；1＝男；

危险分级:1＝低危；2＝中危；3＝高危；4＝极高危；

原发部位:1＝颈部；2＝胸部；3＝腹部；4＝盆腔；

CR:完全缓解(complete remission)

表2本次实验中，IHC与FISH结果的一致性比较

表3 MYCN蛋白表达与临床预后的相关性分析

2联合IHC和FISH检测方法能更好的预测预后

根据前期结果可以看出，IHC能更准确的检测MYCN在肿瘤中的表达以及预测预后。为了进一步证明这一点，利用IHC结果对MYCN-amp和MYCN-non群体进行进一步分组，并利用Kaplan-Meier生存分析进行统计分析。结果发现，IHC结果可进一步区分MYCN-amp和MYCN-non群体的预后情况(图2a-b)。此外，如果我们仅纳入FISH结果作为分组依据，MYCN-amp和MYCN-non的无事件生存率分别为是56.2％和63.0％，生存分析显示两组间没有统计学差异。而只纳入IHC结果作为分组依据，两组间生存率差异具有统计学意义(图2c)。结合两种方法，即将FISH+IHC<9、FISH-IHC＝0作为一组，FISH+IHC≥9、FISH-IHC>0作为另一组，则可以达到最佳临床预测效果(图2c)。同时，我们发现如果FISH检测提示MYCN-non,但如果IHC可检测到MYCN蛋白表达，此患者多预后不佳；相反，FISH检测提示MYCN-amp,而IHC无法检测到MYCN蛋白表达或仅为低表达，此患者多预后良好(图2d)。综上所述，IHC可以弥补FISH在评估预后和指导治疗方面的不足,两种检测结果联合分析可达到最佳临床预测效果。

Claims

1.一种MYCN的蛋白杂交抗体作为儿童神经母细胞瘤的MYCN蛋白的IHC临床检测试剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的MYCN的蛋白杂交抗体购自CellSignaling Technology公司，货号为#84406s。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：在所述的应用中，所述的样本为组织样本。

4.一种预测儿童神经母细胞瘤预后的IHC试剂盒，其特征在于：包括MYCN的蛋白杂交抗体。

5.根据权利要求4所述的一种预测儿童神经母细胞瘤预后的IHC试剂盒，其特征在于：所述的MYCN的蛋白杂交抗体购自Cell Signaling Technology公司，货号为#84406s。

6.根据权利要求5所述的一种预测儿童神经母细胞瘤预后的IHC试剂盒，其特征在于：所述的IHC试剂盒还包括二抗anti-rabbit-IgG，HRP linked，购自Cell Signaling公司，货号为#7074。

7.一种预测儿童神经母细胞瘤预后的试剂盒，其特征在于：包括MYCN的FISH检测试剂盒和权利要求5-6所述IHC检测试剂盒。