CN113667654B

CN113667654B - 一种重组嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN113667654B
Application number: CN202110593340.XA
Authority: CN
Inventors: 侯靖; 杨晓妍; 崔恒林
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2021-05-28
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2041-05-28
Also published as: CN113667654A

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一种重组嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法及其应用；步骤为：首先基于盐长命菌(Halovivax sp.)WLHSJ27‑1的基因组获得编码基因hod_Hvv；通过分子克隆技术将hod_Hvv连接到载体上构建重组质粒；将重组质粒转化嗜盐古菌宿主，得到转化后的重组宿主细胞在Hv‑YPC液体培养基中培养至稳定期后低温离心收集菌体，于细胞裂解液中进行重悬，经超声破碎、离心收集上清液，用于重组蛋白纯化；采用镍亲和层析纯化以及凝胶过滤层析纯化后获得高纯度组胺氧化酶，记为Hod_Hvv；Hod_Hvv能够催化多种胺类，且耐高温和耐受多种金属离子，具有优良的酶学性质。

Description

一种重组嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种重组嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法及其应用。

背景技术

组胺是由组胺脱羧酶将组氨酸脱羧形成的低分子含氮有机碱，少量组胺在人体中调节各种生理功能。摄入过量的组胺(8～40mg)导致急性中毒，典型症状包括皮疹、红斑、出汗、恶心、呕吐、腹泻、口腔烧灼感、舌头和面部肿胀、头痛、呼吸窘迫、心悸和低血压；组胺中毒的症状可能会持续几个小时或一天，在极少数情况下，症状可能会持续几天。组胺超标的问题广泛存在于鱼露、虾酱、酱油等高盐食品中。

目前控制食品中组胺的方法主要有三种：物理方法，化学方法和生物方法。物理方法主要通过对食品低温储存、超高压处理、辐照处理控制食品中产组胺的微生物，这类方法操作简单但价格昂贵。化学方法即向食品中添加化学添加剂或香辛料控制食品中产胺类微生物，从而达到控制组胺的效果。这类方法的缺点在于对食品的风味及营养影响较大。生物方法即通过向食品中添加能降解组胺的微生物或酶。目前发现能降解组胺的微生物种类较多，但安全性无法控制。生物酶法对组胺降解效果良好，产物无毒害，但目前已报道的组胺降解酶种类少，对盐的耐受性差。

组胺降解酶主要有两类，组胺氧化酶与组胺脱氢酶。本发明涉及的组胺氧化酶来自嗜盐古菌，使用异源表达、亲和层析等方法获得纯酶，表达量大且后续纯化方法简单。嗜盐古菌组胺氧化酶对NaCl、温度具有广适性，可应用于降解鱼露、虾酱等高盐食品中的组胺。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术存在缺点，提供一种重组嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法。

本发明基于嗜盐古菌(Halovivax sp.)WLHSJ27-1的基因组获得一个新型组胺氧化酶基因hod_Hvv，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，基因大小为2037bp；使用TatP预测发现该酶无Tat信号肽，为胞内酶，由678个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

为了实现以上目的，本发明包括以下步骤：

本发明涉及了新型嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)构建pTA04-hod_Hvv重组表达质粒：

首先基于嗜盐古菌(Halovivax sp.)WLHSJ27-1的基因组获得一个新型组胺氧化酶基因hod_Hvv；根据目的基因设计含有酶切位点的引物，利用常规PCR技术扩增目的片段hod_Hvv；并通过分子克隆技术将hod_Hvv连接到pTA04载体上构建重组质粒；

(2)重组质粒转化Haloferax volcanii：

将步骤(1)得到的重组质粒转化嗜盐古菌宿主，得到转化后的重组宿主细胞；所述嗜盐古菌宿主为Haloferax volcanii；转化后的重组宿主细胞在Hv-YPC液体培养基中摇瓶培养，细胞培养至稳定期后，低温离心收集菌体，备用；

(3)Hod_Hvv纯化：

收集步骤(2)的菌体于细胞裂解液中进行重悬，重悬后超声破碎细胞，离心收集上清液，用于重组蛋白纯化；首先采用镍柱亲和层析纯化上清液，获得含咪唑的酶液，再利用凝胶过滤去除酶液中的咪唑，获得高纯度组胺氧化酶，记为Hod_Hvv。

优选的，步骤(1)中所述嗜盐古菌(Halovivax sp.)WLHSJ27-1保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心菌种保藏号为CGMCC 22177，保藏日期为2021年4月12日。

优选的，步骤(1)中所述hod_Hvv核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，基因大小为2037bp。

优选的，步骤(1)中所述酶切位点选择限制性内切酶EcoRΙ和BamHI的酶切位点。

优选的，步骤(2)中所述Haloferax volcanii购自日本微生物保藏中心(JCM)，菌株保藏号JCM 8879。

优选的，步骤(2)中所述Hv-YPC培养基成分为(每升)：酵母提取物5.0g，大豆蛋白胨1.0g，酸水解酪素1.0g，KCl 4.2g，MgSO₄·7H₂O 33.0g，MgCl₂·6H₂O 30.0g，NaCl144.0g，1M Tris-HCl(pH 8.0)12.0mL，CaCl₂ 0.33g(首先预溶于水中，溶解后添加)，上述组分定容于1L蒸馏水中，调节pH至7.5，115℃灭菌30min。

优选的，步骤(2)中所述摇瓶培养的温度为37℃，转速为180rpm。

优选的，步骤(2)所述低温为0～4℃。

优选的，步骤(3)中所述获得成熟酶的具体操作为：使用10倍柱床体积细胞裂解液平衡镍柱，随后使用上清液与镍柱结合3遍；使用15倍柱床体积缓冲液Ⅰ洗脱杂蛋白，使用5倍柱床体积缓冲液Ⅱ洗脱目的蛋白，得到纯酶。

优选的，所述细胞裂解液成分为2M NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0。

优选的，所述缓冲液I成分为2M NaCl，20mM Tris-HCl，40mM咪唑，pH 8.0。

优选的，所述缓冲液II成分为2M NaCl，20mM Tris-HCl，250mM咪唑，pH 8.0。

优选的，步骤(3)中所述凝胶过滤层析所用的流动相为细胞裂解液。

本发明制备的组胺氧化酶可用于鱼露、虾酱、腌制食品等各类高盐食品中降解组胺的用途。

本研究以组胺磷酸盐为底物，通过测定其反应产物H₂O₂含量测定Hod_Hvv的催化活性，其方法为：

以蒸馏水溶解100mM组胺磷酸盐底物，取5μg酶液、5μL底物及酶活测定缓冲液共60μL体系，37℃反应30min，置于冰上停止反应，向体系中加入60μL检测液，反应30s，使用核酸蛋白分析仪DU800^TM测定吸光值A₅₉₅。以酶活测定缓冲液代替酶液作为空白对照。制作H₂O₂含量标准曲线计算酶活。一个酶活力单位定义为特定条件下每分钟生成lμg组胺所需要的酶量。2M NaCl、37℃且pH 8.0条件下测得的以组胺磷酸盐为底物的Hod_Hvv比酶活为23.6U/mg。

以组胺磷酸盐为底物，Hod_Hvv在所述的0.07～4M NaCl范围内最适NaCl浓度为2M，在0.5M、2M、4M NaCl浓度下，4h后仍具有100％活性；在所述30～80℃的范围内，最适反应温度为60～65℃，在30℃，4h后仍保持100％的活性，50℃下，3h后酶活达到400％；在所述pH6.0～9.0范围内，最适pH为6.5，在pH 6.0、7.5、9.0下，4h后仍保持100％活性。能耐受多种金属离子，Sr²⁺对酶活有促进作用；能够降解多种生物胺，以组胺为底物时酶活最高。以组胺为底物最大反应速率V_max为30.83μg/min/mg，动力学常数K_m为0.5321mM。

优选的，步骤中所述测定缓冲液为2M NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0。

优选的，步骤中所述检测液为5mM 3-甲基-2-苯并噻唑酮腙盐酸盐，2.5mM间二氨基苯甲酸，0.067mg/mL辣根过氧化物酶。

本发明的优点和技术效果是：

(1)本发明从嗜盐古菌(Halovivax sp.)WLHSJ27-1中筛选获得的新型组胺氧化酶基因，该基因与已发表的其他微生物来源的组胺氧化酶一致性低，且目前暂无嗜盐古菌组胺氧化酶研究，该发明可填补嗜盐古菌组胺氧化酶研究的空白，因此新型嗜盐古菌组胺氧化酶编码基因hod_Hvv与嗜盐古菌组胺氧化酶Hod_Hvv均具有很高的研究价值。

(2)组胺氧化酶Hod_Hvv具有优良的酶学性质，能够催化多种胺类；耐高温，最适反应温度在60～65℃，在30℃及50℃下均较为稳定；对NaCl、pH的耐受性良好，在低盐至高盐、中性至碱性均具有较好的稳定性；可耐受多种金属离子。具有优良性状的组胺氧化酶可应用于组胺含量较高的鱼露、虾酱等各类高盐食品中降解组胺。

附图说明

图1为本发明中hod_Hvv重组质粒在实例2中的质粒双酶切验证图。

图2为本发明中Hod_Hvv实例3中的SDS-PAGE电泳图。

图3为本发明中Hod_Hvv酶活测定在实例4中的H₂O₂含量标准曲线。

图4为本发明中Hod_Hvv在实例5中的最适反应温度图。

图5为本发明中Hod_Hvv在实例5中的最适反应NaCl浓度图。

图6为本发明中Hod_Hvv在实例5中的最适反应pH图。

图7为本发明中Hod_Hvv在实例6中的热稳定性图。

图8为本发明中Hod_Hvv在实例6中的NaCl稳定性图。

图9为本发明中Hod_Hvv在实例6中的pH稳定性图。

图10为本发明中实例6中不同金属离子对Hod_Hvv催化活性的影响图。

图11为本发明中实例7中不同底物下Hod_Hvv催化活性图。

图12为本发明中实例8中以组胺为底物Hod_Hvv动力学曲线图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施实例对本发明做进一步说明。

嗜盐古菌(Halovivax sp.)WLHSJ27-1发明人分离，分离自内蒙古自治区、乌兰察布市乌兰呼少海子，分离时间2019年12月20日。

实施例1：

新型嗜盐古菌组胺氧化酶编码基因hod_Hvv的获取；

基于一株嗜盐古菌(Halovivax sp.)WLHSJ27-1(发明人分离，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC 22177保藏日期：2021.4.12)的全基因组、开放阅读框预测及基因注释结果，筛选疑似组胺氧化酶基因。经数据库比对分析获得hod_Hvv基因，大小为2037bp，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。编码蛋白大小为678个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

通过Blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对序列与数据库中已知组胺氧化酶氨基酸序列的一致性。Hod_Hvv与Arthrobacter globiformis的组胺氧化酶的相似度为39.91％，与Arthrobacter crystallopoiete的组胺氧化酶相似度为38.61％，同源性大于30％。使用Genedoc将预测到的疑似组胺氧化酶与目前已发表的组胺氧化酶序列进行多序列比对，发现Hod_Hvv中的保守氨基酸位点与目前已发表的组胺氧化酶一致。

综上所述，Hod_Hvv为嗜盐古菌来源的一种新型含铜组胺氧化酶。

实施例2：

hod_Hvv重组表达质粒的构建与表达；

将本发明获得的基因hod_Hvv克隆到表达载体上，构建重组表达菌株。基于NCBI ORFFinder的ORF分析获得基因开放阅读框序列，设计扩增hod_Hvv基因的上游引物hod_Hvv-EcoRΙ-F(5’-ATAGAATTCGCAGAAAGCCACACGCGA-3’)和下游引物hod_Hvv-BamHΙ-R(5’-ATAGGATCCGTCGTCGTCGGCGTCCGC-3’)，PCR扩增获得目的片段(2037bp)。

采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用限制性内切酶EcoRΙ和BamHΙ双酶切PCR产物，纯化后的片段与经EcoRΙ和BamHΙ双酶切的质粒pTA04连接，得到重组质粒pTA04-hod_Hvv，***片段的3’端含有6×His tag。CaCl₂转化法转化至E.coli DH5α中，氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒提取阳性克隆的质粒，对阳性重组子进行双酶切验证(图1，其中M为Marker，泳道1、2为质粒pTA04-hod_Hvv-1、pTA04-hod_Hvv-2，泳道3、4分别为质粒pTA04-hod_Hvv-1、pTA04-hod_Hvv-2双酶切结果)并寄上海生工进行测序。将正确的重组表达质粒转化Haloferax volcanii表达菌株中，构建重组表达菌株；转化成功的转化子即为转化后的重组宿主细胞；

将转化成功的转化子按1％(v/v)的接种量接种于200mL Hv-YPC液体培养基中，置于37℃摇床中200rpm，摇瓶培养至稳定期，低温离心收集菌体。

上述限制性内切酶、T4 DNA连接酶购买自New England Biolabs；上述试剂盒购买自美国Axygen公司。

实施例3：

重组蛋白Hod_Hvv纯化；

将实施例2收集的菌体于细胞裂解液中进行重悬，超声破碎获得粗酶液，由于目的蛋白上含有的His-tag标签能与镍结合，所以通过镍柱亲和层析纯化目的蛋白；使用低浓度的咪唑洗脱杂蛋白，高浓度咪唑洗脱目的蛋白，具体步骤如下：

(1)使用25mL细胞裂解液(2M NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0)使菌体重悬，冰浴中超声处理10～15min，超声条件为功率200W，超声3s，停5s。超声后离心两次，取上清液备用。

(2)用10倍柱床体积的Lysis buffer平衡柱子。

(3)将上清液流进柱子，重复三次，保证目的蛋白充分与镍柱结合。

(4)使用15倍柱床体积的缓冲液I(2M NaCl，20mM Tris-HCl，40mM咪唑，pH 8.0)洗脱杂蛋白。

(5)使用5倍柱床体积的缓冲液II(2M NaCl，20mM Tris-HCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱目的蛋白，收集洗脱液储存于4℃备用。

(6)洗脱液使用截留分子量为10kDa的Millipore超滤管浓缩样品，获得浓缩液，用Bradford法测定蛋白质浓度为1mg/mL以上。

(7)浓缩液利用凝胶过滤层析(HiTrap^TMDesalting(5mL))去除咪唑，使用流动相为细胞裂解液(2M NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0)，得到组胺氧化酶，记为Hod_Hvv。

(8)所得组胺氧化酶进行SDS-PAGE检测(图2，M：蛋白预染Marker，泳道1：过脱盐柱后的蛋白)。

实施例4(性能测试)：

Hod_Hvv酶活测定：以蒸馏水溶解100mM组胺磷酸盐底物，取5μg酶液、5μL底物及酶活测定缓冲液共60μL体系，37℃反应30min，置于冰上停止反应，向体系中加入60μL检测液，反应30s，使用核酸蛋白分析仪DU800^TM测定吸光值A₅₉₅。以酶活测定缓冲液代替酶液作为空白对照，设置3组平行。测定H₂O₂含量标准曲线计算酶活(图3)。一个酶活力单位定义为特定条件下每分钟生成lμg组胺所需要的酶量。2M NaCl、37℃且pH 8.0条件下测得的以组胺磷酸盐为底物的Hod_Hvv比酶活为23.6U/mg。

实施例5：

Hod_Hvv最适反应条件分析；

以组胺磷酸盐为底物，取5μg酶液测定Hod_Hvv的最适反应条件。

不同的温度梯度设置为30、40、50、55、60、65、70、80℃，按照实施例4方法,测定不同温度下的酶活。以最高酶活为100％，计算相对酶活。最适反应温度为60～65℃(图4)。

最适NaCl测定范围在0.07～4M，分别配制0.07、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4M NaCl的酶活测定缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0)。以实施例4的方法，在最适温度60℃下，测定酶活。以最高酶活为100％，计算相对酶活。最适反应NaCl为2M(图5)。

最适pH测定范围在6～9，分别配置0.1M K₂HPO₄-KH₂PO₄ buffer，调节pH至6.0、6.5、7.0、7.5；0.1M Tris-HCl buffer，调节pH至7.5、8.0、8.5、9.0；以实施例4的方法，在最适温度60℃，最适NaCl 2M条件下测定酶活。以最高酶活为100％，计算相对酶活。最适反应pH为6.5(图6)。

实施例6：

Hod_Hvv酶学稳定性分析；

以组胺磷酸盐为底物，取5μg酶液于最适反应条件下测定Hod_Hvv的稳定性。

热稳定性的具体操作为，将酶液置于30℃、50℃、70℃分别放置0、1、2、3、4h。以实施例4的方法，在最适条件下测定酶活，以0h时酶活为100％，计算相对酶活。在30℃下酶活在4h后仍保持100％活性；在50℃下，3h后酶活达到400％，4h后略有下降；70℃下，1h后，酶活完全丧失(图7)。

NaCl稳定性的具体操作为，分别将酶液放置在含0.5、2、4M NaCl的酶活测定缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0)中0min、10min、30min、1h、2h、3h、4h。以实施例4的方法，测定酶活。以2M NaCl下0min时酶活为100％，计算相对酶活。在0.5M及2M下，4h后仍然保持100％的酶活，而当酶液放置在4M的NaCl下，初始时酶活较低，但随着时间增加，酶活上升，直至30min后，趋于稳定。表明该酶具有良好的NaCl稳定性(图8)。

pH稳定性的具体操作为：分别将酶液置于pH 6.0的K₂HPO₄-KH₂PO₄ buffer，pH7.5Tris-HCl buffer，pH 9.0Tris-HCl buffer中,放置0h、1h、2h、3h、4h。以实施例4的方法，测定酶活。以pH 6.0下0h时酶活为100％，计算相对酶活。在pH 6.0、7.5、9.0的条件下，4h后仍保持100％的酶活，表明该酶具有较好的pH稳定性(图9)。

金属离子耐受性具体操作为：在应用实例4的反应体系中分别添加KCl、MgCl₂、SrCl₂、NiSO₄、CoCl₂、BaCl₂溶液，使金属离子终浓度为10mM。以实施例4的方法，测定酶活；其中con.是指对照组，以不加金属离子的反应为对照并以其酶活为100％。在所测试的金属离子中，Sr²⁺、K⁺对酶活具有促进作用；Mg²⁺对酶活无明显影响；Ba²⁺、Co²⁺、Ni²⁺抑制酶活，但仍能保持50％的活性，表明该酶具有较好的金属离子耐受性(图10)。

实施例7：

不同底物下Hod_Hvv的酶活。

以不同类型的生物胺为底物，取5μg酶液于最适反应条件下测定Hod_Hvv的酶活。

具体操作为：分别配置100mM的组胺、色胺、尸胺、精胺、腐胺、酪胺。以实施例4的方法，测定酶活。以组胺为底物的酶活设置为100％，计算相对酶活。该酶对组胺的酶活最高，其次是酪胺；对色胺、尸胺、腐胺有30％的酶活；而对精胺无酶活。表明该酶具有广泛的底物特异性(图11)。

实施例8：

Hod_Hvv的酶促动力学分析。

以组胺磷酸盐为底物，取5μg酶液于最适反应条件下测定Hod_Hvv的酶活；

具体操作为：设置各体系中组胺终浓度为0.05、0.15、0.2、0.25、0.3、0.5、0.8、1、1.5、2mM。在最适条件下，以实施例4的方法，测定不同底物下的酶活，利用GraphPad Prism7构建酶动力学曲线，根据米氏方程(Michael-Menten equation)计算酶动力学常数K_m和最大反应速率V_max。所得反应底物最大反应速率V_max为30.83μg/min/mg，动力学常数K_m为0.5321mM(图12)。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种重组嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2037

<212> DNA

<213> 嗜盐古菌 WLHSJ27-1(Halovivax sp)

<400> 1

atggcagaaa gccacacgcg agcgatcgac catccgctcg atccgctcac gccggacgag 60

atcgaggccg cctacgaagt gctgaccgac gaacgcgacg tcggcgaggc gagcctctgt 120

atcaagatcg aactggccga acccgaaaag gaggcgcttc gggcctacga cgacggcggg 180

gagcgtcccg atcgacgggc gctgcttgtg atccgaaaca gttctgacgg aaagacgctc 240

gaggccgtcg tctcgctcga ggaggcgtcg gtcgtctcca ccgaggaggt caacggccag 300

ccgtcgatcg ccatcgagga gttcatcgcc tgcgaggaga ccgtcaaacg caacgaggag 360

tggcaagccg cgctccacga tcgaggaatc gaaaacaccg accgcgcgat ggtcgacccg 420

tggtcggtcg gtcacgagtt cgtccccgag gacgtcgacc gctcgaggcg gctggcccac 480

gggctgacgt tcgtccgacc cagcgaggac gacggcgacg agggttacgc ccatcccgtc 540

tccgggctgc acacgttcgt cgacctcgac cggatggagg tcgtgaaagt cgtcgactac 600

ggcccgccgg atgaggacag tccgatccca cccgaggaga tggcctaccg cgagggcgac 660

gtcgagctcc gagacgacct gaccgcctac aacgtcgacc agccggacgg cccgagctgg 720

agcgtcgacg gccacaaact cgagtggcag aactggcaca tgcgcgtcgg ctggacccag 780

cgggaggggc tggtgctgta cgacgtcggc tacgaggacg acggcgaggt tcggtcgatc 840

atcgatcgcg cttcctgtgc ggagatgtcc gtcccctacg gcgatcagaa catcaacgac 900

cggttcaaga acgcgatgga cgtcggggag tacaacatcg gtcggctggc gaaatcgctg 960

accaacggct gtgactgcct cggtcacatg cactactggg acgccgtgat gaacacagcc 1020

gccggcgagc cgaacgtgct cgagaacgcc atctgcctcc acgaggagga caacgggacg 1080

ctgtgggagc gtagcgactg gcgcaccgag accgacgagg tgcggaggcg ccgccgactg 1140

gtcgtctcgt tcgtcgccgc ggtggggaat tacgactaca tcttcaactg gtacttctac 1200

caggacgcct ccatggaggt cgaggtccgg ctgacgggta tcgacagcgt ctccgccgtc 1260

ggaccggacg aagatccgga cgggtacggc gagttgctcg ccccgcagct caacggcccg 1320

atccaccagc acttctttaa cttccggctc gacatgaacg tcgacgacgg gccgaacagc 1380

ctctaccgcg tccagaacga gcaggtgccg atcggtcccg gtgggctcga cccgatgggc 1440

gaggccgacg agcgaacggc caaccccggc ggccaggcgt tctacgccaa gcgagagcag 1500

ctctcgagcg agtcggcggc caaggacctc atcgacccgc tgaagggccg ctactggcag 1560

gtgattaacc cggccgaaga aaactacctc ggtaaaccga cggggtacaa gctcgttccc 1620

ggcgggaacg tcgaggccgc aatgcagccc gaatcgagcg tgatgaaacg ctccgggttc 1680

atccagtacc acctctgggc gacccccttc cgcgaggacg agcgcttccc cgccggcacc 1740

taccccaacc agcaccccgg cggtgcgggc ctgcccgcgt ggaccgaggc cgaccggaac 1800

ctcgaggaag aagacctcgt gctctggtac accctgggcg tgaaccacgt cacccgcccg 1860

gaagactggc cgatcctctc cgtgcaggtg tacagcttca cactccagcc cgtgaacttc 1920

ttcgacggga gcccggcgat ggacgtgccg ccacagcacg ccatcgaagg tcaggacgtc 1980

cccggccacg gcgaccactg cgcgaccgac gccggcgcgg acgccgacga cgactga 2037

<210> 2

<211> 678

<212> PRT

<213> 嗜盐古菌 WLHSJ27-1(Halovivax sp)

<400> 2

Met Ala Glu Ser His Thr Arg Ala Ile Asp His Pro Leu Asp Pro Leu

1 5 10 15

Thr Pro Asp Glu Ile Glu Ala Ala Tyr Glu Val Leu Thr Asp Glu Arg

20 25 30

Asp Val Gly Glu Ala Ser Leu Cys Ile Lys Ile Glu Leu Ala Glu Pro

35 40 45

Glu Lys Glu Ala Leu Arg Ala Tyr Asp Asp Gly Gly Glu Arg Pro Asp

50 55 60

Arg Arg Ala Leu Leu Val Ile Arg Asn Ser Ser Asp Gly Lys Thr Leu

65 70 75 80

Glu Ala Val Val Ser Leu Glu Glu Ala Ser Val Val Ser Thr Glu Glu

85 90 95

Val Asn Gly Gln Pro Ser Ile Ala Ile Glu Glu Phe Ile Ala Cys Glu

100 105 110

Glu Thr Val Lys Arg Asn Glu Glu Trp Gln Ala Ala Leu His Asp Arg

115 120 125

Gly Ile Glu Asn Thr Asp Arg Ala Met Val Asp Pro Trp Ser Val Gly

130 135 140

His Glu Phe Val Pro Glu Asp Val Asp Arg Ser Arg Arg Leu Ala His

145 150 155 160

Gly Leu Thr Phe Val Arg Pro Ser Glu Asp Asp Gly Asp Glu Gly Tyr

165 170 175

Ala His Pro Val Ser Gly Leu His Thr Phe Val Asp Leu Asp Arg Met

180 185 190

Glu Val Val Lys Val Val Asp Tyr Gly Pro Pro Asp Glu Asp Ser Pro

195 200 205

Ile Pro Pro Glu Glu Met Ala Tyr Arg Glu Gly Asp Val Glu Leu Arg

210 215 220

Asp Asp Leu Thr Ala Tyr Asn Val Asp Gln Pro Asp Gly Pro Ser Trp

225 230 235 240

Ser Val Asp Gly His Lys Leu Glu Trp Gln Asn Trp His Met Arg Val

245 250 255

Gly Trp Thr Gln Arg Glu Gly Leu Val Leu Tyr Asp Val Gly Tyr Glu

260 265 270

Asp Asp Gly Glu Val Arg Ser Ile Ile Asp Arg Ala Ser Cys Ala Glu

275 280 285

Met Ser Val Pro Tyr Gly Asp Gln Asn Ile Asn Asp Arg Phe Lys Asn

290 295 300

Ala Met Asp Val Gly Glu Tyr Asn Ile Gly Arg Leu Ala Lys Ser Leu

305 310 315 320

Thr Asn Gly Cys Asp Cys Leu Gly His Met His Tyr Trp Asp Ala Val

325 330 335

Met Asn Thr Ala Ala Gly Glu Pro Asn Val Leu Glu Asn Ala Ile Cys

340 345 350

Leu His Glu Glu Asp Asn Gly Thr Leu Trp Glu Arg Ser Asp Trp Arg

355 360 365

Thr Glu Thr Asp Glu Val Arg Arg Arg Arg Arg Leu Val Val Ser Phe

370 375 380

Val Ala Ala Val Gly Asn Tyr Asp Tyr Ile Phe Asn Trp Tyr Phe Tyr

385 390 395 400

Gln Asp Ala Ser Met Glu Val Glu Val Arg Leu Thr Gly Ile Asp Ser

405 410 415

Val Ser Ala Val Gly Pro Asp Glu Asp Pro Asp Gly Tyr Gly Glu Leu

420 425 430

Leu Ala Pro Gln Leu Asn Gly Pro Ile His Gln His Phe Phe Asn Phe

435 440 445

Arg Leu Asp Met Asn Val Asp Asp Gly Pro Asn Ser Leu Tyr Arg Val

450 455 460

Gln Asn Glu Gln Val Pro Ile Gly Pro Gly Gly Leu Asp Pro Met Gly

465 470 475 480

Glu Ala Asp Glu Arg Thr Ala Asn Pro Gly Gly Gln Ala Phe Tyr Ala

485 490 495

Lys Arg Glu Gln Leu Ser Ser Glu Ser Ala Ala Lys Asp Leu Ile Asp

500 505 510

Pro Leu Lys Gly Arg Tyr Trp Gln Val Ile Asn Pro Ala Glu Glu Asn

515 520 525

Tyr Leu Gly Lys Pro Thr Gly Tyr Lys Leu Val Pro Gly Gly Asn Val

530 535 540

Glu Ala Ala Met Gln Pro Glu Ser Ser Val Met Lys Arg Ser Gly Phe

545 550 555 560

Ile Gln Tyr His Leu Trp Ala Thr Pro Phe Arg Glu Asp Glu Arg Phe

565 570 575

Pro Ala Gly Thr Tyr Pro Asn Gln His Pro Gly Gly Ala Gly Leu Pro

580 585 590

Ala Trp Thr Glu Ala Asp Arg Asn Leu Glu Glu Glu Asp Leu Val Leu

595 600 605

Trp Tyr Thr Leu Gly Val Asn His Val Thr Arg Pro Glu Asp Trp Pro

610 615 620

Ile Leu Ser Val Gln Val Tyr Ser Phe Thr Leu Gln Pro Val Asn Phe

625 630 635 640

Phe Asp Gly Ser Pro Ala Met Asp Val Pro Pro Gln His Ala Ile Glu

645 650 655

Gly Gln Asp Val Pro Gly His Gly Asp His Cys Ala Thr Asp Ala Gly

660 665 670

Ala Asp Ala Asp Asp Asp

675

Claims

1.一种重组嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）构建pTA04-hod _Hvv重组表达质粒：

首先基于嗜盐古菌Halovivax sp. WLHSJ27-1的基因组获得一个组胺氧化酶基因hod _Hvv；根据目的基因设计含有酶切位点的引物，利用常规PCR技术扩增目的片段hod _Hvv；并通过分子克隆技术将hod _Hvv连接到pTA04载体上构建重组质粒；

所述嗜盐古菌Halovivaxsp. WLHSJ27-1保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为CGMCC 22177，保藏日期为2021年4月12日；

所述hod _Hvv核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，基因大小为2037 bp；所述酶切位点选择限制性内切酶EcoRΙ和BamHI的酶切位点；

（2）重组质粒转化Haloferax volcanii：

将步骤（1）得到的重组质粒转化嗜盐古菌宿主，得到转化后的重组宿主细胞；所述嗜盐古菌宿主为Haloferax volcanii；转化后的重组宿主细胞在Hv-YPC液体培养基中摇瓶培养，细胞培养至稳定期后，低温离心收集菌体，备用；

（3）Hod_Hvv纯化：

收集步骤（2）的菌体于细胞裂解液中进行重悬，重悬后超声破碎细胞，离心收集上清液，用于重组蛋白纯化；首先采用镍柱亲和层析纯化上清液，获得含咪唑的酶液；再利用凝胶过滤去除酶液中的咪唑，获得高纯度组胺氧化酶，记为Hod_Hvv。

2.根据权利要求1所述的一种重组嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述Haloferax volcanii购自日本微生物保藏中心，菌株保藏号JCM 8879。

3.根据权利要求1所述的一种重组嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述Hv-YPC培养基成分如下，以每升计算：酵母提取物5.0 g，大豆蛋白胨1.0 g，酸水解酪素1.0 g，KCl 4.2 g，MgSO₄·7H₂O 33.0 g，MgCl₂·6H₂O 30.0 g，NaCl 144.0 g，1 M、pH 8.0 Tris-HCl 12.0 mL，CaCl₂ 0.33 g，上述组分用蒸馏水定容至1 L，调节pH至7.5，115 ℃灭菌 30 min。

4.根据权利要求1所述的一种重组嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述摇瓶培养的温度为37 ℃，转速为180 rpm；所述低温为0~4 ℃。

5.根据权利要求1所述的一种重组嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述获得含咪唑的酶液的具体操作为：使用10倍柱床体积细胞裂解液平衡镍柱，随后使用上清液与镍柱结合3遍；使用15倍柱床体积缓冲液Ⅰ洗脱杂蛋白，使用5倍柱床体积缓冲液Ⅱ洗脱目的蛋白，得到含咪唑的酶液。

6.根据权利要求5所述的一种重组嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法，其特征在于，所述细胞裂解液成分为2 M NaCl，20 mM Tris-HCl，pH 8.0；所述缓冲液I成分为2 M NaCl，20mM Tris-HCl，40 mM 咪唑，pH 8.0；所述缓冲液II成分为2 M NaCl，20 mM Tris-HCl，250mM咪唑，pH 8.0。

7.根据权利要求1所述的一种重组嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述凝胶过滤层析所用的流动相为细胞裂解液；所述细胞裂解液成分为2 M NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0。

8.根据权利要求1~7任意一项所述的方法制备的重组嗜盐古菌组胺氧化酶用于鱼露、虾酱、腌制食品中降解组胺的用途。