CN113663132B - 脂肪组织再生水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种脂肪组织再生水凝胶，包括透明质酸钠、聚乙二醇和细胞外基质，其中，所述细胞外基质由脂肪干细胞在体外通过重组细胞因子诱导而成，包括60‑70wt％的胶原蛋白、25‑35wt％的糖蛋白以及1‑3wt％的粘多糖。本发明提供的脂肪组织再生水凝胶物理性质稳定，组织相容性好，植入时只需注射即可，无需外科手术便能够与受区组织融为一体。

Description

脂肪组织再生水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及再生工程技术领域，尤其涉及一种基于脂肪干细胞细胞外基质的脂肪组织再生水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
自体脂肪移植是指吸出自身一些部位(如腰、腹、大腿等)的多余脂肪，经离心、提纯、净化处理后，选择完整的脂肪细胞颗粒，并提高这些脂肪细胞的成活率，采用精细联合化注射技术，多层次多点地对其他部位(如太阳穴、苹果肌、面颊等面部)进行填充，以达到除皱和塑形的效果，是面部轮廓和容积填充恢复的重要手段，也是纠正面部不对称畸形的重要方法。
自体脂肪移植作为患者自身的组织，其生物学特性远远优于任何假体材料，因此对患者来说无毒无害，不会产生免疫反应和排异反应。然而该技术对操作要求较高，且脂肪移植的成活率较低，脂肪组织供区还会存在手术并发症等问题，例如，目前已知的做法有将定向分化药物结合三维培养体系诱导干细胞定向分化的研究，即将药物加入培养液中，药物通过扩散进入三维培养体系内促进三维培养体系中干细胞的分化，但是这种做法需要不断的更换培养液以维持药物的浓度，操作繁琐，不适合体内干细胞的定向分化研究与应用。也有研究将药物混合在三维培养体系内，利用水凝胶体系的缓释效应促进三维培养体系中干细胞的分化，但药物尤其是大分子类药物释放较快，药物容易释放至三维培养体系外的介质中消除，往往三维培养体系内有效药物浓度只能维持2-3天，不适合体内干细胞的长期定向分化。
因此，上述做法中无论是基于含有药物培养液还是水凝胶来促进三维培养体系中干细胞的分化，均存在干细胞的移植成活率低，不利于保存、贮藏和销售，稳定性差的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中所述的缺陷，从而提供一种脂肪组织再生水凝胶，该脂肪组织再生水凝胶物理性质稳定，组织相容性好，植入时只需注射即可，无需外科手术便能够与受区组织融为一体。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种脂肪组织再生水凝胶，包括透明质酸钠、聚乙二醇和细胞外基质，其中，所述细胞外基质由脂肪干细胞在体外通过重组细胞因子诱导而成，包括60-70wt％的胶原蛋白、25-35wt％的糖蛋白以及1-3wt％的粘多糖。
重组细胞因子是利用基因工程技术生产的细胞因子产品，细胞因子是由免疫细胞及相关细胞产生的一类调节细胞功能的高活性、多功能的多肽分子，不包括免疫球蛋白、补体和一般生理性的细胞产物，其通常由淋巴细胞、单核巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞等相关细胞产生。
细胞外基质是机体发育过程中由细胞分泌到细胞外间隙的各种生物大分子，组装构成的结构精细的网络，分布于细胞和组织之间，细胞周围或形成上皮细胞的基膜，将细胞与细胞或细胞与基膜相互联系，构成组织与器官，使其连成有机整体。
作为一种可实施的方式，所述重组细胞因子中包括以下体积百分比浓度的组分：
Figure BDA0003171485470000021
卡拉胶30-100ug/mL和/或硫酸葡聚糖0.03-0.1mg/mL；且，
所述重组细胞因子中还包括0.5-1.5v％的胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂。
作为一种可实施的方式，所述细胞外基质、透明质酸钠和聚乙二醇的质量比为2-20：5-30：2-20。
作为一种可实施的方式，所述透明质酸钠的分子量为50-150KD，所述聚乙二醇的分子量为1-10KD。
作为一种可实施的方式，所述脂肪组织再生水凝胶还包含药学上可接受的载体；
优选地，所述脂肪组织再生水凝胶的剂型优选地选自冻干粉针或注射剂。
将所述脂肪组织再生水凝胶应用时，可以将所述脂肪组织再生水凝胶任选地通过肌肉注射、皮下注射等途径进行给药。
一种脂肪组织再生水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、向脂肪干细胞中加入重组细胞因子，在体外诱导出胶原蛋白含量为60-70wt％、糖蛋白含量为25-35wt％以及粘多糖含量为1-3wt％的细胞外基质；
S2、将所述细胞外基质进行冻干，并加入透明质酸钠和聚乙二醇混合，得混合物；
S3、将所述混合物进行水溶解，然后加入4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐进行活化反应，即可得到所述脂肪组织再生水凝胶。
作为一种可实施的方式，每毫升所述重组细胞因子含有0-10ng的表皮细胞生长因子、2-30ng的PDGF-BB、10-60ng的***-1、1-100ng的转化生长因子β1、1-30ng的***、30-100ug的卡拉胶和/或0.03-0.1mg的硫酸葡聚糖、以及0.005-0.015mL的胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂。
作为一种可实施的方式，所述活化反应的温度为25-37℃，时间为3-6h。
本发明的另一目的在于提供所述脂肪组织再生水凝胶在皮肤除皱和容积填充中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本申请采用脂肪干细胞体外组织工程方法，经过重组细胞因子诱导形成成分组成比例与脂肪组织类似的天然组织材料细胞外基质，再将形成的细胞外基质与天然高分子材料透明质酸钠等结合，交联形成人工合成的高分子材料，即高分子水凝胶，该高分子水凝胶便于运输和储藏，性能稳定，组织相容性好，可以合成不同硬度和弹性的水凝胶材料，用于面部轮廓和容积填充恢复中脂肪组织的再生。
附图说明
图1为本发明实施例3所提供的细胞外基质中胶原蛋白、粘多糖和糖蛋白的质量含量百分比；
图2为实施例3所得细胞外基质脱细胞后在扫描电子显微镜下放大2500倍的视图；
图3为实施例3所得细胞外基质脱细胞后在扫描电子显微镜下放大20000倍的视图；
图4为实施例4所得脂肪组织再生水凝胶冻干后在扫描电子显微镜下放大129倍的视图；
图5为实施例4所得脂肪组织再生水凝胶冻干后在扫描电子显微镜下放大230倍的视图；
图6为实施例4所得脂肪组织再生水凝胶冻干后在扫描电子显微镜下放大610倍的视图；
图7为实施例4所得脂肪组织再生水凝胶冻干后在扫描电子显微镜下放大3100倍的视图；
图8为实施例5合成的脂肪组织再生水凝胶的储能模量和损耗模量；
图9为实施例6合成的脂肪组织再生水凝胶的储能模量和损耗模量；
图10为实施例7合成的脂肪组织再生水凝胶的储能模量和损耗模量；
图11为实施例8合成的脂肪组织再生水凝胶的储能模量和损耗模量；
图12为将实施例7所合成的脂肪组织再生水凝胶植入C57BL/6J小鼠皮下三天后的组织学表现；
图13为将实施例7所合成的脂肪组织再生水凝胶植入C57BL/6J小鼠皮下七天后的组织学表现；
图14为将实施例7所合成的脂肪组织再生水凝胶植入C57BL/6J小鼠皮下十四天后的组织学表现；
图15为将实施例7所合成的脂肪组织再生水凝胶植入C57BL/6J小鼠皮下二十八天后的组织学表现；
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中的表皮细胞生长因子(EGF，Epidermal Growth Factor)，又名人寡肽-1，是人体内分泌的一种重要细胞生长因子，由53个氨基组成的活性多肽，有很强的生理活性。EGF是一种单链多肽，可提高冷冻保存后人的ADSC s的增殖及成脂分化能力，它的主要功能是促进皮肤细胞的***。研究表明：极微量的EGF能强烈刺激细胞生长，抑制衰老基因表达，阻止皮肤衰老，使皮肤各组成份保持最佳生理状态。此外，它还能刺激细胞外的一些大分子(如透明质酸和胶原蛋白等)的合成与分泌，滋润皮肤，是决定皮肤活力和健康的关键因素。
PDGF-BB是血小板衍生生长因子B亚基，血小板衍生因子(PDGF)可分为分子量为31KD含有7％糖的PDGFI及28KD含4％糖的PDGFⅡ。两者均由两条高度同源的A链及B链组成，这使PDGF具有三种形式的二聚体结构，即PDGF-AA，PDGF-BB及PDGF-AB。体内单核/巨噬细胞是主要合成PDGF的细胞。
***(insulin-like growth factors，简称IGFs)，是一类多功能细胞增殖调控因子，在细胞的分化、增殖、个体的生长发育中具有重要的促进作用。现已发现的包括IGF-1和IGF-2两种。IGF-1是一个有70个氨基酸的单链碱性蛋白，分子量7649Da，耐热，也被称为生长调节素Csomatomedin C，是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质。IGF-1也曾经被称为“酸硫化因子”，其作用为“不受抑制的胰岛样活力”(nonsuppressible insulin-like activity，NSILA)，IGF-1在婴儿的生长和在成人体内持续进行合成代谢作用上具有重要意义。
转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长，分化、细胞凋亡及免疫调节等功能。转化生长因子-β包括三个亚型，转化生长因子-β1，转化生长因子-β2和转化生长因子-β3。人TGF-β1广泛参与体内各种病理生理过程，与炎症、创伤、器官纤维化等多种疾病的发生、发展关系密切。
***(Dexamethasone，简称DXMS)，别名德沙美松、可的松、甲氟烯索等，化学式为C22H29FO5。***是一种人工合成的皮质类固醇，可用于治疗多种症状，包含风湿性疾病，某些皮肤病、严重过敏、哮喘、慢性阻塞性肺病、义膜性喉炎、脑水肿，也可能与抗生素合并用于结核病患者。在本申请中采用所述体积百分比浓度的***可以诱导脂肪干细胞的成脂分化。
胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂(简称ITS)，用于细胞培养，可降低多种细胞常规维持和低密度贴壁所需的胎牛血清(FBS)浓度。
卡拉胶(Carrageen，CAS 9000-07-1)，又称鹿角菜胶、角叉菜胶、爱尔兰苔菜胶，是一种从海洋红藻(包括角叉菜属、麒麟菜属、杉藻属及沙菜属等)中提取的多糖的统称，是多种物质的混合物，卡拉胶由硫酸基化的或非硫酸基化的半乳糖和3，6-脱水半乳糖通过α-1，3糖苷键和β-1，4键交替连接而成，在1，3连接的D半乳糖单位C4上带有1个硫酸基。分子量为20万以上。卡拉胶是一种很好的凝固剂，可取代通常的琼脂、明胶及果胶等。
硫酸葡聚糖(Dextran Sulfate Sodium)，别名为硫酸葡聚糖钠盐、葡聚糖硫酸酯钠盐、葡聚糖、糖酐酯、右旋糖酐硫酸酯钠；右旋硫酸葡聚糖、糖酐酯钠、右旋糖酐硫酸酯。硫酸葡聚糖能加快VLDL和TG的代谢，还能竞争地抑制氧化LDL与巨噬细胞受体结合，阻止泡沫细胞形成和动脉粥样硬化病变的发展。
透明质酸钠(SODIUM HYALURONATE)，又称玻璃酸钠、玻尿酸钠、糖醛酸钠、玻璃(糖醛)酸、爱维、爱丽等。为白色或类白色颗粒或粉末，无臭味，干燥时，氮含量为2.8％-4.0％，葡糖醛酸含量为37.0％-51.0％。广泛存在于动物和人体的生理活性物质，在人皮肤、关节滑膜液、脐带、房水及眼玻璃体中均有分布。分子量为500000～730000道尔顿，其溶液具有高黏弹性及仿形性，透明质酸钠本身是人体皮肤的构成之一，是人体内分布最广的一种酸性黏糖，存在于***的基质中，具有良好的保湿作用。
聚乙二醇的通用化学名为聚乙二醇PEG、乙二醇聚氧乙烯醚，又名α-氢-ω-羟基(氧-1，2-乙二基)的聚合物、聚氧化乙烯(PEO-LS)。无毒、无刺激性，味微苦，具有良好的水溶性，并与许多有机物组份有良好的相溶性。它们具有优良的润滑性、保湿性、分散性、粘接剂、抗静电剂及柔软剂等。
MTMM是一种试剂，分子量为276.72，纯度≥98％(HPLC)。中文名称：4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)，在溶液或者固相肽合成中活化羧酸的试剂，性能优于或者相当于目前最流行的偶联试剂。
本申请中“包含”或“包括”旨在表示组合物(例如介质)和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质上影响要求保护的本发明的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由……组成”是指排除其他组成部分的微量元素和实质性的方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本发明的范围内。
实施例1脂肪干细胞细胞外基质的合成
将0.1ng/mL的EGF、2ng/mL的PDGF-bb、160ng/mL的IGF-1、1ng/mL的TGF-β1、1ng/mL的***、100ug/mL的卡拉胶混合得第一混合物，向所述第一混合物中加入ITS形成重组细胞因子，其中ITS的添加量为重组细胞因子的0.5v％；
在体外通过该重组细胞因子对脂肪干细胞进行诱导形成细胞外基质蛋白。
实施例2
与实施例1不同的是，本实施例中重组细胞因子包括10ng/mL的EGF、30ng/mL的PDGF-bb、160ng/mL的IGF-1、100ng/mL的TGF-β1、30ng/mL的***、0.03mg/mL的硫酸葡聚糖混合得第一混合物，向所述第一混合物中加入ITS形成重组细胞因子，其中ITS的添加量为重组细胞因子的1.5v％。
实施例3
与实施例1不同的是，本实施例中重组细胞因子包括8ng/mL的EGF、16ng/mL的PDGF-bb、160ng/mL的IGF-1、75ng/mL的TGF-β1、18ng/mL的***、0.03mg/mL的硫酸葡聚糖和60ug/mL的卡拉胶混合得第一混合物，向所述第一混合物中加入ITS形成重组细胞因子，其中ITS的添加量为重组细胞因子的1.3v％。
经检测，本实施例中细胞外基质各主要成分比例与天然脂肪细胞外基质成分比例近似，其中据文献(Tissue Eng Part C Methods.2009 Sep；15(3):309-21.doi:10.1089/ten.tec.2008.0309.)记载，脂肪组织中胶原蛋白(collagen)、粘多糖(sGAGs)和糖蛋白(glycoproteins)的比例如下表所示：
表1真皮和脂肪细胞外基质干重成分比例总结
Figure BDA0003171485470000081
aIndicates a statistically significant (p＜0.05)difference fromMatrigel.
而本实施例经所述诱导方案形成的细胞外基质的成分如图1所示，胶原蛋白的含量为60-70wt％，糖蛋白的含量为25-35wt％，多糖成分的含量为1-3wt％，图2和图3显示了实施例1所得细胞外基质在脱细胞后在不同倍率下的扫描电镜图，可以看到大量的成片的细胞外基质蛋白。可见，采用重组细胞因子在体外诱导生成的细胞外基质中各主要成分比例与天然脂肪细胞外基质成分比例近似，其相对于自体脂肪移植术所用到的脂肪细胞来说克服了移植成活率的问题，且便于保存、贮藏和销售。
实施例4脂肪组织再生水凝胶的合成
将由实施例3获取的细胞外基质冻干后，取2-20mg/ml的细胞外基质，与50-150KD分子量的透明质酸钠5-30mg/ml，1KD分子量的聚乙二醇2-20mg/ml混合，对该混合物进行水溶解，然后在DMTMM活化下，25-37℃反应3-6小时，形成脂肪组织再生水凝胶。
由本实施例所获得的脂肪组织再生水凝胶的形态如图4所示，图5-图7示出了脂肪组织再生水凝胶经在扫描电电子显微镜下放大不同倍率后的视图，从各视图可以看出冻干后的脂肪组织再生水凝胶呈多孔状态。
实施例5
与实施例4不同的是，本实施例中聚乙二醇的分子量为2.5KD。
实施例6
与实施例4不同的是，本实施例中聚乙二醇的分子量为5KD。
实施例7
与实施例4不同的是，本实施例中聚乙二醇的分子量为7.5KD。
实施例8
与实施例4不同的是，本实施例中聚乙二醇的分子量为10KD。
图8-11依次示出了实施例5-8所得脂肪组织再生水凝胶的硬度和弹性，由此可以看出，本申请的脂肪组织再生水凝胶经不同的合成方案可以得到具有不同模量的水凝胶材料，他们均具有三维交联网络以及较好的流动性。
实验例脂肪组织再生水凝胶的体内脂肪再生诱导功能
将由实施例7合成的脂肪组织再生水凝胶植入到C57BL/6J小鼠(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，在无特定病原微生物的环境下饲养，恒温恒湿，保持昼夜(12:12)节律)的皮下组织后，分别在术后3天、7天、14天、21天将组织标本取出，并进行H&E染色(苏木精-伊红染色法)。
结果如图12-15所示，图12中显示将实施例7所合成的脂肪组织再生水凝胶植入C57BL/6J小鼠皮下3天后的组织，图中箭头所示部分的H&E染色呈蓝紫色，表明植入了脂肪组织再生水凝胶；图13中显示植入7天后的组织，箭头所示为部分降解的水凝胶材料，标识材料开始降解；图14中箭头所示部分显示了脂肪组织再生水凝胶植入皮下后14天开始有脂肪细胞形成，并且由星形标识部分可以看到含有红细胞的血管；图15中箭头所示部分显示脂肪组织再生水凝胶植入皮下后21天形成了空泡状的脂肪细胞，星形所示部分显示有新生的血管组织。以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种脂肪组织再生水凝胶，其特征在于，包括透明质酸钠、聚乙二醇和细胞外基质；其中，所述细胞外基质由脂肪干细胞在体外通过重组细胞因子诱导而成，包括60-70wt%的胶原蛋白、25-35wt%的糖蛋白以及1-3wt%的粘多糖；
所述重组细胞因子中包括以下体积百分比浓度的组分：
表皮细胞生长因子 0.1-10ng/mL；
PDGF-BB 2-30ng/mL；
***-1 10-160ng/mL；
转化生长因子β1 1-100ng/mL；
*** 1-30ng/mL；以及，
卡拉胶30-100ug/mL和/或硫酸葡聚糖0.03-0.1mg/mL；且，
所述重组细胞因子中还包括0.5-1.5v%的胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂。
2.根据权利要求1所述的脂肪组织再生水凝胶，其特征在于，所述细胞外基质、透明质酸钠和聚乙二醇的质量比为2-20：5-30：2-20。
3.根据权利要求2所述的脂肪组织再生水凝胶，其特征在于，所述透明质酸钠的分子量为50-150KD，所述聚乙二醇的分子量为1-10KD。
4.根据权利要求1-3任一所述脂肪组织再生水凝胶，其特征在于，所述脂肪组织再生水凝胶还包含药学上可接受的载体。
5.根据权利要求1-3任一所述脂肪组织再生水凝胶，其特征在于，所述脂肪组织再生水凝胶的剂型选自注射剂。
6.根据权利要求1-3任一所述脂肪组织再生水凝胶，其特征在于，所述脂肪组织再生水凝胶的剂型选自冻干粉针。
7.一种制备如权利要求1-3中任一项所述脂肪组织再生水凝胶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、向脂肪干细胞中加入重组细胞因子，在体外诱导出胶原蛋白含量为60-70wt%、糖蛋白含量为25-35wt%以及粘多糖含量为1-3wt%的细胞外基质；
S2、将所述细胞外基质进行冻干，并加入透明质酸钠和聚乙二醇混合，得混合物；
S3、将所述混合物进行水溶解，然后加入4-（4，6-二甲氧基三嗪-2-基）-4-甲基吗啉盐酸盐进行活化反应，即可得到所述脂肪组织再生水凝胶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，每毫升所述重组细胞因子含有0.1-10ng的表皮细胞生长因子、2-30ng的PDGF-BB、10-160ng的***-1、1-100ng的转化生长因子β1、1-30ng的***、30-100ug的卡拉胶和/或0.03-0.1mg的硫酸葡聚糖、以及0.005-0.015mL的胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述活化反应的温度为25-37℃，时间为3-6h。
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