CN113662958A - 灵孢多糖在制备治疗中枢神经***损伤药物中的应用及其制备方法 - Google Patents

灵孢多糖在制备治疗中枢神经***损伤药物中的应用及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及灵孢多糖在制备治疗中枢神经***损伤药物中的应用，同时公开了灵孢多糖的制备方法。具体制备方法如下：以赤芝孢子为原料，经脱脂、水提、去蛋白、醇沉、干燥后得到灵孢多糖。通过细胞增殖实验检测发现，灵孢多糖可促进神经元细胞增殖，减轻甲基***引起的神经元损伤；能改善甲基***引起的小鼠神经行为障碍以及学习记忆障碍，减少神经元丢失，并增加神经生长因子(BDNF)的表达。因此灵孢多糖对神经元损伤具有很好的保护作用，可用于中枢神经***损伤的治疗。这种灵孢多糖在制备治疗中枢神经***损伤药物中的应用，拓宽了灵孢多糖的应用领域，同时为中枢神经***损伤的治疗提供了一种新的治疗方案。

Description

灵孢多糖在制备治疗中枢神经***损伤药物中的应用及其制 备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及灵孢多糖在制备治疗中枢神经***损伤药物中的应用，本发明还涉及灵孢多糖提取物的制备方法。
背景技术
神经细胞是神经***最重要的一类细胞又称为神经元，它是构成神经***结构和功能的基本单位，它的主要功能就是接受刺激和传递信息。神经细胞是由细胞体和细胞突起构成，可以传到兴奋的一种内分泌细胞。神经细胞是人体必不可少的组成细胞。其中感觉神经元可以接受体内外的刺激，把神经冲动传导到中枢神经。运动神经元通过神经元的胞体传到神经末梢，使肌肉收缩和腺体分泌。而联络神经元则是接受其他神经元传来的神经冲动，起着联络作用。人类多种中枢神经***疾病的病理改变都包括神经元的损伤、丢失、坏死和凋亡。通过减少神经元损伤和丢失、抑制神经元凋亡来保护神经元，是治疗中枢神经***损伤疾病的一个重要方向。
近年来,毒品造成的神经元损伤逐渐引起研究者的关注。长期吸食“合成毒品”如甲基***(MA)等会导致滥用者思维联想松散,逻辑性差,并出现偏执观念或妄想,同时伴有严重的焦虑、抑郁情绪,滥用者往往容易在幻觉安想和抑郁情绪的支配下出现***或杀人等暴力行为。毒品滥用能诱导小鼠多部位的神经元固缩、水样变性、凋亡、坏死等多种超微结构病理改变,诱导脑神经元轴突、树突及突触均有不同程度的水样变性、退行性变性、髓鞘板层分离、断裂等改变。以上研究均证明滥用毒品可以引起中枢神经***的神经元发生病理性损伤,进而影响中枢神经***功能。因此寻找对神经元损伤具保护作用的物质已成为研究的热点。
多糖是生物体内普遍存在的一类大分子物质，广泛参与细胞的各种生理活动的调节。研究表明多糖具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、免疫调节的药理作用，也有文献报道多糖对中枢神经损伤的保护作用，例如山药多糖对缺氧/复氧性神经细胞具有保护作用，可以抑制细胞凋亡，巴戟甲多糖对β淀粉样蛋白致神经元细胞损伤模型有保护作用，可通过激活脑能量代谢、改善胆碱能***损伤防治老年痴呆症。大量研究表明多糖能在多条途径，多个层面对中枢神经损伤起到保护作用。
灵芝孢子是灵芝的生殖细胞，其含丰富的蛋白质、多糖、氨基酸类、糖肽类、维生素类、胡萝卜素、甾醇类、三萜类、生物碱类、脂肪酸类等多种活性成分，其中的多糖是主要有效成分之一，现代研究表明灵孢多糖具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等生物活性，但是在神经保护领域的研究和应用关注不足。因此，进一步开展灵孢多糖在神经***保护方面的研究不仅有利于拓宽其本身的应用范围，还可以为神经***损伤修复提供新的活性物质，并且能够推动灵孢多糖在医学领域的应用。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的提供灵孢多糖在制备治疗中枢神经***损伤药物中的应用，本发明另一目的是提供一种灵孢多糖的制备方法。
申请人以甲基***诱导的脑损伤为例，研究灵孢多糖对中枢神经***损伤的保护作用，结果如下：
(1)通过细胞增殖实验，检测发现灵孢多糖可以促进细胞增殖，可减轻甲基***引起的神经元损伤。
(2)神经行为学评分发现，甲基***组小鼠有明显的神经行为学障碍，Morris水迷宫检测模型组小鼠学习记忆能力受损，组织学观察模型组小鼠皮层组织结构异常，神经生长因子(BDNF)的表达下降，灵孢多糖治疗后能改善甲基***引起的神经行为学障碍和学习记忆障碍，减少神经元丢失，并增加BDNF的表达。
申请人还发现，灵孢多糖治疗中枢神经***损伤的效果与多糖的制备方法和分子量大小有一定关系，按以下方法制备的灵孢多糖活性最强，该方法的步骤如下：
(1)将灵芝孢子破壁，用非极性有机溶剂脱脂，然后烘干；
(2)将烘干后的灵芝孢子破壁粉中按重量加入30～40倍纯化水，加热至80～90℃煎煮2-3h，离心过滤，将上清液浓缩成流浸膏。向流浸膏中加入80～120U/ml蛋白酶，常温下搅拌1～2h，灭酶，离心过滤后取上清液。
(3)将上清液浓缩成流浸膏后加入药用乙醇，使乙醇占总体积的80～90％，醇沉后将沉淀干燥，得粗多糖；
(4)将粗多糖用水溶解，用截留分子量为5KD、100KD、300KD的切向流超滤膜包过滤，分别收集分子量为≤5KD、5KD～100KD和100KD～300KD三个组分，真空干燥后得灵孢多糖成品。
优选地，所述灵芝孢子为赤芝孢子。
优选地，步骤1)中所述的非极性有机溶剂为四氯甲烷、石油醚。
优选地，步骤2)中，向流浸中加入100U/ml蛋白酶。
优选地，步骤3中，使乙醇占总体积的85％。
试验证明，在获得三个多糖提取物组分中，多糖MAP2组分(即分子量范围为5KD～100KD)活性最强。
本发明公开的疗效确切，由于是天然产物，因此副作用少，安全可靠；所提供的制备方法收率高，活性成分含量高。本发明公开的灵孢多糖(5KD～100KD)对神经元损伤具有很好的保护作用，可用于中枢神经***损伤的治疗。这种灵孢多糖在制备治疗中枢神经***损伤药物中的应用，拓宽了灵孢多糖的应用领域，同时为中枢神经***损伤的治疗提供了一种新的治疗方案。
说明书附图
图1为实施例1中的MAP1组分对PC-12细胞增殖的影响；
图2为实施例1中的MAP2组分对PC-12细胞增殖的影响；
图3为实施例1中的MAP3组分对PC-12细胞增殖的影响；
图4是灵孢多糖对对甲基***染毒大鼠海马BDNF表达的影响。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步详述，需要说明的是，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制其范围。
实施例1
灵孢多糖的制备，其步骤如下：
(1)将灵芝孢子破壁，用1.5倍四氯化碳脱脂，过滤收集滤饼，然后真空干燥；
(2)将干燥后的灵芝孢子破壁粉中按重量加入40倍纯化水，加热至85℃煎煮3h，离心过滤，将上清液浓缩成流浸膏。向流浸膏中加入100U/ml蛋白酶，常温下搅拌1h，加热灭酶，降温到常温后离心过滤并收集上清液。
(3)将上清液浓缩成流浸膏后加入药用乙醇，使乙醇占总体积的85％，醇沉12h后过滤，收集滤饼将沉淀干燥，得粗多糖；
(4)将粗多糖用水溶解，用截留分子量为5KD、100KD、300KD的切向流超滤膜包过滤，分别收集分子量为≤5KD、5KD～100KD和100KD～300KD三个组分，真空干燥后得灵孢多糖成品。
经计算：三组分的多糖收率(各组分占药材总糖含量的比例)：MAP1、MAP 2、MAP 3的收率分别为20.5％、38.6％、9.9％。
实施例2
灵孢多糖的制备，其步骤如下：
(1)将灵芝孢子破壁，用2倍石油醚脱脂，过滤收集滤饼，然后真空干燥；
(2)将干燥后的灵芝孢子破壁粉中按重量加入30倍纯化水，加热至80℃煎煮2h，离心过滤，将上清液浓缩成流浸膏。向流浸膏中加入90U/ml蛋白酶，常温下搅拌1h，加热灭酶，降温到常温后离心过滤并收集上清液。
(3)将上清液浓缩成流浸膏后加入药用乙醇，使乙醇占总体积的90％，醇沉12h后过滤，收集滤饼将沉淀干燥，得粗多糖；
(4)将粗多糖用水溶解，用截留分子量为5KD、100KD、300KD的切向流超滤膜包过滤，分别收集分子量为≤5KD、5KD～100KD和100KD～300KD三个组分，真空干燥后得灵孢多糖成品。
经计算：三组分的多糖收率(各组分占药材总糖含量的比例)：MAP1、MAP 2、MAP 3的收率分别为16.2％、31.5％、5.2％。
实施例3
灵孢多糖的制备，其步骤如下：
(1)将灵芝孢子破壁，用2倍石油醚脱脂，过滤收集滤饼，然后真空干燥；
(2)将干燥后的灵芝孢子破壁粉中按重量加入40倍纯化水，加热至90℃煎煮2h，离心过滤，将上清液浓缩成流浸膏。向流浸膏中加入80U/ml蛋白酶，常温下搅拌1h，加热灭酶，降温到常温后离心过滤并收集上清液。
(3)将上清液浓缩成流浸膏后加入药用乙醇，使乙醇占总体积的80％，醇沉12h后过滤，收集滤饼将沉淀干燥，得粗多糖；
(4)将粗多糖用水溶解，用截留分子量为5KD、100KD、300KD的切向流超滤膜包过滤，分别收集分子量为≤5KD、5KD～100KD和100KD～300KD三个组分，真空干燥后得灵孢多糖成品。
经计算：三组分的多糖收率(各组分占药材总糖含量的比例)：MAP1、MAP 2、MAP 3的收率分别为17.8％、35.5％、6.6％。
试验例
下面通过细胞和动物实验来验证灵孢多糖的功能，试验对象是实施例1获得多糖提取物，也可采用相同的方法对实施例1和2获得的多糖提取物进行验证并取得相似的效果。
试验例1
灵孢多糖对PC-12细胞增殖的影响
实验方法：
大鼠嗜铬神经细胞瘤PC-12细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，用完全培养基(含10％FBS和100U青链霉素溶液的RPMI-1640培养基)于37℃、5％CO2饱和湿度培养。
取对数生长期的PC-12细胞，0.25％胰蛋白酶消化，用完全培养基吹打，制备成单个细胞悬液，将细胞浓度调整为1×105个/ml，接种于96孔板中，100μl/孔，置于5％CO2、37℃培养箱中培养24h。根据实验需求分为10组，分别给与0，1.56，3.12，6.25，12.5，25，50，100，200和400μg/ml的实施例1中的灵孢多糖MAP1处理，每个浓度设置6个复孔，37℃继续培养24h，同时设立空白孔。处理结束后吸弃上清，用无菌PBS洗涤3次，每孔加入90μl完全培养基，再加入10μl的无菌MTT(终浓度5mg/ml)溶液，置于培养箱中继续培养4h。培养结束后小心吸弃上清，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡器振荡10min，使紫色结晶完全溶解，酶标仪570nm波长检测吸光度值(A)，按下面公式计算各组细胞的存活率T/C(％)：T/C(％)＝(A样品组－A空白组)/(A对照组－A空白组)×100％。
实施例1中的MAP2和MAP3的实验方法与MAP1相同。
实验结果：如图1、2、3所示，三种分子量的灵孢多糖在1.56～400μg/ml范围内均无细胞毒性，且可以促进PC-12细胞增殖，其中MAP2效果最佳，MAP2处理组细胞存活率最高达171.1±5.3％。
试验例2
灵孢多糖对甲基***(MA)所致PC-12细胞损伤的保护作用
实验方法：
取对数生长期的PC-12细胞，0.25％胰蛋白酶消化，用完全培养基吹打，制备成单个细胞悬液，将细胞浓度调整为1×105个/ml，接种于96孔板中，100μl/孔，置于5％CO2、37℃培养箱中培养24h。根据实验需求分为7组：正常对照组、3mmol/lMA损伤组、25μg/mlMAP1+MA处理组、50μg/mlMAP1+MA处理组、100μg/mlMAP1+MA处理组、200μg/mlMAP1+MA处理组和400μg/mlMAP1+MA处理组。然后按上述分组分别加入不同浓度的受试物，每个浓度设置6个复孔，37℃继续培养，同时设立空白孔。处理结束后吸弃上清，用无菌PBS洗涤3次，每孔加入90μl完全培养基，再加入10μl的无菌MTT(终浓度5mg/ml)溶液，置于培养箱中继续培4h。培养结束后小心吸弃上清，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡器振荡10min，使紫色结晶完全溶解，酶标仪570nm波长检测吸光度值(A)，计算各组细胞的存活率。
实施例1中的MAP2和MAP3的实验方法与MAP1相同。
结果：如表1-3所示，MAP1、MAP2和MAP3均可减轻MA引起的神经元损伤，MAP2效果最优。
表1 MAP1对MA损伤PC-12细胞的保护作用
Figure BDA0003240688660000061
Figure BDA0003240688660000071
表2 MAP2对MA损伤PC-12细胞的保护作用
Figure BDA0003240688660000072
注：实验组4与诱导组相比，P<0.05，实验组5与诱导组相比，P<0.01。
表3 MAP3对MA损伤PC-12细胞的保护作用
Figure BDA0003240688660000073
注：实验组4、组5与诱导组相比，P<0.05
试验例3
灵孢多糖对甲基***染毒大鼠脑损伤的保护作用
实验方法：
(1)动物分组大鼠与处理
SD雄性大鼠(体重180～220g)饲养于恒温空调SPF级动物房。12h光暗交替循环，保持自由饮水及进食。将大鼠随机分为6组大鼠，每组大鼠10只大鼠，分别为正常对照组、MA损伤组、阳性对照组、MAP2低剂量组：MA+MAP222.5μg/kg、MAP2中剂量组：MA+MAP245.0μg/kg、MAP2高剂量组：MA+MAP290.0μg/kg。
第一周，正常对照组大鼠腹腔注射生理盐水，其余各组大鼠腹腔注射1mg/kgMA，正常对照组大鼠和MA组大鼠灌胃生理盐水，MAP2低剂量组：MA+MAP222.5μg/kg、MAP2中剂量组：MA+MAP245.0μg/kg、MAP2高剂量组：MA+MAP290.0μg/kg，阳性对照组大鼠采用市售的灵孢多糖灌胃，剂量为90.0μg/kg，每天腹腔注射和灌胃各一次，持续一周。
从第二周开始，正常对照组大鼠和MA组大鼠灌胃生理盐水，MAP2低剂量组：MA+MAP222.5μg/kg、MAP2中剂量组：MA+MAP245.0μg/kg、MAP2高剂量组：MA+MAP290.0μg/kg，阳性对照组大鼠灌胃90.0μg/kg灵孢多糖，每天一次，持续三周。
(2)大鼠空间学习和记忆能力检测
实验结束后，利用Morris水迷宫对大鼠学***台固定于第二象限正中央的位置。加水至平台隐没在水平面下1cm。每只大鼠游泳轨迹通过安装在水迷宫顶部的摄像机采集输入追踪***，实时记录大鼠在水面的位置、逃逸潜伏期(搜索目标所需时间)、运动轨迹、游泳速度等运动相关信息。
(3)大鼠海马BDNF表达水平检测
实验结束后，分别取每组大鼠各4只断头取脑，迅速于冰上分离海马。将海马组织用0.4ml冰冷匀浆缓冲液
(Tris-HMA50mmol/L,PH7.4,NaMA150mmol/L,0.5％TritonX-100,edeticacid1mmol/L,phenylmethylsulfonyfluoride1mol/L,抑肽酶5mg/L)，在冰浴下制成匀浆，14,000g、4℃、离心30min。收集上清用作总蛋白。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度为8％，pH8.8，浓缩胶浓度为5％，pH6.8。电泳结束后将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转膜到硝酸纤维素膜，将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS缓冲液中4℃过夜，加入BDNF单克隆兔抗鼠抗体(1:500)室温孵育2h。TBS洗膜后，将膜用辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗室温下孵育1h，TBS洗膜后，将化学发光剂和增强剂按1:1混合后，滴加到硝酸纤维素膜上，通过化学发光成像***捕获图像。
(4)形态学检测
深度麻醉各组大鼠，透心灌注取脑(冰冷的生理盐水及4％多聚甲醛)，4％多聚甲醛4℃固定过夜，取出脑，4％多聚甲醛4℃外固定，脱水后石蜡包埋，选择前囟后3mm和4.5mm处作等距离的冠状切片，片厚5μm，HE染色后于光镜下观察。
结果：
(1)灵孢多糖对甲基***染毒大鼠空间学习和记忆能力的影响
正常对照组大鼠寻找平台的时间经过前4天的训练后，大鼠找到平台时间明显缩短，MA组大鼠寻找平台的时间明显大于正常组大鼠，MAP2各剂量组大鼠第5天的寻找平台的时间明显缩短，目标性也明显增强。学习训练结束时正常对照组大鼠潜伏期为12.25±3.3s，MA组大鼠潜伏期为32.8±3.22s，MAP2低、中、高组大鼠潜伏期分别为31.23±3.62s，22.11±3.45s，15.23±3.22s，阳性对照组大鼠潜伏期为27.05±3.89s。MAP2中、高剂量组大鼠与MA组大鼠比较潜伏期均有显著性缩短(P<0.05)，但低剂量MAP2组大鼠和阳性对照组大鼠与MAP组大鼠比较有缩短趋势，但无统计学差异(P>0.05)。
(2)灵孢多糖对甲基***染毒大鼠海马BDNF蛋白表达变化的影响
免疫印迹结果如附图4所示，显示大鼠海马组织BDNF蛋白表达量变化的情况，MA组大鼠BDNF蛋白表达量低于正常对照组大鼠，阳性对照组大鼠、MAP2低、中、高剂量组大鼠BDNF蛋白表达量均有所上调，且MAP2高剂量组大鼠与MA组大鼠相比显著性升高(P<0.05)。
(3)灵孢多糖对甲基***染毒大鼠皮层形态学变化的影响
HE染色可用于检验甲基***导致脑组织损伤的病理学改变。MA组大鼠皮层组织的形态学改变明显：神经细胞丢失、核染色变深、神经胶质增生、核固缩等。MAP2(22.5μg/kg，45.0μg/kg，90.0μg/kg)治疗后小鼠会显著减轻上述形态学改变，说明灵孢多糖对甲基***导致脑组织损伤具有保护作用。
试验例4
临床试验
根据试验例3的结果，换算成人类的用药量，分为MAP2低剂量组(3.0mg/d),MAP2中剂量组(4.5mg/d),MAP2高剂量组(6.0mg/d)。
灵孢多糖对甲基***染毒人脑损伤的保护作用试验，在某戒毒所，对200位甲基***染毒人员，进行灵孢多糖试验。将200人随机分成5组，每组40人分别为阳性对照组(奥氮平口服20mg/d),阴性对照组(注射生理盐水),MAP2低剂量组(3.0mg/d),MAP2中剂量组(4.5mg/d),MAP2高剂量组(6.0mg/d)，分别在测试前和测试后(3个月后)进行简易精神状态评价量表(MMSE)和蒙特利尔认知评估量表(MoCA)的测量，比较其得分(每组平均分)。MMSE判定标准：最高得分为30分,分数在27-30分为正常,分数<27为认知功能障碍，严重程度分级方法:轻度MMSE≥21分；中度,MMSE10-20分；重度,MMSE≤9分；
MoCA量表判断标准：MoCA量表满分30分，≥26分正常，18-26轻度认知功能障碍(MCI)，10-17中度，小于10重度。两者具体得分见表4.
表4 MMSE和MoCA量表
MMSE(治疗前) MMSE(治疗后) MoCA(治疗前) MoCA(治疗后)
MAP2低剂量组 21.5 27.5 17.6 28.2
MAP2中剂量组 21.7 28.1 17.7 28.4
MAP2高剂量组 21.4 28.6 17.3 28.8
阳性对照组 21.5 27.1 17.6 27.6
阴性对照组 21.5 22.5 17.5 23.1
根据表4结果可知，本发明所公开的灵孢多糖在有效剂量下，对改善甲基***染毒人脑损伤方面有较明显作用，效果优于阳性对照奥氮平，值得进一步研究其各种剂型和药物组合物。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。

Claims (10)

1.灵孢多糖在制备治疗中枢神经***损伤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的灵孢多糖在制备治疗中枢神经***损伤药物中的应用，其特征在于，所述中枢神经***损伤是由毒品或精神活性物质导致的脑组织损伤。
3.根据权利要求1所述的灵孢多糖在制备治疗中枢神经***损伤药物中的应用，其特征在于，所述毒品或精神活性物质为甲基***。
4.根据权利要求1所述的灵孢多糖在制备治疗中枢神经***损伤药物中的应用，其特征在于，所述灵孢多糖的分子量为≤5KD、5KD～100KD或100KD～300KD。
5.根据权利要求4所述的灵孢多糖在制备治疗中枢神经***损伤药物中的应用，其特征在于，所述灵孢多糖的分子量为5KD～100KD。
6.根据权利要求5所述的灵孢多糖在制备治疗中枢神经***损伤药物中的应用，其特征在于，所述灵孢多糖制备作用于SD大鼠的药物时的使用剂量为22.5μg/kg-90.0μg/kg。
7.根据权利要求6所述的灵孢多糖在制备治疗中枢神经***损伤药物中的应用，其特征在于，所述灵孢多糖制备作用于人类的药物时，其使用剂量根据SD大鼠的使用剂量进行换算；所述换算方法根据本领域内的一般换算方法；包括但不限于Blackwell法、Dollery法、Fibonacci法、NOAEL法。
8.根据权利要求1所述的灵孢多糖在制备治疗中枢神经***损伤药物中的应用，其特征在于，所属药物的剂型包括注射剂、颗粒剂、片剂和胶囊剂。
9.一种灵孢多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将灵芝孢子破壁，用非极性有机溶剂脱脂，然后烘干；
(2)将烘干后的灵芝孢子破壁粉中按重量加入30～40倍纯化水，加热至80～90℃煎煮2-3h，离心过滤，将上清液浓缩成流浸膏；向流浸膏中加入80～120U/ml蛋白酶，常温下搅拌1～2h，灭酶，离心过滤后取上清液；
(3)将上清液浓缩成流浸膏后加入药用乙醇，使乙醇占总体积的80～90％，醇沉后将沉淀干燥，得粗多糖；
(4)将粗多糖用水溶解，用截留分子量为5KD、100KD、300KD的切向流超滤膜包过滤，分别收集分子量为≤5KD、5KD～100KD和100KD～300KD三个组分，真空干燥后得灵孢多糖成品。
10.根据权利要求9所述的一种灵孢多糖的制备方法，其特征在于，所述灵芝孢子为赤芝孢子。
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