CN113660989A - 色谱*** - Google Patents

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Abstract

一种色谱***，其包括并联连接的至少两个色谱单元(3)，其中所述至少两个色谱单元(3)各自包含基于对流的色谱材料，其中由于在色谱过程期间提供的色谱单元性质的变化，在所述***运行期间动态补偿从不同色谱单元(3)提供的初始背压差。

Description

色谱***
发明领域
本发明涉及一种包括并联连接的至少两个色谱单元的色谱***。
背景技术
历史上，使用多孔珠粒的常规填充床色谱已经是一种非常强大的分离工具。在基于多孔珠粒的***中，靶分子/杂质与固相之间的结合事件取决于向多孔珠粒中的扩散。因此，在基于多孔珠粒的***中的停留时间与流速之间存在强相关性。因此，结合容量随停留时间的减少而降低。这种类型的色谱可以被称为基于扩散的色谱。基于扩散的色谱基质包括任何由颗粒组成的基质，并且实质上表现出传质的扩散限制，这是因为，由于物质的扩散系数(其非常严重地取决于物质的尺寸或分子量)，吸附和解吸过程的速率由物质进入和离开颗粒的扩散速率决定。
作为基于多孔珠粒的***的替代物，可以使用整料或膜。通过这种材料的流动是对流的而不是扩散的，并且因此它们的结合容量远不如基于多孔珠粒的***对流动敏感。这些材料可以以比基于多孔珠粒的材料高得多的流速运行。在(膜)吸附色谱中，与凝胶渗透色谱相比，存在流体组分如单独分子、缔合物或颗粒与接触流体的固体表面的结合。膜吸附剂优于填充色谱柱的优点是它们适合以高得多的流速运行。然而，相反地，膜吸附剂具有比例如凝胶渗透色谱柱低的动态容量。这也被称为基于对流的色谱。基于对流的色谱基质包括任何基质，其中在基质的流入和流出之间施加液压差迫使基质灌注，实现物质进入基质或离开基质的实质对流输送，这在高流速下非常迅速地实现。
基于对流的色谱和膜吸附剂描述于例如US20140296464A1、US20160288089A1、WO2018011600A1和WO2018037244A1中，其据此以引用的方式整体并入本文。
为了增加容量而并联连接色谱单元通常是有问题的，这是由于不同单元中的微小差异，其将导致通过不同单元的不均匀流量分布。据此，一些单元将不能被最佳地使用。此外，当色谱单元并联连接时，由于通过单元的不均匀流体流，常常导致色谱之后洗脱样品的峰变宽。
据此，需要为这种***提供尽可能均匀的色谱单元和/或需要其他控制布置来控制单元之间的流体流。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有并联连接的色谱单元的改进的色谱***。
本发明的另一个目的是提供一种灵活的和可扩展的色谱***。
这通过根据权利要求1所述的色谱***来实现。
根据本发明的一个方面，提供了一种色谱***，其包括并联连接的至少两个色谱单元，其中所述至少两个色谱单元各自包含基于对流的色谱材料，其中由于在色谱过程期间提供的色谱单元性质的变化，在***运行期间动态补偿从不同色谱单元提供的初始背压差。
据此，提供一种灵活的和可扩展的色谱***。可以并联连接任何数目的色谱单元。由于动态改变的Δ柱压，通过每个色谱单元的流体流在***运行期间也将动态改变，即通过并联连接的色谱单元的流动在***运行期间将依赖于从每个色谱单元提供的背压自动调节。令人惊讶的是，所述***据此将以非常有效的方式自我调节。结果将是所有色谱单元的有效和均一使用。在并联连接色谱单元的先前尝试中，情况并非如此。可以提供这些类型的色谱单元，其基于色谱而不扩散到色谱介质中，例如使用纤维素纤维膜，以允许高流速，这将允许这种有效的自我调节。据此，***中的所有单元都将被有效地使用。
在本发明的一个实施方案中，每个色谱单元包含色谱材料，所述色谱材料具有如下色谱材料体积，其尺寸设计成允许通过所述色谱单元的流体流速是至少2倍色谱材料体积/分钟，其中所述***包括进料泵，所述进料泵被配置成使流过所述色谱单元的进料流体以至少2倍色谱材料体积/分钟的流体流速流过色谱单元中的每一个。
由于通过色谱单元的这些相对高的流速，所以将从每个色谱单元提供相应高的背压。这种高背压可以有助于快速且有效地自动调节通过色谱单元的流动。
在从属权利要求和下面的详细说明中描述了另外的实施方案。
附图说明
图1是并联连接的色谱单元的示意图。
图2是显示单元的并联连接的照片。
图3是来自循环研究的色谱图的实例。
图4显示每第10次循环(1至51)即CIP后循环的UV和压力曲线的重叠。
图5显示每第10次循环(61至101)即CIP后循环的UV和压力曲线的重叠。
图6显示对于所有循环1-101 (每第10次循环用1.0 M NaOH进行CIP)在装载、洗脱和再平衡期间的Δ柱压和相对洗脱峰面积(A300 nm)。
图7显示来自单次循环、来自2次循环的洗脱液的合并物和来自45次循环的本体合并物的回收率和洗脱液体积。
图8显示来自单次循环的洗脱液、来自2次循环的洗脱液的合并物和来自45次循环的本体合并物中的HCP和漏出的配体。
图9显示在循环前后在歧管中的不同单元的dCP。
图10显示在两个平行的具有聚烯丙胺配体的歧管单元上用牛血清白蛋白的装载和洗脱实验的色谱图。
图11显示在两个平行的具有聚烯丙胺配体的歧管单元上腺伴随病毒血清型2(AAV-2)的色谱图。
具体实施方式
本发明涉及一种包括并联连接的至少两个色谱单元3的色谱***1。这种并联连接可以被称为歧管，并且在图1中示意性地显示。色谱***包括通向色谱单元3的公共入口5和自色谱单元3的公共出口7。在图1中，显示并联连接的四个不同的色谱单元3，但是色谱单元3的数目当然可以改变。图1中显示的实施方案中的每个色谱单元3包括入口3a和出口3b，其中入口3a连接到公共入口7，并且出口3b连接到公共出口9。色谱单元3可以在色谱***1中以不同的方式彼此连接，但是根据本发明它们中的至少两个并联连接。根据本发明，所述至少两个色谱单元各自包含基于对流的色谱材料，其中由于在色谱过程期间提供的色谱单元性质的变化，在***1的运行期间动态补偿从不同色谱单元3提供的初始背压差。
基于对流的色谱材料是不基于扩散(例如扩散到多孔珠粒中)的色谱材料。基于对流的色谱材料可以是例如整料或膜，例如膜吸附剂，并且也可以被称为吸附色谱。纤维素纤维膜是膜吸附剂的一个实例。基于对流的色谱材料可以被官能化，例如蛋白质A官能化。
在本发明的一个实施方案中，每个色谱单元3包含色谱材料，所述色谱材料具有如下色谱材料体积，其尺寸设计成允许通过所述色谱单元的流体流速是至少2倍或至少5倍色谱材料体积/分钟。色谱***1据此包括进料泵11，所述进料泵被配置成使流过色谱单元3的进料流体以至少2倍或至少5倍色谱材料体积/分钟的流体流速流过色谱单元中的每一个。
在色谱过程期间色谱单元性质的变化可以归因于色谱材料中不同的结合性质，例如蛋白质的结合。据此，从不同色谱单元3提供的背压将依赖于多少蛋白质结合在色谱材料中而改变。据此，在***运行期间，通过色谱单元的流体流将被自动调节。据此，所有单元都将被最佳地利用。由于通过色谱单元的相对高的流速，快速地进行通过所述单元的流体流的调节。
这种类型的色谱***1可以被配置成使流体流再循环通过色谱单元3至少10次或至少20次或至少40次。
由于根据本发明的***中的流体流的快速调节，色谱***1的不同色谱单元3不需要完全相同。仍然可以使用例如在初始Δ柱压或色谱材料体积方面具有一些较小差异的色谱单元3，并且这些色谱单元3的利用仍然可以在根据本发明的色谱***1中有效。
在本发明的一些实施方案中，进料泵11被配置成提供通过***的每个色谱单元3的流体流速，使得从每个色谱单元3提供的背压为至少5巴。
本发明的官能化聚合物色谱介质可以适当地由聚合物纳米纤维基材形成。每种基材可以由一种或多种聚合物纳米纤维形成。聚合物纳米纤维通常是静电纺丝的聚合物纳米纤维。这种静电纺丝的聚合物纳米纤维是本领域技术人员公知的，并且用于其生产的优化条件可以在例如O. Hardick等，J. Mater. Sci. 46 (2011) 3890中找到，其全部内容以引用的方式并入本文。本发明的方法通常包括静电纺丝聚合物以产生一种或多种聚合物纳米纤维的初始步骤。这可以包括静电纺丝聚合物以产生一个或多个非织造片材或层，其各自包含一种或多种聚合物纳米纤维。适当地，片材或层(10)各自包含多个纳米纤维-纳米纤维熔结点(20)，如图14中所示。在其接合处的单独纳米纤维(30)之间的层内熔结点为片材/层提供机械稳定性，并降低纳米纤维在使用期间脱落到液体中的风险。通过控制静电纺丝过程期间的温度，使得沉积的纳米纤维在固化之前彼此接触，可以适当地实现熔结点。可以特别有利的是，对聚合物溶液进行静电纺丝，在这种情况下，形成的纤维通过蒸发溶剂而固化，从而在固化之前提供足够的时间以形成层内熔结点。
用于本发明的聚合物纳米纤维通常具有10 nm至1000 nm的平均直径。对于一些应用，平均直径为200 nm至800 nm的聚合物纳米纤维是合适的。平均直径为200 nm至400 nm的聚合物纳米纤维对于某些应用可以是合适的。用于本发明的聚合物纳米纤维的长度没有特别限制。因此，常规的静电纺丝方法可以产生长度为数百米或甚至数千米的聚合物纳米纤维。然而，通常，所述一种或多种聚合物纳米纤维具有至多10 km，优选10 m至10 km的长度。聚合物纳米纤维可以适当地是单丝纳米纤维，并且可以例如具有圆形、椭圆形或基本上圆形/椭圆形的横截面。
通常，所述一种或多种聚合物纳米纤维以一个或多个非织造片材的形式提供，其各自包含一种或多种聚合物纳米纤维。因此，基材通常由一个或多个非织造片材形成，其各自包含一种或多种聚合物纳米纤维。包含一种或多种聚合物纳米纤维的非织造片材是所述一种或多种聚合物纳米纤维的垫，其中每种纳米纤维基本上无规取向，即，其未被制造成使得所述一种或多种纳米纤维采用特定的图案。包含聚合物纳米纤维的非织造片材通常通过已知方法提供，例如O. Hardick等，J. Mater. Sci. 46 (2011) 3890中公开的方法。在某些情况下，非织造片材可以由单一聚合物纳米纤维组成。或者，非织造片材可以包含两种或更多种聚合物纳米纤维，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种聚合物纳米纤维。
非织造片材通常具有1 g/m2至40 g/m2，优选5 g/m2至25 g/m2，在一些情况下，1g/m2至20 g/m2或5 g/m2至15 g/m2的面积密度。非织造片材也可以典型地具有5 μm至120 μm，优选10 μm至100 μm，在一些情况下，50 μm至90 μm，在其他情况下，5 μm至40 μm、10 μm至30 μm或15 μm至25 μm的厚度。
用于生产本发明的方法中使用的纳米纤维的聚合物不受特别限制，条件是所述聚合物适合在色谱应用中使用。因此，通常，所述聚合物是适合在色谱方法中作为色谱介质，即吸附剂使用的聚合物。合适的聚合物包括聚酰胺，例如尼龙、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚砜如聚醚砜(PES)、聚己内酯、胶原、壳聚糖、聚环氧乙烷、琼脂糖、琼脂糖乙酸酯、纤维素、乙酸纤维素及其组合。聚醚砜(PES)、纤维素、乙酸纤维素及其组合是优选的。在一些情况下，纤维素、乙酸纤维素及其组合是优选的。
在一些实施方案中，基材包含一种或多种由一种或多种聚合物纳米纤维形成的纳米纤维，所述聚合物纳米纤维由不同的聚合物形成。因此，在所述实施方案中，基材包含一种或多种不同的聚合物。典型的聚合物如上所定义。
通常，色谱介质是由基材制备的官能化纤维素色谱介质，所述基材由一种或多种乙酸纤维素纳米纤维形成。优选地，提供由一个或多个非织造片材或层形成的基材，所述片材或层各自包含一种或多种乙酸纤维素纳米纤维。乙酸纤维素易于通常由乙酸纤维素在一种或多种有机溶剂中的溶液静电纺丝，并且在静电纺丝后可以容易地转化成纤维素。因此，优选地，基材由一个或多个非织造片材/层形成，所述片材或层各自包含一种或多种静电纺丝的乙酸纤维素纳米纤维。
纳米纤维的物理改性
基材的提供可以包括在接枝步骤之前对任选地在非织造片材/层中的聚合物纳米纤维进行物理改性。具体地，物理改性可以包括加热和/或压制聚合物纳米纤维/非织造片材/层，优选地加热和压制聚合物纳米纤维/非织造片材/层。这些步骤改进了材料的结构稳定性。也可以改变压制和加热条件，以改变所得材料的厚度和/或孔隙率。使用聚合物纳米纤维的多个非织造片材使得能够制备更厚的材料，所述材料具有更大的吸附容量(一旦接枝和官能化)。因此，基材的提供通常可以包括提供两个或更多个彼此叠放的非织造片材/层，所述片材各自包含一种或多种聚合物纳米纤维，和同时加热和压制片材/层的叠层以熔结相邻片材/层的纳米纤维之间的接触点，产生层间熔结点。在纤维素色谱介质的情况下，基材的提供通常包括提供两个或更多个彼此叠放或折叠的非织造片材/层，所述片材/层各自包含一种或多种乙酸纤维素纳米纤维，和同时加热和压制片材/层的叠层以熔结相邻片材的纳米纤维之间的接触点。因此，官能化色谱介质可以是多个非织造聚合物纳米纤维层的叠层，其具有多个层间纳米纤维-纳米纤维熔结点，将所述层中的至少两个彼此粘合。用于压制和加热聚合物纳米纤维/非织造片材的优选加工条件可以在US 20160288089和WO-A-2015/052465中找到，其全部内容以引用的方式并入本文。
接枝纳米纤维基材
色谱介质的制备可以包括接枝步骤，其通常包括从提供的基材接枝一个或多个中性聚合物链。从基材接枝一个或多个中性聚合物链通常包括任选地在存在一种或多种催化剂的情况下从存在于基材上的一个或多个官能团生长一个或多个聚合物链。因此，通常，基材包含一个或多个官能团，优选一个或多个可以自其生长聚合物链的官能团。从一个或多个官能团生长聚合物链是指在来自单独的单体结构单元的一个或多个官能团处构建聚合物。因此，接枝步骤通常包括直接从基材生长聚合物链，而不是将预先形成的聚合物链键合到基材。因此，随着聚合的进行，将单独的单体添加到远端锚定到基材的生长中的聚合物链的末端。聚合物涂层随后将包含单点共价连接到基材的聚合物分子。聚合物分子可以是线性的或支化的，甚至是超支化的，在这种情况下，大于50%的单体残基是支化点或末端单体。直接从基材生长聚合物链使得能够控制聚合物涂层的结构，特别是使用聚合策略，其中聚合物全部以均匀速率同时生长。这使得能够形成致密且轮廓分明的聚合物涂层。因此，当基材是在它们的接合处熔结在一起的一层或多层聚合物纳米纤维时，将形成轮廓分明的薄涂层，覆盖芯纳米纤维和在单独纳米纤维之间的熔结点。涂层可以是保形涂层，即遵循纳米纤维和熔结点的轮廓。涂层的厚度可以是例如使得涂覆的纳米纤维具有100-1000 nm，例如100-700 nm或200-700 nm的平均直径。未涂覆的纳米纤维的平均直径则可以是例如100-800 nm，例如100-600 nm。所述层的平均孔径可以是例如200-800 nm，并且孔体积分数可以是例如50-90%，例如60-80%。平均孔径和平均纤维直径可以由层的SEM图像计算，并且孔体积分数可以由层或基材的总体积(厚度乘以横截面积)和纳米纤维的比重计算。代表性多层乙酸纤维素纳米纤维盘的孔体积计算的具体实例是：盘直径32 mm和盘厚度0.44 mm给出0.354 cm3的总体积。盘干重是0.165 g，其在乙酸纤维素比重是1.31 g/cm3时给出0.126cm3的乙酸纤维素体积。因此，孔体积分数是(0.354-0.126)/0.354 = 64%。
层的孔结构对于性能是重要的，因为需要满足高动态结合容量(大可及表面和短扩散路径)和低背压(大孔和高孔体积分数)之间的微妙平衡。接枝的纳米纤维层以其小纤维直径和高孔体积分数独特地适合满足这种平衡。当层具有以下孔径时，获得特别好的组合，如用全氟聚醚润湿液体由毛细流孔径测定法获得：泡点孔径为0.9-1.2 μm，例如1.0-1.2 μm；最小孔径为0.2-0.4 μm和/或平均流量孔(MFP)孔径为0.3-0.5 μm。测量应如以下实施例4中详述进行。
为了良好的流动性质，如果在接枝过程之后保留基材的开放孔结构，则是有利的。以这种方式，色谱介质将具有第一侧和第二侧，其通过由接枝的聚合物纳米纤维之间的间隙(间隙体积)形成的开放的且三维连接的孔结构彼此流体连接。该孔结构优选不含或基本上不含接枝聚合物或在接枝过程期间偶然形成的任何均聚物。这可以通过限制在接枝期间添加的单体量来实现，并且任何阻塞孔结构的聚合物的不存在可以通过测量流速和/或通过电子显微术观察孔结构来容易地检查。接枝聚合方法提供了引入官能化聚合物的独特可能性，所述聚合物增加了结合容量，而不阻塞孔结构。
实施例1
研究：使mAb灌注收获物在4×4 mL PrismA纤维歧管上循环
本研究的目的是显示Fibro PrismA单元的歧管化的概念验证，所述单元如WO2018011600和WO2019137869中公开的那样制备，这两个文献均以引用的方式整体并入本文。选择四个原型单元用于4×4 mL歧管的设置(阵列)。选择设置内的单元，以使DBC和Δ柱压(dCP)相似。
寿命研究包括每第10次循环使用1.0 M NaOH以低流速逆向进行CIP，对应30分钟的接触时间。在两天内进行101次循环，其中前51次循环用深度过滤和无菌过滤的mAb收获材料在环境温度下进行过夜。由于冷藏过夜，在第二天用低温的收获材料进行后50次循环。低mAb收获物温度导致从循环52及之后的压力增加(跳跃)，尤其是在收获物装载期间。
纯化性能良好，回收率≥94%，洗脱合并物体积接近4 MV，并且HCP降低大约log 3。在第一次循环中，配体漏出水平为26 ppm，然而，在101次循环过程中配体漏出降低，并且在本体合并物中浓度＜5 ppm。
在循环前和循环后测量每个单一单元和歧管上的dCP和DBC。循环之后，单独单元和歧管的平均dCP增加了大约30%，而循环后的DBC是初始容量的97%。
该研究提供了4x PrismA纤维单元的并联歧管化可行的另外证据。然而，由于这些化学原型的相对高的初始背压，流速不得不降低。
研究的处置
循环4×4 mL PrismA纤维歧管，第1天：
1. 将100 L灌注mAb收获物深度过滤，并且将50 L进一步无菌过滤到一次性使用袋中。将剩余的50 L mAb收获物在冷室中储存过夜。
2. 用深度/无菌过滤的mAb8收获物运行51次循环过夜，其中包括每第10次循环用1.0 M NaOH在30分钟的接触时间下进行的CIP。
循环4×4 mL PrismA纤维歧管，第2天：
3. 将剩余的50 L深度过滤的材料从冷室中的储存处取出并且无菌过滤到一次性使用袋中。
4. 完成50次循环(循环52-101)，包括每第10次循环用1.0 M NaOH在30分钟的接触时间下进行的CIP。
在循环后确定歧管和单独单元的平衡期间的动态结合容量(DBC)和dCP。
专业术语
术语 注释
LS 实验室规模
PDS 过程开发规模
PD 过程开发
NPI 新产品介绍
POC 概念验证
4×4 mL 4个4 mL单元的歧管
dCP Δ柱压
CIP 就地清洁
DBC 动态结合容量
BT 穿透
QB10% 10%穿透下的动态结合容量
PQ 产品质量
表1 化学品
Figure 429135DEST_PATH_IMAGE002
表2 歧管中的PrismA纤维4 mL单元
化学 单元号/ID DBC (mg/mL) dCP (MPa) 在歧管中的位置
13BW111 U2 32.5 0.51 1
8FL078A U3 sil 31.5 0.51 2
8FL078A U2 29.7 0.54 3
8FL078B U5 31.4 0.58 4
根据图1中的示意图和图2中的照片，通过使用两个3D打印的塑料部件和PEEK管(ID 1.0 mm)将这些单元并联连接，所述塑料部件和PEEK管使用手指紧固和Luer适配器连接器连接在一起。
表3 设备
Figure DEST_PATH_IMAGE003
mAb8灌注细胞培养收获物
细胞培养在WAVE生物反应器(GE Healthcare)中以25 L灌注物进行。CHO细胞在作为灌注培养基的HyClone CDM4NS0培养基 + CellBoost 1和CellBoost 3中生长。将细胞以小体积接种到反应器中，并且在三天期间将体积连续增加至全体积。两天后，以12.5升/天的培养基交换速率开始灌注。此后，随着细胞密度增加，灌注速率增加到50升/天的最终速率。大约十天后以140×10e6细胞/毫升的细胞密度完成灌注。灌注物中mAb浓度增加到大约0.5 g/L的终浓度。
最后三天自所述灌注培养物获得167 L的体积。通过Biacore使用mAb标准品确定mAb浓度为0.4 (0.368) mg/mL。
方法
单独4 mL单元和4×4 mL歧管的DBC的确定
将预纯化的mAb样品在洗涤1缓冲液(20 mM磷酸盐，500 mM NaCl，pH 7)中稀释至浓度为2 mg/mL。过滤样品(0.22 u)，并且在洗涤1缓冲液中稀释4倍后，通过测量280 nm下的UV吸光度并使用1.48 ml/(mg×cm)作为吸收率系数(ε)通过比尔定律(方程式1)计算浓度，确定mAb浓度。
方程式1 比尔定律
A = ε L c
其中A是280 nm下的UV吸收，ε是吸收率系数，L是比色皿架的路径长度，并且c是溶液的浓度。
在开始BT分析之前，mAb样品绕过柱阀注射，并且记录在280 nm下的100% UV吸光度。
用洗脱缓冲液洗涤纤维单元，并在开始BT分析之前平衡。用于BT分析的独角兽法(Unicorn method)如下所述。
独角兽法
起始条件：报警柱前压力1.7 MPa和Δ柱压1.0 MPa或1.5 MPa。UV平均时间(噪声降低) 2.5秒。
空气阱和混合器阀旁通。
在整个方法中，对于单个单元(4 mL)和歧管化单元(16 mL)，分别使用32 mL/min和128 mL/min的流速。
表4 独角兽法
Figure 346275DEST_PATH_IMAGE004
通过使用以下程序，mAb的10% BT下的DBC (QB10%)近似于10% BT下每毫升PrismA纤维装载的mAb的量(mg)：
延迟体积确定为在平衡缓冲液过渡到在含有500 mM NaCl的20 mM磷酸盐缓冲液中稀释的mAb样品期间发生50%电导率偏移的体积。竖直标记参考点设定在50%电导率突破下，并且Δ体积确定为A280 nm曲线达到mAb样品的100%吸光度的10%时的体积。将Δ体积乘以mAb样品的浓度，然后除以单元的体积(4 mL (单个单元)或16 mL (歧管))。
使用深度过滤和无菌过滤的mAb灌注收获物的歧管的循环，包括每第10次循环进行的CIP
使用表5中的独角兽法，在环路阶段后增加CIP。
CIP以逆流(柱2向上流动)进行，其中以100 mL/min的流速施加6 MV的1.0 M NaOH(A4)。然后，在施加12.5 MV (200 mL) 1.0 M NaOH期间将流速降至6.6 mL/min，导致CIP接触时间为30分钟。CIP后进行10 MV的再平衡。
表5 独角兽法
Figure DEST_PATH_IMAGE005
歧管的容量为29.6 mg/mL，这导致对于80%的QB10%的负荷，每次循环的负荷体积是947.2mL mAb收获物(滴度为0.4 mg/mL) (0.8*29.6*16/0.4)。
使用并联联结的两个深度过滤器(Zeta Plus Capsule过滤器，E102FSA90ZB05A，1020 cm2，3M)，将100 L mAb收获物过滤到200 L袋中。使用Ulta HC 20”过滤器将大约50 L深度过滤的mAb收获物进一步无菌过滤到50 L袋中并用于前51次循环。当开始循环时，该材料的温度接近环境温度。将剩余的50 L深度过滤的材料储存在冷室中，直到第二天用于循环52-101。
前51次循环使用根据表6的探测(scouting)方案运行过夜。
第二天，从冷室取出最后50 L mAb灌注收获物，并使用新Ulta HC 20”过滤器无菌过滤到50 L袋中。当根据表7开始循环52-101时，该材料仍然是冷的。
取出来自所有洗脱液的样品(单次循环、两次循环的合并物和45次循环的本体合并物)，并准备通过根据段落的SEC分析得到HCP、漏出的PrismA配体、mAb浓度(Biacore和UV)和聚集体浓度。
表6 循环1-51的探测方案
探测运行 循环次数 循环# 出口中的洗脱液 CIP
001 1 1 3 否
002 9 2-10 2 (本体) 循环10结束
003 1 11 4 否
004 9 12-20 2 (本体) 循环20结束
005 1 21 4 否
006 9 22-30 2 (本体) 循环30结束
007 1 31 5 否
008 9 32-40 2 (本体) 循环40结束
009 1 41 5 否
010 9 42-50 2 (本体) 循环50结束
011 1 51 6 否
表7 循环52-101的探测方案
探测运行 循环次数 循环# 出口中的洗脱液 CIP
001 9 52-60 2 (本体) 循环60结束
002 1 61 3 否
003 9 62-70 2 (本体) 循环70结束
004 1 71 4 否
005 9 72-80 2 (本体) 循环80结束
006 1 81 5 否
007 9 82-90 2 (本体) 循环90结束
008 1 91 5 否
009 9 92-100 2 (本体) 循环100结束
010 1 101 6 否
在循环中的dCP和UV峰面积的评价
对dCP和UV 300 nm曲线进行积分，并使用UNICORN中的“多结果峰比较”函数将对应于装载、洗脱和再平衡期间的Δ柱压的峰以及洗脱峰面积输出到excel。对于在歧管上的101次循环绘制压力峰高(MPa)和标准化UV300 nm峰面积。
宿主细胞蛋白质、漏出的PrismA配体和mAb浓度的分析
取出450 μL mAb收获物样品并将其与50 μL保存液混合，并且储存在冰箱中，直到HCP分析。取出450 μL洗脱液样品并将其与50 μL保存液混合，并且储存在冰箱中，直到HCP和蛋白质A配体(PrismA)分析。
使用稀释五次的样品在280 nm下的UV吸光度确定洗脱液的mAb浓度。将40 μL样品与160 μL洗脱缓冲液在UV可读板中混合(一式两份稀释)。使用路径检验校正测量UV，并且使用比尔定律(方程式1)以1.48 ml/(mg×cm)作为吸收率系数计算浓度。
用于聚集体浓度确定的SEC分析
将200 μL洗脱样品分配在96孔板中，并且使用SEC分析。
缓冲液：通过将缓冲片剂(09-9400-100，Medicago)溶解在MQ水中并在容量瓶中将最终体积调节至1 L来制备PBS，0.14 M NaCl，0.0027 M KCl，0.010 M磷酸盐，pH 7.4。
柱：Superdex 200 Increase 10/300 GL，代号28-9909-44，批次10263258 (有效期限2022-06，ID 0094)，CV 23.563 mL。
独角兽法：
流速1 mL/min
波长：280 nm、260 nm和215 nm
报警压力 4.50 MPa
柱位置 3
平衡 1 mL，自动调零UV
样品注射 部分_905，50 μL
25 mL的等度洗脱
最初用空白(缓冲液)注射进行SEC运行。
接纳标准
在循环研究中，单元之间的压差小于0.12 MPa的4×4 mL单元的歧管最初应该表现良好，纯度和回收率与MabSelect PrismA相当。
结果和讨论
使用深度过滤和无菌过滤的mAb灌注收获物在歧管上的101次循环，包括每第10次循环进行的CIP
使用由四个4 mL单元组成的歧管，所述单元由来自不同化学批次的PrismA纤维制成。
整个方法的流速设定为100 mL/min。色谱图的实例参见图3。由于灌注收获材料的低滴度(0.4 mg/mL)，装载阶段花费大于50%的循环时间。
早上将100 L灌注mAb收获材料从冷室中取出，并在两个过滤步骤(深度过滤和无菌过滤)期间全天保持在室温下。因此，当下午开始纯化时，收获材料接近室温。进行前51次循环过夜。第二天进行后52-101次循环。在那个时间点，将前一天深度过滤的50 L mAb收获物在冷室中保存过夜，并且在无菌过滤期间仅在室温下保持少于一小时。因此，当开始循环时，收获材料仍然是冷的。
在第一次循环中的平衡/再平衡期间dCP接近0.5 MPa。dCP在前51次循环中增加了大约0.1 MPa，其中在前10次循环期间发生最大压力增加，然后趋于平稳(图4)。对于色谱循环的所有阶段(装载、洗涤、洗脱和再平衡)，压力增加是相似的。
在循环52至101中，样品装载期间的压力与mAb收获材料的温度有关。在每第10次循环61至101的重叠中，在循环61中装载期间的压力最高，然后在循环中随着mAb收获物的温度接近环境温度而降低(图5)。在循环中的压力增加可以用CIP来减轻。
装载、洗脱和再平衡阶段的dCP以及所有循环的相对洗脱峰面积呈现在(图6)中。尤其在后50次循环期间，清楚地看到每第10次循环进行的CIP的效果。即使在装载期间与收获物的温度有关的压力增加是显著的，在后50次循环期间的总压力也是稳定的。
对于来自所有循环的洗脱液(单次循环，来自两次循环的洗脱液的合并物和来自45次循环的洗脱液的本体合并物)，回收率≥95%，并且洗脱液合并物接近4 MV (图7)。HCP浓度范围在100 ppm至200 ppm之间，对应于大约3的log纯化因子(图8)。漏出的PrismA配体浓度在第一次循环中最高(26 ppm)，但随后在循环中降低至低于5 ppm。
来自歧管的循环的洗脱液的产品质量
循环前后单独单元和歧管的dCP和DBC
在歧管的循环之前，四个单元的dCP在0.51 MPa至0.58 MPa之间，如在平衡阶段期间在BT分析期间以32 mL/min的流速所测量的(图)。在循环之后，四个单元的dCP不同程度地增加，其中平均增加32%，这也与歧管的dCP增加相关。循环之前在单元之间的最大压差是0.07 MPa，并且循环之后是0.17 MPa。循环之前歧管具有0.60 MPa的dCP，并且循环之后，所述dCP增加到0.78 MPa。循环前后单独单元和歧管的DBC和dCP呈现在表中。循环后的歧管容量是28.6 mg/mL，其对应于初始容量的97%。
表8 循环前后单独单元和歧管的表征
Figure 562230DEST_PATH_IMAGE006
*可能错误的值。
结论
所述研究提供了4x PrismA纤维单元的并联歧管化可行的另外证据。然而，由于这些化学原型的相对高的背压，流速不得不降低到100 mL/min。在本项目中目标是128 mL/min。
· 在研究中完成101次循环，包括每第10次循环用1.0 M NaOH在30分钟的接触时间下进行的CIP。
·51次循环后的压力增加(跳跃)与在冷室中储存后收获材料的低温有关。
·对于来自所有循环的洗脱液，mAb回收率≥95%并且洗脱液合并物接近4 MV。
·HCP浓度范围在100 ppm至200 ppm之间，对应于大约3的log纯化因子。
·漏出的PrismA配体浓度在第一次循环中最高(26 ppm)，但随后在循环中降低至低于5 ppm。
·在循环之后，单独单元的平均dCP和歧管的dCP增加了大约30%，而循环后的DBC为97%。
·循环之前歧管2中的单元之间的最大压差是0.07 MPa，并且循环之后是0.17MPa。
·增加的污堵/背压与歧管中的具***置无关。
据信歧管中单独单元的压力和容量匹配对于良好的纯化性能至关重要。然而，还假定在歧管内存在压力和流量的固有平衡。如果在歧管中的一个单元上建立的压力大于另一个单元，则通过所述单元的流量将减小。这将导致在剩余单元期间流速增加，在这些单元上建立的压力增加。考虑到单元之间的初始差异不太大，通过单元的这种自调节压力建立和流速将继续并最终使单元之间的任何差异达到平衡。
实施例2-在两个并行的用聚烯丙胺官能化的歧管化单元上的牛血清白蛋白(BSA)
如WO2018011600和WO2019137869中所述，用缩水甘油接枝2 mL纤维素纳米纤维膜，并用二乙烯基砜(DVS)处理。然后使它们与聚烯丙胺反应，产生阴离子交换官能团。将这两个2 mL膜并联联结，并且在20 mM Tris pH 8.0 + 100 mM NaCl中平衡。以50 mL/min流速装载在相同缓冲液中的BSA溶液，然后用平衡缓冲液洗涤膜。然后用20 mM Tris pH 8.0+ 2.0 M NaCl洗脱吸附的BSA。如图10中所见，洗脱峰是尖锐且狭窄的，表明流速在两个膜上基本相同。
实施例3-在两个并行的用聚烯丙胺官能化的歧管化单元上的腺伴随病毒(AAV-2)
如WO2018011600和WO2019137869中所述，用缩水甘油接枝2 mL纤维素纳米纤维膜，并用二乙烯基砜(DVS)处理。然后使它们与聚烯丙胺反应，产生阴离子交换官能团。将这两个2 mL膜并联联结，并且在20 mM Tris pH 8.0 + 100 mM NaCl中平衡。以50 mL/min流速装载腺伴随病毒2 (AAV-2)在相同缓冲液中的悬浮液，然后用平衡缓冲液洗涤膜。用20mM Tris pH 8.0 + 1.0 M NaCl洗脱吸附的AAV-2。如图11中所见，洗脱峰是尖锐且狭窄的，表明流速在两个膜上基本相同。
实施例4-通过毛细管流动分析进行孔径测量
所用的设备是POROLUXTM 100气孔仪(IB-FT GmbH, Berlin, Germany)，并且方法如表9中所给出。关于测量原理的另外细节可以在制造商的网站http://www.ib-ft.com/measurement_principle.html上找到。
从测量中获得的三种孔径是最小孔径、平均流量孔(MFP)孔径和泡点孔径(最大孔径)。
表9：毛细流孔径测定法
Figure DEST_PATH_IMAGE007
毛细流孔径测定法的结果以及由SEM图像估计的平均纳米纤维直径示于表10中。这些结果也适用于实施例1-3中使用的Fibro PrismA和聚烯丙胺膜。
表10 孔径和纳米纤维直径
Figure 770489DEST_PATH_IMAGE008
。

Claims (17)

1.色谱***，其包括并联连接的至少两个色谱单元(3)，其中所述至少两个色谱单元(3)各自包含基于对流的色谱材料，其中由于在色谱过程期间提供的色谱单元性质的变化，在所述***运行期间动态补偿从不同色谱单元(3)提供的初始背压差。
2.根据权利要求1所述的色谱***，其中每个色谱单元(3)包含色谱材料，所述色谱材料具有如下色谱材料体积，其尺寸设计成允许通过所述色谱单元(3)的流体流速是至少2倍色谱材料体积/分钟，其中所述***包括进料泵(11)，所述进料泵被配置成使流过所述色谱单元(3)的进料流体以至少2倍色谱材料体积/分钟的流体流速流过所述色谱单元中的每一个。
3.根据前述权利要求中任一项所述的色谱***，其中在所述色谱过程期间色谱单元性质的变化是由于所述色谱材料中的不同结合性质。
4.根据前述权利要求中任一项所述的色谱***，其中所述***被配置成使所述流体流再循环通过所述色谱单元至少10次或至少20次。
5.根据前述权利要求中任一项所述的色谱***，其中所述色谱材料是至少一种纤维素纤维膜。
6.根据权利要求5所述的色谱***，其中每个色谱单元的所述至少一种纤维素纤维膜是蛋白质A官能化的纤维素纤维膜。
7.根据权利要求5所述的色谱***，其中每个色谱单元的所述至少一种纤维素纤维膜是阴离子交换官能化的纤维素纤维膜。
8.根据权利要求5或7所述的色谱***，其中每个色谱单元的所述至少一种纤维素纤维膜是聚烯丙胺官能化的纤维素纤维膜。
9.根据前述权利要求中任一项所述的色谱***，其中所述色谱材料是至少一种纤维膜，所述纤维膜包含共价连接到所述纤维膜的多个接枝聚合物分子和共价结合到所述接枝聚合物分子的多个配体基团，其中所述配体基团能够与靶生物分子相互作用。
10. 根据前述权利要求中任一项所述的色谱***，其中所述色谱材料包含直径为100-1000 nm，例如100-700 nm或200-700 nm的纤维。
11. 根据前述权利要求中任一项所述的色谱***，其中所述色谱材料具有200-800 nm的平均孔径。
12. 根据前述权利要求中任一项所述的色谱***，其中所述色谱材料具有0.9-1.2 μm，例如1.0-1.2 μm的泡点孔径。
13. 根据前述权利要求中任一项所述的色谱***，其中所述色谱材料具有0.2-0.4 μm的最小孔径。
14. 根据前述权利要求中任一项所述的色谱***，其中所述色谱材料具有0.3-0.5 μm的平均流量孔(MFP)孔径。
15.根据前述权利要求中任一项所述的色谱***，其中所述色谱材料具有50-90%的孔体积分数。
16. 根据前述权利要求中任一项所述的色谱***，其中所述色谱材料具有100-2000 μmol配体/g干燥的官能化色谱介质的配体密度。
17.根据前述权利要求中任一项所述的色谱***，其中所述进料泵被配置成提供通过所述***的每个色谱单元的流体流速，使得从所述色谱单元中的每一个提供的背压是至少5巴。
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