CN113660857A - 包含降低的烟碱和降低的烟草特异性亚硝胺的烟草植物 - Google Patents

包含降低的烟碱和降低的烟草特异性亚硝胺的烟草植物 Download PDF

Info

Publication number
CN113660857A
CN113660857A CN202080023186.6A CN202080023186A CN113660857A CN 113660857 A CN113660857 A CN 113660857A CN 202080023186 A CN202080023186 A CN 202080023186A CN 113660857 A CN113660857 A CN 113660857A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tobacco
plant
transgene
tobacco plant
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080023186.6A
Other languages
English (en)
Inventor
C·库迪蒂普迪
许冬梅
J·斯特里克兰德
M·F·德戈多伊鲁索
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Altria Client Services LLC
Original Assignee
Altria Client Services LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Altria Client Services LLC filed Critical Altria Client Services LLC
Publication of CN113660857A publication Critical patent/CN113660857A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/82—Solanaceae, e.g. pepper, tobacco, potato, tomato or eggplant
    • A01H6/823—Nicotiana, e.g. tobacco
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本公开提供用于减少烟碱的方法。还提供了具有降低的烟草特异性亚硝胺(TSNA)的烟草植物。本公开还提供具有低烟碱和增加的抗氧化能力的经修饰的烟草植物。进一步提供了具有低烟碱和低TSNA的烟草植物或材料。还提供了本文提供的烟草植物的熟化烟草材料和包含该熟化烟草材料的烟草制品。

Description

包含降低的烟碱和降低的烟草特异性亚硝胺的烟草植物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年1月24日提交的美国临时申请No.62/796,399的优先权，其全部以引用方式并入本文。
序列表的并入
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，其全部以引用方式并入本文。在2020年1月23日创建的所述ASCII副本被命名为Sequence_Listing_P 34595WO00.txt，并且大小为2,447,884字节。
技术领域
本公开提供具有低烟碱的经修饰的烟草植物。本公开还提供具有低烟碱和增加的抗氧化能力的经修饰的烟草植物。还提供包含降低量的烟草特异性亚硝胺(TSNA)的烟草植物。还提供具有改变的总生物碱和烟碱含量和商业上可接受的叶等级的烟草植物(它们经由育种或转基因途径开发)，以及由这些烟草植物生产烟草制品。
背景技术
在烟草中发现了四种主要的生物碱：烟碱、降烟碱、假木贼碱和新烟草碱。烟碱是主要的生物碱，通常在商业烟草栽培种中占总生物碱的90％以上。烟碱的生物合成主要发生在烟草根部。然后，烟草植物通过维管束将烟碱转运到叶片，然后在那里将烟碱储存在液泡中。
多种因素影响烟草的生物碱含量，包括基因型、环境、受精和农艺实践(例如，烟草生产受到打顶、受伤和食草动物伤害的刺激)。最初在古巴雪茄烟草品种株系中发现的低生物碱性状通过一系列回交被引入到香烟品种中。低生物碱烟草种质随后登记在栽培种白肋21的遗传背景中(Legg等,Crop Science,10:212(1970))。使用低生物碱白肋21(LA BU21)系的遗传研究表明，两个未连锁的基因座促进烟叶中的烟碱含量。这两个基因座被称为Nic1和Nic2(也称为NIC1和NIC2(分别为烟碱1和烟碱2)。LA BU21中的nic1和nic2突变是半显性的。它们对烟碱含量显示剂量依赖效应，其中nic1的作用比nic2强约2.4倍。已经报道了Nic2基因座的分子表征。显示nic2突变含有来自乙烯响应因子(ERF)家族的转录因子基因簇的缺失。
降低烟草中的总生物碱含量可以有很多好处。它可以提高烟草作为生物质资源的价值。增加烟草植物中烟碱类生物碱的含量可以在保护植物抵御昆虫和食草动物方面发挥重要作用。
细胞色素p450催化多种化学上不同的底物的酶促反应，包括内源性和异生素底物的氧化、过氧化和还原代谢。在植物中，p450参与生物化学途径，包括植物产物(诸如苯丙素、生物碱、萜类化合物、脂质、生氰糖苷和芥子油苷)的合成(Chappel,Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol..198,49:311-343)。细胞色素p450，也称为p450血红素-硫醇盐蛋白，通常在多组分电子转移链中充当末端氧化酶，称为含p450的单加氧酶***。催化的具体反应包括偶氮、硝基和N-氧化物基团的脱甲基化、羟基化、脱氨和还原。三种细胞色素p450被鉴定为烟碱脱甲基酶(参见美国专利号8,319,011；8,124,851；9,187,759；9,228,194；9,228,195；9,247,706，作为示例性烟碱脱甲基酶序列)。
烟草特异性亚硝胺(TSNA)，诸如N-亚硝基降烟碱(NNN)和4-(甲基亚硝氨基)-l-(3-吡啶基)-l-丁酮(NNK)，可以在香烟的无烟烟草；主流烟雾；以及侧流烟雾中找到。据报道，晾制和烤制烟草含有烟草特异性亚硝胺。参见，"Effect of Air-Curing on theChemical Composition of Tobacco",Wiernik et al.,Recent Adv.Tob.Sci,(1995),21,pp.39-80。根据Wiernik等，TSNA在生长的烟草植物或鲜切烟草(绿色烟草)中不以显著的量存在，但在熟化过程中形成。据称，存在于烟叶上的细菌种群在很大程度上会导致在熟化过程中从硝酸盐形成亚硝酸盐，并可能影响生理pH值下仲胺亚硝化的直接催化作用。受影响的仲胺包括烟草生物碱，它们在亚硝化时会形成TSNA。
需要开发含有改变的烟碱含量(例如，降低的烟碱)以及降低的TSNA同时维持(如果不能制备更优的)烟叶质量的烟草植物和制品。
发明内容
在一个方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含抑制来自NIC1b基因座、NIC2基因座或两者的一个或多个基因的第一遗传修饰，并且还包含增加烟碱向降烟碱转化的第二遗传修饰。
在另一个方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含抑制来自NIC1b基因座、NIC2基因座或两者的一个或多个基因的第一遗传修饰，包含增加烟碱向降烟碱转化的第二遗传修饰，并且还包含与缺乏第三遗传修饰的对照植物相比增加一种或更多种抗氧化剂的含量的第三遗传修饰。
在一个方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含增加烟碱向降烟碱转化的第一遗传修饰，并且还包含增加一种或更多种抗氧化剂含量的第二遗传修饰。
在一个方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含提供一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个基因的诱变或转基因抑制的第一遗传修饰，所述基因包含与SEQ ID Nos:10-19和30-36具有至少90％同一性的核苷酸序列，并且还包含增加烟碱向降烟碱转化的第二遗传修饰。在一个方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含提供一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个基因的诱变或转基因抑制的第一遗传修饰，所述基因编码与SEQ ID Nos:20-29和37-43具有至少90％同一性的核苷酸序列，并且还包含增加烟碱向降烟碱转化的第二遗传修饰。在进一步的方面，烟草植物还任选地包含增加一种或更多种抗氧化剂的含量的另一种遗传修饰。
序列简要说明
SEQ ID NOs:1和5示出了来自红花烟草(Nicotiana tabacum)的细胞色素P450单加氧酶CYP82E4v2基因的示例性编码和多肽序列。
SEQ ID NOs:2和6示出了红花烟草Myb3基因的示例性编码序列和多肽序列。
SEQ ID NOs:3和7示出了拟南芥(Arabidopsis thaliana)PAP1基因的示例性编码序列和多肽序列。
SEQ ID NOs:4和8示出了马铃薯(Solanum tuberosum)AN1的示例性编码序列和多肽序列。
SEQ ID NO:9示出了Nic1b区的序列。
SEQ ID NOs:10-19示出了如表8中所列的Nic1b_ERF基因的示例性基因组序列。
SEQ ID NOs:20-29示出了如表8中所列的Nic1b_ERF基因的示例性基因组序列。
SEQ ID NOs:30-36示出了如表9中所列的Nic2_ERF基因的示例性基因组序列。
SEQ ID NO:37-43示出了如表9中所列的Nic2_ERF基因的示例性基因组序列。
SEQ ID NO:44示出了带有用于表达NtMYB3和NtCYP82E4的两个堆叠表达盒的示例性构建体(CsVMV-NtMYB3-Nos-T-CsVMV-CYP82E4-Nos-T)。
SEQ ID NO:45示出了6xHIS标签的氨基酸序列。
各种序列可包括核苷酸序列中的“N”或氨基酸序列中的“X”。“N”可以是任何核苷酸，例如A、T、G、C，或一个或更多个核苷酸的缺失或***。在某些情况下，示出了一串“N”。“N”的数目不一定与该位置上未确定的核苷酸的实际数目相关。实际的核苷酸序列可以比所示的“N”片段更长或更短。类似地，“X”可以是任何氨基酸残基或一个或更多个氨基酸的缺失或***。同样，“X”的数目不一定与该位置上未确定的氨基酸的实际数目相关。实际的氨基酸序列可以比所示的“X”片段更长或更短。尽管在描述序列表中的任何SEQ ID中使用了A、T、G、C(与A、U、G、C相比)，取决于其中提及SEQ ID的上下文，SEQ ID也可以指RNA序列。
附图简要说明
图1：过表达烟碱脱甲基酶CYP82E4v2的温室生长的T0转基因植物中的烟碱含量。
图2：过表达烟碱脱甲基酶CYP82E4v2的温室生长的T0转基因植物中的降烟碱含量。
图3：过表达烟碱脱甲基酶CYP82E4v2的温室生长的T0转基因植物中的假木贼碱含量。
图4：过表达烟碱脱甲基酶CYP82E4v2的温室生长的T0转基因植物中的新烟草碱含量。
图5：在过表达烟碱脱甲基酶CYP82E4v2的田间生长的T1转基因植物中的烟碱含量。
图6：在过表达烟碱脱甲基酶CYP82E4v2的田间生长的T1转基因植物中的降烟碱含量。
图7：在过表达烟碱脱甲基酶CYP82E4v2的田间生长的T1转基因植物中的假木贼碱含量。
图8：在过表达烟碱脱甲基酶CYP82E4v2的田间生长的T1转基因植物中的新烟草碱含量。
图9：在LATN90中过表达Myb3的T0转基因植物表现出增加的抗氧化剂含量，如通过铁还原抗氧化能力(FRAP)测定所测量。
图10：在3代过表达Myb3的转基因植物中观察到抗氧化剂含量增加。
图11：在LATN90中过表达Myb3的T2转基因植物表现出增加的抗氧化剂含量，如通过铁还原抗氧化能力(FRAP)测定所测量。
图12：过表达烟碱脱甲基酶CYP82E4v2和Myb3的温室生长的T0转基因植物中的烟碱含量。
图13：过表达烟碱脱甲基酶CYP82E4v2和Myb3的温室生长的T0转基因植物中的降烟碱含量
图14：过表达烟碱脱甲基酶CYP82E4v2和Myb3的温室生长的T0转基因植物中的假木贼碱含量。
图15：过表达烟碱脱甲基酶CYP82E4v2和Myb3的温室生长的T0转基因植物中的新烟草碱含量。
图16：TN90中过表达CYP82E4v2和Myb3的T0转基因植物表现出增加的抗氧化剂含量，如通过铁还原抗氧化能力(FRAP)测定所测量。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。本领域技术人员将认识到在本公开的实践中可以使用许多方法。实际上，本公开决不限于所描述的方法和材料。为了本公开的目的，下面定义以下术语。
本文引用的任何参考文献，包括例如所有专利和出版物通过引用以其全部并入，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。
如本文所用，单数形式“一”，“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。在以单数形式提供术语的情况下，发明人还预期由所述术语的复数形式描述的本发明的方面，且反之亦然。在通过引用并入的参考文献中使用的术语和定义存在差异的情况下，本申请中使用的术语应具有本文给出的定义。所使用的其他技术术语具有其在所使用的技术领域中的普通含义，如由各种特定领域的词典所例示，例如“The American
Figure BDA0003272574610000061
Science Dictionary”(Editors of the American Heritage Dictionaries,2011,Houghton Mifflin Harcourt,Boston and New York)，“McGraw-Hill Dictionary ofScientific and Technical Terms”(6th edition,2002,McGraw-Hill,New York)或“Oxford Dictionary of Biology”(6th edition,2008,Oxford University Press,Oxford and New York)。
当出现一组备选方案时，特别设想了组成该备选方案组的成员的任何和所有组合。例如，如果项目选自由A、B、C和D组成的组，则本发明人明确地设想了每个单独的替代方案(例如，单独的A、单独的B等)，以及诸如A、B和D；A和C；B和C等的组合。术语“和/或”在两个或多个项目的列表中使用时是指所列项目中的任何一个单独或与任何一个或更多个其他所列项目组合。例如，表述“A和/或B”旨在表示A和B之一或两者-即单独的A、单独的B或A和B的组合。表述“A、B和/或C”旨在表示单独的A、单独的B、单独的C、A和B的组合、A和C的组合、B和C的组合，或A、B和C的组合。
当本文提供数值范围时，该范围应理解为包括该范围的边界以及该范围的限定边界之间的任何数值。例如，“1-10”包括在1和10之间的任何数字，以及数字1和数字10。
本文使用的术语“约”是指大约、粗略地、周围或在其范围内(例如，在10％内)。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过将边界延伸到所述数值以上和以下来改变该范围。
如本文所用，任何副词、介词或其他修饰词短语(例如，约、小于、大于、至少、至多)与字符串或一组替代词(例如，定量或定性描述符)结合使用来修饰整个字符串或组包括此类字符串或组的每个列出的成员，无论副词、介词或其他修饰词是否在每个成员之前复制。
如本文所用，“Nic1b基因座”或“NIC1b基因座”是指Nic1b区内或与Nic1b区域紧密连锁的任何染色***置或部位。“Nic1b区”指约150万bp长的染色体片段，对应于TN90基因组的SEQ ID No.9，并具有与低生物碱性状相关的等位基因。Nic1b区描述于美国申请Nos.16/246,281和16/246,308中，两者均于2019年1月11日提交；和PCT申请No.PCT/US2019/013345和PCT/US2019/013363中，两者均于2019年1月11日提交，所有这些申请通过引用以其全部并入本文。“nic1b突变”是指Nic1b基因座中的突变。
如本文所用，Nic1b_ERF(或复数形式，Nic1b_ERFs)是指Nic1b基因座处或附近的ERF基因或基因座中的任一种，并且包括例如ERF101、ERF110、ERFnew、ERF199、ERF19、ERF130、ERF16、ERF29、ERF210和ERF91L2。参见表8和Kajikawa et al.,,Plantphysiol.2017,174:999-1011。“nic1b_erf突变”是指Nic1b_ERF基因中的突变。如本文所用，突变或突变型等位基因以所有小写字母和斜体显示。基因、基因座或蛋白质名称以所有大写字母或以大写字母开始显示，并且可以是斜体或非斜体的。
如本文所用，Nic2_ERF(或复数形式，Nic2_ERFs)是指Nic2基因座处或附近的ERF基因或基因座中的任一种，并且包括例如ERF221,ERF115,ERF168,ERF17,ERF179,ERF189。参见表9；Shoji et al.,Plant Cell,(10):3390-409(2010)；和Kajikawa et al.,,Plantphysiol.2017,174:999-1011。
表8：在Nic1b区处或附近选择的ERF基因。每个ERF基因的基因组坐标显示为染色体7上的起始和终止。ERF命名法基于Rushton et al.,TOBFAC:the database of tobaccotranscription factors,BMC Bioinformatics 2008,9:53。从TobFac数据集获得每个Nic1b_ERF的DNA序列，并用于探测烟草基因组数据库以鉴定带注释的基因模型、转录物和染色体坐标。为每个基因的示例性基因组编码DNA序列(包括内含子，如果适用)和多肽序列提供序列识别号(SEQ ID Nos.)。
Figure BDA0003272574610000081
Figure BDA0003272574610000091
表9：在Nic2区处或附近选择的ERF基因。每个ERF基因的基因组坐标显示为染色体19上的起始和终止。ERF命名法基于Rushton et al.,TOBFAC:the database of tobaccotranscription factors,BMC Bioinformatics 2008,9:53；Shoji et al.,Plant Cell,(10):3390-409(2010)；和Kajikawa et al.,,Plant physiol.2017,174:999-1011。从TobFac数据集或从NCBI数据库获得每个Nic2_ERF的DNA序列，并用于探测烟草基因组数据库以鉴定带注释的基因模型、转录物和染色体坐标。为每个基因的示例性基因组编码DNA序列(包括内含子，如果适用)和多肽序列提供序列识别号(SEQ ID Nos.)。
Figure BDA0003272574610000092
如本文所用，“遗传修饰”是指植物或植物基因组的遗传组成的改变。可以通过包括但不限于诱变、基因组编辑、遗传转化或其组合的方法引入遗传修饰。遗传修饰包括例如基因中的突变(例如非天然突变)或靶向基因的转基因。如本文所用，“靶向”是指直接上调或直接下调基因的表达或活性。如本文所用，在影响基因表达或活性的转基因的上下文中，“直接”是指通过基因(例如，启动子区或UTR区)或其中编码的产物(例如，mRNA分子或多肽)与转基因编码的产物(例如，非编码小RNA分子或蛋白质，诸如转录因子或显性失活多肽变体)之间的物理接触或化学相互作用对基因施加的影响。在一个方面，转基因影响靶基因的表达或活性而不涉及转录因子(例如，转基因不编码转录因子和/或不抑制转而调节靶基因的转录因子的表达或活性)。
如本文所用，突变是指引入基因中以改变由基因编码的产物的表达或活性的可遗传的遗传修饰。这样的修饰可以在基因的任何序列区中，例如在启动子、5'UTR、外显子、内含子、3'UTR或终止子区中。在一个方面，突变减少、抑制或消除基因产物的表达或活性。在另一个方面，突变增加、提高、强化或增强基因产物的表达或活性。在一个方面，突变不是存在于特定烟草品种或栽培品种中的天然多态性。如本文所用，“突变等位基因”是指来自其中等位基因包含突变的基因座的等位基因。如本文所用，“诱变”是指产生不涉及转基因或在最终突变体中没有剩余突变相关转基因的突变。在一个方面，诱变剂是同源转基因的。在另一个方面，诱变是经由基因或基因组编辑的。在另一个方面，诱变是经由随机诱变，例如化学(例如EMS)或物理(r-照射)诱变的。应当理解，当鉴定突变时，参考序列应当来自相同的烟草品种或背景。例如，如果包含突变的经修饰的烟草植物来自TN90品种，则相应的参考序列应当是内源TN90序列，而不是来自不同烟草品种(例如，K326)的同源序列。在一个方面，突变是“非天然的”或“非天然存在的”突变。如本文所用，“非天然的”或“非天然的”突变是指不是并且不对应于在没有人为干预的情况下产生的自发突变的突变。人为干预的非限制性实例包括诱变(例如，化学诱变、电离辐射诱变)和靶向遗传修饰(例如，基于CRISPR的方法、基于TALEN的方法、基于锌指的方法)。非天然突变和非天然存在的突变不包括天然发生的自发突变(例如，经由植物种系中的异常DNA复制)。
如本文所用，烟草植物可来自烟草属的任何植物，包括但不限于红花烟草(Nicotiana tabacum)、抱茎烟草(Nicotiana amplexicaulis)PI 271989；本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)PI 555478；毕基劳式烟草(Nicotiana bigelovii)PI 555485；迪勃纳氏烟草(Nicotiana debneyi)；高烟草(Nicotiana excelsior)PI224063；粘烟草(Nicotiana glutinosa)PI 555507；古特斯比氏烟草(Nicotiana goodspeedii)PI241012；哥西氏烟草(Nicotiana gossei)PI 230953；西烟草(Nicotianahesperis)PI271991；奈特氏烟草(Nicotiana knightiana)PI 555527；滨海烟草(Nicotiana maritima)PI 555535；特大管烟草(Nicotiana megalosiphon)PI 555536；裸茎烟草(Nicotiananudicaulis)PI 555540；圆锥烟草(Nicotiana paniculata)PI 555545；蓝茉莉叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)PI 555548；残波烟草(Nicotiana repanda)PI 555552；黄花烟草(Nicotiana rustica)；Nicotiana suaveolens PI 230960；林烟草(Nicotianasylvestris)PI 555569；绒毛烟草(Nicotiana tomentosa)PI 266379；绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)；和三角叶烟草(Nicotiana trigonophylla)PI 555572。在一个方面，本文所述的烟草植物是红花烟草植物。
在一个方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含抑制来自NIC1b基因座、NIC2基因座或两者的一个或多个基因的第一遗传修饰，并且还包含增加烟碱向降烟碱转化的第二遗传修饰。在一个方面，烟草植物或其部分包含在Nic1b基因座中的突变。在一个方面，Nic1b基因座包含选自下组的基因：ERF101,ERF110,ERFnew,ERF199,ERF19,ERF130,ERF16,ERF29,ERF210和ERF91L2。在一个方面，烟草植物包含在选自下组的两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或所有七个基因中的一个或更多个突变：ERFnew,ERF199,ERF16,ERF19,ERF29,ERF210和ERF91L2。在一个方面，烟草植物包含在ERFnew、ERF16或两者中的一个或更多个突变。在一个方面，第一遗传修饰包括降低来自NIC1b基因座的一个或多个非ERF基因的表达或活性的转基因或突变。在一个方面，烟草植物或其部分包含在Nic2基因座中的突变。在一个方面，Nic2基因座包含选自下组的基因：ERF189,ERF115,ERF221,ERF104,ERF179,ERF17和ERF168。在一个方面，烟草植物包含在选自下组的两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或所有七个基因中的一个或更多个突变：ERF189,ERF115,ERF221,ERF104,ERF179,ERF17和ERF168。在一个方面，烟草植物包含在ERF189、ERF115或两者中的一个或更多个突变。在另一个方面，烟草植物包含一个或多个编码烟碱脱甲基酶的转基因(例如CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10)。在另一个方面，烟草植物包含一个或多个当在植物细胞中时能够表达烟碱脱甲基酶的转基因(例如CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10)。在另一个方面，烟草植物包含一个或多个编码烟碱脱甲基酶的转基因CYP82E4v2。在另一个方面，烟草植物包含一个或多个能够表达烟碱脱甲基酶的转基因CYP82E4v2。
在一个方面，烟草植物还包含一个或多个编码抗氧化剂调节蛋白的转基因(例如拟南芥PAP1、马铃薯AN1、红花烟草Myb3)。在一个方面，烟草植物还包含一个或多个能够表达抗氧化剂调节蛋白的转基因(例如拟南芥PAP1、马铃薯AN1、红花烟草Myb3)。
在一个方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含提供一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个基因(所述基因包含与SEQ ID Nos:10-19和30-36具有至少85％、90％、95％、97％、99％同一性的核苷酸序列)的诱变或转基因抑制的第一遗传修饰，并且还包含增加烟碱向降烟碱转化的第二遗传修饰。在一个方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含提供一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个基因(所述基因编码与SEQ ID Nos:20-29和37-43具有至少90％同一性的核苷酸序列)的诱变或转基因抑制的第一遗传修饰，并且还包含增加烟碱向降烟碱转化的第二遗传修饰。在进一步的方面，烟草植物还任选地包含增加一种或更多种抗氧化剂含量的另一种遗传修饰。
在一个方面，本公开的烟草植物包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的突变，一个或多个编码烟碱脱甲基酶的转基因和一个或多个编码抗氧化剂调节蛋白的转基因。在一个方面，本公开的烟草植物包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一种或更多种Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的突变，一个或多个能够表达烟碱脱甲基酶的转基因，以及一个或多个能够表达抗氧化剂调节蛋白的转基因。在一个方面，本公开的烟草植物包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的突变，编码拟南芥PAP1的转基因和编码烟碱脱甲基酶CYP82E4v2的转基因。在一个方面，本公开的烟草植物包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的突变，编码马铃薯AN1的转基因和编码烟碱脱甲基酶CYP82E4v2的转基因。在一个方面，本公开的烟草植物包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的突变，编码烟草Myb3的转基因和编码烟碱脱甲基酶CYP82E4v2的转基因。在一个方面，本公开的烟草植物包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的突变，编码拟南芥PAP1的转基因和编码烟碱脱甲基酶CYP82E5的转基因。在一个方面，本公开的烟草植物包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的突变，编码马铃薯AN1的转基因和编码烟碱脱甲基酶CYP82E5的转基因。在一个方面，本公开的烟草植物包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的突变，编码红花烟草Myb3的转基因和编码烟碱脱甲基酶CYP82E5的转基因。在一个方面，本公开的烟草植物包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的突变，编码拟南芥PAP1的转基因和编码烟碱脱甲基酶CYP82E410的转基因。在一个方面，本公开的烟草植物包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的突变，编码马铃薯AN1的转基因和编码烟碱脱甲基酶CYP82E10的转基因。在一个方面，本公开的烟草植物包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的突变，编码红花烟草Myb3的转基因和编码烟碱脱甲基酶CYP82E10的转基因。
在一个方面，本公开的烟草植物或其部分包含抑制来自Nic1b或NIC2基因座的一个或多个基因的第一遗传修饰，并且还包含增加烟碱向降烟碱转化的第二遗传修饰。在另一个方面，第一遗传修饰包含nic1b或nic2突变等位基因。在另一个方面，nic1b或nic2突变等位基因衍生自古巴雪茄烟草品种、低生物碱白肋烟21(LABU21)、低中级白肋烟21(LIBU21)、低生物碱烤烟53(LAFC53)、低烟碱KY171(LNKY171)或衍生自其的品种。在另一个方面，nic1b或nic2突变等位基因不衍生自古巴雪茄烟草品种、低生物碱白肋烟21(LABU21)、低中级白肋烟21(LIBU21)、低生物碱烤烟53(LAFC53)、低烟碱KY171(LNKY171)或衍生自其的品种。在另一个方面，第一遗传修饰包含降低来自Nic1b或NIC2基因座的一个或多个乙烯响应因子(ERF)基因的表达或活性的转基因或突变。在一个方面，转基因靶向一个或多个选自下组的基因：ERF101、ERF110、ERFnew、ERF199、ERF19、ERF130、ERF16、ERF29、ERF210、和ERF91L2。在进一步的方面，转基因靶向一个或多个选自下组的基因：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17、和ERF168。
在一个方面，本公开的烟草植物或其部分包含遗传修饰，所述遗传修饰包含编码烟碱脱甲基酶的转基因。在另一个方面，转基因编码来自烟草(Nicotiana)属烟草植物的烟碱脱甲基酶基因。在另一个方面，烟碱脱甲基酶包含非天然的、突变的或工程化的氨基酸序列。
在进一步的方面，包含编码烟碱脱甲基酶的转基因的遗传修饰过表达CYP82E4、CYP82E5和CYP85E10多肽中的一个或多个。在另一个方面，遗传修饰包含增加CYP82E4、CYP82E5和CYP85E10多肽中的一个或多个的表达或活性的基因组编辑。在另一个方面，CYP82E4烟碱脱甲基酶是CYP82E4v2。
在另一个方面，本公开的烟草植物或其部分包含与缺乏遗传修饰的对照植物相比增加一种或更多种抗氧化剂的含量的遗传修饰。在另一个方面，遗传修饰包含编码或靶向抗氧化剂生物合成酶、抗氧化剂的调节转录因子、抗氧化剂转运蛋白、抗氧化剂代谢酶或其组合的转基因。在另一个方面，遗传修饰包含编码抗氧化剂生物合成酶、抗氧化剂的调节转录因子、抗氧化剂转运蛋白、抗氧化剂代谢酶或其组合的一个或多个内源基因的修饰。在另一个方面，烟草植物包含编码一个或多个选自下组的多肽的转基因：AtPAP1、Ntmyb3A、Ntmyb3B、Ntmyb3C、NtJAF13、StAN1、NtAN1和NtAN2。参见美国专利申请公开US2018/0119163，其全部内容通过引用并入本文。
在一个方面，本公开的烟草植物或其部分包含增加量的一种或更多种抗氧化剂。在一个方面，具有增加的量的抗氧化剂选自下组：花青素、黄烷酮、黄烷醇、黄酮、黄酮醇、异黄酮、羟基苯甲酸、羟基肉桂酸、鞣花单宁、芪类(stibene)、木酚素、类胡萝卜素和甘草甜素。在另一个方面，具有增加的量的抗氧化剂选自下组：飞燕草素、花青素、原花青素、飞燕草素、橙皮素、柚皮素、儿茶素、表儿茶素、芹菜素、木犀草素(Luteonin)、槲皮素、杨梅素、芸香素、染料木黄酮、大豆黄素、没食子酸、香草酸、原儿茶酸、阿魏酸、肉桂酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、血根素、白藜芦醇、芝麻素、类胡萝卜素(Caretonoids)和维生素C。
在一个方面，本公开的烟草植物在熟化时能够产生具有选自下组的USDA等级指数值的叶：55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高和95或更高。在另一个方面，烟草植物在熟化时能够产生USDA等级指数值与在相似条件下生长且熟化时的对照植物的USDA等级指数值相当的叶，其中除目标突变或修饰以外，对照植物与该烟草植物具有基本相同的遗传背景。
在另一个方面，本公开的烟草植物在熟化时能够产生USDA等级指数值为在相似条件下生长时的对照植物的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的叶，其中除目标突变或修饰以外，对照植物与该烟草植物具有基本相同的遗传背景。
在另一个方面，本公开的烟草植物在熟化时能够产生USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的65％-130％、70％-130％、75％-130％、80％-130％、85％-130％、90％-130％、95％-130％、100％-130％、105％-130％、110％-130％、115％-130％或120％-130％的叶。在另一个方面，烟草植物在熟化时能够产生USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的70％-125％、75％-120％、80％-115％、85％-110％或90％-100％的叶。在一个方面，烟草植物包含烟碱含量低于在相似生长条件下生长时的对照植物的烟碱含量的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％，其中除目标突变或修饰以外，对照植物与该烟草植物具有基本相同的遗传背景。
在一个方面，来自经修饰的烟草植物的熟化叶产生或包含少于2、少于1.8、少于1.5、少于1.2、少于1.0、少于0.8、少于0.6、少于0.4、少于0.3、少于0.2、少于0.15、少于0.1或少于0.05ppm的总TSNA。在一个方面，来自经修饰的烟草植物的熟化叶包含2ppm-0.05ppm、1.8ppm-0.05ppm、1.5ppm-0.05ppm、1.2ppm-0.05ppm、1.0ppm-0.05ppm、0.8ppm-0.05ppm、0.6ppm-0.05ppm、0.4ppm-0.05ppm、0.3ppm-0.05ppm、0.2ppm-0.05ppm、0.15ppm-0.05ppm或0.1ppm-0.05ppm的总TSNA。在一个方面，来自经修饰的烟草植物的熟化叶包含2ppm-0.05ppm、1.8ppm-0.1ppm、1.5ppm-0.15ppm、1.2ppm-0.2ppm、1.0ppm-0.3ppm、0.8ppm-0.4ppm或0.6ppm-0.5ppm的总TSNA。
在一个方面，经修饰的烟草植物产生或包含少于2、少于1.8、少于1.5、少于1.2、少于1.0、少于0.8、少于0.6、少于0.4、少于0.3、少于0.2、少于0.15、少于0.1或少于0.05ppm的总NNN。在一个方面，来自经修饰的烟草植物的熟化叶包含2ppm-0.05ppm、1.8ppm-0.05ppm、1.5ppm-0.05ppm、1.2ppm-0.05ppm、1.0ppm-0.05ppm、0.8ppm-0.05ppm、0.6ppm-0.05ppm、0.4ppm-0.05ppm、0.3ppm-0.05ppm、0.2ppm-0.05ppm、0.15ppm-0.05ppm或0.1ppm-0.05ppm的总NNN。在一个方面，来自经修饰的烟草植物的熟化叶包含2ppm-0.05ppm、1.8ppm-0.1ppm、1.5ppm-0.15ppm、1.2ppm-0.2ppm、1.0ppm-0.3ppm、0.8ppm-0.4ppm或0.6ppm-0.5ppm的总NNN。
在一个方面，经修饰的烟草植物产生或包含少于2、少于1.8、少于1.5、少于1.2、少于1.0、少于0.8、少于0.6、少于0.4、少于0.3、少于0.2、少于0.15、少于0.1或少于0.05ppm的总NNK。在一个方面，来自经修饰的烟草植物的熟化叶包含2ppm-0.05ppm、1.8ppm-0.05ppm、1.5ppm-0.05ppm、1.2ppm-0.05ppm、1.0ppm-0.05ppm、0.8ppm-0.05ppm、0.6ppm-0.05ppm、0.4ppm-0.05ppm、0.3ppm-0.05ppm、0.2ppm-0.05ppm、0.15ppm-0.05ppm或0.1ppm-0.05ppm的总NNK。在一个方面，来自经修饰的烟草植物的熟化叶包含2ppm-0.05ppm、1.8ppm-0.1ppm、1.5ppm-0.15ppm、1.2ppm-0.2ppm、1.0ppm-0.3ppm、0.8ppm-0.4ppm或0.6ppm-0.5ppm的总NNK。
在另一个方面，本公开的烟草植物包含选自下组的总生物碱含量：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％和小于0.05％。在另一个方面，烟草植物包含选自下组的烟碱或总生物碱含量：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％和小于0.05％。在进一步的方面，烟草植物还包含直接抑制一个或多个编码选自下组的产物的基因的表达或活性的转基因或突变：PMT、MPO、QPT、BBL、A622、天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚胺酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、烟碱摄取通透酶(NUP)和MATE转运蛋白。
在另一个方面，烟草植物在熟化时能够产生具有选自下组的USDA等级指数值的叶：55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高和95或更高。在另一个方面，烟草植物在熟化时能够产生具有选自下组的USDA等级指数值的叶：50-95、55-95、60-95、65-95、70-95、75-95、80-95、85-95、90-95、55-90、60-85、65-80、70-75、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90和90-95。在另一个方面，烟草植物在熟化时能够产生USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的叶。在另一个方面，烟草植物在熟化时能够产生USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的65％-130％、70％-130％、75％-130％、80％-130％、85％-130％、90％-130％、95％-130％、100％-130％、105％-130％、110％-130％、115％-130％或120％-130％的叶。在进一步的方面，烟草植物在熟化时能够产生USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的70％-125％、75％-120％、80％-115％、85％-110％或90％-100％的叶。在另一个方面，烟草植物包含为在相似生长条件下生长时的对照植物的烟碱或总生物碱含量的1％以下、2％以下、5％以下、8％以下、10％以下、12％以下、15％以下、20％以下、25％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下或80％以下的烟碱或总生物碱含量。在另一个方面，烟草植物还包含直接抑制一个或多个编码选自下组的产物的基因的表达或活性的转基因或突变：PMT、MPO、QPT、BBL、A622、天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚胺酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、烟碱摄取通透酶(NUP)和MATE转运蛋白。
在一个方面，本公开还提供包含nic1b或nic2突变的烟草品种、栽培品种或品系，其包含增加烟碱向降烟碱转化的遗传修饰，并且还任选地包含增加一种或更多种抗氧化剂的含量的另一种遗传修饰，其中所述烟草品种、栽培品种或品系的叶等级与在相似生长条件下生长时的对照烟草品种、栽培品种或品系的叶等级相当，其中除目标突变或修饰以外，对照烟草品种与该烟草品种、栽培品种或品系具有基本相同的遗传背景。
在一个方面，本公开提供本文公开的任何烟草植物的群体。
在一个方面，本公开提供本文公开的任何烟草植物的熟化烟草材料。在进一步的方面，本公开提供包含本文公开的任何烟草植物的熟化烟草材料的烟草混合物。在另一个方面，本公开提供包含本文提供的熟化烟草材料的烟草制品。
在另一个方面，本公开的熟化烟草材料的烟草混合物构成所述烟草混合物中的熟化烟草的约至少10重量％、至少15重量％、至少20重量％、至少25重量％、至少30重量％、至少35重量％、至少40重量％、至少45重量％、至少50重量％、至少55重量％、至少60重量％、至少65重量％、至少70重量％、至少75重量％、至少80重量％、至少85重量％、至少90重量％或至少95重量％。在另一个方面，本公开的熟化烟草材料的烟草混合物构成所述烟草混合物中的熟化烟草的约至少10体积％、至少15体积％、至少20体积％、至少25体积％、至少30体积％、至少35体积％、至少40体积％、至少45体积％、至少50体积％、至少55体积％、至少60体积％、至少65体积％、至少70体积％、至少75体积％、至少80体积％、至少85体积％、至少90体积％或至少95体积％。
在一个方面，提供的烟草植物还包含一个或多个表达一种或更多种烟碱脱甲基酶蛋白的转基因(例如，CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10)，该烟碱脱甲基酶蛋白赋予与缺乏一个或多个表达烟碱脱甲基酶的转基因的对照植物相比增加量的降烟碱(参见美国专利号8,319,011；8,124,851；9,187,759；9,228,194；9,228,195；9,247,706)。在一个方面，提供的烟草植物还包含一个或多个编码一种或更多种烟碱脱甲基酶蛋白的转基因(例如CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10)，所述转基因赋予与缺乏一个或多个编码烟碱脱甲基酶的转基因的对照植物相比增加量的降烟碱。在一个方面，当在相当条件下生长和熟化时，所描述的经修饰的烟草植物与对照植物相比还包含增加的烟碱脱甲基酶活性。
在一个方面，本公开提供能够产生熟化烟叶的经修饰的烟草植物，所述经修饰的烟草植物包含降低含量的一种或更多种烟草特异性亚硝胺(TSNA)并且还包含增加含量的一种或更多种抗氧化剂，其中该降低和增加的含量与在相当条件下生长和熟化时的对照烟草植物或来自相同品种的对照烟草植物的熟化叶相当。在一个方面，一种或更多种TSNA的降低的含量小于来自对照植物的熟化叶中一种或更多种TSNA的含量的50％。在另一个方面，当在相当条件下生长和熟化时，经修饰的烟草植物与对照烟草植物相比还包含增加含量的氧自由基吸收能力(ORAC)。
另一个方面，当在相当条件下生长和熟化时，来自经修饰的烟草植物的熟化叶与来自对照烟草植物的熟化叶相比包含降低含量的总TSNA。在一个方面，还原的一种或更多种TSNA选自N'-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝氨基)-l-(3-吡啶基)-l-丁酮(NNK)、N'-亚硝基新烟草碱(NAT)、N'-亚硝基假木贼碱(NAB)及其任何组合。在一个方面，使用具有串联质谱法的液相色谱(LC/MS/MS)基于冷冻干燥的熟化叶样品测量总TSNA或单独TSNA的含量。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含与SEQ ID NO:1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同源性的序列的转基因。在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含与SEQ ID NO:1具有至少70％同源性的序列的转基因。在一个方面，所述转基因包含与SEQ ID NO:1具有至少75％同源性的序列。在一个方面，所述转基因包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的序列。在一个方面，所述转基因包含与SEQ ID NO:1具有至少85％同源性的序列。在一个方面，所述转基因包含与SEQ IDNO:1具有至少90％同源性的序列。在一个方面，所述转基因包含与SEQ ID NO:1具有至少91％同源性的序列。在一个方面，转基因包含与SEQ ID NO:1具有至少92％同源性的序列。在一个方面，所述转基因包含与SEQ ID NO:1具有至少93％同源性的序列。在一个方面，所述转基因包含与SEQ ID NO:1具有至少94％同源性的序列。在一个方面，所述转基因包含与SEQ ID NO:1具有至少95％同源性的序列。在一个方面，转基因包含与SEQ ID NO:1具有至少96％同源性的序列。在一个方面，转基因包含与SEQ ID NO:1具有至少97％同源性的序列。在一个方面，所述转基因包含与SEQ ID NO:1具有至少98％同源性的序列。在一个方面，所述转基因包含与SEQ ID NO:1具有至少99％同源性的序列。在一个方面，所述转基因包含与SEQ ID NO:1具有至少100％同源性的序列。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含与SEQ ID NO:1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同源性的序列的转基因并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含与SEQ ID NO:2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同源性的序列。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含与SEQ ID NO:1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同源性的序列的转基因并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含与SEQ ID NO:3具有70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同源性的序列。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含与SEQ ID NO:1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同源性的序列的转基因并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含与SEQ ID NO:4具有70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同源性的序列。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含SEQ ID NO:1的转基因并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含与SEQ ID NO:2具有70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同源性的序列。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含SEQ ID NO:1的转基因并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含与SEQ ID NO:3具有70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同源性的序列。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含SEQ ID NO:1的转基因并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含与SEQ ID NO:4具有70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同源性的序列。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含SEQ ID NO:1的转基因并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含与SEQ ID NO:2具有至少70％同源性的序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:2具有至少75％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:2具有至少85％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ IDNO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:2具有至少90％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ IDNO:2具有至少91％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，烟草植物包含含有SEQ IDNO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:2具有至少92％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ IDNO:2具有至少93％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:2具有至少94％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQID NO:2具有至少95％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:2具有至少96％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:2具有至少97％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:2具有至少98％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:2具有至少99％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:2具有至少100％同源性的序列的第二转基因。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含SEQ ID NO:1的转基因并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含与SEQ ID NO:3具有至少70％同源性的序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:3具有至少75％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:3具有至少80％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:3具有至少85％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ IDNO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:3具有至少90％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ IDNO:3具有至少91％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:3具有至少92％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ IDNO:3具有至少93％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:3具有至少94％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQID NO:3具有至少95％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:3具有至少96％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:3具有至少97％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:3具有至少98％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:3具有至少99％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:3具有至少100％同源性的序列的第二转基因。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含SEQ ID NO:1的转基因并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含与SEQ ID NO:4具有至少70％同源性的序列。在另一个方面，烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:4具有至少75％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:4具有至少80％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:4具有至少85％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:4具有至少90％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:4具有至少91％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:4具有至少92％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:4具有至少93％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:4具有至少94％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:4具有至少95％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:4具有至少96％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，所述烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:4具有至少97％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:4具有至少98％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:4具有至少99％同源性的序列的第二转基因。在另一个方面，烟草植物包含含有SEQ ID NO:1的转基因，并且还包含含有与SEQ ID NO:4具有至少100％同源性的序列的第二转基因。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含编码与SEQ ID NO:5具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列的转基因。在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中至少一个突变和包含编码与SEQ ID NO:5具有至少70％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列的转基因。在一个方面，所述转基因包含编码与SEQ ID NO:5具有至少75％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在一个方面，所述转基因包含编码与SEQ ID NO:5具有至少80％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在一个方面，所述转基因包含编码与SEQ ID NO:5具有至少85％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在一个方面，所述转基因包含编码与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在一个方面，所述转基因包含编码与SEQ ID NO:5具有至少91％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在一个方面，所述转基因包含编码与SEQ ID NO:5具有至少92％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在一个方面，所述转基因包含编码与SEQ ID NO:5具有至少93％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在一个方面，所述转基因包含编码与SEQ ID NO:5具有至少94％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在一个方面，所述转基因包含编码与SEQ IDNO:5具有至少95％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在一个方面，所述转基因包含编码与SEQ ID NO:5具有至少96％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在一个方面，转基因包含编码与SEQ ID NO:5具有至少97％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在一个方面，所述转基因包含编码与SEQ ID NO:5具有至少98％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在一个方面，所述转基因包含编码与SEQ ID NO:5具有至少99％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在一个方面，所述转基因包含编码与SEQ ID NO:5具有至少100％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含编码与SEQ ID NO:5具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的蛋白质的核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含编码与SEQ ID NO:5具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的蛋白质的核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含编码与SEQ ID NO:5具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的蛋白质的核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的蛋白质的核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少70％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少75％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少85％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少91％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少92％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少93％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少94％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少95％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少96％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少97％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少98％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少99％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:6具有至少100％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有至少70％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有至少75％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有至少80％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有至少85％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有至少90％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有至少91％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有至少92％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有至少93％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有至少94％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有至少96％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有至少97％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有至少98％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有至少99％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:7具有至少100％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供烟草植物，其包含在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)中的至少一个突变和包含编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少70％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少75％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少85％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少90％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少91％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少92％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少93％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少94％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少96％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少97％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少98％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少99％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。在另一个方面，所述烟草植物包含含有编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的转基因，并且还包含第二转基因，所述第二转基因包含编码与SEQ ID NO:8具有至少100％同一性的蛋白质序列的核苷酸序列。
在一个方面，低烟碱和/或低TSNA烟草植物(例如，CYP82E4v2和Myb3(或AtPAP1)的过表达或含量升高)还包含提供降低含量的新烟草碱的一种或更多种遗传修饰。提供降低新烟草碱的示例性遗传修饰可见于US 20160010103A1和US 10375910B2中。在一个方面，降低新烟草碱的遗传修饰包括喹啉酸合酶(QS)基因中的突变。另一个方面，QS基因突变包括导致在对应于US 20160010103A1的SEQ ID NO:8的第487位半胱氨酸残基和/或第516位缬氨酸残基的位置上的氨基酸取代的突变。在另一个方面，降低新烟草碱的遗传修饰存在于、渗入自或源自烟草株系dMS932，其中所述烟草植物的种子的代表性样品以ATCC保藏号PTA-124990保藏。在另一个方面，降低新烟草碱的遗传修饰存在于、渗入自或源自US10375910B2的选自下组的烟草株系：MS108、MS445、MS170和MS3908。
在一个方面，本公开还提供烟草植物或其部分，其包含选自下组的烟碱或总生物碱含量：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％和小于0.05％，其中该烟草植物在熟化时能够产生USDA等级指数值为50或更高、55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高、和95或更高的叶。在另一个方面，该非转基因烟草植物包含低于2.0％的烟碱含量，并且在熟化时能够产生USDA等级指数值为70或更高的叶。在另一个方面，该非转基因烟草植物包含低于1.0％的烟碱含量，并且在熟化时能够产生USDA等级指数值为70或更高的叶。
在一个方面，本公开还提供包含非转基因突变的烟草植物或其部分，其中当在类似生长条件下生长时，所述非转基因突变将所述烟草植物的烟碱或总生物碱含量降低至对照植物的烟碱含量的1％以下、2％以下、5％以下、8％以下、10％以下、12％以下、15％以下、20％以下、25％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下或80％以下，其中所述烟草植物在熟化时能够产生USDA等级指数值与所述对照植物的USDA等级指数值相当的叶，并且其中除目标突变或修饰以外，对照植物与该烟草植物具有基本相同的遗传背景。
在一个方面，当在相当条件下生长和熟化时，降低或增加的含量比对照烟草植物或来自对照烟草植物的熟化叶中的含量低或高约10％以内、约20％以内、约30％以内、约40％以内、约50％以内、约60％以内、约70％以内、约80％以内、约90％以内、约92％以内、约94％以内、约95％以内、约96％以内、约97％以内、约98％以内或约99％以内。
在另一个方面，当在相当条件下生长和熟化时，降低或增加的含量比对照烟草植物或来自对照烟草植物的熟化叶中的含量低或高约1倍以内、约2倍以内、约3倍以内、约4倍以内、约5倍以内、约6倍以内、约7倍以内、约8倍以内、约9倍以内、约10倍以内、约15倍以内、约20倍以内、约25倍以内、或约30倍以内。
在一个方面，当在相当条件下生长和熟化时，降低或增加的含量比对照烟草植物或来自对照烟草植物的熟化叶中的含量低或高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
在另一个方面，当在相当条件下生长和熟化时，降低或增加的含量比对照烟草植物或来自对照烟草植物的熟化叶中的含量低或高至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、或至少约30倍。
在一个方面，当在相当条件下生长和熟化时，降低或增加的含量比对照烟草植物或来自对照烟草植物的熟化叶中的含量低或高约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％。
在另一个方面，当在相当条件下生长和熟化时，降低或增加的含量比对照烟草植物或来自对照烟草植物的熟化叶中的含量低或高约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍或约30倍。
在一个方面，当在相当条件下生长和熟化时，降低或增加的含量比对照烟草植物或来自对照烟草植物的熟化叶中的含量低或高约1-2倍、约2-3倍、约3-4倍、约4-5倍、约5-6倍、约6-7倍、约7-8倍、约8-9倍、约9-10倍、约10-15倍、约15-20倍、约20-25倍、约25-30倍或约30-50倍。
在另一个方面，当在相当条件下生长和熟化时，降低或增加的含量比对照烟草植物或来自对照烟草植物的熟化叶中的含量低或高约1-10倍、约2-10倍、约3-10倍、约4-10倍、约5-10倍、约6-10倍、约7-10倍、约8-10倍、约9-10倍、约10-50倍、约15-50倍、约20-50倍、约25-50倍或约30-50倍。
在一个方面，来自经修饰的烟草植物的熟化叶产生或包含小于2、小于1.8、小于1.5、小于1.2、小于1.0、小于0.8、小于0.6、小于0.4、小于0.3、小于0.2、小于0.15、小于0.1或小于0.05ppm的总TSNA。在一个方面，来自经修饰的烟草植物的熟化叶包含2ppm-0.05ppm、1.8ppm-0.05ppm、1.5ppm-0.05ppm、1.2ppm-0.05ppm、1.0ppm-0.05ppm、0.8ppm-0.05ppm、0.6ppm-0.05ppm、0.4ppm-0.05ppm、0.3ppm-0.05ppm、0.2ppm-0.05ppm、0.15ppm-0.05ppm或0.1ppm-0.05ppm的总TSNA。在一个方面，来自经修饰的烟草植物的熟化叶包含2ppm-0.05ppm、1.8ppm-0.1ppm、1.5ppm-0.15ppm、1.2ppm-0.2ppm、1.0ppm-0.3ppm、0.8ppm-0.4ppm或0.6ppm-0.5ppm的总TSNA。
在一个方面，较低烟碱含量是指平均烟碱含量低于对照烟草植物的平均烟碱含量的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。在另一个方面中，较低烟碱含量是指平均烟碱含量为对照烟草植物的平均烟碱含量的约0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-6％、7％-8％、8％-9％、9％-10％、11％-12％、12％-13％、14％-15％、15％-16％、17％-18％、18％-19％、19％-20％、21％-22％、22％-23％、23％-24％、25％-26％、26％-27％、27％-28％、28％-29％、29％-30％。在另一个方面，较低烟碱含量是指平均烟碱含量为对照烟草植物的平均烟碱含量的约0.5％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％。
在一个方面，本文提供的烟草植物包含选自下组的平均烟碱或总生物碱含量：以干重计，约0.01％、0.02％、0.05％、0.75％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.35％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、5％、6％、7％、8％和9％。在另一个方面，本文提供的烟草植物包含选自下组的平均烟碱或总生物碱含量：以干重计，约0.01％-0.02％、0.02％-0.05％、0.05％-0.75％、0.75％-0.1％、0.1％-0.15％、0.15％-0.2％、0.2％-0.3％、0.3％-0.35％、0.35％-0.4％、0.4％-0.5％、0.5％-0.6％、0.6％-0.7％、0.7％-0.8％、0.8％-0.9％、0.9％-1％、1％-1.1％、1.1％-1.2％、1.2％-1.3％、1.3％-1.4％、1.4％-1.5％、1.5％-1.6％、1.6％-1.7％、1.7％-1.8％、1.8％-1.9％、1.9％-2％、2％-2.1％、2.1％-2.2％、2.2％-2.3％、2.3％-2.4％、2.4％-2.5％、2.5％-2.6％、2.6％-2.7％、2.7％-2.8％、2.8％-2.9％、2.9％-3％、3％-3.1％、3.1％-3.2％、3.2％-3.3％、3.3％-3.4％、3.4％-3.5％和3.5％-3.6％。在进一步的方面，本文提供的烟草植物包含选自下组的平均烟碱或总生物碱含量：以干重计，约0.01％-0.1％、0.02％-0.2％、0.03％-0.3％、0.04％-0.4％、0.05％-0.5％、0.75％-1％、0.1％-1.5％、0.15％-2％、0.2％-3％和0.3％-3.5％。
LA白肋烟21(也称为LABU21)是通过将来自古巴雪茄品种的低生物碱基因通过若干次回交掺入白肋烟21中而产生的低总生物碱烟草品系(Legg et al.1970)。其具有约0.2％总生物碱(干重)，而其亲本(白肋烟21)具有约3.5％总生物碱(干重)。LA BU21的叶等级远低于商业上可接受的标准。LA BU21还表现出其它不利的叶表型，其特征在于较低的产量、延迟的成熟和衰老、较高的对昆虫食草的敏感性和熟化后较差的终产物质量(Chaplinand Weeks,Crop Sci.16:416–418(1976)；Legg et al.Crop.Sci.10:212(1970)；Chaplinand Burk,Crop Sci.75:133–136(1983))。LABU21叶还表现出诸如更高的多胺含量、更高的叶绿素含量和更多的叶肉细胞/单位叶面积的性状。
LA白肋烟21品系包含nic1和nic2病变，并且包含基于干重约0.3％的平均烟碱量(范围为约0.2-0.6％)。低中级(LI)白肋烟21包含nic1病变和野生型Nic2基因座，并且包含约2.3％的平均烟碱量(范围为约1.5-3.0％)。高中级(HI)白肋烟21包含野生型Nic1基因座和nic2病变，并且平均烟碱量为约3.7％(范围为约2.5-5.0％)。野生型白肋烟21(也称为“BU21”)(Nic1 Nic2)包含约4.7％的平均烟碱量(范围为约4.0-6.0％))。参见美国专利申请公开US2016/0374387，其全部内容通过引用并入本文。先前Shoji et.al(2010)报道了nic2基因座以包含7个乙烯反应因子(ERF)基因的缺失。将这些缺失的ERF基因映射至TN90基因组的单个连续区域。
在一个方面，经修饰的烟草植物包含能够提供降低含量的一种或更多种TSNA的一种或更多种突变或修饰。在另一个方面，一种或更多种突变还能够提供选自以下的一种或更多种性状：i.增加含量的氧自由基吸收能力(ORAC)，和ii.增加含量的一种或更多种抗氧化剂；其中当在相当条件下生长和熟化时，所述降低或增加的含量与对照烟草植物或来自对照烟草植物的熟化叶相当。参见美国专利申请公开US2018/0119163，其全部内容通过引用并入本文。
除非另有说明，否则本文提及的烟草植物、品种、栽培品种或品系的生物碱、多胺或烟碱含量(或另一叶化学或特性表征)或叶等级指数值的测量值是指平均测量值，包括例如单株植物的多个叶的平均值或来自单个品种、栽培品种或品系的烟草植物群体的平均测量值。除非另有说明，本文所述的烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一叶化学或特性表征)在打顶后2周在收集自打顶后第3、4和5号叶的合并叶样品中测量。在另一个方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一叶化学或特性表征)在打顶后在具有最高烟碱、生物碱或多胺含量(或另一叶化学或特性表征)的叶中测量。在一个方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量在打顶后在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30号叶中测量。在另一个方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一叶化学或特性表征)在打顶后在具有选自下组的连续叶编号的两片或更多片叶的集合中测量：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。在另一个方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一叶化学或特性表征)在打顶后在叶编号选自下组的叶中测量：1-5、6-10、11-15、16-20、21-25和26-30。在另一个方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一叶化学或特性表征)在打顶后在具有选自下组的叶编号的两片或更多片叶的集合中测量：1-5、6-10、11-15、16-20、21-25和26-30。在另一个方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一叶化学或特性表征)在打顶后在具有选自下组的叶编号的三片或更多片叶的集合中测量：1-5、6-10、11-15、16-20、21-25和26-30。
如本文所用，叶编号基于烟草茎上的叶位置，其中叶编号1是打顶后最嫩的叶(在顶部)并且最高的叶编号分配给最老的叶(在底部)。
用于测定平均测量值(例如，生物碱或烟碱含量或叶等级)的烟草植物群体或烟叶集合可以是任何大小，例如，5、10、15、20、25、30、35、40或50。遵循工业上可接受的标准来确定平均测量值或等级指数值。
如本文所用，“打顶”是指当烟草植物接近营养成熟期并在大约生殖生长开始时，去除茎尖，包括SAM、花和多达几个相邻叶。典型地，烟草植物在纽扣阶段(花开始出现后不久)被打顶。例如，当50％的植物具有至少一朵开放的花时，温室或田间生长的烟草植物可以被打顶。打顶烟草植物导致顶端优势的丧失并且还诱导生物碱产量的增加。
典型地，在打顶后约2周测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一叶化学或特性表征)。也可以使用其它时间点。在一个方面，在打顶后约1、2、3、4或5周测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一叶化学或特性表征)。在另一个方面，在打顶后约3、5、7、10、12、14、17、19或21天测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一叶化学或特性表征)。
除非另有说明，烟草植物的烟碱或生物碱含量(或另一叶化学或特性表征)在打顶后在收集自打顶后第3、4和5号叶的合并叶样品中测量。如本文所用，每当提及来自两种植物(例如，突变体植物VS对照植物)的叶之间的比较时，预期来自相同或相当的茎位置和发育阶段的叶使得该比较可证明归因于基因型差异而非来自其它因素的效应。
如本文所用，“相似生长条件”或“相当生长条件”或“相当条件”是指用于在两种或更多种植物基因型之间生长和进行有意义的比较的相似的环境条件和/或农艺实践，使得环境条件或农艺实践都不会有助于或解释在两种或更多种植物基因型之间观察到的任何差异。环境条件包括例如光、温度、水(湿度)和营养(例如氮和磷)。农艺实践包括例如播种、修剪、底切、移植、打顶和吮吸。参见Tobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford(1999),pp 70-103的第4B和4C章。
“生物碱”是在植物中天然存在的复杂的含氮化合物，并且在人和动物中具有药理学作用。“烟碱”是商品化香烟烟草中的主要天然生物碱，占红花烟草中生物碱含量的约90％。烟草中的其它主要生物碱包括可替宁、降烟碱、麦斯明、二烯烟碱、假木贼碱和新烟草碱。次要烟草生物碱包括烟碱-n-氧化物、N-甲基新烟草碱、N-甲基假木贼碱、假氧化烟碱、2,3联吡啶和其它。
生物碱含量可以通过本领域已知的方法测定，例如通过基于气液色谱法、高效液相色谱法、放射免疫测定法和酶联免疫吸附测定法的定量。例如，烟碱生物碱含量可以通过基于CORESTA推荐的方法No.7,1987和ISO标准(ISO TC 126N 394E.See also Hibi etal.,Plant Physiology 100:826-35(1992))，使用配备有毛细管柱和FID检测器的气液色谱法测量。除非另有说明，本文所述的所有生物碱含量使用根据CORESTA方法No 62，Determination of Nicotine in Tobacco and Tobacco Products by GasChromatographic Analysis,February 2005，和定义于疾病控制中心以及1999年3月23日出版的Federal Register第64卷，第55号(和2009年1月7日修订的第74卷，第4号)的Prevention’s Protocol for Analysis of Nicotine,Total Moisture and pH inSmokeless Tobacco Products的那些方法测量。
或者，烟草总生物碱可使用被开发用于分析烟草样品的分段流动比色法测量，该方法由Skalar Instrument Co(West Chester,PA)改进并描述于Collins et al.,TobaccoScience 13:79-81(1969)。简言之，在分析总生物碱和还原糖之前，将烟草样品干燥、研磨并提取。然后，该方法采用乙酸/甲醇/水提取和木炭进行脱色。总生物碱的测定基于氯化氰与烟碱生物碱在芳族胺存在下反应形成有色络合物，其在460nm下测量。除非另有说明，本文所示的总生物碱含量或烟碱含量是基于干重(例如，总生物碱百分比或烟碱百分比)。
如本文所用，“降低的”或“增加的”含量是指与参照点相比统计学上显著的变化(降低或增加)。如本文所用，“统计上显著的”是指当使用统计显著性的适当量度(例如，单侧双样本t-检验)时，小于0.05的p值、小于0.025的p值、小于0.01的p值或小于0.001的p值。
如本文所用，“对照植物”是指比较植物，取决于对照植物的上下文或目的，其是相同品种的未修饰的烟草植物或不具有目标转基因的烟草植物。对照烟草植物和目标植物在相当条件下生长和熟化。
本公开还提供具有改变的烟碱含量而对其他烟草性状(例如叶等级指数值)没有负面影响的烟草植物。在一个方面，低烟碱或无烟碱烟草品种提供商业上可接受等级的熟化烟草。基于以下因素评价烟草等级，所述因素包括但不限于叶茎位置、叶尺寸、叶颜色、叶均匀性和完整性、成熟度、质地、弹性、光泽(与叶的着色强度和深度以及光泽有关)、吸湿性(烟叶吸收和保留环境水分的能力)和绿色细微差别或脱落。叶等级可以例如使用由美国农业部的Agricultural Marketing Service公布的官方标准等级(7U.S.C.§511)来测定。参见，例如，1990年11月5日生效的白肋烟的官方标准等级(美国31型和外国93型)(55F.R。40645)；1989年3月27日生效的烤烟的官方标准等级(美国11，12，13，14型和外国92型)(54F.R.7925)；1965年1月8日生效的宾夕法尼亚州宽叶烟草的官方标准等级(U.S.Type41)(29F.R.16854)；1963年12月8日生效的俄亥俄州雪茄烟草的官方标准等级(美国42，43和44型)(28F.R.11719和28F.R.11926)；1969年11月20日生效的威斯康星州雪茄内包叶烟草的官方标准等级(美国54和55型)(34F.R.17061)；1969年11月20日生效的威斯康星州雪茄内包叶烟草的官方标准等级(美国54和55型)(34F.R.17061)；1971年4月生效的佐治亚州和佛罗里达州荫下栽种雪茄外***烟草的官方标准等级(美国62型)。USDA等级指数值可以根据工业上可接受的等级指数来确定。参见，例如，Bowman et al,Tobacco Science,32:39-40(1988)；传统烟草文档库(Bates文档#523267826-523267833，1988年7月1日，Memorandumon the Proposed Burley Tobacco Grade Index)；和Miller et al.,1990,TobaccoIntern.,192:55-57(所有上述参考文献通过引用以其全部并入)。除非另有说明，USDA等级指数是所接收的联邦等级的0-100数值表示，并且是所有茎位置的加权平均值。等级指数越高表示质量越高。或者，可以经由高光谱成像来确定叶等级。参见例如WO2011/027315(于2011年3月10日公开，并且通过引用以其全部并入)。
在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物包含具有降低的总TSNA的烟叶并且还包含一种或更多种所需的或增强的特性，例如在打顶之前或之后抑制或降低的烟杈生长(sucker growth)。在一个方面，当在相当条件下生长和熟化时，与缺乏此类修饰的对照植物相比，本文提供的经修饰的植物包含更少的总烟杈、更小的烟杈或两者兼有。在一个方面，与在相当条件下生长和熟化的对照植物的烟杈相比，本文提供的经修饰的植物的较小烟杈包含减小的质量、减小的长度、减小的直径或其组合。
在一个方面，当在相似生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，本文提供的烟草植物包含相似含量的一种或更多种选自下组的烟草芳香化合物：3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、labdenoid、西松烷、糖酯和还原糖。在另一个方面，本文提供的烟草植物包含nic1突变、nic2突变或其组合，其对选自下组的一种或更多种烟草芳香化合物的含量没有影响：3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、labdenoid、西松烷、糖酯和还原糖。
如本文所用，烟草香气化合物是与烟草烟气的风味和香气相关的化合物。这些化合物包括但不限于3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、西松烷和labdenoid双萜以及糖酯。烟草芳香化合物的浓度可以通过本领域任何已知的代谢物图谱方法测定，包括但不限于气相色谱质谱(GC-MS)、核磁共振光谱、液相色谱-连接质谱。参见The Handbook of PlantMetabolomics,由Weckwerth和Kahl编辑,(Wiley-Blackwell)(2013年5月28日)。
如本文所用，“还原糖”是具有游离或潜在游离的醛基或酮基的任何糖(单糖或多糖)。通过降低烟气pH和有效降低“游离”未质子化烟碱的量，葡萄糖和果糖在香烟烟雾中充当烟碱缓冲剂。例如，还原糖通过改变烟碱和其它烟草生物碱的感官影响来平衡烟味。已经报道了在烟草品种间、相同品种内以及由种植条件引起的相同株系内，糖含量和生物碱含量之间呈反比关系。还原糖含量可以使用被开发用于分析烟草样品的分段流动比色法测量，该方法由Skalar Instrument Co(West Chester,PA)改进并描述于Davis,TobaccoScience 20:139-144(1976)。例如，用碳酸钠溶液透析样品。将铜新铜试剂添加到样品中并加热溶液。铜新铜试剂螯合物在糖的存在下还原，得到在460nm下测量的有色络合物。
在一个方面，本文提供的烟草植物在Nic1b或Nic2基因座(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)包含一个或更多个非天然存在的突变等位基因，其降低或消除Nic1b或Nic2基因座的一个或更多个基因(例如，一个或更多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)的基因活性。在一个方面，这些突变等位基因导致较低的烟碱含量。突变体Nic2等位基因可以通过本领域已知的任何方法引入，包括随机或靶向诱变途径。
如本文所用，突变是指引入基因中以降低、抑制或消除由基因编码的产物的表达或活性的可遗传的遗传修饰。该修饰可以在基因的任何序列区域中，例如在启动子、5'UTR、外显子、内含子、3'UTR或终止子区域中。在一个方面，突变不是存在于特定烟草品种或栽培品种中的天然多态性。如本文所用，“突变等位基因”是指来自其中等位基因包含突变的基因座的等位基因。
本文提供的诱变方法包括但不限于用甲基硫酸乙酯(EMS)处理种子(Hilderingand Verkerk,In,The use of induced mutations in plant breeding.Pergamon press,pp 317-320,1965)或UV-辐射、X-射线和快中子辐射(参见，例如Verkerk,Neth.J.Agric.Sci.19:197-203,1971；and Poehlman,Breeding Field Crops,VanNostrand Reinhold,New York(3.sup.rd ed),1987)、转座子标签(Fedoroff et al.,1984；U.S.Pat.No.4,732,856and U.S.Pat.No.5,013,658)，以及T-DNA***法(Hoekema etal.,1983；U.S.Pat.No.5,149,645)。EMS诱导的诱变由在基因组长度上化学诱导随机点突变组成。快中子诱变包括将种子暴露于中子轰击，其通过双链DNA断裂导致大量缺失。转座子标签包括在内源基因内***转座子以减少或消除基因的表达。烟草基因中可能存在的突变类型包括例如点突变、缺失、***、复制和逆转。这些突变理想地存在于烟草基因的编码区中；但是，烟草基因的启动子区和内含子或非翻译区中的突变也可能是期望的。
此外，使用变性HPLC或选择性内切核酸酶消化所选择的PCR产物来筛选化学诱导的突变TILLING(在基因组中靶诱导局部病变)的快速且可自动化的方法也适用于本公开。参见，McCallum et al.(2000)Nat.Biotechnol.18:455-457。影响基因表达或干扰基因功能的突变可使用本领域熟知的方法确定。基因外显子中的***突变通常导致无效突变体。保守残基的突变可特别有效地抑制蛋白质的功能。在一个方面，包含无义(例如，终止密码子)突变的烟草植物是本文所述的一个或多个NCG基因。
在一个方面，本公开还提供具有改变的烟碱含量同时保持商业上可接受的叶质量的烟草品系。这些品系可以通过经由精确基因组工程技术将突变引入Nic1b或Nic2基因座的一个或更多个基因(例如，一个或更多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)来产生，例如，转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、锌指核酸酶、以及成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9***、CRISPR/CasX***、CRISPR/CasY***、CRISPR/Cpf1***、CRISPR/Csm1***以及它们的组合(参见例如美国专利申请公布2017/0233756)。参见例如Gaj et al.,Trends in Biotechnology,31(7):397-405(2013)。
诱变烟草植物的筛选和选择可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法。筛选和选择方法的实例包括但不限于Southern分析、用于检测多核苷酸的PCR扩增、Northern印迹、RNase保护、引物延伸、用于检测RNA转录物的RT-PCR扩增、Sanger测序、下一代测序技术(例如Illumina,PacBio,Ion Torrent,454)、用于检测酶或多肽和多核苷酸的核酶活性的酶测定，以及用于检测多肽的蛋白质凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀和酶联免疫测定。其它技术(诸如原位杂交、酶染色和免疫染色)也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。用于实施所有参考技术的方法是已知的。
在一个方面，经修饰的烟草植物包含一种或更多种突变或修饰，所述突变或修饰能够活化一个或多个编码生物合成酶、调控转录因子、转运蛋白、分解代谢酶或其组合的基因，用于一种或更多种抗氧化剂。在另一个方面，一种或更多种突变或修饰在编码生物合成酶、调节转录因子、转运蛋白、分解代谢酶或其组合的一个或多个基因中，用于一种或更多种选自下组的抗氧化剂：花青素、黄烷酮、黄烷醇、黄酮、黄酮醇、异黄酮、羟基苯甲酸、羟基肉桂酸、鞣花单宁、芪类、木酚素、类胡萝卜素和甘草甜素。在另一个方面，一种或更多种突变或修饰是在编码生物合成酶、调节转录因子、转运蛋白、分解代谢酶或其组合的一个或多个基因中，用于一种或更多种选自下组的抗氧化剂：飞燕草素、花青素、原花青素、飞燕草素、橙皮素、柚皮素、儿茶素、表儿茶素、芹菜素、木犀草素、槲皮素、杨梅素、芸香素、染料木黄酮、大豆黄素、没食子酸、香草酸、原儿茶酸、阿魏酸、肉桂酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、血根素、白藜芦醇、芝麻素、类胡萝卜素和维生素C。
在一个方面，本说明书的经修饰的烟草植物包含花青苷含量增加的烟叶。在另一个方面，花青苷含量增加的经修饰的烟草植物还包含具有紫色或深红色视觉外观的叶。在一个方面，本说明书的经修饰的烟草植物包含具有增加的抗氧化剂含量而没有增加的花青苷含量的烟叶。在另一个方面，包含增加含量的抗氧化剂而没有增加含量的花色素苷的经修饰的烟草植物还包含具有与未经修饰的烟草植物相似的视觉外观的叶。
如本文所用，“抗氧化剂调节蛋白”是指与不包含突变或表达的生物合成酶、调节转录因子或转运蛋白的对照植物相比，当在烟草植物中突变或表达时，可改变一种或更多种抗氧化剂的量的生物合成酶、调节转录因子或转运蛋白。
如本文所用，“生物合成酶”是指在抗氧化剂、生物碱、TSNA、绿原酸或影响抗氧化剂、生物碱、TSNA或绿原酸的活性或稳定性的其它蛋白质的合成中起作用的蛋白质。这些蛋白质催化反应，导致一种分子结构转变为作为生物合成途径的一部分的另一种结构。示例性的生物合成酶包括但不限于花青素合酶2(NtANS2)、二氢黄酮醇-4-还原酶(NtDFR2)、莽草酸O-羟基肉桂酰基转移酶(HCT)和羟基肉桂酰辅酶A奎宁转移酶(HQT)。生物合成酶的活性影响组成生物合成途径的不同分子种类的总浓度。
如本文所用，“调节转录因子”是结合靶基因的启动子元件以调节参与抗氧化剂生物合成、转运、分解代谢或影响一种或更多种抗氧化剂含量的其它过程的一个或多个基因的转录的蛋白质。示例性的调节转录因子包括AtPAP1、NtPAP1、NtMYB3样、NtJAF13和AtTTG1，参见美国专利申请公开US2018/0119163，其全部内容通过引用并入本文。调节转录因子可以作为蛋白质复合物的一部分或单独地结合DNA。调节转录因子可以具有单个靶或多个靶，并且可以以不同的亲和力结合不同的靶。调节转录因子的活性可以是激活、抑制或减弱靶基因座的转录。
如本文所用，“转运蛋白”可以是主动或被动地使分子移动穿过生物膜的跨膜蛋白。转运蛋白可有助于离子、小分子或大分子的移动。转运蛋白可称为跨膜转运蛋白、跨膜泵、阴离子转运蛋白、阳离子转运蛋白或护送蛋白。转运蛋白还可以促进分子或蛋白在由生物膜组成的囊泡中的移动。转运蛋白可以整合到生物膜中。转运蛋白可以经由不同的修饰，诸如但不限于十四烷基化、异戊烯化或棕榈酰化锚定于生物膜。
在一个方面，本文提供的烟草植物或植物基因组被选自下组的核酸酶突变或编辑：大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas9核酸酶、CRISPR/CasX核酸酶、CRISPR/CasY核酸酶、CRISPR/Cpf1核酸酶或CRISPR/Csm1核酸酶。
如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”是指内源植物基因组核酸序列的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个核苷酸的靶向诱变，或内源植物基因组核酸序列的去除或置换。在一个方面，提供的编辑的核酸序列与内源核酸序列具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。在一个方面，提供的编辑的核酸序列与选自下组的多核苷酸具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性：SEQ ID NO:1-4及其片段。在另一个方面，提供的编辑的核酸序列与编码选自下组的多肽的多核苷酸具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性：SEQ ID NO:5-8。
在一个方面，可以通过本领域已知的能够相对于参考序列取代、添加或缺失一个序列的核苷酸或氨基酸的任何方式改变序列同一性。
大范围核酸酶、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9、CRISPR/CasX、CRISPR/CasY、CRISPR/Csm1和CRISPR/Cpf1在基因组序列的靶位点处诱导双链DNA断裂，然后通过同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)的天然过程修复。然后，在切割位点发生序列修饰，其可包括在NHEJ的情况下导致基因破坏的缺失或***，或通过HR整合供体核酸序列。在一个方面，提供的方法包括用提供的核酸酶编辑植物基因组以经由HR用供体多核苷酸突变植物基因组中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或多于10个核苷酸。在一个方面，提供的突变由使用核酸酶的基因组编辑引起。在另一个方面，提供的突变由非同源末端连接或同源重组引起。
在一个方面，本文提供的突变提供激活目标基因的表达或活性的显性突变体，所述目标基因是例如选自下组的基因：生物合成酶、调节转录因子、转运蛋白、分解代谢酶或其组合，用于一种或更多种抗氧化剂。
通常在微生物中鉴定的大范围核酸酶是具有高活性和长识别序列(>14bp)的独特酶，导致靶DNA的位点特异性消化。天然存在的大范围核酸酶的工程化形式典型地具有延伸的DNA识别序列(例如，14-40bp)。大范围核酸酶的工程化可能比ZFN和TALEN的工程化更具挑战性，因为大范围核酸酶的DNA识别和切割功能在单个结构域中交织。诱变和高通量筛选的专门方法已经用于产生新的大范围核酸酶变体，其识别独特的序列并具有改进的核酸酶活性。
ZFN是由与FokI限制性内切核酸酶的切割结构域融合的工程化锌指DNA结合结构域组成的合成蛋白质。ZFN可被设计成切割几乎任何长度的双链DNA以修饰锌指DNA结合结构域。ZFN由单体形成二聚体，所述单体由融合到工程化以结合靶DNA序列的锌指阵列的FokI内切核酸酶的非特异性DNA切割结构域组成。
ZFN的DNA结合结构域典型地由3-4个锌指阵列组成。相对于锌指∞-螺旋起点的位置-1、+2、+3和+6处的氨基酸(其有助于与靶DNA的位点特异性结合)可被改变和定制以适合特异性靶序列。其它氨基酸形成共有主链以产生具有不同序列特异性的ZFN。用于选择ZFN的靶序列的规则是本领域已知的。
FokI核酸酶结构域需要二聚化以切割DNA，因此需要两个具有其C-末端区域的ZFN以结合切割位点的相对DNA链(间隔5-7bp)。如果两个-ZF-结合位点是回文的，则ZFN单体可以切割靶位点。本文所用的术语ZFN是广义的，并且包括单体ZFN，其可以在没有来自另一ZFN的帮助下切割双链DNA。术语ZFN也用于指一对ZFN的一个或两个成员，其被工程化以一起工作以在相同位点切割DNA。
不受任何科学理论的限制，因为锌指结构域的DNA结合特异性原则上可以使用各种方法之一再工程化，所以定制的ZFN理论上可以构建成靶向几乎任何基因序列。用于工程化锌指结构域的公开可用的方法包括背景依赖性组装(CoDA)，寡聚化池工程化(OPEN)和模块化组装。
TALEN是通过将转录激活物样效应物(TALE)DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域融合而产生的人工限制酶。当TALEN对的每个成员与靶位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并在靶位点引起双链DNA断裂。本文所用的术语TALEN是广义的，并且包括单体TALEN，其可以在没有来自另一TALEN的帮助下切割双链DNA。术语TALEN也用于指共同作用以在相同位点切割DNA的一对TALEN的一个或两个成员。
转录激活物样效应物(TALE)可被工程化以实际上结合任何DNA序列。TALE蛋白是衍生自黄单胞菌(Xanthomonas)属的各种植物细菌病原体的DNA结合结构域。黄单胞菌属病原体在感染期间分泌TALE到宿主植物细胞中。TALE移动到细胞核，在细胞核中它识别并结合宿主基因组中特定基因的启动子区中的特定DNA序列的启动子区中的特定DNA序列。TALE具有由33-34个氨基酸的13-28个重复单体组成的中心DNA结合结构域。每个单体的氨基酸是高度保守的，除了第12和13位的高变氨基酸残基。这两个可变氨基酸被称为重复可变双残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且RVD的调节可以识别连续的DNA碱基。氨基酸序列和DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择含有适当RVD的重复片段的组合来工程化特异性DNA结合结构域。
除了野生型FokI切割结构域之外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以改进切割特异性和切割活性。FokI结构域作为二聚体起作用，需要两个具有独特DNA结合结构域的构建体，用于目标基因组中具有正确方向和间隔的位点。TALEN DNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基数目和两个单个TALEN结合位点之间的碱基数目都是获得高水平活性的参数。
TALE结合结构域的氨基酸序列和DNA识别之间的关系允许可设计的蛋白。软件程序(诸如DNA Works)可用于设计TALE构建体。设计TALE构建体的其它方法是本领域技术人员已知的。参见Doyle et al,.Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122.；Cermak etal.,Nucleic Acids Research(2011).39:e82；和tale-nt.cac.cornell.edu/about。
CRISPR/Cas9、CRISPR/CasX、CRISPR/CasY、CRISPR/Csm1或CRISPR/Cpf1***是基于FokI的方法ZFN和TALEN的替代物。CRISPR***基于RNA引导的工程化核酸酶，其使用互补碱基配对以识别靶位点处的DNA序列。
CRISPR/Cas9、CRISPR/Csm1和CRISPR/Cpf1***是细菌和古细菌的适应性免疫***的一部分，通过以序列依赖性方式切割外源DNA来保护它们免于侵入核酸(诸如病毒)。通过在CRISPR基因座近端的两个相邻重复序列之间整合称为间隔区的侵入DNA的短片段获得免疫。CRISPR阵列(包括间隔区)在随后遇到侵入性DNA时被转录，并被加工成长度约40NT的小干扰CRISPR RNA(crRNA)，其与反式-激活CRISPRRNA(tracrRNA)组合以激活和引导Cas9核酸酶。这裂解了侵入DNA中称为原型间隔区的同源双链DNA序列。切割的先决条件是在靶DNA下游存在保守的原型间隔区-邻近基序(PAM)，其通常具有序列5-NGG-3，但不经常具有序列NAG。特异性由PAM上游大约12个碱基的所谓“种子序列”提供，其必须在RNA和靶DNA之间匹配。Cpf1和Csm1以类似于Cas9的方式起作用，但Cpf1和Csm1不需要tracrRNA。
在又另一个方面，提供的烟草植物还包含一个或多个编码烟碱脱甲基酶的转基因(例如CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10)，所述转基因赋予与缺乏一个或更多个转基因的对照植物相比增加量的降烟碱(对于示例性烟碱脱甲基酶序列，参见美国专利号8,319,011；8,124,851；9,187,759；9,228,194；9,228,195；9,247,706)。在一个方面，当在相当的条件下生长和熟化时，与对照植物相比，描述的经修饰的烟草植物还包含增加的烟碱脱甲基酶活性。
术语“抑制序列”涵盖能够抑制植物中涉及来自Nic1b或Nic2基因座的烟碱生物合成调节的基因(例如，一个或多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)的表达或功能的任何多核苷酸或多肽序列，诸如全长多核苷酸或多肽序列、截短的多核苷酸或多肽序列、多核苷酸或多肽序列的片段、多核苷酸或多肽序列的变体、有义方向的核苷酸序列、反义方向的核苷酸序列、有义或反义方向的核苷酸序列的互补物、核苷酸序列的反向区、核苷酸序列的发夹、双链核苷酸序列、单链核苷酸序列、其组合等。术语“多核苷酸序列”包括RNA、DNA、化学修饰的核酸、核酸类似物、其组合等的序列。
抑制序列由靶基因产物的名称指定。因此，“Nic2抑制序列”是指能够例如在转录和/或翻译水平上抑制来自植物中的Nic2基因座的参与烟碱生物合成调节的基因的表达，或能够抑制基因产物的功能的抑制序列。当在多核苷酸抑制序列的上下文中使用短语“能够抑制”时，意指抑制序列本身发挥抑制作用；或者，当抑制序列编码抑制性核苷酸分子(例如，发夹RNA、miRNA或双链RNA多核苷酸)或编码抑制性多肽(例如，抑制靶基因产物的表达或功能的多肽)时，在其转录(例如，在编码发夹RNA、miRNA或双链RNA多核苷酸的抑制序列的情况下)或其转录和翻译(在编码抑制性多肽的抑制序列的情况下)之后，转录或翻译的产物分别对靶基因产物发挥抑制作用(例如，抑制靶基因产物的表达或功能)。
在一个方面，抑制一个或更多个Nic1b或Nic2基因的遗传修饰包含一个或多个Nic1b或Nic2抑制序列。所公开的Nic1b或Nic2抑制序列可以是经由包括但不限于以下的本领域已知的任何沉默途径或机制引发基因沉默的序列：有义抑制/共抑制、反义抑制、双链RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA干扰和含内含子的发夹RNA干扰、扩增子介导的干扰、核酶、小干扰性RNA、人造或合成微RNA和人造反式作用siRNA。取决于所希望的结果，Nic1b或Nic2抑制序列可以是至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约70个核苷酸、约100个核苷酸、约150个核苷酸、约200个核苷酸、约250个核苷酸、约300个核苷酸、约350个核苷酸、约400个核苷酸、并且直至编码本公开的蛋白质的全长多核苷酸。在一个方面，Nic1b或Nic2抑制序列可以是长度为约50-约400个核苷酸、约70-约350个核苷酸、约90-约325个核苷酸、约90-约300个核苷酸、约90-约275个核苷酸、约100-约400个核苷酸、约100-约350个核苷酸、约100-约325个核苷酸、约100-约300个核苷酸、约125-约300个核苷酸或约125-约275个核苷酸的片段。在一些实施方案中，细胞色素P450多核苷酸的片段长度为约50个、约60个、约70个、约80个、约90个、约100个、约125个、约150个、约175个、约200个、约225个、约250个、约275个、约300个、约325个、约350个、约400个核苷酸，以及介于约70个和约400个核苷酸之间的其它此类值。在一个方面，Nic1b或Nic2抑制序列可包含约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
术语“多核苷酸”的使用不旨在将本公开限制为包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到多核苷酸可以包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这些脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的类似物。本公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。
在一个方面，本公开提供重组DNA构建体，其包含在烟草细胞中有功能并与编码RNA分子的多核苷酸可操作地连接的启动子，所述RNA分子能够结合编码与选自下组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列的多肽的RNA：SEQ ID NO:5-8及其片段，并且其中所述RNA分子抑制所述多肽的表达。在一个方面，RNA分子选自微RNA、siRNA和反式作用siRNA。另一个方面，重组DNA构建体编码双链RNA。还提供包含这些重组DNA构建体的转基因烟草植物或其部分、熟化烟草材料或烟草制品。在一个方面，与不含重组DNA构建体的对照烟草植物相比，这些转基因植物、熟化烟草材料或烟草制品包含较低含量的烟碱。进一步提供降低烟草植物的烟碱含量的方法，该方法包括用任何这些重组DNA构建体转化烟草植物。
如本文所用，“可操作地连接”是指两个或更多个元件之间的功能连接。例如，目标多核苷酸与调节序列(例如启动子)之间的可操作连接是允许目标多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。
如本文所用并且当用于序列时，“异源的”是指源自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则通过有意的人为干预在组成和/或基因组基因座中从其天然形式进行实质修饰的序列。该术语也适用于核酸构建体，在本文中也称为“多核苷酸构建体”或“核苷酸构建体”。以这种方式，“异源”核酸构建体意指来源于外源物种的构建体，或者，如果来源于相同物种，通过有意的人为干预在组成和/或基因组基因座上从其天然形式进行实质修饰的构建体。异源核酸构建体包括但不限于已被引入植物或其植物部分的重组核苷酸构建体，例如，经由转化方法或随后用另一目标植物育种转基因植物。在一个方面，所用的启动子与启动子驱动的序列是异源的。另一个方面，所用的启动子与烟草是异源的。在进一步的方面，所用的启动子对于烟草是天然的。
在一个方面，所描述的经修饰的烟草植物是同源转基因(cisgenic)植物。如本文所用，“同源转基因”或“同源转基因的”是指植物、植物细胞或植物基因组的遗传修饰，其中所有组分(例如，启动子、供体核酸、选择基因)仅具有植物来源(即，不使用非植物来源的组分)。在一个方面，提供的经修饰的植物、植物细胞或植物基因组是同源转基因的。提供的同源转基因植物、植物细胞和植物基因组可产生即用型烟草品系。在另一个方面，提供的经修饰的烟草植物不包含非烟草遗传物质或序列。
如本文所用，“基因表达”是指基因产物的生物合成或产生，包括基因产物的转录和/或翻译。
本文还提供用于在植物中过表达一种或更多种烟碱脱甲基酶多肽的组合物和方法，所述植物在植物，特别是烟草属植物，包括各种商业品种的烟草植物中具有对来自Nic1b或Nic2基因座的一个或更多个基因(例如，一个或更多个Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)的转基因或诱变抑制，并且还任选地包含增加一种或更多种抗氧化剂的含量的另一种遗传修饰。
在一个方面，重组DNA构建体或表达盒还可以包含用于选择转基因细胞的选择性标记基因。选择性标记基因包括但不限于编码抗生素抗性的基因，诸如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物(诸如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸酯(2,4-D))抗性的基因。其它选择标记包括表型标记(诸如β-半乳糖苷酶)和荧光蛋白(诸如绿色荧光蛋白(GFP))。
在一个方面，重组DNA构建体或表达盒包含选自下组的启动子：组成型启动子、诱导型启动子和组织优选的启动子(例如叶特异性或根特异性启动子)。示例性组成型启动子包括Rsyn7启动子的核心启动子和美国专利号6,072,050中公开的其他组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell et al.(1985)Nature 313:810-812)；泛素(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。示例性的化学诱导型启动子包括被水杨酸激活的烟草PR-1a启动子。其它的目标化学诱导型启动子包括类固醇响应型启动子(Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10421-10425和McNellis et al.(1998)Plant J.14(2):247-257中公开的糖皮质激素诱导型启动子)和四环素诱导型启动子(参见，例如，Gatz et al.(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237和U.S.Pat.Nos.5,814,618and 5,789,156)。可以使用的其它示例性启动子是负责热调节基因表达、光调节基因表达的启动子(例如，豌豆rbcS-3A；玉米rbcS启动子；豌豆中发现的叶绿素alb结合蛋白基因；或Arabssu启动子)、激素调节基因表达(例如，来自小麦的Em基因的脱落酸(ABA)响应序列；ABA诱导型HVA1和HVA22以及大麦和拟南芥属的rd29A启动子；以及伤口诱导的基因表达(例如，wunl的基因表达)、器官特异性基因表达(例如，块茎特异性贮藏蛋白基因的基因表达)；所述来自玉米的23-kDa玉米醇溶蛋白基因；或扁豆(β-菜豆蛋白基因)、或病原体诱导型启动子(例如，PR-1、prp-1、或β-1,3葡聚糖酶启动子、小麦的真菌诱导型wirla启动子以及线虫诱导型启动子，烟草干燥西芹的TobRB7-5A和Hmg-1)。
各种类型的启动子可用于本文所述的转基因或重组核酸(例如，用于表达烟碱脱甲基酶、NtMyb3或AtPAP1)，其根据与可操作地连接至启动子的编码序列或基因(包括转基因)的表达模式相关的多种标准分类，诸如组成型、发育型、组织特异性、组织优选型、诱导型等。在植物的所有或大部分组织中起始转录的启动子称为“组成型”启动子。在发育的某些时期或阶段启动转录的启动子称为“发育型”启动子。相对于其它植物组织，其表达在植物的某些组织中增强的启动子被称为“组织增强型”或“组织优选型”启动子。因此，“组织优选型”启动子在植物的特定组织中引起相对较高或优选的表达，但在植物的其它组织中具有较低的表达水平。在植物的特定组织中表达，在其它植物组织中很少表达或不表达的启动子称为“组织特异性”启动子。在植物的某一细胞类型中表达的启动子被称为“细胞类型特异性”启动子。“诱导型”启动子是响应环境刺激(诸如冷、干旱、热或光)或其它刺激(诸如受伤)或化学应用而启动转录的启动子。本文还使用了根据其来源分类的启动子，诸如异源的、同源的、嵌合的、合成的等。“异源”启动子是相对于其相关的可转录序列、编码序列或基因(或转基因)具有不同来源的启动子序列，和/或非天然存在于待转化的植物物种中的启动子序列。术语“异源”更广泛地包括两个或多个DNA分子或序列的组合，当这种组合在自然界中通常不存在时。例如，如果两个或多个DNA分子或序列通常存在于不同基因组中或相同基因组中的不同基因座，或者如果它们在自然界中不相同地组合，则它们彼此是异源的。
在一个方面，提供的烟草植物还包含参与烟碱生物合成或转运的基因的活性的增加或降低的表达。参与烟碱生物合成的基因包括但不限于精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPT)和S-腺苷-甲硫氨酸合成酶(SAMS)。尽管已经提出了两种候选基因(A622和NBB1)，但尚未阐明催化烟酸衍生物和甲基吡咯啉阳离子之间缩合步骤的烟碱合酶。参见US2007/0240728A1和US2008/0120737A1。A622编码异黄酮还原酶样蛋白。此外，几种转运蛋白可参与烟碱的转运。已经克隆并表征了命名为MATE的转运蛋白基因(Morita et al.,PNAS 106:2447-52(2009))。
在一个方面，与对照烟草植物相比，提供的烟草植物还包含一个或多个增加或降低含量的编码选自下组的产物的基因的mRNA、蛋白质或两者：PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1。另一个方面，提供的烟草植物还包含直接抑制一个或多个编码选自下组的产物的基因的表达的转基因：PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1。在另一个方面，提供的烟草植物还包含抑制一个或多个编码选自下组的产物的基因的表达或活性的转基因或突变：PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1。另一个方面，提供的烟草植物还包含表达一个或多个编码选自下组的产物的基因的转基因：PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1。
增强子元件是可被蛋白质结合以激活RNA转录的DNA区域。在一个方面，本文使用的启动子序列与增强子元件可操作地连接。在一个方面，本文提供的增强子元件是CsVMV启动子。
还公开了使用本领域已知的任何合适的转化方法用重组构建体或表达盒转化烟草植物。将多核苷酸序列引入烟草植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。“稳定转化”是指在其中引入植物的目标核苷酸构建体整合到植物基因组中并能够被其后代遗传的转化。“瞬时转化”意指将序列引入植物并仅在植物中瞬时表达或仅瞬时存在。
在一个方面，本文提供的方法和组合物包含载体。如本文所用，术语“载体”或“质粒”可互换使用，是指与染色体DNA物理分离的环状双链DNA分子。在一个方面，本文使用的质粒或载体能够在体内复制。本文所用的“转化载体”是能够转化植物细胞的质粒。在一个方面，本文提供的质粒是细菌质粒。在另一个方面，本文提供的质粒是农杆菌Ti质粒或衍生自农杆菌Ti质粒。
在一个方面，本文提供的质粒或载体是重组载体。如本文所用，术语“重组载体”是指通过遗传重组的实验室方法(诸如分子克隆)形成的载体。在另一个方面，本文提供的质粒是合成质粒。如本文所用，“合成质粒”是能够与天然质粒(例如，Ti质粒)具有相同功能(例如，复制)的人工产生的质粒。不受限制地，本领域技术人员可以经由由单个核苷酸合成质粒，或通过将来自不同的预先存在的质粒的核酸分子拼接在一起来重新产生合成质粒。
载体是可商购的或可以通过本领域常规的重组DNA技术产生。含有核酸的载体可以具有可操作地连接至该核酸的表达元件，并且还可以包括诸如编码选择性标记(例如抗生素抗性基因)的序列。含有核酸的载体可以编码嵌合或融合多肽(即，与异源多肽可操作地连接的多肽，其可以在多肽的N-末端或C-末端)。代表性的异源多肽是可用于纯化所编码的多肽(例如，6xHis标签(SEQ ID NO:45)，谷胱甘肽S-转移酶(GST))的那些。
将多核苷酸引入到本公开的植物细胞中的合适方法包括显微注射(Crossway etal.(1986)Biotechniques 4:320-334))、电穿孔(Shillito et al.(1987)Meth.Enzymol.153:313-336；Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5,104,310、5,149,645、5,177,010、5,231,019、5,463,174、5,464,763、5,469,976、4,762,785、5,004,863、5,159,135、5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3:2717-2722)、和弹道粒子加速(参见例如美国专利号4,945,050、5,141,131、5,886,244、5,879,918和5,932,782；Tomeset al.(1995)in Plant Cell,Tissue,and Organ Culture Fundamental Methods,ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag,Berlin)；McCabe et al.(1988)Biotechnology 6:923-926))。还参见Weising et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Christou et al.(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆)；McCabe et al.(1988)Bio/Technology 6:923-926(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro CellDev.Biol.27P:175-182(大豆)；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；De Wet et al.(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,ed.Chapman et al.(Longman,N.Y.),pp.197-209(花粉)；Kaeppler et al.(1990)PlantCell Reports 9:415-418and Kaeppler et al.(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(晶须介导的转化)；D'Halluin et al.(1992)Plant Cell 4:1495-1505(电穿孔)。
应理解，本公开的任何经修饰的烟草植物可还包含其它农学上所需的性状，例如通过使用本领域已知的技术用遗传构建体或转基因转化。非限制性地，所需性状的实例是除草剂抗性、害虫抗性、疾病抗性、高产率、高等级指数值、可熟化性、熟化质量、机械可收获性、保持能力、叶质量、高度、植物成熟(例如，早期成熟、早中期成熟、中期成熟、中晚期成熟、或晚期成熟)、茎尺寸(例如，小的、中等的、或大的茎)、或每株植物的叶数(例如，小的(例如，5-10片叶)、中等的(例如，11-15片叶)、或大的(例如，16-21)片叶)，或任何组合。在一个方面，本文提供的能够产生具有降低的TSNA的熟化叶或种子的烟草植物包含表达一种或更多种杀昆虫蛋白的一个或多个转基因，所述杀昆虫蛋白例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的晶体蛋白或来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的营养性杀昆虫蛋白，诸如VIP3(参见例如Estruch et al.(1997)Nat.Biotechnol.15:137)。在另一个方面，本文提供的烟草植物还包含赋予对褐色茎腐病的抗性(美国专利号5,689,035)或对孢囊线虫的抗性(美国专利号5,491,081)的渗入性状。
本文提供的多肽的含量和/或活性可以通过采用在转化的植物中不能指导蛋白质或RNA表达的多核苷酸来调节。例如，本发明的多核苷酸可用于设计可用于改变或突变生物体中基因组核苷酸序列的方法中的多核苷酸构建体。此类多核苷酸构建体包括但不限于RNA:DNA载体、RNA:DNA突变载体、RNA:DNA修复载体、混合双链寡核苷酸、自身互补RNA:DNA寡核苷酸和重组寡核苷酸碱基。该核苷酸构建体和使用方法是本领域已知的。参见，美国专利号5,565,350；5,731,181；5,756,325；5,760,012；5,795,972和5,871,984；它们中的每一个都通过引用并入本文，如同其全文列出。还参见国际专利申请公开号WO98/149350、WO99/107865和WO99/125921；和Beetham et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:8774-8778；它们中的每一个都通过引用并入本文，如同其全文列出。
本公开还提供用于抑制一种或更多种多肽的表达或功能的组合物和方法，所述一种或更多种多肽直接或间接地抑制一种或更多种抗氧化剂在植物，特别是烟草属植物，包括各种商业品种的烟草植物中的产生或积累。
在一个方面，本文提供的一种或更多种多肽(例如，Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因)的表达的抑制可以通过表达能够产生本文提供的抑制序列的转基因的RNA干扰(RNAi)来获得。在一个方面，RNAi包括表达非编码RNA。如本文所用，“非编码RNA”选自下组：微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、内含子、发夹RNA(hpRNA)和含内含子的发夹RNA(ihpRNA)。在一个方面，本文提供的单一非编码RNA抑制至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或多于10个多肽的表达。在一个方面，本文提供的非编码RNA被稳定地转化到植物基因组中。另一个方面，本文提供的非编码RNA被瞬时转化到植物基因组中。
如本文所用，术语“抑制(suppress)”，“抑制(inhibit)”，“抑制(inhibition)”，“抑制(inhibiting)”和“下调(downregulation)”定义为降低基因产物(例如mRNA、蛋白质、非编码RNA)的表达或功能的本领域已知或本文所述的任何方法。“抑制”可以是在两种细胞(例如，经修饰的细胞VS对照细胞)之间的比较的上下文中。基因产物的表达或功能的抑制还可以在同一植物内或不同植物之间的植物细胞、细胞器、器官、组织或植物组分之间的比较的上下文中，并且包括同一植物或植物组分内或植物或植物组分之间的发育阶段或时间阶段之间的比较。“抑制”包括目标基因产物的功能或产生的任何相对减少，直至并包括该基因产物的功能或产生的完全消除。术语“抑制”涵盖下调靶基因产物的翻译和/或转录或靶基因产物的功能活性的任何方法或组合物。“抑制”不必包括完全消除基因产物的表达。在一个方面，本文提供的经修饰的细胞中的基因产物的表达比对照细胞中的基因产物的表达低至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。在另一个方面，本文提供的经修饰的细胞中的基因产物包含或比对照细胞中基因产物的表达低1％-100％、1％-95％、1％-90％、1％-80％、1％-70％、1％-50％、1％-40％、1％-30％、1％-25％、1％-20％、1％-15％、1％-10％、1％-5％、5％-25％、5％-75％、5％-100％、10％-25％、10％-75％、10％-100％、25％-50％、25％-75％、25％-100％、50％-100％的表达。
如本文所用，“靶位点”是指与位点特异性核酸酶结合并被位点特异性核酸酶切割的多核苷酸序列的位置，所述位点特异性核酸酶将双链断裂引入核酸主链中。在另一个方面，靶位点包含至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少29个、或至少30个连续核苷酸。在另一个方面，本文提供的靶位点是至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少200、至少250、至少300、至少400、或至少500个核苷酸。在一个方面，位点特异性核酸酶结合靶位点。在另一个方面，位点特异性核酸酶经由向导性非编码RNA(即，诸如但不限于CRISPR RNA或单向导性RNA(两者均在下文详细描述))结合至靶位点。在一个方面，本文提供的非编码RNA与靶位点互补。应当理解，非编码RNA结合靶位点不需要完全互补；可耐受靶位点与非编码RNA之间的至少1、至少2、至少3、至少4或至少5、至少6、至少7或至少8个错配。如本文所用，“靶区域”或“靶向区域”是指需要修饰的多核苷酸序列。在一个方面，“靶区域”，“靶向区域”或“靶基因”侧接两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、或十个或更多个靶位点。“靶基因”是指编码需要修饰或需要从中调节转录表达的基因的多核苷酸序列。在一个方面，包含靶基因的多核苷酸序列还包含一个或更多个靶位点。另一个方面，转基因被称为靶向靶位点或靶基因。在另一个方面，靶区域包含一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个、七个或多个、八个或多个、九个或多个、或十个或多个靶基因。不受限制地，在一个方面，靶区域可进行缺失或逆转。如本文所用，当用于描述靶区域时，“侧接”是指物理围绕靶区域的两个或更多个靶位点，其中一个靶位点在靶区域的每一侧上。
如本文所用，“上游”是指位于连锁的核酸序列的5'末端之前的核酸序列。如本文所用，“下游”是指位于连锁的核酸序列的3'末端之后的核酸序列。如本文所用，“5'”是指编码DNA序列的起点或RNA分子的起点。如本文所用，“3'”是指编码DNA序列的末端或RNA分子的末端。应当理解，“逆转”指反转给定多核苷酸序列的方向。例如，如果样品序列5′-ATGATC-3′被反转，它将以相反的方向读成5′-CTAGTA-3′。另外，样品序列5′-ATGATC-3′被认为与样品序列5′-CTAGTA-3′处于“相反方向”。
在另一个方面，重组构建体或表达盒可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触而引入植物中。通常，此类方法涉及将本公开的表达盒并入病毒DNA或RNA分子中。已认识到用于表达盒的启动子也包括用于病毒RNA聚合酶转录的启动子。将多核苷酸引入植物并表达其中编码的蛋白质(包括病毒DNA或RNA分子)的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,889,191,5,889,190,5,866,785,5,589,367,5,316,931以及Porta et al.(1996)Molecular Biotechnology 5:209-221。
如本文所用，“基因座”是多态性核酸、性状决定簇、基因或标记所在的染色体区域。本公开的基因座包含群体中的一种或更多种多态性；例如，在一些个体中存在替代等位基因。如本文所用，“等位基因”是指特定基因座处的替代核酸序列。等位基因的长度可以小至1个核苷酸碱基，但典型地较大。例如，第一等位基因可以出现在一条染色体上，而第二等位基因出现在第二同源染色体上，例如对于杂合个体的不同染色体出现，或者在群体中的不同纯合或杂合个体之间出现。如本文所用，当仅存在一个拷贝的基因座时，二倍体植物中的染色体是“半合的”。例如，当***的转基因仅***一个姐妹染色体(即，第二姐妹染色体不含有***的转基因)时，它是半合的。
在一个方面，经修饰的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的转基因是纯合的。在另一个方面，经修饰的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的转基因是杂合的。在一个方面，经修饰的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的转基因是半合的。在一个方面，经修饰的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的突变是纯合的。在另一个方面，经修饰的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的突变是杂合的。在一个方面，经修饰的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的突变是半合的。
如本文所用，“渗入(introgression)”或“渗入(introgress)”是指遗传基因座的所需等位基因从一个遗传背景传递到另一个。
如本文所用，“杂交(crossed)”或“杂交(cross)”意指通过受精(例如细胞、种子或植物)产生后代，并且包括不同植物之间的杂交(有性)和自花授粉(自交)。
如本文所用，“回交(backcross)”和“回交(backcrossing)”是指后代植物重复地与它的亲本之一回交的过程。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待被渗入的所需基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(一次或多次使用)或“轮回”亲本(两次或多次使用)是指基因或基因座被渗入其中的亲本植物。初始杂交产生F1代。术语“BC1”是指轮回亲本的第二次使用，“BC2”是指轮回亲本的第三次使用，等等。在一个方面，反复进行回交，每个连续回交世代的后代个体自身回交至相同的亲本基因型。
如本文所用，“优良品种”意指由育种和选择产生的具有优异农艺性能的任何品种。
如本文所用，在育种上下文中的“选择(selecting)”或“选择(selection)”是指基于某些预定标准通常从群体中挑选或选择所需个体的行为。
在一个方面，本文提供的烟草植物是杂交植物。杂交种可以通过阻止第一品种的雌性亲本植物(例如，种子亲本)的自花授粉，允许来自第二品种的雄性亲本植物的花粉使雌性亲本植物受精，并且允许F1杂交种种子在雌性植物上形成来产生。雌性植物的自花授粉可以通过在花发育的早期阶段使花去雄来防止。或者，可以使用雄性不育形式防止在雌性亲本植物上形成花粉。例如，雄性不育可以由雄性不育(MS)或转基因雄性不育产生，其中转基因抑制微孢子形成和/或花粉形成，或自身不相容性。含有MS的雌性亲本植物特别有用。在雌性亲本植物是MS的方面，可从雄性可育植物收获花粉并人工施用于MS雌性亲本植物的花柱，并收获得到的F1种子。另外，雌性不育植物也可用于防止自花受精。
植物可用于形成单交烟草F1杂交种。将来自雄性亲本植物的花粉人工转移至去雄的雌性亲本植物或雄性不育的雌性亲本植物以形成F1种子。或者，可以进行三向杂交，其中单交F1杂交种用作雌性亲本并与不同的雄性亲本杂交。作为另一种选择，可以产生双杂交杂交种，其中两个不同单交的F1后代自身杂交。当形成双杂交杂交种时，自交不亲和性可特别有利地用于防止雌性亲本的自花授粉。
在一个方面，本文提供的烟草品种是雄性不育的。在另一个方面，本文提供的烟草品种是细胞质雄性不育(CMS)。雄性不育烟草植物可通过本领域已知的任何方法产生。Wernsman,E.A.,and Rufty,R.C.1987.Chapter Seventeen.Tobacco.Pages 669-698In:Cultivar Development.Crop Species.W.H.Fehr(ed.),MacMillan Publishing Go.,Inc.,New York,N.Y.761pp中描述了生产雄性不育烟草的方法。在另一个方面，本文提供的烟草品种是雌性不育的。作为非限制性实例，雌性不育植物可通过突变STIG1基因来制备。参见例如Goldman et al.1994,EMBO Journal 13:2976-2984。
如本文所用，术语“序列同一性”或“同一性”在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中是指当在指定的比较窗口上进行最大对应性比对时在两个序列中相同的残基。当参照蛋白质使用序列同一性百分比时，认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代，因此不改变分子的功能性质。当序列的保守取代不同时，可向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性。由于这种保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。对于本文提供的任何蛋白质序列，还考虑了由于一个或更多个众所周知的保守氨基酸取代而在一个或更多个氨基酸上不同的功能同源蛋白质，例如缬氨酸是丙氨酸的保守取代，苏氨酸是丝氨酸的保守取代。天然序列中氨基酸的保守取代可选自天然存在的氨基酸所属类别的其它成员。这些不同类别中的代表性氨基酸包括但不限于：(1)酸性(带负电荷)氨基酸，诸如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电荷)氨基酸，诸如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸，诸如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；和(4)中性非极性(疏水性)氨基酸，诸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。天然氨基酸序列中氨基酸的保守取代物可以选自天然存在的氨基酸所属的组中的其它成员。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。天然保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸、缬氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本公开的另一个方面包括由于在天然序列中缺失或***一个或更多个氨基酸而在一个或更多个氨基酸上与所述蛋白质序列不同的蛋白质。
提供的核酸分子、多肽或蛋白质可以是分离的或基本上纯化的。“分离的”或“纯化的”核酸分子、多肽、蛋白质或其生物活性部分实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与多核苷酸或蛋白质伴随或相互作用的组分。例如，分离或纯化的多核苷酸或蛋白质当通过重组技术产生时基本上不含其它细胞物质或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。
在一个方面，本公开提供在植物细胞中检测本文所述的一种或更多种重组核酸和多肽的方法。不受限制地，也可以使用杂交检测核酸。核酸之间的杂交详细讨论于Sambrooket al.(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)中。
可以使用抗体检测多肽。使用抗体检测多肽的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。本文提供的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。对本文提供的多肽具有特异性结合亲和力的抗体可使用本领域熟知的方法产生。可以使用本领域已知的方法将本文提供的抗体附着于固体支持物(如微量滴定板)上。
可以使用可检测标签实现(例如，扩增产物、杂交复合物、多肽)的检测。术语“标签”旨在包括使用直接标签以及间接标签。可检测标签包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。
可以用重组构建体或表达盒转化随后可以使用克隆方法繁殖的任何植物组织，无论是通过器官发生还是胚胎发生。“器官发生”意指从分生组织中心顺序发育枝条和根的过程。“胚胎发生”意指这样的过程，通过该过程枝条和根以一致的方式(不是顺序地)一起发育，无论是来自体细胞还是配子。适用于所述各种转化方案的示例性组织包括但不限于愈伤组织、现有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)、下胚轴、子叶、叶盘、花粉、胚等。
在一个方面，提供的烟草植物来自选自下组的烟草类型：烤制熟化烟草、晾制熟化烟草、深色晾制熟化烟草、深色明火烤制熟化烟草，Galpao烟草和东方烟草。另一个方面，提供的烟草植物来自选自下组的烟草类型：白肋烟草、马里兰烟草和深色烟草。
在一个方面，提供的烟草植物在烤制熟化烟草背景中或表现出本文所述的一种或更多种烤烟特性。烤制熟化烟草(也称为弗吉尼亚烟或金黄色烟)占世界烟草产量的约40％。因为在熟化期间其达到金黄色至深橘色，烤制熟化烟草也常常称为“金黄色烟”。烤制熟化烟草具有淡淡的、明亮的香气和味道。烤制熟化烟草通常糖含量高并且油含量低。主要的烤制熟化烟草种植国家有阿根廷、巴西、中国、印度、坦桑尼亚和美国。在一个方面，提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子在选自下组的烤制熟化烟草背景中：CC 13、CC 27、CC33、CC 37、CC 65、CC 67、CC 700、GF 318、GL 338、GL 368、GL 939、K 346、K 399、K326、NC102、NC 196、NC 291、NC 297、NC 299、NC 471、NC 55、NC 606、NC 71、NC 72、NC 92、PVH1118、PVH 1452、PVH 2110、SPEIGHT 168、SPEIGHT 220、SPEIGHT 225、SPEIGHT 227、SPEIGHT 236，和基本上衍生自任何一种前述品种的任何品种。在另一个方面，提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子在选自下组的烤制熟化烟草背景中：Coker 48、Coker 176、Coker 371-Gold、Coker 319、Coker 347、GL 939、K 149、K326、K 340、K 346、K 358、K 394、K 399、K 730、NC 27NF、NC 37NF、NC 55、NC 60、NC 71、NC 72、NC 82、NC 95、NC 297、NC606、NC 729、NC 2326、McNair 373、McNair 944、Ox 207、Ox 414NF、Reams 126、Reams 713、Reams 744、RG 8、RG 11、RG 13、RG 17、RG 22、RG 81、RG H4、RG H51、Speight H-20、Speight G-28、Speight G-58、Speight G-70、Speight G-108、Speight G-l11、Speight G-l17、Speight 168、Speight 179、Speight NF-3、Va 116、Va 182、以及基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种。参见WO2004/041006A1。在另一个方面，低生物碱或低烟碱烟草植物、种子、杂交种、品种或品系在选自下组的任何烤制熟化背景中：K326、K346和NC196。在一个方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自由表1中列出的品种组成的组的烤制熟化烟草品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种。参见WO2004/041006A1。在另一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物或种子是选自下组的烤制熟化品种：K326、K346和NC196。
表1.烤制熟化烟草品种。
Figure BDA0003272574610000691
Figure BDA0003272574610000701
Figure BDA0003272574610000711
在一个方面，提供的烟草植物在晾制熟化烟草背景中或表现出本文所述的一种或更多种晾制熟化烟草特性。晾制熟化烟草包括白肋烟、马里兰烟和深色烟草。共同的因素是熟化主要是没有人造热源和湿度源。白肋烟颜色浅至深棕色，油含量高并且糖含量低。白肋烟在仓中晾制熟化。主要的白肋烟草生长的国家是阿根廷、巴西、意大利、马拉维，且美国马里兰烟草非常蓬松，具有良好的燃烧性能、低烟碱和中性香气。主要的马里兰生长国家包括美国和意大利。在一个方面，提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子在选自下组的白肋烟草背景中：Clay 402、Clay 403、Clay 502、Ky 14、Ky 907、Ky 910、Ky 8959、NC 2、NC 3、NC 4、NC 5、NC 2000、TN 86、TN 90、TN 97、R 610、R 630、R 711、R 712、NCBH 129、Bu 21×Ky 10、HB04P、Ky 14×L 8、Kt 200、Newton 98、Pedigo 561、Pf561和Va 509。在另一个方面，低生物碱或低烟碱烟草植物、种子、杂交种、品种或品系在选自下组的任何白肋烟背景中：TN 90、KT 209、KT 206、KT212和HB 4488。在一个方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自由表2中列出的烟草品种组成的组的白肋烟草品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种。在另一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物或种子是选自下组的白肋烟品种：TN 90、KT 209、KT 206、KT212和HB 4488。
表2.白肋烟草品种。
Figure BDA0003272574610000712
Figure BDA0003272574610000721
在另一个方面，提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子在选自下组的马里兰烟草背景中：Md 10、Md 40、Md 201、Md 609、Md 872和Md 341。在另一个方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自由表3中列出的烟草品种组成的组的马里兰烟草品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种。
表3.马里兰烟草品种。
Maryland 10(TC 498)
Maryland 14D2(TC 499)
Maryland 201(TC 503)
Maryland 21(TC 500)
Maryland 341(TC 504)
Maryland 40
Maryland 402
Maryland 59(TC 501)
Maryland 601
Maryland 609(TC 505)
Maryland 64(TC 502)
Maryland 872(TC 506)
Maryland Mammoth(TC 507)
在一个方面，提供的烟草植物在深色晾制熟化烟草背景中或表现出本文所述的一种或更多种深色晾制熟化烟草特性。深色晾制熟化烟草与其它类型的区别主要在于其熟化过程使深色晾制熟化烟草具有中等至深棕色的颜色和独特的香气。深色晾制熟化烟草主要用于生产嚼烟和鼻烟。在一个方面，所提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子在选自下组的深色晾制熟化烟草背景中：Sumatra、Jatim、Dominican Cubano、Besuki、One sucker、Green River、Virginia sun-cured、和Paraguan Passado，以及基本上衍生自任何一种前述品种的任何品种。
在一个方面，提供的烟草植物在深色明火烤制熟化烟草背景中或表现出本文所述的一种或更多种深色明火烤制熟化烟草特性。深色明火烤制熟化烟草通常在封闭的烤房的地板上用低燃烧的木火熟化。它们的叶具有低糖含量但高烟碱含量。深色明火烤制熟化烟草用于制造管混合物、香烟、嚼烟、鼻烟和强烟味雪茄。深色明火烤制熟化烟草的主要生长区域是Tennessee、Kentucky和Virginia,USA。在一个方面，提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子在选自下组的深色明火烤制熟化烟草背景中：Narrow Leaf Madole、ImprovedMadole、Tom Rosson Madole、Newton's VH Madole、Little Crittenden、Green Wood、Little Wood、Small Stalk Black Mammoth、DT 508、DT 518、DT 592、KY 171、DF 911、DF485、TN D94、TN D950、VA 309和VA 359。在一个方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子选自由表4中列出的烟草品种组成的组的深色明火烤制熟化烟草品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种。
表4.深色明火烤制熟化烟草品种。
Figure BDA0003272574610000741
在一个方面，提供的烟草植物在东方烟草背景中或表现出本文所述的一种或更多种东方烟草特征。东方烟草也称为希腊香气和土耳其烟草，因为它们典型地种植在东地中海区域例如土耳其、希腊、保加利亚、马其顿、叙利亚、黎巴嫩、意大利和罗马里亚。今天的东方品种的特征是植株和叶的尺寸小，以及它独特的香气特性，这是植物在过去的几个世纪中适应生长的贫瘠土壤和恶劣的气候条件的结果。在一个方面，提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子在选自下组的东方烟草背景中：Izmir、Katerini、Samsun、Basma和Krumovgrad、Trabzon、Thesalian、Tasova,Sinop、Izmit,Hendek、Edirne、Semdinli、Adiyanman、Yayladag、Iskenderun、Duzce、Macedonian、Mavra、Prilep、Bafra、Bursa、Bucak、Bitlis、Balikesir和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种。在一个方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自由表5中列出的烟草品种组成的组的东方烟草品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种。
表5.东方烟草品种。
Figure BDA0003272574610000751
在一个方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是雪茄烟草品种，其选自由表6中列出的烟草品种组成的组的雪茄烟草品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种。
表6.雪茄烟草品种
Figure BDA0003272574610000761
在一个方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自由表7中列出的烟草品种组成的组的烟草品种，和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种。
表7.其他烟草品种
Chocoa(TI 319)
Hoja Parada(TI 1089)
Hoja Parado(Galpoa)(TI 1068)
Perique(St.James Parrish)
Perique(TC 556)
Perique(TI 1374)
Sylvestris(TI 984)
TI 179
在一个方面，本文所述的经修饰的烟草植物、种子或细胞来自选自由表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7中所列出的烟草品种组成的组的品种。
在一个方面，低生物碱或低烟碱烟草植物、种子、杂交种、品种或品系基本上衍生自以下或在以下遗传背景中：BU 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371Gold、Coker 48、CU 263、DF911、Galpao tobacco、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、K 149、K326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY 14、KY 160、KY17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14 x L8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、NealSmith Madole、OXFORD 207、`Perique`tobacco、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA 309、or VA359、Maryland 609、HB3307PLC、HB4488PLC、KT206LC、KT209LC、KT210LC、KT212LC、R610LC、PVH2310、NC196、KTD14LC、KTD6LC、KTD8LC、PD7302LC、PD7305LC、PD7309LC、PD7318LC、PD7319LC、PD7312LC、ShireyLC、或根据本领域已知的标准烟草育种技术的任何商业烟草品种。
上述提到的深色晾制熟化、白肋烟、马里兰烟、深色明火烤制熟化或东方烟草类型的所有特定品种仅出于示例性目的而列出。在本申请中还考虑了任何其它的深色晾制熟化、白肋烟、马里兰烟、深色明火烤制熟化或东方烟草品种。
还提供所述烟草植物的群体。在一个方面，烟草植物群体具有每英亩约5,000-约8000、约5,000-约7,600、约5,000-约7,200、约5,000-约6,800、约5,000-约6,400、约5,000-约6,000、约5,000-约5,600、约5,000-约5,200、约5,200-约8,000、约5,600-约8,000、约6,000-约8,000、约6,400-约8,000、约6,800-约8,000、约7,200-约8,000、or约7,600-约8,000株植物的种植密度。在另一个方面，烟草植物群体是低至中等生育力的土壤类型。
还提供了来自所述烟草植物的种子的容器。本公开的烟草种子的容器可以包含任何数量、重量或体积的种子。例如，容器可包含至少或大于约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000粒或更多的种子。或者，容器可容纳至少或大于约1盎司、5盎司、10盎司、1磅、2磅、3磅、4磅、5磅或更多的种子，或至少50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000克。烟草种子的容器可以是本领域可获得的任何容器。作为非限制性实例，容器可以是盒、袋、包、小袋、胶带卷、管或瓶。
还提供了由所述低生物碱或低烟碱烟草植物制成的熟化烟草材料。还提供了由所述烟草植物制成的具有较高含量的总生物碱或烟碱的熟化烟草材料。
“熟化”是一种陈化过程，其减少水分并导致叶绿素的破坏，使烟叶呈现金黄色，并且淀粉也转化为糖。因此，与收获的绿叶相比，熟化烟草具有更高的还原糖含量和更低的淀粉含量。在一个方面，提供的绿叶烟草可以使用常规方法熟化，例如烤制熟化、仓房熟化(barn-cured)、明火烤制熟化、晾制熟化或晒制熟化。对于各种类型的熟化方法的描述，参见例如(1999,Chapter 1in Tobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford)。熟化烟草通常在水分含量为10％至约25％的压缩条件下在木桶(例如大桶)或纸板箱中陈化数年(例如2至5年)。参见美国专利号4,516,590和5,372,149。然后可以进一步加工熟化和陈化的烟草。进一步加工包括在引入或不引入各种温度的蒸汽、巴氏杀菌和发酵的情况下在真空下调制烟草。典型地，发酵的特征是初始水分含量高、产生热量和干重损失10至20％。参见例如美国专利号4,528,993、4,660,577、4,848,373、5,372,149；美国公开号2005/0178398；和Tso(1999,Chapter1inTobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,BlackwellPublishing,Oxford)。可以进一步加工熟化、陈化和发酵的烟草(例如切割、切碎、膨化或混合)。参见例如美国专利号4,528,993；4,660,577和4,987,907。在一个方面，本公开的熟化烟草材料是晒制熟化的。在一个方面，本公开的熟化烟草材料是烤制熟化的、晒制熟化的、或明火烤制熟化的。
从本公开的烟草品系、品种或杂交种获得的烟草材料可用于制备烟草制品。如本文所用，“烟草制品”被定义为旨在供人使用或消费的由烟草制成或衍生自烟草的任何产品。
提供的烟草制品包括但不限于卷烟制品(例如卷烟和比迪烟)、雪茄制品(例如雪茄***烟和小雪茄)、烟斗烟制品、衍生自烟草的制品、衍生自烟草的烟碱制品、无烟烟草制品(例如湿鼻烟、干鼻烟和嚼烟)、膜、可嚼物、标签、片剂、成形部分、凝胶、可消费单元、不溶性基质、中空形状、再造烟草、膨化烟草等。参见例如美国专利公开号US 2006/0191548。
如本文所用，“卷烟”是指具有“棒”和“填料”的烟草制品。卷烟“棒”包括卷烟纸、滤嘴、滤棒(用于容纳过滤材料)、将卷烟纸(包括填料)固定在滤嘴上的接装纸，以及将这些部件固定在一起的所有胶水。“填料”包括(1)所有烟草，包括但不限于再造烟草和膨化烟草，(2)非烟草替代品(包括但不限于草药、非烟草植物材料和可能伴随烟草卷入卷烟纸的其他香料)，(3)外壳，(4)调味料，和(5)(混入烟草和替代品并卷入卷烟的)所有其他添加剂。
如本文所用，“再造烟草”是指加工成片状并切成条状以模拟烟草的由烟草粉末和其他烟草废料制成的一部分烟草填料。除了节省成本之外，再造烟草由于通过使用氨和糖之间的反应加工风味发展有助于香烟味道的贡献而非常重要。
如本文所用，“膨化烟草”是指一部分烟草填料，其通过合适气体的膨胀进行处理，使得烟草“膨化”，导致密度降低和填充能力增加。它减少了卷烟中使用的烟草的重量。
衍生自本公开的植物的烟草制品还包括卷烟和其他吸烟制品，特别是那些包括过滤元件的吸烟制品，其中可吸烟材料棒包括烟草混合物中的熟化烟草。在一个方面，本公开的烟草制品选自下组：小雪茄、不通风过滤嘴香烟、通风过滤嘴香烟、雪茄(cigar)、鼻烟、烟斗烟、雪茄烟(cigar tobacco)、卷烟、嚼烟、叶烟、水烟、烟碎(shredded tobacco)和烟丝(cut tobacco)。在另一个方面，本公开的烟草制品是无烟烟草制品。无烟烟草制品不燃烧，包括但不限于嚼烟、潮湿无烟烟草、鼻烟和干鼻烟。嚼烟是粗分的烟叶，其典型地包装在大袋状包装中并用于塞子或捻。潮湿无烟烟草是一种潮湿的、更细分的烟草，以松散的形式或以小袋的形式提供，并且典型地包装在圆形罐中并用作夹(pinch)在或放置在成人烟草消费者的脸颊和牙龈之间的小袋中。鼻烟是经过热处理的无烟烟草。干鼻烟是放在嘴里或经鼻使用的精细研磨的烟草。在另一个方面，本公开的烟草制品选自下组：散叶嚼烟、塞嚼烟(plug chewing tobacco)、湿鼻烟和鼻烟(nasal snuff)。在又另一个方面，本公开的烟草制品选自下组：电子加热的卷烟、e-卷烟、电子蒸发装置。
在一个方面，本公开的烟草制品可以是混合烟草制品。在一个方面，混合烟草制品包含熟化烟草材料。在一个方面，按重量计，熟化烟草材料在烟草混合物的熟化烟草中占约至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一个方面，按体积计，熟化烟草材料在烟草混合物的熟化烟草中占约至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
在一个方面，本公开的烟草制品可以是低烟碱烟草制品。在进一步的方面，本公开的烟草制品可以少于约3mg/g的含量包含降烟碱。例如，这种制品中的降烟碱含量可以是约3.0mg/g、2.5mg/g、2.0mg/g、1.5mg/g、1.0mg/g、750μg/g、500pg/g、250pg/g、100pg/g、75pg/g、50pg/g、25pg/g、10pg/g、7.0pg/g、5.0pg/g、4.0pg/g、2.0pg/g、1.0pg/g、0.5pg/g、0.4pg/g、0.2pg/g、0.1pg/g、0.05pg/g、0.01pg/g或不可检测。
在一个方面，基于干重，提供的熟化烟草材料或烟草制品包含选自下组的平均烟碱或总生物碱含量：约0.01％、0.02％、0.05％、0.75％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.35％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、5％、6％、7％、8％和9％。在另一个方面，基于干重，提供的熟化烟草材料或烟草制品包含选自下组的平均烟碱或总生物碱含量：约0.01％-0.02％、0.02％-0.05％、0.05％-0.75％、0.75％-0.1％、0.1％-0.15％、0.15％-0.2％、0.2％-0.3％、0.3％-0.35％、0.35％-0.4％、0.4％-0.5％、0.5％-0.6％、0.6％-0.7％、0.7％-0.8％、0.8％-0.9％、0.9％-1％、1％-1.1％、1.1％-1.2％、1.2％-1.3％、1.3％-1.4％、1.4％-1.5％、1.5％-1.6％、1.6％-1.7％、1.7％-1.8％、1.8％-1.9％、1.9％-2％、2％-2.1％、2.1％-2.2％、2.2％-2.3％、2.3％-2.4％、2.4％-2.5％、2.5％-2.6％、2.6％-2.7％、2.7％-2.8％、2.8％-2.9％、2.9％-3％、3％-3.1％、3.1％-3.2％、3.2％-3.3％、3.3％-3.4％、3.4％-3.5％和3.5％-3.6％。在进一步的方面，基于干重，提供的熟化烟草材料或烟草制品包含选自下组的平均烟碱或总生物碱含量：约0.01％-0.1％、0.02％-0.2％、0.03％-0.3％、0.04％-0.4％、0.05％-0.5％、0.75％-1％、0.1％-1.5％、0.15％-2％、0.2％-3％和0.3％-3.5％。
本公开还提供了制造烟草制品的方法，所述烟草制品包含来自所述烟草植物的烟草材料。在一个方面，方法包括调制由本文提供的烟草植物制成的陈化烟草材料，以将其水分含量从约12.5％至约13.5％增加至约21％，混合经调制的烟草材料以产生所需的混合物。在一个方面，制造烟草制品的方法还包含将所述混合物进行加料(casing)或调味。通常，在加料工艺中，在混合物中添加加料或调味的材料，通过平衡化学组成来提高它们的质量并开发某些期望的风味特征。加料工艺的进一步细节可见于L.Davis和M.Nielsen主编的Tobacco Production,Chemistry and Technology,Edited by L.Davis and M.Nielsen,Blackwell Science,1999。
提供的烟草材料也可以使用包括但不限于热处理(例如烹饪、烘烤)、调味、酶处理、膨化和/或熟化的方法进行加工。可以使用这些技术加工发酵和非发酵烟草。合适的加工烟草的实例包括深色晾制熟化的、深色明火烤制熟化的、白肋烟、烤制熟化的和雪茄填料或包装纸，以及来自全叶填塞操作的制品。在一个方面，烟草纤维包括基于鲜重高达70％的深色烟草。例如，如美国公开号2004/0118422或2005/0178398中所述，可通过加热、出汗和/或巴氏杀菌步骤来调制烟草。
提供的烟草材料可以进行发酵。典型地，发酵的特征是初始水分含量高、产生热量和干重损失10至20％。参见例如美国专利号4,528,993；4,660,577；4,848,373和5,372,149。除了改变叶片的香气外，发酵还可以改变叶片的颜色和质地或两者。同样在发酵过程中，可以产生逸出气体，可以吸收氧气，可以改变pH值，可以改变保留的水量。参见例如美国公开号2005/0178398和Tso(1999,Chapter 1in Tobacco,Production,ChemistryandTechnology,Davis&Nielsen,eds.,Blac kwell Publishing,Oxford)。在加入口腔用制品之前，可以进一步加工(例如切割、膨化、混合、研磨或粉碎)熟化或熟化并发酵的烟草。在某些情况下，烟草是长切发酵的熟化湿烟草，在与共聚物和任选的食用香料和其他添加剂混合之前，其烘箱挥发物含量为48-50重量％。
在一个方面，提供的烟草材料可以加工成所需的尺寸。在某些方面，烟草纤维可以加工成平均纤维尺寸小于200微米。在一个方面，烟草纤维为75至125微米。在另一个方面，将烟草纤维加工成具有75微米或更小的尺寸。在一个方面，烟草纤维包括长切烟草，其可被切割或切碎成宽度为约10切/英寸(cut/inch)直至约110切/英寸，长度为约0.1英寸至约1英寸。双切烟草纤维可具有一定范围的颗粒尺寸，使得约70％的双切烟草纤维落在-20目至80目的筛目尺寸之间。
本文提供的烟草材料可以加工成总烘箱挥发物含量为约10重量％或更高；约20重量％或更高；约40重量％或更高；约15重量％至约25重量％；约20重量％至约30重量％；约30重量％至约50重量％；约45重量％至约65重量％或约50重量％至约60重量％。本领域技术人员将理解，“湿”烟草典型地是指烘箱挥发物含量为约40重量％至约60重量％(例如约45重量％至约55重量％，或约50％重量)的烟草。如本文所用，“烘箱挥发物”通过计算在预热的强制通风烘箱中于110℃干燥样品3.25小时后样品的失重百分比来确定。口腔用制品的总烘箱挥发物含量可与用于制备口腔用制品的烟草纤维的烘箱挥发物含量不同。本文描述的加工步骤可以减少或增加烘箱挥发物含量。
本公开还提供用于育种包含所需含量的总生物碱或烟碱(例如低烟碱或无烟碱)的烟草品系、栽培种或品种的方法。育种可以通过任何已知的程序进行。可以在标记-辅助选择(MAS)育种项目中使用DNA指纹图谱、SNP作图、单倍型作图或相似技术以将所需的性状或等位基因转移或育种到烟草植物中。例如，育种者可以使用本文公开的F1杂交植物在F2代或回交世代中生成分离群体，或者进一步将F1杂交种植物与其他具有农艺上所需基因型的供体植物杂交。可以使用本领域已知的技术或本文列出的技术之一筛选F2或回交世代的植物的所需农艺性状或所需化学特征。取决于预期的遗传模式或使用的MAS技术，可以在每个回交周期之前对所选植物进行自花授粉，以帮助鉴定所需的单个植株。回交或其他育种程序可重复进行，直到轮回亲本的所需表型恢复。本公开中的轮回亲本可以是烤制熟化品种、白肋品种、深色晾制熟化品种、深色明火烤制熟化品种或东方品种。例如，其它育种技术可以在Wernsman,E.A.,and Rufty,R.C.1987.Chapter Seventeen.Tobacco.Pages 669-698In:Cultivar Development.Crop Species.W.H.Fehr(ed.),MacMillan PublishingGo.,Inc.,New York,N.Y.,中找到，其全部内容通过引用并入本文。
使用所描述的烟草植物的植物育种程序的结果包括本公开的有用的品系、栽培种、品种、后代、近交系和杂交种。如本文所用，术语“品种”是指具有将其与相同物种的其他植物分离的恒定特征的植物群体。品种通常是，尽管并不总是，商业化销售的。尽管具有一种或更多种区别性状，品种的进一步特征是在该品种内的个体之间的总体差异非常小。可以通过数代自花受粉和选择，或使用组织或细胞培养技术从单个亲本无性繁殖生成“纯品系”品种。品种可以基本上衍生自另一个品系或品种。根据国际公约对植物新品种保护所定义的(1961年12月2日，于1972年11月10日、1978年10月23日和1991年3月19日在日内瓦修订)，品种“基本上衍生”自初始品种，如果：a)它主要衍生自初始品种，或衍生自主要衍生自初始品种的品种，同时保留由所述初始品种的基因型或基因型组合产生的必要特征的表达；b)它与初始品种有明显区别；c)除了由衍生行为产生的差异，它在由所述初始品种的基因型或基因型组合导致的必要特征的表达中与初始品种相符合。例如，可通过选择天然或诱导的突变体、体细胞无性变异、来自初始品种植物的变异个体、回交或转化获得基本上衍生的品种。认为第一烟草品种和第二烟草品种(第一烟草品种基本衍生自第二烟草品种)具有基本相同的遗传背景。与品种不同，“品系”最通常是指非商业化使用，例如用于植物研究的一组植物。品系通常在个体间的一种或更多种目标性状显示非常小的总体差异，尽管在个体间的其他性状可能存在一些差异。
在另一个方面，所提供的植物部分包括但不限于叶、茎、根、种子、花、花粉、花药、胚珠、花梗、果实、分生组织、子叶、下胚轴、果荚、胚、胚乳、外植体、愈伤组织、组织培养物、枝条、细胞和原生质体。在一个方面，所提供的烟草植物不包括种子。在一个方面，本公开提供了不是繁殖材料并且不介导植物的天然繁殖的烟草植物细胞、组织和器官。在另一个方面，本公开还提供是繁殖材料并介导植物的天然繁殖的烟草植物细胞、组织和器官。在另一个方面，本发明提供了不能通过光合作用维持自身的烟草植物细胞、组织和器官。另一个方面，本发明提供了体细胞烟草植物细胞。与生殖细胞相反，体细胞不介导植物繁殖。
提供的细胞、组织和器官可以来自种子、果实、叶、子叶、下胚轴、分生组织、胚、胚乳、根、枝条、茎、果荚、花、花序、叶柄、花梗、花柱、柱头、花托、花瓣、萼片、花粉、花药、花丝、子房、胚珠、果皮、韧皮部、维管组织。在另一个方面，本公开提供烟草植物叶绿体。在另一个方面，本公开提供表皮细胞、气孔细胞、叶或根毛、贮藏根或块茎。在另一个方面，本公开提供烟草原生质体。
技术人员理解，烟草植物经由种子自然繁殖，而不是通过无性繁殖或营养繁殖。在一个方面，本公开提供烟草胚乳。在另一个方面，本公开提供烟草胚乳细胞。在另一个方面，本公开提供雄性或雌性不育的烟草植物，其在没有人为干预的情况下不能繁殖。技术人员进一步理解，熟化烟草不构成活的有机体并且不能生长或繁殖。
以下是本公开的示例性实施例。
实施方案1.烟草植物或其部分，其包含抑制来自NIC1b基因座、NIC2基因座或两者的一个或多个基因的第一遗传修饰，并且还包含增加烟碱向降烟碱转化的第二遗传修饰。
实施方案2.实施方案1的烟草植物或其部分，其中所述第一遗传修饰包含nic1b突变等位基因。
实施方案3.实施方案2的烟草植物或其部分，其中所述nic1b突变等位基因衍生自古巴雪茄烟草品种、低生物碱白肋烟21(LABU21)、低中级白肋烟21(LIBU21)、低生物碱烤烟53(LAFC53)、低烟碱KY171(LNKY171)或衍生自其的品种。
实施方案4.实施方案1的烟草植物或其部分，其中所述第一遗传修饰包含降低来自NIC1b基因座的一个或多个乙烯响应因子(ERF)基因的表达或活性的转基因或突变。
实施方式5.实施方式4的烟草植物或其部分，其中所述第一遗传修饰包含靶向一个或多个选自下组的基因的转基因：ERF101、ERF110、ERFnew、ERF199、ERF19、ERF130、ERF16、ERF29、ERF210和ERF91L2。
实施方案6.实施方案1的烟草植物或其部分，其中所述第一遗传修饰包含降低来自NIC1b基因座的一个或多个非ERF基因的表达或活性的转基因或突变。
实施方案7.实施方案1的烟草植物或其部分，其中所述第一遗传修饰包含增加来自NIC1b基因座的一个或多个乙烯响应因子(ERF)基因的表达或活性的转基因或突变。
实施方案8.实施方案1的烟草植物或其部分，其中所述第一遗传修饰包含降低来自NIC1b基因座的一个或多个非ERF基因的表达或活性的转基因或突变。
实施方案9.实施方案1的烟草植物或其部分，其中所述第一遗传修饰包含nic2突变等位基因。
实施方案10.实施方案9的烟草植物或其部分，其中所述nic2突变等位基因衍生自古巴雪茄烟草品种、低生物碱白肋烟21(LABU21)、低中级白肋烟21(LIBU21)、低生物碱烤烟53(LAFC53)、低烟碱KY171(LNKY171)或衍生自其的品种。
实施方案11.实施方案1的烟草植物或其部分，其中所述第一遗传修饰包含降低来自NIC2基因座的一个或多个乙烯响应因子(ERF)基因的表达或活性的转基因或突变。
实施方案12.实施方案11的烟草植物或其部分，其中所述第一遗传修饰包含靶向一个或多个选自下组的基因的转基因：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。
实施方案13.实施方案1-12中任一项的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰过表达烟碱脱甲基酶。
实施方案14.实施方案13中任一项的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰包含编码所述烟碱脱甲基酶的转基因。
实施方案15.实施方案13中任一项的烟草植物或其部分，其中所述烟碱脱甲基酶来自烟草属的植物。
实施方案16.实施方案13中任一项的烟草植物或其部分，其中所述烟碱脱甲基酶包含非天然的、突变的或工程化的氨基酸序列。
实施方案17.实施方案13中任一项的烟草植物或其部分，其中所述烟碱脱甲基酶包含天然或烟草天然氨基酸序列。
实施方案18.实施方案1-12中任一项的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰包含编码CYP82E4、CYP82E5和CYP85E10多肽中的一种或更多种的转基因。
实施方式19.实施方式1-12中任一项的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰包括增加CYP82E4、CYP82E5和CYP85E10多肽中的一种或更多种的表达或活性的基因组编辑。
实施方案20.实施方案18或19的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰增加CYP82E4v2的表达或活性，或包含编码CYP82E4v2的转基因。
实施方式21.实施方式1-20中任一项的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物还包含与缺乏第三遗传修饰的对照植物相比增加一种或更多种抗氧化剂的含量的第三遗传修饰。
实施方案22.实施方案21的烟草植物或其部分，其中所述第三种遗传修饰包含编码或靶向抗氧化剂生物合成酶、抗氧化剂的调节转录因子、抗氧化剂转运蛋白、抗氧化剂代谢酶或其组合的转基因。
实施方式23.实施方式21的烟草植物或其部分，其中所述第三遗传修饰包含编码抗氧化剂生物合成酶、抗氧化剂的调节转录因子、抗氧化剂转运蛋白、抗氧化剂代谢酶或其组合的一个或多个内源基因的修饰。
实施方案24.实施方案21的烟草植物或其部分，其中所述一种或更多种抗氧化剂选自下组：花青素、黄烷酮、黄烷醇、黄酮、黄酮醇、异黄酮、羟基苯甲酸、羟基肉桂酸、鞣花单宁、芪类、木酚素、类胡萝卜素和甘草甜素。
实施方式25.实施方式21的烟草植物或其部分，其中所述一种或更多种抗氧化剂选自下组：飞燕草素、花青素、原花青素、飞燕草素、橙皮素、柚皮素、儿茶素、表儿茶素、芹菜素、木犀草素、槲皮素、杨梅素、芸香素、染料木黄酮、大豆黄素、没食子酸、香草酸、原儿茶酸、阿魏酸、肉桂酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、血根素、白藜芦醇、芝麻素、类胡萝卜素和维生素C。
实施方案26.实施方案21的烟草植物或其部分，其中所述第三遗传修饰包含编码一种或更多种选自下组的多肽的转基因：AtPAP1、Ntmyb3A、Ntmyb3B、Ntmyb3C、NtJAF13、StAN1、NtAN1和NtAN2。
实施方案27.烟草植物或其部分，其包含增加烟碱向降烟碱转化的第一遗传修饰并且还包含增加一种或更多种抗氧化剂的含量的第二遗传修饰。
实施方案28.实施方案27的烟草植物或其部分，其还包含减少所述烟草植物中烟碱的第三遗传修饰。
实施方案29.实施方案28的烟草植物或其部分，其中所述第三遗传修饰包含nic1b突变等位基因、nic2突变等位基因或两者。
实施方案30.实施方案29的烟草植物或其部分，其中所述nic1b突变等位基因衍生自古巴雪茄烟草品种、低生物碱白肋烟21(LABU21)、低中级白肋烟21(LIBU21)、低生物碱烤烟53(LAFC53)、低烟碱KY171(LNKY171)或衍生自其的品种。
实施方案31.实施方案28的烟草植物或其部分，其中所述第三遗传修饰包含降低来自NIC1b基因座的一个或多个乙烯响应因子(ERF)基因的表达或活性的转基因或突变。
实施方案32.实施方案28的烟草植物或其部分，其中所述第三种遗传修饰包含靶向一个或多个选自下组的基因的转基因：ERF101、ERF110、ERFnew、ERF199、ERF19、ERF130、ERF16、ERF29、ERF210和ERF91L2。
实施方案33.实施方案28的烟草植物或其部分，其中所述第三遗传修饰包含降低来自NIC1b基因座的一个或多个非ERF基因的表达或活性的转基因或突变。
实施方案34.实施方案28的烟草植物或其部分，其中所述第三遗传修饰包含增加来自NIC1b基因座的一个或多个乙烯响应因子(ERF)基因的表达或活性的转基因或突变。
实施方案35.实施方案28的烟草植物或其部分，其中所述第三遗传修饰包含增加来自NIC1b基因座的一个或多个非ERF基因的表达或活性的转基因或突变。
实施方案36.实施方案29的烟草植物或其部分，其中所述nic2突变等位基因衍生自古巴雪茄烟草品种、低生物碱白肋烟21(LABU21)、低中级白肋烟21(LIBU21)、低生物碱烤烟53(LAFC53)、低烟碱KY171(LNKY171)或衍生自其的品种。
实施方案37.实施方案28的烟草植物或其部分，其中所述第三遗传修饰包含降低来自NIC2基因座的一个或多个乙烯响应因子(ERF)基因的表达或活性的转基因或突变。
实施方案38.实施方案37的烟草植物或其部分，其中所述第三种遗传修饰包含一个或多个选自下组的基因的转基因：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。
实施方案39.实施方案28-38中任一项的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰包含编码烟碱脱甲基酶的转基因。
实施方案40.实施方案39中任一项的烟草植物或其部分，其中所述烟碱脱甲基酶来自烟草属的植物。
实施方案41.实施方案39中任一项的烟草植物或其部分，其中所述烟碱脱甲基酶包含非天然的、突变的或工程化的氨基酸序列。
实施方式42.实施方式39中任一项的烟草植物或其部分，其中所述烟碱脱甲基酶包含天然或烟草天然氨基酸序列。
实施方案43.实施方案28-38中任一项的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰包含编码CYP82E4、CYP82E5和CYP85E10多肽中的一种或更多种的转基因。
实施方案44.实施方案43的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰包含编码CYP82E4v2的转基因。
实施方案45.实施方案28-38中任一项的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰包含增加CYP82E4、CYP82E5和CYP85E10多肽中的一种或更多种的表达或活性的基因组编辑。
实施方式46.实施方式45的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰包含增加CYP82E4v2的表达或活性的基因组编辑。
实施方案47.实施方案28-46中任一项的烟草植物或其部分，其中与缺乏所述第二遗传修饰的对照植物相比，所述第二遗传修饰增加一种或更多种抗氧化剂的含量并且降低一种或更多种TSNA的含量。
实施方案48.实施方案47的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰包含编码或靶向抗氧化剂生物合成酶、抗氧化剂的调节转录因子、抗氧化剂转运蛋白、抗氧化剂代谢酶或其组合的转基因。
实施方案49.实施方案47的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰包括编码抗氧化剂生物合成酶、抗氧化剂的调节转录因子、抗氧化剂转运蛋白、抗氧化剂代谢酶或其组合的一个或多个内源基因的修饰。
实施方案50.实施方案47的烟草植物或其部分，其中所述一种或更多种抗氧化剂选自下组：花青素、黄烷酮、黄烷醇、黄酮、黄酮醇、异黄酮、羟基苯甲酸、羟基肉桂酸、鞣花单宁、芪类、木酚素、类胡萝卜素和甘草甜素。
实施方式51.实施方式47的烟草植物或其部分，其中所述一种或更多种抗氧化剂选自下组：飞燕草素、花青素、原花青素、飞燕草素、橙皮素、柚皮素、儿茶素、表儿茶素、芹菜素、木犀草素、槲皮素、杨梅素、芸香素、染料木黄酮、大豆黄素、没食子酸、香草酸、原儿茶酸、阿魏酸、肉桂酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、血根素、白藜芦醇、芝麻素、类胡萝卜素和维生素C。
实施方案52.实施方案47的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰包含编码一个或多个选自下组的多肽的转基因：AtPAP1、Ntmyb3A、Ntmyb3B、Ntmyb3C、NtJAF13、StAN1、NtAN1和NtAN2。
实施方案53.前述实施方案中任一项的烟草植物或其部分，其中所述植物能够产生USDA等级指数值为在相似条件下生长并加工的对照植物的叶的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的叶，并且其中除一种或两种所述遗传修饰以外，所述对照植物与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。
实施方案54.前述实施方案中任一项的烟草植物或其部分，其中所述植物能够产生表现出选自下组的USDA等级指数值的叶：55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高和95或更高。
实施方案55.前述实施方案中任一项的烟草植物或其部分，其中所述植物能够产生烟碱含量低于对照植物的烟碱含量的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的叶，其中除一种或两种所述遗传修饰以外，所述对照植物与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。
实施方案56.前述实施方案中任一项的烟草植物或其部分，其中所述植物能够产生包含选自下组的烟碱含量的叶：以干重计，小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％和小于0.05％。
实施方案57.前述实施方案中任一项的烟草植物或其部分，其中所述植物能够产生包含少于2、少于1.9、少于1.8、少于1.7、少于1.6、少于1.5、少于1.4、少于1.3、少于1.2、少于1.1、少于1.0、少于0.9、少于0.8、少于0.7、少于0.6、少于0.5、少于0.4、少于0.3、少于0.2、少于0.15、少于0.1或少于0.05ppm的总TSNA含量的熟化叶。
实施方案58.前述实施方案任一项的烟草植物或其部分，其中所述植物能够产生包含包含2ppm-0.05ppm、1.9ppm-0.05ppm、1.8ppm-0.05ppm、1.7ppm-0.05ppm、1.6ppm-0.05ppm、1.5ppm-0.05ppm、1.4ppm-0.05ppm、1.3ppm-0.05ppm、1.2ppm-0.05ppm、1.1ppm-0.05ppm、1.0ppm-0.05ppm、0.9ppm-0.05ppm、0.8ppm-0.05ppm、0.7ppm-0.05ppm、0.6ppm-0.05ppm、0.5ppm-0.05ppm、0.4ppm-0.05ppm、0.3ppm-0.05ppm、0.2ppm-0.05ppm、0.15ppm-0.05ppm或0.1ppm-0.05ppm的总TSNA含量的熟化叶。
实施方案59.前述实施方案中任一项的烟草植物或其部分，其中所述植物能够产生包含少于2、少于1.9、少于1.8、少于1.7、少于1.6、少于1.5、少于1.4、少于1.3、少于1.2、少于1.1、少于1.0、少于0.9、少于0.8、少于0.7、少于0.6、少于0.5、少于0.4、少于0.3、少于0.2、少于0.15、少于0.1或少于0.05ppm的总NNN含量的熟化叶。
实施方案60.前述实施方案中任一项的烟草植物或其部分，其中所述植物能够产生包含2ppm-0.05ppm、1.9ppm-0.05ppm、1.8ppm-0.05ppm、1.7ppm-0.05ppm、1.6ppm-0.05ppm、1.5ppm-0.05ppm、1.4ppm-0.05ppm、1.3ppm-0.05ppm、1.2ppm-0.05ppm、1.1ppm-0.05ppm、1.0ppm-0.05ppm、0.9ppm-0.05ppm、0.8ppm-0.05ppm、0.7ppm-0.05ppm、0.6ppm-0.05ppm、0.5ppm-0.05ppm、0.4ppm-0.05ppm、0.3ppm-0.05ppm、0.2ppm-0.05ppm、0.15ppm-0.05ppm或0.1ppm-0.05ppm的总NNN含量的熟化叶。
实施方案61.前述实施方案中任一项的烟草植物或其部分，其中所述植物能够产生包含少于2、少于1.9、少于1.8、少于1.7、少于1.6、少于1.5、少于1.4、少于1.3、少于1.2、少于1.1、少于1.0、少于0.9、少于0.8、少于0.7、少于0.6、少于0.5、少于0.4、少于0.3、少于0.2、少于0.15、少于0.1或少于0.05ppm的总NNK含量的熟化叶。
实施方案62.前述实施方案中任一项的烟草植物或其部分，其中所述植物能够产生包含2ppm-0.05ppm、1.9ppm-0.05ppm、1.8ppm-0.05ppm、1.7ppm-0.05ppm、1.6ppm-0.05ppm、1.5ppm-0.05ppm、1.4ppm-0.05ppm、1.3ppm-0.05ppm、1.2ppm-0.05ppm、1.1ppm-0.05ppm、1.0ppm-0.05ppm、0.9ppm-0.05ppm、0.8ppm-0.05ppm、0.7ppm-0.05ppm、0.6ppm-0.05ppm、0.5ppm-0.05ppm、0.4ppm-0.05ppm、0.3ppm-0.05ppm、0.2ppm-0.05ppm、0.15ppm-0.05ppm或0.1ppm-0.05ppm的总NNK含量的熟化叶。
实施方案63.实施方案28-62中任一项的烟草植物群体。
实施64.来自实施方案1-62中任一项的烟草植物的熟化烟草材料。
实施方案65.实施方案64的熟化烟草材料，其中所述熟化烟草材料通过选自下组的熟化方法制备：烤制熟化、晾制熟化、明火烤制熟化和晒制熟化。
实施方式66.包含实施方式64的熟化烟草材料的烟草混合物。
实施方案67.实施方案66的烟草混合物，其中所述熟化烟草材料构成所述烟草混合物中熟化烟草的约至少10重量％、至少15重量％、至少20重量％、至少25重量％、至少30重量％、至少35重量％、至少40重量％、至少45重量％、至少50重量％、至少55重量％、至少60重量％、至少65重量％、至少70重量％、至少75重量％、至少80重量％、至少85重量％、至少90重量％或至少95重量％。
实施方案68.实施方案66的烟草混合物，其中所述熟化烟草材料构成所述烟草混合物中熟化烟草的约至少10体积％、至少15体积％、至少20体积％、至少25体积％、至少30体积％、至少35体积％、至少40体积％、至少45体积％、至少50体积％、至少55体积％、至少60体积％、至少65体积％、至少70体积％、至少75体积％、至少80体积％、至少85体积％、至少90体积％或至少95体积％。
实施方式69.包含实施方式64的熟化烟草材料的烟草制品。
实施方案70.实施方案69的烟草制品，其中所述烟草制品选自下组：香烟、小雪茄、不通风过滤嘴香烟、通风过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟、雪茄烟、卷烟、嚼烟、叶烟、烟碎和烟丝。
实施方案71.实施方案69的烟草制品，其中所述烟草制品是无烟烟草制品。
实施方案72.实施方案71的烟草制品，其中所述无烟烟草制品选自下组：散叶嚼烟、塞嚼烟、湿鼻烟和鼻烟。
实施方案73.包含实施方案64的熟化烟草材料的再造烟草。
现在已经一般性地描述了本公开内容，通过参考以下实施例将更容易地理解本公开内容，除非另有说明，否则以下实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本公开内容。
实施例
实施例1.植物转化
经由农杆菌介导的转化产生表达目标基因的烟草植物。表达载体p45-2-7用作产生多个转化载体的骨架。p45-2-7含有CsVMV启动子、NOS终止子和包含卡那霉素选择标记(NPT II)的盒，该盒与肌动蛋白2启动子和NOS终止子可操作地连接。经由农杆菌转化将含有目标转基因的核酸载体引入烟草叶盘。例如，参见Mayo et al.,2006,Nat Protoc.1:1105-11and Horsch et al.,1985,Science 227:1229-1231。
将高中级白肋烟21(HI BU21)或低中级白肋烟21(LI BU21)烟草植物在MagentaTMGA-7盒中生长，切下叶盘并置于陪替氏平皿中。通过在50mL离心管中以3500RPM离心20mL细胞悬液10分钟来收集包含转化载体的根癌农杆菌细胞。除去上清液，将根癌农杆菌细胞沉淀重悬于40mL液体重悬培养基中。用#15剃刀刀片将烟叶(避开中肋)切成8个0.6cm圆盘，并颠倒放置在陪替氏平皿中。将具有B5维生素液体重悬培养基的Murashige&Skoog薄层添加到陪替氏平皿中，并用细针将叶圆盘均匀地戳破。将约25mL根癌农杆菌悬液添加到陪替氏平皿中，并将叶盘在悬液中温育10分钟。
将叶盘转移至共培养陪替氏平皿(1/2MS培养基)，并将圆盘颠倒放置以与覆盖在共培养TOM培养基(具有20g/L蔗糖；1mg/L吲哚-3-乙酸；和2.5mg/L6-苄氨基嘌呤(BAP)的MS培养基)上。将陪替氏平皿用石蜡膜密封，然后在24摄氏度下在暗光(60-80mE/ms)中以18小时开、6小时关的光周期温育三天。温育后，将叶盘转移到再生/选择TOM K培养基陪替氏平皿(TOM培养基加300mg/L卡那霉素)。将叶盘在24摄氏度下在暗光下以18小时开、6小时关的光周期每两周一次继代培养到新鲜的TOMK培养基中，直到枝条变得可切除。用镊子取出从叶盘再生的枝条并***含有100mg/L卡那霉素的MS基础培养基中。将外植体置于含有100mg/L卡那霉素的MS基础培养基上，在24摄氏度温育18小时，在高强度光照(6080mE/ms)下进行6小时关闭光周期以诱导生根。
当含有枝条和根的小植株生长足够大时(例如，达到MagentaTM GA-7盒高度的约一半)，将它们转移到土壤中。将建立的幼苗转移到温室中用于进一步分析和结籽。对照植物是未转化的HI BU21或LI BU21植物，或已经用空p45-2-7载体转化的HI BU21或LI BU21植物。
实施例2：过表达烟碱脱甲基酶(细胞色素P450单加氧酶CYP82E4v2)以降低烟草中的烟碱含量
根据实施例1，将烟碱脱甲基酶CYP82E4v2的编码序列(SEQ ID NO:1)整合到p45-2-7转化载体中，并产生经修饰的烟草植物。经修饰的HI BU21烟草植物(T0和T1代)和对照烟草植物在移植至土壤后生长4-6周。将植物在开花期打顶。打顶后两周，收获来自顶部的第3-第5片叶。将叶冷冻干燥或烘干。使用标准方案从干燥叶测量生物碱。与对照HI BU21植物相比，表达CYP82E4v2的T0转基因植物具有降低的烟碱含量(图1)。当CYP82E4v2在LI BU21和TN90 LC植物中过表达时，在T0转基因植物中也观察到烟碱减少(图1)。还测量了这些转基因植物中的降烟碱、假木贼碱和新烟草碱含量。当CYP82E4v2在所有三种背景中过表达时，降烟碱含量升高(图2)。在各种T0转基因植物中，假木贼碱和新烟草碱在它们的含量上显示出类似的趋势，因为它们的含量彼此相关，而没有由于CYP82E4v2过表达引起的决定性的变化(图3和4)。进一步测试TN90 LC中T1代的生物碱含量，例如烟碱减少而降烟碱不增加，以及假木贼碱和新烟草碱略微增加(图5-8)。值得注意的是，CYP82E4v2过表达TN90 LCT1植物中的平均烟碱含量为对照植物的烟碱含量的约1％(图5)。
实施例3：抗氧化剂调节基因的过表达降低TSNA
根据实施例1，将抗氧化调节基因拟南芥PAP1(SEQ ID NO:2)、红花烟草Myb3(SEQID NO:3)和马铃薯AN1(SEQ ID NO:4)的编码序列掺入p45-2-7转化载体中，并产生经修饰的烟草植物。表达CYP82E4v2和至少一种抗氧化剂调节基因(T0和T1代)的经修饰的HI BU21烟草植物和对照烟草植物在移植到土壤后生长4-6周。将植物在开花期打顶。打顶后两周，收获来自顶部的第3-第5片叶。将叶冷冻干燥或烘干。使用标准方案从干燥叶测量生物碱。选择具有低生物碱量和高抗氧化剂量的植物并在田间生长。将所选择的植物以及对照植物打顶，将叶晾制熟化并测试TSNA。表达拟南芥PAP1、红花烟草Myb3或马铃薯AN1的植物与未经修饰的对照植物相比表现出增加的抗氧化能力和减少的TSNA量。在烟草植物中增加抗氧化能力的任何基因的过表达可用于降低经修饰的HIBU21中的TSNA。如图9所示，在LATN90中过表达Myb3的T0转基因植物表现出增加的抗氧化剂含量，如通过铁还原抗氧化能力(FRAP)测定所测量(图9)。在3代植物中观察到这种抗氧化剂增加(图10)。类似地，在LATN90中过表达Myb3的T2转基因植物表现出增加的抗氧化能力(图11)。这里使用的LATN90是具有从LABU21渗入的nic1 nic2双突变的TN90品种。
铁还原抗氧化能力(FRAP)方法基于2,4,6-三吡啶基-s-三嗪(TPTZ)与六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)的络合物的还原，其还原后形成蓝色亚铁络合物(Benzie&Strain,1996,Analytical Biochemistry,239,70-76)。使用三种溶液进行试验：溶液1)TPTZ(0.07802g/25mL)在40mM盐酸中的10mmol.L-1溶液；溶液2)六水合氯化铁(0.13513g/25mL)在ACS水中的20mM溶液；溶液3)20mM乙酸盐缓冲液，pH 3.6(三水合乙酸钠在100mLACS水中的重量为0.27216g，使用HCl调节至所需pH)。将这三种溶液(TPTZ，FeCl3，乙酸盐缓冲液)以1:1:10的比例混合。将245μL体积的混合液移液到塑料比色皿中，随后添加入5μL样品(没食子酸，
Figure BDA0003272574610000972
)。在主λ593nm波长下测量吸光度。使用不同浓度的
Figure BDA0003272574610000973
制备标准曲线，并将样品与标准曲线进行比较。使用以下等式计算总抗氧化剂
Figure BDA0003272574610000971
实施例4：使用CYP82E4v2和烟草Myb3的过表达以降低烟碱和TSNA并改进叶质量
将红花烟草Myb3(SEQ ID NO:3)和CYP82E4v2(SEQ ID NO:1)引入p45-2-7转化载体中，并用于产生如实施例1所述的经修饰的烟草植物。经修饰的烟草植物(T0和T1代)和对照烟草植物在移植到土壤后生长4-6周。将植物在开花期打顶。打顶后两周，收获来自顶部的第3-第5片叶。将叶冷冻干燥或烘干。使用标准方案从干燥叶测量生物碱。与对照植物相比，过表达CYP82E4v2的植物具有降低的烟碱含量。选择具有低生物碱量和高抗氧化剂量的植物并在田间生长。使用标准分子技术证实Myb3的过表达。将经修饰的和对照植物打顶，将叶晾制熟化，并使用标准方案测试生物碱和TSNA。与未经修饰的对照植物相比，测试表达拟南芥PAP1、红花烟草Myb3或马铃薯AN1，也表达CYP82E4v2的植物的烟碱和TSNA含量。如图12所示，在所有三种烟草背景TN90、HI BU21和LI BU21中，与载体对照植物相比，过表达CYP82E4v2和Myb3的T0转基因植物含有减少的烟碱。相反，在所有三种烟草背景TN90、HIBU21和LI BU21中，与载体对照植物相比，过表达CYP82E4v2和Myb3的T0转基因植物含有增加含量的降烟碱(图13)。同样，假木贼碱和新烟草碱在各种T0转基因植物中的含量显示出类似的趋势，因为它们的含量彼此相关，而没有由于CYP82E4v2和Myb3过表达引起的决定性的变化(图14和15)。如果有的话，相对于平均对照含量，TN90可以表现出稍高的假木贼碱和新烟草碱的平均含量。此外，FRAP测定证明CYP82E4v2和Myb3共同过表达也增加了所有三种烟草背景TN90、HI BU21和LI BU21中的抗氧化剂含量(图16)。
或者，用烟碱脱甲基酶和Myb3过表达构建体共转化HI BU21(或LI BU21)植物。愈伤组织颜色(例如紫色或深红色)可用于选择Myb3转化体。此外，用烟碱脱甲基酶过表达构建体转化过表达AtPAP1的烟草植物。另外，用AtPAP1(或Myb3)过表达构建体转化烟碱脱甲基酶过表达植物。此外，带有两个或多个堆叠的表达盒的单一构建体(例如，如SEQ IDNo.44所示的CsVMV-NtMYB3-Nos-T-CsVMV-CYP82E4-Nos-T)用于转化HI BU21(或LI BU21)植物。选择转化体并测试烟碱和TSNA含量。
实施例5：将表达抗氧化剂调节基因的HI BU21(或LI BU21)植物杂交到白肋烟转化品系中
使用标准技术将显示烟碱高度转化为降烟碱的白肋烟品系(稳定转化品系)与表达抗氧化调节基因的HI BU21(或LI BU21)植物杂交。测试稳定的F2植物的烟碱含量。进行抗氧化剂分析以测试这些植物与亲本白肋烟转化品系相比的抗氧化能力。TSNA分析用于评估与亲本白肋烟转化品系相比的TSNA含量。使用标准技术测量生物碱、抗氧化能力和TSNA。

Claims (20)

1.烟草植物或其部分，其包含抑制来自NIC1b基因座、NIC2基因座或两者的一个或多个基因的第一遗传修饰，并且还包含增加烟碱向降烟碱转化的第二遗传修饰。
2.权利要求1的烟草植物或其部分，其中所述第一遗传修饰包含nic1b突变等位基因。
3.权利要求2的烟草植物或其部分，其中所述nic1b突变等位基因衍生自古巴雪茄烟草品种、低生物碱白肋烟21(LABU21)、低中级白肋烟21(LIBU21)、低生物碱烤烟53(LAFC53)、低烟碱KY171(LNKY171)或衍生自其的品种。
4.权利要求1的烟草植物或其部分，其中所述第一遗传修饰包含降低来自NIC1b基因座的一个或多个乙烯响应因子(ERF)基因的表达或活性的转基因或突变。
5.权利要求4的烟草植物或其部分，其中所述第一遗传修饰包含靶向一个或多个选自下组的基因的转基因：ERF101、ERF110、ERFnew、ERF199、ERF19、ERF130、ERF16、ERF29、ERF210和ERF91L2。
6.权利要求1的烟草植物或其部分，其中所述第一遗传修饰包含nic2突变等位基因。
7.权利要求1的烟草植物或其部分，其中所述第一遗传修饰包含降低来自NIC2基因座的一个或多个乙烯响应因子(ERF)基因的表达或活性的转基因或突变。
8.权利要求7的烟草植物或其部分，其中所述第一遗传修饰包含靶向一个或多个选自下组的基因的转基因：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。
9.权利要求1-8中任一项的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰过表达烟碱脱甲基酶。
10.权利要求9中任一项的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰包含编码所述烟碱脱甲基酶的转基因。
11.权利要求1-8中任一项的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰包含编码CYP82E4、CYP82E5和CYP85E10多肽中的一种或更多种的转基因。
12.权利要求1-8中任一项的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰包含增加CYP82E4、CYP82E5和CYP85E10多肽中的一种或更多种的表达或活性的基因组编辑。
13.权利要求11或12的烟草植物或其部分，其中所述第二遗传修饰增加CYP82E4v2的表达或活性，或包含编码CYP82E4v2的转基因。
14.权利要求1-13中任一项的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物还包含与缺乏第三遗传修饰的对照植物相比增加一种或更多种抗氧化剂的含量的第三遗传修饰。
15.权利要求14的烟草植物或其部分，其中所述第三种遗传修饰包含编码或靶向抗氧化剂生物合成酶、抗氧化剂的调节转录因子、抗氧化剂转运蛋白、抗氧化剂代谢酶或其组合的转基因。
16.权利要求14的烟草植物或其部分，其中所述第三种遗传修饰包含编码一种或更多种选自下组的多肽的转基因：AtPAP1、Ntmyb3A、Ntmyb3B、Ntmyb3C、NtJAF13、StAN1、NtAN1和NtAN2。
17.烟草植物或其部分，其包含增加烟碱向降烟碱转化的第一遗传修饰，并且还包含增加一种或更多种抗氧化剂含量的第二遗传修饰。
18.权利要求17的烟草植物或其部分，其还包含减少所述烟草植物中烟碱的第三种遗传修饰。
19.来自权利要求1-18中任一项的烟草植物的熟化烟草材料。
20.包含权利要求19的熟化烟草材料的烟草制品。
CN202080023186.6A 2019-01-24 2020-01-23 包含降低的烟碱和降低的烟草特异性亚硝胺的烟草植物 Pending CN113660857A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962796399P 2019-01-24 2019-01-24
US62/796,399 2019-01-24
PCT/US2020/014724 WO2020154466A1 (en) 2019-01-24 2020-01-23 Tobacco plants comprising reduced nicotine and reduced tobacco specific nitrosamines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113660857A true CN113660857A (zh) 2021-11-16

Family

ID=69740542

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080023186.6A Pending CN113660857A (zh) 2019-01-24 2020-01-23 包含降低的烟碱和降低的烟草特异性亚硝胺的烟草植物

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20200239899A1 (zh)
EP (1) EP3914069A1 (zh)
CN (1) CN113660857A (zh)
WO (1) WO2020154466A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110592103A (zh) * 2019-10-22 2019-12-20 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草假木贼碱合成调控基因NtERF91的克隆和应用
CN110643616A (zh) * 2019-10-22 2020-01-03 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草降烟碱合成调控基因NtERF91的克隆和应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021026119A1 (en) * 2019-08-05 2021-02-11 University Of Virginia Patent Foundation TRANSCRIPTION FACTOR NtERF221 AND METHODS OF USING THE SAME
WO2023172805A1 (en) * 2022-03-07 2023-09-14 North Carolina State University Methods and compositions for producing tobacco plants with reduced nicotinic alkaloid levels

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018067985A1 (en) * 2016-10-07 2018-04-12 Altria Client Services Llc Composition and methods for producing tobacco plants and products having reduced tobacco-specific nitrosamines (tsnas)
WO2018237107A1 (en) * 2017-06-23 2018-12-27 University Of Kentucky Research Foundation PROCESS

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4762785A (en) 1982-08-12 1988-08-09 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducting alien DNA in vivo
US4528993A (en) 1982-08-20 1985-07-16 R. J. Reynolds Tobacco Company Process for producing moist snuff
US4660577A (en) 1982-08-20 1987-04-28 R.J. Reynolds Tobacco Company Dry pre-mix for moist snuff
US4516590A (en) 1982-11-26 1985-05-14 Philip Morris Incorporated Air-cured bright tobacco filler, blends and smoking articles
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US4732856A (en) 1984-04-03 1988-03-22 Carnegie Institution Of Washington Transposable elements and process for using same
US5231019A (en) 1984-05-11 1993-07-27 Ciba-Geigy Corporation Transformation of hereditary material of plants
US5149645A (en) 1984-06-04 1992-09-22 Rijksuniversiteit Leiden Process for introducing foreign DNA into the genome of plants
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
SE455438B (sv) 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
US4848373A (en) 1987-04-13 1989-07-18 Helme Tobacco Company Nicotine removal process and product produced thereby
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5013658A (en) 1988-05-13 1991-05-07 Dna Plant Technology Corporation Transposon tagging of genes in transformed plants
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US4987907A (en) 1988-06-29 1991-01-29 Helme Tobacco Company Chewing tobacco composition and process for producing same
US5879918A (en) 1989-05-12 1999-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun
US5141131A (en) 1989-06-30 1992-08-25 Dowelanco Method and apparatus for the acceleration of a propellable matter
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5372149A (en) 1992-03-25 1994-12-13 Roth; David S. Sterilization process in the manufacturing of snuff
HUT70467A (en) 1992-07-27 1995-10-30 Pioneer Hi Bred Int An improved method of agrobactenium-mediated transformation of cultvred soyhean cells
IL108241A (en) 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
US5469976A (en) 1993-04-30 1995-11-28 Burchell; James R. Shelf allocation and management system
US5789156A (en) 1993-06-14 1998-08-04 Basf Ag Tetracycline-regulated transcriptional inhibitors
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
EP0733059B1 (en) 1993-12-09 2000-09-13 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells
US5491081A (en) 1994-01-26 1996-02-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean cyst nematode resistant soybeans and methods of breeding and identifying resistant plants
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US5689035A (en) 1995-09-26 1997-11-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Brown stem rot resistance in soybeans
US5760012A (en) 1996-05-01 1998-06-02 Thomas Jefferson University Methods and compounds for curing diseases caused by mutations
US5731181A (en) 1996-06-17 1998-03-24 Thomas Jefferson University Chimeric mutational vectors having non-natural nucleotides
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
WO1998049350A1 (en) 1997-04-30 1998-11-05 Regents Of The University Of Minnesota In vivo use of recombinagenic oligonucleobases to correct genetic lesions in hepatocytes
CN100419083C (zh) 1997-08-05 2008-09-17 金默拉根有限公司 用混合双链寡核苷酸在植物中实现定点遗传改变的用途
JP4243426B2 (ja) 1997-11-17 2009-03-25 メトソ ペーパ、 インコーポレイテッド 紙用カレンダにおけるニップ通過面の汚染および／または損傷の検出方法
US10266836B2 (en) * 2001-11-13 2019-04-23 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Tobacco nicotine demethylase genomic clone and uses thereof
US7025066B2 (en) 2002-10-31 2006-04-11 Jerry Wayne Lawson Method of reducing the sucrose ester concentration of a tobacco mixture
US20040118422A1 (en) 2002-12-19 2004-06-24 Swedish Match North Europe Ab Tobacco dough and a method for its manufacture
US8627828B2 (en) 2003-11-07 2014-01-14 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Tobacco compositions
TW200531647A (en) 2003-12-22 2005-10-01 Us Smokeless Tobacco Co Conditioning process for tobacco and/or snuff compositions
EP1851317B1 (en) 2005-02-23 2011-10-26 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
KR101672423B1 (ko) 2005-02-28 2016-11-03 22엔디 센츄리 리미티드, 엘엘씨 식물의 니코틴 알칼로이드 수준의 감소
US9551003B2 (en) 2006-09-13 2017-01-24 22Nd Century Limited, Llc Increasing levels of nicotinic alkaloids in plants
US8319011B2 (en) 2006-12-15 2012-11-27 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Tobacco plants having reduced nicotine demethylase activity
WO2009064771A2 (en) 2007-11-12 2009-05-22 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
WO2011027315A1 (en) 2009-09-04 2011-03-10 Moshe Danny S Grading of agricultural products via hyper spectral imaging and analysis
AU2011205282B2 (en) 2010-01-15 2014-10-02 North Carolina State University Compositions and methods for minimizing nornicotine synthesis in tobacco
US10375910B2 (en) 2013-03-15 2019-08-13 Altria Client Services Llc Development of tobacco varieties with no or significantly reduced anatabine content
WO2016007632A1 (en) 2014-07-08 2016-01-14 Altria Client Services Llc The genetic locus imparting a low anatabine trait in tobacco and methods of using
EP3313173A1 (en) 2015-06-26 2018-05-02 Altria Client Services LLC Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
US9896696B2 (en) 2016-02-15 2018-02-20 Benson Hill Biosystems, Inc. Compositions and methods for modifying genomes

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018067985A1 (en) * 2016-10-07 2018-04-12 Altria Client Services Llc Composition and methods for producing tobacco plants and products having reduced tobacco-specific nitrosamines (tsnas)
WO2018237107A1 (en) * 2017-06-23 2018-12-27 University Of Kentucky Research Foundation PROCESS

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MANOHAR CHAKRABARTI: "CYP82E4-mediated nicotine to nornicotine conversion in tobacco", 《PLANT MOL BIOL》 *
RAMSEY S. LEWIS: "Three nicotine demethylase genes mediate nornicotine biosynthesis", 《PHYTOCHEMISTRY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110592103A (zh) * 2019-10-22 2019-12-20 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草假木贼碱合成调控基因NtERF91的克隆和应用
CN110643616A (zh) * 2019-10-22 2020-01-03 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草降烟碱合成调控基因NtERF91的克隆和应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20200239899A1 (en) 2020-07-30
WO2020154466A1 (en) 2020-07-30
EP3914069A1 (en) 2021-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7399923B2 (ja) アルカロイドレベル改変タバコ植物体及び製品を作出する組成物及び方法
US11950563B2 (en) Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
US11634724B2 (en) Composition and methods for producing tobacco plants and products having reduced tobacco-specific nitrosamines (TSNAs)
US20240117370A1 (en) Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels with desirable leaf quality
WO2021113337A1 (en) Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
US20200239899A1 (en) Tobacco Plants Comprising Reduced Nicotine and Reduced Tobacco Specific Nitrosamines
US20220010324A1 (en) Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
US20220403402A1 (en) Composition and Methods for Producing Tobacco Plants and Products Having Increased Phenylalanine and Reduced Tobacco-Specific Nitrosamines (TSNAs)
US20240067977A1 (en) Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels with desirable leaf quality via manipulating leaf quality genes
US20190309317A1 (en) Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination