CN113655004A - 一种奶茶饮料中茶多酚的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品检测技术领域，公开了一种奶茶饮料中茶多酚的检测方法，包括以下步骤：将奶茶样液、菠萝蛋白酶溶液、乙醇水溶液配制成混合液，酶解后，经冷却、过滤，获得澄清滤液；取澄清滤液，与酒石酸亚铁溶液和磷酸缓冲溶液混合后，配制成待测样液，检测待测样液的吸光度；取澄清滤液，与磷酸缓冲溶液混合后，配制成对照溶液，所述对照溶液与待测样液中的澄清滤液含量相同，检测对照溶液的吸光度；根据待测样液和对照溶液的吸光度，获得奶茶样液中的茶多酚含量。本发明将菠萝蛋白酶酶解与乙醇沉淀相结合，能破坏茶多酚与蛋白质之间的络合作用，并充分去除奶茶饮料中的蛋白质，获得澄清滤液，从而提高检测的准确性、精密度和稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种奶茶饮料中茶多酚的检测方法。
背景技术
GB/T 21733-2008《中华人民共和国国家标准茶饮料》中对茶多酚含量作出了明确规定，其中，调味茶饮料(奶、奶味)中茶多酚含量应≥200mg/kg，复(混)合茶饮料中茶多酚含量应≥150mg/kg。
国家标准方法GB/T 21733-2008附录A在测定奶茶饮料中茶多酚含量时使用乙醇作为沉淀剂，由于奶茶饮料除了蛋白质和脂肪等干扰物质外，还添加了乳化剂、稳定剂，乙醇沉淀蛋白效果不佳，无法得到澄清预处理液。另外，在沉淀蛋白质时，可能会由于茶多酚与蛋白质之间的络合效应而导致茶多酚检测回收率偏低，该方法对于奶茶饮料中茶多酚检测存在较大缺陷。
而其他测定茶多酚含量的方法，如高锰酸钾滴定法、钼酸铵分光光度法、紫外分光光度法、重氮化-偶合分光光度法、差示分光光度法、柠檬酸铁铵分光光度法、流动注射-抑制化学发光法、近红外光谱快速无损检测方法、Folin-Ciocalteu比色法、电化学检测法等，也都只适用于基质比较简单的样品，如茶叶或茶汤中茶多酚含量的测定，而不适合含蛋白质、脂肪、稳定剂等成分复杂的奶茶类样品中茶多酚含量的测定。
在现有的检测奶茶中茶多酚含量的方法中，通常采用沉淀法去除蛋白质干扰。例如，文献“奶茶饮料中茶多酚含量测定的方法改进”(颜慧,张鹏,邹勇平,周元元.食品安全导刊,2017(36):154-156.)中，采用三氯乙酸-盐溶液乙醇法，利用三氯乙酸沉淀蛋白和盐溶液盐析的协同效应，能够快速有效沉淀奶茶中的复杂物质，得到清透稳定的显色液。此外，文献中还报道过盐酸沉淀法、乙酸沉淀法、乙腈沉淀法、丙酮沉淀法等，这类沉淀法虽然能够去除奶茶中的蛋白质，但由于络合作用，茶多酚会随着蛋白质一起沉淀，导致测定茶多酚回收率均偏低。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种奶茶饮料中茶多酚的检测方法。本发明将菠萝蛋白酶酶解与乙醇沉淀相结合，能破坏茶多酚与蛋白质之间的络合作用，并充分去除奶茶饮料中的蛋白质，获得澄清滤液，从而提高检测的准确性、精密度和稳定性。
本发明的具体技术方案为：
一种奶茶饮料中茶多酚的检测方法，包括以下步骤：
(1)将奶茶样液、菠萝蛋白酶溶液、乙醇水溶液配制成混合液，酶解后，经冷却、过滤，获得澄清滤液；
(2)取澄清滤液，与酒石酸亚铁溶液和磷酸缓冲溶液混合后，配制成待测样液，检测待测样液的吸光度；
(3)取澄清滤液，与磷酸缓冲溶液混合后，配制成对照溶液，所述对照溶液与待测样液中的澄清滤液含量相同，检测对照溶液的吸光度；
(4)根据待测样液和对照溶液的吸光度，获得奶茶样液中的茶多酚含量。
在奶茶饮料中，蛋白质含量远高于茶多酚含量，两者之间存在络合作用，当乙醇使蛋白质沉淀时，茶多酚也会一起沉淀，导致测得的茶多酚含量偏低。本发明利用菠萝蛋白酶对奶茶样液进行酶解处理，解决了上述问题，机制如下：茶多酚中邻位的酚羟基与蛋白质分子的肽基之间能形成双点氢键，使茶多酚络合到蛋白质上；而加入菠萝蛋白酶后，菠萝蛋白酶能催化水解蛋白质分子中的肽键，从而破坏茶多酚与蛋白质的络合作用，防止茶多酚随着蛋白质一起沉淀。
此外，当单独采用乙醇沉淀法时，由于乳化剂、稳定剂的影响，蛋白质沉淀效果不佳，无法获得澄清滤液，严重影响茶多酚含量的检测；而本发明通过将乙醇沉淀与菠萝蛋白酶酶解相结合，能充分去除奶茶饮料中的蛋白质，得到澄清的滤液，因而能较大程度地去除奶茶饮料中复杂基质的干扰。
作为优选，步骤(1)中，所述奶茶样液与菠萝蛋白酶溶液中的菠萝蛋白之间的质量比为1:0.014～0.016。
菠萝蛋白酶的用量过大或过小均会导致茶多酚检测结果偏低，具体而言：当菠萝蛋白酶用量过小时，无法充分破坏奶茶中蛋白质与茶多酚之间的络合作用，导致茶多酚含量检测结果偏低；而当菠萝蛋白酶用量过大时，多余的菠萝蛋白酶会与茶多酚发生络合，同样会导致茶多酚含量检测结果偏低。
作为优选，步骤(1)中，酶解温度为60～65℃，时间为15～50min。
作为优选，步骤(1)中，所述菠萝蛋白酶溶液中，菠萝蛋白酶的浓度为8～12g/100mL。
作为优选，步骤(1)中，所述乙醇水溶液中，乙醇的体积分数为90～96％；所述奶茶样液与混合液的质量体积比为1g:2.0～2.5mL。
混合液中的乙醇含量过高或过低均会影响茶多酚检测的准确性，具体而言：当混合液中的乙醇含量过低时，无法使蛋白质、脂肪等物质充分沉淀，导致获得的滤液浑浊度较高，对茶多酚的检测造成干扰；而当混合液中的乙醇含量过高时，会导致菠萝蛋白酶变性，造成酶解过程无法充分破坏蛋白质与茶多酚之间的络合作用，进而导致茶多酚含量检测结果偏低。
作为优选，步骤(1)中，过滤时，弃去5～8mL初滤液。
作为优选，步骤(1)中，采用慢速定量滤纸进行过滤。
作为优选，步骤(2)中，所述酒石酸亚铁溶液的制备方法如下：将硫酸亚铁和酒石酸钾钠溶于水中，所述硫酸亚铁、酒石酸钾钠与水的质量体积比为0.10～0.15:0.50～0.75:100。
作为优选，步骤(2)中，所述澄清滤液、酒石酸亚铁溶液与磷酸缓冲液的体积比为1:0.9～1.3:2.5～3.5。
作为优选，步骤(2)和(3)中，所述磷酸缓冲溶液的pH为7.0～7.5。
作为优选，步骤(2)和(3)中，检测吸光度时，采用10mm的比色皿，检测波长为540nm；步骤(4)中，按照以下公式计算奶茶样液中的茶多酚含量：
X＝(A1-A2)×1.957×2×K×1000/m
其中，X为奶茶样液中的茶多酚含量，单位为mg/kg；A1为待测样液的吸光度；A2为对照溶液的吸光度；K为稀释倍数，K＝V1/V2，V1为步骤(1)中混合液的体积，V2为步骤(2)中取的澄清滤液体积；m为奶茶样液的质量，单位为g。
上式中，1.957表示：根据GB/T 21733-2008《中华人民共和国国家标准茶饮料》，用10mm比色皿、检测波长为540nm的情况下，当吸光度等于0.50时，1mL茶汤中茶多酚的含量相当于1.957mg。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)采用一定量的菠萝蛋白酶对奶茶样液进行酶解，能破坏茶多酚与蛋白质之间的络合作用，防止茶多酚随蛋白质一起沉淀而造成检测结果偏低；
(2)将乙醇沉淀与菠萝蛋白酶酶解相结合，能充分去除奶茶饮料中的蛋白质，获得澄清滤液，防止茶多酚的检测受到干扰。
附图说明
图1为不同菠萝蛋白酶添加量下对茶多酚含量的检测结果；
图2为不同酶解时间下对茶多酚含量的检测结果；
图3为不同酶解温度下对茶多酚含量的检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种奶茶饮料中茶多酚的检测方法，包括以下步骤：
(1)将奶茶样液、浓度为8～12g/100mL的菠萝蛋白酶溶液、90～96％(乙醇的体积分数)的乙醇水溶液配制成混合液，所述奶茶样液与菠萝蛋白酶溶液中的菠萝蛋白之间的质量比为1:0.014～0.016，所述奶茶样液与混合液的质量体积比为1g:2.0～2.5mL；在60～65℃下酶解15～50min后，冷却，过滤，弃去5～8mL初滤液，获得澄清滤液；
(2)取澄清滤液，与酒石酸亚铁溶液和pH 7.0～7.5的磷酸缓冲溶液以1:0.9～1.3:2.5～3.5的体积比混合后，配制成待测样液；采用10mm的比色皿，在波长540nm处，检测待测样液的吸光度；将硫酸亚铁和酒石酸钾钠溶于水中，所述硫酸亚铁、酒石酸钾钠与水的质量体积比为0.10～0.15:0.50～0.75:100；
(3)取澄清滤液，与磷酸缓冲溶液混合后，配制成对照溶液，所述对照溶液与待测样液中的澄清滤液含量相同；采用10mm的比色皿，在波长540nm处，检测对照溶液的吸光度；
(4)按照以下公式计算奶茶样液中的茶多酚含量：
X＝(A1-A2)×1.957×2×K×1000/m
其中，X为奶茶样液中的茶多酚含量，单位为mg/kg；A1为待测样液的吸光度；A2为对照溶液的吸光度；K为稀释倍数，K＝V1/V2，V1为步骤(1)中混合液的体积，V2为步骤(2)中取的澄清滤液体积；m为奶茶样液的质量，单位为g。
实施例1
一种奶茶饮料中茶多酚的检测方法，包括以下步骤：
(1)将奶茶饮料充分摇匀后，从中准确称取奶茶样液25.00g，加入50mL容量瓶中，加入4mL浓度为10g/100mL的菠萝蛋白酶溶液(菠萝蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司，活力为1200U/mg)后，用95％(乙醇的体积分数)的乙醇水溶液定容至刻度，充分摇匀，配制成混合液；在60℃下酶解15min后，冷却至室温，用慢速定量滤纸过滤，弃去5mL初滤液，获得滤液；
(2)精确移取滤液5.0mL于25mL容量瓶中，加入5.0mL酒石酸亚铁溶液，充分摇匀后，用pH 7.5的磷酸缓冲溶液定容至刻度，配制成待测样液；采用10mm的比色皿，在波长540nm处，以试剂空白做参比，检测待测样液的吸光度，记为A1；所述酒石酸亚铁溶液的制备方法如下：称取硫酸亚铁0.1g和酒石酸钾钠0.5g，用水溶解并定容至100mL(低温保存有效期10天)；
(3)精确移取澄清滤液5.0mL于25mL容量瓶中，用pH 7.5的磷酸缓冲溶液定容至刻度，配制成对照溶液；采用10mm的比色皿，在波长540nm处，以试剂空白做参比，检测对照溶液的吸光度，记为A2；
(4)按照以下公式计算奶茶样液中的茶多酚含量：
X＝(A1-A2)×1.957×2×10×1000/25
其中，X为奶茶样液中的茶多酚含量，单位为mg/kg；A1为待测样液的吸光度；A2为对照溶液的吸光度。
对比例1
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，将奶茶样液25.00g加入50mL容量瓶中后，用95％(乙醇的体积分数)的乙醇水溶液定容至刻度，充分摇匀，静置15min后，用慢速定量滤纸过滤，弃去5mL初滤液，获得滤液。
对比例2
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，将奶茶样液25.00g加入50mL容量瓶中后，加5mL 106g/L亚铁***溶液和5mL 220g/L乙酸锌溶液，混匀，用水定容至刻度，充分摇匀，静置15min后，用慢速定量滤纸过滤，弃去5mL初滤液，获得滤液。
对比例3
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，将奶茶样液25.00g加入50mL容量瓶中后，加5mL饱和硫酸铵溶液，混匀，用水定容至刻度，充分摇匀，静置15min后，用慢速定量滤纸过滤，弃去5mL初滤液，获得滤液。
对比例4
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，将奶茶样液25.00g加入50mL容量瓶中后，加1mL 1wt％盐酸，混匀，用95％(乙醇的体积分数)的乙醇水溶液定容至刻度，充分摇匀，静置15min后，用慢速定量滤纸过滤，弃去5mL初滤液，获得滤液。
对比例5
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，将奶茶样液25.00g加入50mL容量瓶中后，加1mL 4wt％醋酸溶液，混匀，用95％(乙醇的体积分数)的乙醇水溶液定容至刻度，充分摇匀，静置15min后，用慢速定量滤纸过滤，弃去5mL初滤液，获得滤液。
对比例6
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，将奶茶样液25.00g加入50mL容量瓶中后，乙腈定容至刻度，充分摇匀，静置15min后，用慢速定量滤纸过滤，弃去5mL初滤液，获得滤液。
对比例7
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，将奶茶样液25.00g加入50mL容量瓶中后，加1mL 4wt％三氯乙酸溶液，混匀，用95％(乙醇的体积分数)的乙醇水溶液定容至刻度，充分摇匀，静置15min后，用慢速定量滤纸过滤，弃去5mL初滤液，获得滤液。
对比例8
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，将奶茶样液25.00g加入50mL容量瓶中后，加1mL 1wt％盐酸，混匀，用丙酮定容至刻度，充分摇匀，静置15min后，用慢速定量滤纸过滤，弃去5mL初滤液，获得滤液。
采用实施例1和对比例1～8中的方法，对奶茶饮料1和奶茶饮料2进行茶多酚含量检测，结果见表1。
表1
从表1可以看出：
(1)根据对比例1～3的实验结果可知：当采用乙醇沉淀法、亚铁***沉淀法、饱和硫酸铵沉淀法对奶茶样液进行预处理时，无法获得澄清滤液，失光严重不能进行测定吸光度。
(2)对比实施例1与对比例1～8的实验结果可知：相较于采用单一的沉淀法而言，当采用菠萝蛋白酶酶解法与乙醇沉淀法时，测得的茶多酚含量更高。推测原因在于：在奶茶饮料中，蛋白质含量远高于茶多酚含量，两者之间存在络合作用，当沉淀剂使蛋白质沉淀时，茶多酚也会一起沉淀，导致测得的茶多酚含量偏低；而菠萝蛋白酶能催化水解蛋白质分子中的肽键，从而破坏茶多酚与蛋白质的络合作用，防止茶多酚随着蛋白质一起沉淀。
(3)对比实施例1与对比例1的实验结果可知：当采用单一的乙醇沉淀法时，无法获得澄清滤液；而在乙醇沉淀法的基础上，采用菠萝蛋白酶进行酶解，能够获得澄清滤液。推测原因在于：当单独采用乙醇沉淀法时，由于乳化剂、稳定剂的影响，蛋白质沉淀效果不佳，无法获得澄清滤液，严重影响茶多酚含量的检测；而当将乙醇沉淀与菠萝蛋白酶酶解相结合时，能充分去除奶茶饮料中的蛋白质，从而得到澄清的滤液。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，菠萝蛋白酶溶液的体积为3.5mL。
对比例9
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，菠萝蛋白酶溶液的体积为2mL。
对比例10
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，菠萝蛋白酶溶液的体积为2.5mL。
对比例11
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，菠萝蛋白酶溶液的体积为3mL。
对比例12
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，菠萝蛋白酶溶液的体积为4.5mL。
对比例13
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，菠萝蛋白酶溶液的体积为5mL。
采用实施例1～2和对比例9～13中的方法，对奶茶饮料1进行茶多酚含量检测，结果见图1。从图1可以看出：菠萝蛋白酶用量过大或过小均会导致茶多酚检测结果偏低；当菠萝蛋白酶溶液添加量为3.5～4mL(即奶茶样液与菠萝蛋白之间的质量比为1:0.014～0.016)时，测得的茶多酚含量较高。推测原因在于：当菠萝蛋白酶用量过小时，无法充分破坏奶茶中蛋白质与茶多酚之间的络合作用，导致茶多酚含量检测结果偏低；而当菠萝蛋白酶用量过大时，多余的菠萝蛋白酶会与茶多酚发生络合，同样会导致茶多酚含量检测结果偏低。
实施例3
本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，酶解时间为20min。
实施例4
本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，酶解时间为25min。
实施例5
本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，酶解时间为30min。
实施例6
本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，酶解时间为40min。
实施例7
本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，酶解时间为50min。
对比例14
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，酶解时间为5min。
对比例15
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，酶解时间为10min。
采用实施例1、3～7和对比例14～15中的方法，对奶茶饮料1进行茶多酚含量检测，结果见图2。从图2可以看出：酶解时间过短会导致茶多酚检测结果偏低；当酶解时间在15min以上时，酶解时间对茶多酚检测结果影响不大，从实验周期考虑，酶解时间优选为15min。
实施例8
本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，酶解温度为65℃。
对比例16
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，酶解温度为50℃。
对比例17
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，酶解温度为55℃。
对比例18
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，酶解温度为70℃。
采用实施例1、8和对比例16～18中的方法，对奶茶饮料1进行茶多酚含量检测，结果见图3。从图3可以看出：酶解温度过高或过低均会导致茶多酚检测结果偏低；当酶解温度为60～65℃时，测得的茶多酚含量较高。推测原因在于：酶解温度过高或过低均会造成菠萝蛋白酶的活性减弱，进而导致蛋白质与茶多酚之间的络合作用无法被充分破坏。
方法学验证1：精密度试验
采用实施例1中的方法，对奶茶饮料1和奶茶饮料2中的茶多酚含量进行6次重复测定，计算相对标准偏差(RSD)，结果见表2。
表2
从表2可以看出：奶茶饮料1和奶茶饮料2重复测定6次的RSD分别为0.23％、0.57％，表明本发明的方法有较好的精密度。
方法学验证2：回收率试验
向奶茶饮料1、2、3、4中添加3个不同浓度水平的茶多酚标准溶液后，采用实施例1中的方法检测茶多酚含量，进行回收试验，结果见表3。
表3
从表3可以看出：不同样品的回收率为99.1～102.0％，均在90～110％范围内，且RSD均小于5％，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求。
通过对本发明的检测方法进行精密度和回收率试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明该检测方法科学有效。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种奶茶饮料中茶多酚的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将奶茶样液、菠萝蛋白酶溶液、乙醇水溶液配制成混合液，酶解后，经冷却、过滤，获得澄清滤液；
(2)取澄清滤液，与酒石酸亚铁溶液和磷酸缓冲溶液混合后，配制成待测样液，检测待测样液的吸光度；
(3)取澄清滤液，与磷酸缓冲溶液混合后，配制成对照溶液，所述对照溶液与待测样液中的澄清滤液含量相同，检测对照溶液的吸光度；
(4)根据待测样液和对照溶液的吸光度，获得奶茶样液中的茶多酚含量。
2.如权利要求1所述的奶茶饮料中茶多酚的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述奶茶样液与菠萝蛋白酶溶液中的菠萝蛋白之间的质量比为1:0.014～0.016。
3.如权利要求1或2所述的奶茶饮料中茶多酚的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，酶解温度为60～65℃，时间为15～50min。
4.如权利要求1或2所述的奶茶饮料中茶多酚的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述菠萝蛋白酶溶液中，菠萝蛋白酶的浓度为8～12g/100mL。
5.如权利要求4所述的奶茶饮料中茶多酚的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乙醇水溶液中，乙醇的体积分数为90～96％；所述奶茶样液与混合液的质量体积比为1g:2.0～2.5mL。
6.如权利要求1所述的奶茶饮料中茶多酚的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，过滤时，弃去5～8mL初滤液。
7.如权利要求1所述的奶茶饮料中茶多酚的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酒石酸亚铁溶液的制备方法如下：将硫酸亚铁和酒石酸钾钠溶于水中，所述硫酸亚铁、酒石酸钾钠与水的质量体积比为0.10～0.15:0.50～0.75:100。
8.如权利要求1或7所述的奶茶饮料中茶多酚的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述澄清滤液、酒石酸亚铁溶液与磷酸缓冲液的体积比为1:0.9～1.3:2.5～3.5。
9.如权利要求1所述的奶茶饮料中茶多酚的检测方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中，所述磷酸缓冲溶液的pH为7.0～7.5。
10.如权利要求1所述的奶茶饮料中茶多酚的检测方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中，检测吸光度时，采用10mm的比色皿，检测波长为540nm；步骤(4)中，按照以下公式计算奶茶样液中的茶多酚含量：
X＝(A1-A2)×1.957×2×K×1000/m
其中，X为奶茶样液中的茶多酚含量，单位为mg/kg；A1为待测样液的吸光度；A2为对照溶液的吸光度；K为稀释倍数，K＝V1/V2，V1为步骤(1)中混合液的体积，V2为步骤(2)中取的澄清滤液体积；m为奶茶样液的质量，单位为g。
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