CN113637782B - 与急性胰腺炎病程进展相关的微生物标志物及其应用 - Google Patents
与急性胰腺炎病程进展相关的微生物标志物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113637782B CN113637782B CN202111194850.6A CN202111194850A CN113637782B CN 113637782 B CN113637782 B CN 113637782B CN 202111194850 A CN202111194850 A CN 202111194850A CN 113637782 B CN113637782 B CN 113637782B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fold
- acute pancreatitis
- sample
- group
- progression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/06—Quantitative determination
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
- G01N2800/067—Pancreatitis or colitis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了与急性胰腺炎病程进展相关的微生物标志物及其应用,所述微生物标志物选自g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG‑008和/或g_Eubacterium_ventriosum_group。本发明的微生物标志物预测急性胰腺炎病程进展的敏感性高,特异性强,通过检测微生物标志物的丰度,可用于警示受试者,进一步通过调整饮食或医疗介入减少风险。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及与急性胰腺炎病程进展相关的微生物标志物及其应用。
背景技术
急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP) 是一种可导致局部损伤、全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)和器官衰竭的炎症性疾病。随着社会的不断发展和进步,人们生活水平的提高,高脂饮食,低运动量,过度工作压力,酗酒等饮酒习惯增加等原因,胰腺炎的发病率增加,导致急性胰腺炎的发病率增加。急性胰腺炎占急腹症的3%-10%,这是临床常见的急腹症。这种疾病对生理学有很大的破坏性。它具有起效快,发展迅速,风险高,死亡率高的特点。AP按临床病情严重度分型可分为轻度急性胰腺炎(mild acute pancreastitis,MAP )、中度急性胰腺炎(moderately severe acutepancreatitis,MSAP)及重度急性胰腺炎(severe acute pancreatitis ,SAP )。在临床上,80%的AP患者为轻症,不伴随严重并发症及不良预后,但20%的患者病情严重、临床过程复杂并存在高死亡风险。随着急性胰腺炎严重程度的增加,患者的病死率增加, SAP病死率较高,为36%~50%,如后期合并感染则病死率极高(Vege SS, Gardner TB, Chari ST,et al.Low mortality and high morbidity in severe acute pancreatitis without organfailure: a case for revising the Atlanta classification to include "moderately severe acute pancreatitis"[J]. Am J Gastroenterol.2009,104(3):710-5.)。寻找急性胰腺炎病程进展的标志物对于急性胰腺炎的监控,提高患者的生存和生活质量具有重要的意义。
在急性胰腺炎的病程中,早期发生的器官衰竭和后期因菌群紊乱、菌群易位导致的肠源性感染均是影响急性胰腺炎预后及病死率的主要因素(Petrov M S, Shanbhag S,Chakraborty M, et al. Organ failure and infection of pancreatic necrosis asdeterminants of mortality in patients with acute pancreatitis[J].Gastroenterology,2010,139(3):813-820.),但由于过去检测手段的局限性,对急性胰腺炎,随着近年来分子微生物学技术的进步,人们对肠道微生物菌群的结构与特性有了更新的认识,探讨肠道菌群在AP发生发展中的变化及作用,对AP的临床治疗研究将起到有效的影响。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求,本发明的目的在于提供一种用于评估急性胰腺炎的微生物标志物及其应用,本发明的微生物标志物预测急性胰腺炎风险的灵敏性好,只需要获取微生物标志物的相对含量,作为协助诊断,指导微生物环境的调整,降低急性胰腺炎的风险。
为达上述目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种急性胰腺炎病程进展相关的微生物标志物,所述微生物标志物选自g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008和/或g_Eubacterium_ventriosum_group;
进一步,所述微生物标志物选自g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008、g_Eubacterium_ventriosum_group的任意两种;
进一步,所述微生物标志物选自g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008和g_Eubacterium_ventriosum_group。
第二方面,本发明提供了一种检测样本中第一方面所述的微生物标志物的试剂。
第三方面,本发明提供了一种第一方面所述的微生物标志物或第二方面所述的试剂的用途,所述用途包括用于构建预测急性胰腺炎病程进展的模型、制备诊断急性胰腺炎病程进展的产品。
进一步,相比MAP患者,g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008在MSAP和SAP患者中显著上调,g_Eubacterium_ventriosum_group在MSAP和SAP患者中显著下调。
进一步,所述产品包括芯片、试剂盒、试纸。
进一步,所述模型的输入变量为第一方面所述的微生物标志物的丰度。
进一步,所述微生物标志物丰度的测定方法包括宏基因组测序、16S测序或qPCR定量检测中的任意一种或几种。
第四方面,本发明提供了一种诊断急性胰腺炎病程进展的产品,所述产品包括第二方面所述的试剂。
进一步,所述试剂包括检测第一方面所述的微生物标志物的特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
进一步,所述特异性的引物为扩增所述微生物标志物 16SrRNA的引物。
进一步,所述产品还包括提取样本中DNA的试剂。
进一步,所述样本选自粪便、直肠拭子。
进一步,所述样本选自直肠拭子。
本发明的优点和有益效果:
本发明首次发现了g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008或g_Eubacterium_ventriosum_group与急性胰腺炎病程进展相关,相比MAP患者,g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008在MSAP和SAP患者中显著上调,g_Eubacterium_ventriosum_group在MSAP和SAP患者中显著下调,g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008和/或g_Eubacterium_ventriosum_group作为检测靶标应用于急性胰腺炎病程进展的判断具有较高的准确性、敏感性和特异性。
附图说明
图1是g_Rhodococcus联合g_Ruminococcaceae_UCG-008的诊断效能图;
图2是g_Rhodococcus联合g_Eubacterium_ventriosum_group的诊断效能图;
图3是g_Ruminococcaceae_UCG-008联合g_Eubacterium_ventriosum_group的诊断效能图;
图4是g_Rhodococcus联合g_Ruminococcaceae_UCG-008和g_Eubacterium_ventriosum_group的诊断效能图。
具体实施方式
本发明通过将不同病程进展的急性胰腺炎的人群作为对象,首次查明了微生物与急性胰腺炎病程进展的临床医学指标的相关性,并以此为基础提供了急性胰腺炎病程进展的诊断技术。为了评估微生物菌群能否作为急性胰腺炎病程进展的预测因子,本发明通过收集不同病程进展的急性胰腺炎的直肠棉拭子,综合分析16S rRNA测序、宏基因组测序和针对特定菌群的定量聚合酶链反应结果,发现与急性胰腺炎相关的微生物菌群,本发明通过16S rRNA测序,首次发现了g_ Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008或g_Eubacterium_ventriosum_group的丰度在不同病程进展的急性胰腺炎患者呈现显著性差异,说明g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008或g_Eubacterium_ventriosum_group可作为判断急性胰腺炎病程进展的生物标志物。
在本发明中,微生物的类型没有特别限制,并且其例如包括细菌、病毒、真菌、微小的藻类和原生动物及其组合。
在本发明的实施方式中,本发明通过以下步骤来检测急性胰腺炎的病程进展:在来自个体的核酸样本中,检测与急性胰腺炎病程进展的诊断相关的菌种所对应的一个或多个核酸片段。在特定的实施方式中,检测对应于g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008或g_Eubacterium_ventriosum_group的核酸片段。在实施本发明描述的方法中,使用分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA方面的很多传统技术,这些技术是公知的。
下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明,本发明中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
本发明中术语“OTU”(操作分类单元)是指***发生树中的末端叶(terminalleaf),由特定的遗传序列以及与该序列在科、属、种或菌株水平上享有序列同一性的全体序列来定义。所述特定遗传序列可以是16S序列或16S序列的一部分,或者可以是在广泛存在于整个真细菌界的功能保守的管家基因。OTU之间具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。OTU经常通过比较生物体之间的序列来定义,序列同一性低于95%的序列不视为构成同一OTU的一部分,然而在本发明所用,一个OTU标识可包含序列同一性为0至100%、25%至100%和50%至100%、优选70%至100%、75%至100%、77%至100%、80%至100%、81%至100%、82%至100%、83%至100%、84%、至100%、更优选85%至100%、86%至100%、87%至100%、88%至100%、89%至100%、90%至100%、91%至100%、92%至100%、93%至100%、94%至100%、95%至100%、96%至100%、97%至100%98%至100%和99%至100%的序列。
本发明中,OTU代表此前已经归入或尚未归入属、种和/或株名的细菌,也即OTU或OTU标识等同于细菌的目、科、属、种或株,在进行生物信息学分析的过程中,通过OUT聚类,分析其代表的细菌的含量。
16S rRNA的“V1-V9区”指16S rRNA基因的第一至第九高变区,用于细菌样品的基因分型,这是普通技术人员众所周知的。一些实施方式中,用V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8和V9区中至少其一来表征微生物标志物。一些实施方式中,用V3和V4区来表征微生物标志物。
本发明中检测微生物标志物的探针是与微生物标志物多核苷酸“特异性杂交”的寡核苷酸,其具有充分互补序列从而允许在本领域常用预定条件下与目标核苷酸序列杂交的寡核苷酸(有时称为“基本互补”)。尤其,该表述包括一寡核苷酸与本发明所述单链DNA或RNA分子内所含基本上互补的序列杂交,基本上排除该寡核苷酸与非互补序列的单链核酸杂交。探针和引物的具体长度和序列取决于所需核酸靶标的复杂性以及反应条件(例如温度和离子强度)。总体来说,杂交条件是本领域所知的严格杂交条件。“严格”指核苷酸序列能够结合相关或非特异性序列的条件。例如,高温和低盐提高严格性,使得非特异性结合或低熔融温度的结合发生解离。一些实施方式中,与微生物标志物多核苷酸互补的寡核苷酸与微生物标志物多核苷酸至少95%、96%、97%、98%、99%或100%互补。
术语 “二代测序” 或 “高通量测序” 指高通量测序技术,其将测序过程并行,一次产生数千条或数百万条序列。实例包括大规模平行信号测序(MPSS) 、聚合酶克隆 测序(Polony sequencing)、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、SOLiD测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、Helioscope(TM)单分子测序、单分子SMRT(TM)测序、单分子实时(RNAP)测序、纳米孔DNA测序、通过杂交进行的测序、扩增子测序、GnuBio。
作为一种可选择的实施方式,用于诊断对象急性胰腺炎病程进展的方法包括:分析对象测试样品的核酸;检测测试样品的核酸中一种或多种微生物和/或OTU的水平;当所述测试样品中一种或多种微生物和/或OTU的水平低于对照样品时诊断所述对象存在发生急性胰腺炎的风险;优选的,所述微生物标志物为g_ Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008和/或g_Eubacterium_ventriosum_group。
另一实施方式中,用于诊断对象急性胰腺炎病程进展的方法包括:获取对象的样品;处理受试者样品以获取16S rRNA基因序列数据;检测样品中一种或多种微生物和/或OTU的水平,包括用生物信息学软件分析16S rRNA基因序列数据;并且当样品中一种或多种微生物和/或OTU的水平低于对照样品时诊断所述对象存在发生急性胰腺炎的风险;优选的,所述微生物标志物为g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008或g_Eubacterium_ventriosum_group。
如本发明所用,“显著性差异”是指当测试样品中一种或多种微生物或OTU的水平相比对照样品按log2差异倍数计改变至少约1.2倍。“改变”一词包括测试样品中微生物或OTU水性相比对照样品升高或降低。一些实施方式中,测试样品与对照样品之间一种或多种微生物或一个或多个OTU水平的改变可以是按log2差异倍数计相对于对照样品的约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍或5倍及以上。
一些实施方式中,当测试样品中一种或多种微生物或一个或多个OTU的水平按log2差异倍数计相比对照样品高约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍或5倍及以上。
一些实施方式中,当测试样品中一种或多种微生物或一个或多个OTU的水平按log2差异倍数计相比对照样品低约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍或5倍及以上。
本发明中使用的术语“样本”或“测试样本”指的是含核酸的任何液体材料或固体材料。在合适的实施方式中,测试样本从生物源获取(即,“生物样本”),比如培养中的细胞,或者是来自动物且最优选地来自人类的组织样本。在示例性实施方式中,所述样本是直肠棉拭子。
本发明的方法和产品可以用来利用获取自个体的生物样本来检测与各种细菌有关的核酸。可以根据本领域的技术人员所熟知的任何方法将该核酸(DNA 或 RNA)从所述样本中分离出来。可以通过标准步骤来获取生物样本并且可以立即使用所述生物样本,或者可以在适于该类型的生物样本的条件下储存该生物样本以备后续使用。
本申请所用的术语“曲线下面积”或“AUC”是指本技术领域中所众所周知的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve;ROC)的下面积。曲线下面积(AUC)测定有助于经由整体数据范围来比较分类器的准确性。具有更大的曲线下面积(AUC)的分类器具有更大的能力以在两个感兴趣的组之间准确分类未知物。在于区别两个群体方面上,受试者工作特征曲线(ROC)有用于以图表形式来表现特定的特征(例如,本发明中所描述的生物标志物和/或额外的生物医学信息的任意项目)的性能。通常,基于单一特征值,经由整个群体(例如,患者组及对照组)的上述特征数据被升序排列。然后,针对上述特征的每个值,计算对于数据的真阳性率及假阳性率。通过计算高于针对其特性的值以上的病例数之后,除以总病例数来测定上述真阳性率。通过计算高于针对其特性的值以上的对照组数之 后,除以总对照组数来测定上述假阳性率。尽管该定义是指患者组的特性相对于对照组高的情况,但该定义还适用于患者组的特性相对于对照组低的情况(在这种情况下,可计算出低于上述特性的值的样本的数)。受试者工作特征曲线(ROC)可以针对其他单一计算,还可针对单一特性生成,为了提供单一和值,例如,可数学性地组合两个以上的特性(例如,加、减等),该单一和值可由受试者工作特征曲线(ROC)来表示。附加地,能够以受试者工作特征曲线(ROC)来画出可导出单一计算值的多重特性的组合。这些特性组合可构成测试。上述受试者工作特征曲线(ROC)为表示相对于测试的假阳性率(1-特异性)的测试的真阳性率(灵敏度)的图表。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件。
实施例1 急性胰腺炎相关的微生物菌群的检测
1、样本的采集
收集轻度急性胰腺炎(MAP)直肠棉拭子样本20例,中度重症急性胰腺炎(MSAP)和重度重症急性胰腺炎(SAP)直肠棉拭子样本40例。患者资料统计如表1所示。
患者的纳入标准:符合2012年新亚特兰大急性胰腺炎分类标准。
患者的排除标准:无免疫缺陷、过敏、哮喘、结肠癌、糖尿病、HIV、炎症性肠病、肠易激综合症、肠胃炎、麻醉小肠结肠炎、和关节炎;服用抗生素、益生菌、中草药和其他可能影响肠道菌群结构的物质。
表1 患者资料
2、16S rRNA测序
2.1 DNA的提取
使用DNA提取试剂盒自样本中提取细菌DNA,操作步骤按说明书进行。
2.2 DNA样本纯度及浓度测定
利用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。
2.3 PCR扩增及产物纯化
按指定测序区域,合成带有barcode的特异引物,或合成带有错位碱基的融合引物。
为保证后续数据分析的准确性及可靠性,需满足两个条件,1) 尽可能使用低循环数扩增;2) 保证每个样本扩增的循环数一致。随机选取具有代表性的样本进行预实验,确保在最低循环数中使绝大多数样本能够扩增出浓度合适的产物。
PCR 采用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase;
PCR仪:ABI GeneAmp® 9700型;
全部样本按照正式实验条件进行,每个样本3个重复,将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测,使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物,Tris_HCl洗脱; 2%琼脂糖电泳检测。
2.4 荧光定量
将PCR产物用QuantiFluor™ -ST蓝色荧光定量***(Promega公司)进行检测定量,之后按照每个样本的测序量要求,进行相应比例的混合。
2.5 Miseq文库构建
1) 通过PCR将Illumina官方接头序列添加至目标区域外端;
2) 使用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物;
3) Tris-HCl缓冲液洗脱,2%琼脂糖电泳检测;
4) 氢氧化钠变性,产生单链DNA片段。
试剂:TruSeqTM DNA Sample Prep Kit
2.6 Miseq测序
1) DNA片段的一端与引物碱基互补,固定在芯片上;
2) 以DNA片段为模板,芯片上固定的碱基序列为引物进行PCR合成,在芯片上合成目标待测DNA片段;
3) 变性、退火后,芯片上DNA片段的另一端随机与附近的另外一个引物互补,也被固定住,形成“桥(bridge)”;
4) PCR扩增,产生DNA簇;
5) DNA扩增子线性化成为单链;
6) 加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP,每次循环只合成一个碱基;
7) 用激光扫描反应板表面,读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类;
8) 将“荧光基团”和“终止基团”化学切割,恢复3'端粘性,继续聚合第二个核苷酸;
9) 统计每轮收集到的荧光信号结果,获知模板DNA片段的序列。
3、数据分析
3.1 数据预处理
MiSeq测序得到的是双端序列数据,首先根据PE reads之间的overlap关系,将成对的reads拼接(merge)成一条序列,同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤,根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列,并校正序列方向,即为优化数据。
数据去杂方法和参数:
1)过滤reads尾部质量值20以下的碱基,设置50bp的窗口,如果窗口内的平均质量值低于20,从窗口开始截去后端碱基,过滤质控后50bp以下的reads,去除含N碱基的reads;
2)根据PE reads之间的overlap关系,将成对reads拼接(merge)成一条序列,最小overlap长度为10bp;
3)拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2,筛选不符合序列;
4)根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品,并调整序列方向,barcode允许的错配数为0,最大引物错配数为2;
使用软件:FLASH、Trimmomatic。
3.2 物种注释与评估
使用Usearch进行OTU聚类分析,OTU(Operational Taxonomic Units)是在***发生学或群体遗传学研究中,为了便于进行分析,人为给某一个分类单元(品系,属,种、分组等)设置的统一标志。要了解一个样本测序结果中的菌种、菌属等数目信息,就需要对序列进行聚类(cluster)。通过聚类操作,将序列按照彼此的相似性分归为许多小组,一个小组就是一个OTU。可根据不同的相似度水平,对所有序列进行OTU划分,通常对在97%的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。
软件平台:Usearch(vsesion 7.0 http://drive5.com/uparse/)
分析步骤如下:
对优化序列提取非重复序列,便于降低分析中间过程冗余计算量;
去除没有重复的单序列;
按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类,在聚类过程中去除嵌合体,得到OTU的代表序列。
采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析,并分别在各个分类学水平:domain(域),kingdom(界),phylum(门),class(纲),order(目),family(科),genus(属),species(种)统计各样本的群落组成。
3.3 物种差异分析
运用生物信息学分析方法分析物种差异分析根据得到的群落丰度数据,检测不同组(或样本)微生物群落表现出的丰度差异。物种差异性分析的内容包括:组间差异显著性检验、Lefse多级物种差异判别分析。本项目使用组间差异显著性检验进行差异物种的筛选。
组间差异显著性检验根据得到的群落丰度数据,运用严格的统计学方法可以检测不同组(样本)微生物群落中表现出的丰富度差异的物种,进行假设性检验,评估观察到的差异的显著性。分析可选择域、界、门、纲、目、科、属、种、OTU等不同分类水平。
1) Wilcox秩和检验(Wilcoxon rank-sum test),也叫曼-惠特尼U检验(Mann–Whitney U test),是两组独立样本非参数检验的一种方法。其原假设为两组独立样本来自的两总体分布无显著差异,通过对两组样本平均秩的研究来实现判断两总体的分布是否存在差异,该分析可以对两组样本的物种进行显著性差异分析,并对P值进行多种方法的校正。
2) 多重检验校正,即对P值进行多重检验校正方法为"fdr"。
3) 双尾检验,用于指定所求置信区间的类型,选择双尾检验(求置信区间)。
4) CI计算方法,即计算置信区间的方法,方法为DP:Welch’s confidenceinverted。置信度选择:0.95。
运用DP的方法计算影响大小(effect size),即mean1-mean2;运用Welch T检验的方法计算置信区间,筛选标准P<0.05。
软件:R的stats包和python的scipy包。
4、结果
结果显示,相比MAP患者,g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008在MSAP和SAP患者中显著上调,g_Eubacterium_ventriosum_group在MSAP和SAP患者中显著下调,差异具有统计学意义(P<0.05),提示g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008或g_Eubacterium_ventriosum_group可以作为生物标志物应用于急性胰腺炎病程进展的诊断。
实施例2 g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008或g_Eubacterium_ventriosum_group的诊断效能
根据g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008或g_Eubacterium_ventriosum_group的相对含量,使用R绘制受试者工作特征曲线(ROC),分析g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008或g_Eubacterium_ventriosum_group用于急性胰腺炎病程进展诊断的灵敏性和特异性。
ROC曲线以及特征参数分别如图1-4和表2所示,g_Rhodococcus作为检测指标的曲线下面积为0.73,g_Ruminococcaceae_UCG-008作为检测指标的曲线下面积为0.6,g_Eubacterium_ventriosum_group作为检测指标的曲线下面积为0.666。
g_Rhodococcus联合g_Ruminococcaceae_UCG-008的曲线下面积为0.779,最佳阈值计算下的特异性和敏感性分别为0.850,0.675(图1);g_Rhodococcus联合g_Eubacterium_ventriosum_group的曲线下面积为0.815,最佳阈值计算下的特异性和敏感性分别为0.700,0.800(图2);g_Ruminococcaceae_UCG-008联合g_Eubacterium_ventriosum_group的曲线下面积为0.781,最佳阈值计算下的特异性和敏感性分别为0.700,0.725(图3);g_Rhodococcus联合g_Clostridium_sensu_stricto_和g_Eubacterium_ventriosum_group和的曲线下面积为0.880,最佳阈值计算下的特异性和敏感性分别为0.700,0.925(图4)。说明将g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008或g_Eubacterium_ventriosum_group尤其是其组合应用于急性胰腺炎病程进展中的诊断或预测具有较高的准确性,敏感性和特异性。
表2曲线下面积
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.检测样本中微生物标志物的试剂的用途,其特征在于,所述用途为制备诊断急性胰腺炎病程进展的产品,所述微生物标志物选自g_Rhodococcus、g_Ruminococcaceae_UCG-008和g_Eubacterium_ventriosum_group的组合。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述产品包括芯片、试剂盒、试纸。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述微生物标志物的检测方法包括宏基因组测序、16S测序或qPCR定量检测中的任意一种或几种。
4.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述试剂包括检测微生物标志物的特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
5.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述产品还包括提取样本中DNA的试剂。
6.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述样本选自粪便、直肠拭子。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111194850.6A CN113637782B (zh) | 2021-10-13 | 2021-10-13 | 与急性胰腺炎病程进展相关的微生物标志物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111194850.6A CN113637782B (zh) | 2021-10-13 | 2021-10-13 | 与急性胰腺炎病程进展相关的微生物标志物及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113637782A CN113637782A (zh) | 2021-11-12 |
CN113637782B true CN113637782B (zh) | 2022-02-08 |
Family
ID=78426724
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111194850.6A Active CN113637782B (zh) | 2021-10-13 | 2021-10-13 | 与急性胰腺炎病程进展相关的微生物标志物及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113637782B (zh) |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111647673A (zh) * | 2020-06-17 | 2020-09-11 | 中国医学科学院北京协和医院 | 微生物菌群在急性胰腺炎中的应用 |
-
2021
- 2021-10-13 CN CN202111194850.6A patent/CN113637782B/zh active Active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Gut microbiota dysbiosis worsens the severity of acute pancreatitis in patients and mice;Yin Zhu等;《Journal of Gastroenterology》;20181205;第54卷(第4期);347-358 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113637782A (zh) | 2021-11-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108368551B (zh) | 用于诊断结核病的方法 | |
JP2020513856A (ja) | 大腸癌の複合バイオマーカーを特定するための配列ベースの糞便微生物群調査データの活用 | |
CN107847515B (zh) | 实体瘤甲基化标志物及其用途 | |
US11312999B2 (en) | Set of genes for molecular classifying of medulloblastoma and use thereof | |
CN110283903B (zh) | 用于诊断胰腺炎的肠道微生物菌群 | |
CN111411150B (zh) | 诊断肌少症的肠道菌群及其应用 | |
CN111647673A (zh) | 微生物菌群在急性胰腺炎中的应用 | |
CN113637744B (zh) | 微生物标志物在判断急性胰腺炎病程进展中的应用 | |
CN112639983A (zh) | 微卫星不稳定性检测 | |
CN112553328A (zh) | 检测基因表达水平的产品及其在制备重度抑郁症诊断工具中的应用 | |
CN113637782B (zh) | 与急性胰腺炎病程进展相关的微生物标志物及其应用 | |
CN111662992A (zh) | 与急性胰腺炎相关的菌群及其应用 | |
KR20240021975A (ko) | 종양 평가를 위한 물질 및 방법 | |
EP3717665A1 (en) | Assays for detection of acute lyme disease | |
CN115261499A (zh) | 耐力相关的肠道微生物标记物及其应用 | |
CN111748640B (zh) | 肠道菌群在肌少症中的应用 | |
US11898210B2 (en) | Tools for assessing FimH blockers therapeutic efficiency | |
CN114839369B (zh) | 急性高原反应微生物标志物及其应用 | |
CN115261500B (zh) | 爆发力相关的肠道微生物标记物及其应用 | |
CN114045353B (zh) | 与诺如病毒感染性腹泻相关的微生物标志物及其用途 | |
KR102612260B1 (ko) | 여성의 탈모 진단을 위한 두피 마이크로바이옴 기반바이오 마커, 이를 이용한 탈모를 진단하는 방법, 및 기계 학습을 이용한 마이크로바이옴 기반 바이오 마커를 선별하는 방법 | |
US20230326600A1 (en) | A method for determining a diagnostic outcome | |
CN116875685A (zh) | 一种肝硬化合并门静脉***血栓形成的诊断模型及其应用 | |
CN111733206A (zh) | ***微生物在复发性流产中的应用 | |
Mahmod | Novel methods to study intestinal microbiota |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |